Nanopartikel Biokompatibel sebagai Platform untuk Meningkatkan Khasiat Antitumor Kombinasi Cisplatin–Tetradrine

Abstrak

Terapi kombinasi telah menjadi strategi standar dalam pengobatan tumor klinis. Kami telah menunjukkan bahwa kombinasi Tetradrine (Tet) dan Cisplatin (CDDP) menunjukkan aktivitas antikanker sinergis yang nyata, tetapi efek samping yang tak terhindarkan membatasi konsentrasi terapeutik mereka. Mempertimbangkan sifat fisikokimia dan farmakokinetik yang berbeda dari kedua obat, kami memasukkannya ke dalam kendaraan nano bersama-sama dengan metode emulsi ganda yang ditingkatkan. Nanopartikel (NP) dibuat dari campuran poli(etilenglikol)–polikaprolakton (PEG–PCL) dan polikarprolakton (HO-PCL), sehingga CDDP dan Tet dapat ditempatkan ke dalam NP secara bersamaan, menghasilkan efek interferensi rendah dan stabilitas tinggi . Gambar dari mikroskop fluoresensi mengungkapkan serapan seluler dari agen hidrofilik dan hidrofobik yang disampaikan oleh NP. Studi in vitro pada garis sel tumor dan jaringan tumor yang berbeda mengungkapkan peningkatan penghambatan tumor dan tingkat apoptosis. Mengenai studi in vivo, kemanjuran antitumor superior dan pengurangan efek samping diamati pada kelompok NP. Selanjutnya, ¹⁸ Pencitraan FDG-PET / CT menunjukkan bahwa NP mengurangi aktivitas metabolisme tumor lebih menonjol. Hasil kami menunjukkan bahwa NP kopolimer blok PEG–PCL bisa menjadi pembawa yang menjanjikan untuk kemoterapi kombinasi dengan kemanjuran yang solid dan efek samping yang kecil.

Pengantar

Dengan perkembangan terapi tumor yang komprehensif, senyawa platinum memainkan peran penting dalam pengobatan berbagai jenis kanker, di antaranya cisplatin (CDDP) banyak digunakan di klinik [1, 2]. Saat ini, CDDP masih signifikan bila dikombinasikan dengan imunoterapi tumor, menunjukkan efek yang menguntungkan pada tumor ganas seperti kanker paru-paru non-sel kecil (NSCLC) [3]. Namun, agen kemoterapi ini selalu mencapai aktivitas antitumor dengan mengorbankan toksisitas yang tidak diinginkan [4], sehingga agen terapeutik yang dapat mengurangi toksisitas dan meningkatkan kemanjuran kemoterapi telah dieksplorasi tanpa henti [5, 6]. Tetrandrine (Tet) adalah anggota bis-benzylisoquinoline alkaloid [7], menunjukkan efek yang memuaskan dalam sensitisasi kemoterapi. Pekerjaan kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa kombinasi Tet dan CDDP memang memiliki aktivitas antikanker sinergis yang ditandai dengan menghambat ekspresi gen terkait agen kemoterapi, termasuk perbaikan eksisi cross-complementation group 1 (ERCC1), Thymidylate Synthase (TS), - tubulin III, dll [8]. Namun, aplikasi klinis Tet memiliki kelarutan air yang buruk dan bioavailabilitas oral yang rendah [7]. Selain itu, CDDP hidrofilik paling mudah terdistribusi dalam matriks ekstraseluler (ECM), sedangkan Tet hidrofobik menembus membran lipid dapat diangkut melalui sel, sehingga kedua obat tidak dapat benar-benar bekerja sama. Oleh karena itu, penting untuk menemukan cara yang dapat secara efektif memberikan kedua obat secara bersamaan, meningkatkan efek antineoplastik dengan mengurangi efek samping.

Kemajuan terbaru di bidang nanoteknologi mengelola pendekatan baru untuk diagnosis dan pengobatan kanker [9, 10]. Nanopartikel (NPs) dibangun dengan kopolimer amfifilik, terutama polietilen glikol (PEG), dikenal karena kemampuannya untuk mengurangi kepatuhan protein serum dan mencegah penyerapan oleh sistem retikuloendotelial (RES) [11]. Jika digunakan untuk membawa obat hidrofobik, nanocarrier meningkatkan kelarutan bijaksana dan memperpanjang serta meningkatkan residensi obat dalam sirkulasi darah dan tumor [12]. Dengan penggunaan klinis NP kopolimer, biokompatibilitas NP semakin menarik perhatian. Sebagai contoh, temuan terbaru mengungkapkan bahwa beberapa titanium dioksida, silika, dan nanopartikel emas yang disuntikkan mempercepat intravasasi dan ekstravasasi sel kanker pada model hewan [13]. NP yang dibuat dari bahan nano dengan biokompatibilitas dan keamanan yang baik, terutama yang disetujui oleh FDA, adalah kandidat pembawa obat yang lebih baik.

Sebelumnya, kami telah berhasil membangun NP bermuatan CDDP [14, 15] dan NP bermuatan Tet menggunakan polietilen glikol-poli(kaprolakton) (PCL-PEG) [16], yang efek antitumor in vivo keduanya telah ditunjukkan. Dalam penelitian ini, kami menggunakan PEG-PCL untuk pengiriman bersama CDDP dan Tet. Dengan muatan yang hampir netral, PEG membentuk cangkang hidrofilik dari nanopartikel, yang menyembunyikan epitop antigenik dan mencegah reaksi imunologis [14]. Gambar dari mikroskop fluoresensi menunjukkan seluler dapat menyerap agen hidrofilik dan hidrofobik yang disampaikan oleh NP. Hasil penelitian in vitro, tidak hanya pada garis sel tumor yang berbeda, tetapi juga pada jaringan tumor, mengungkapkan CDDP-Tet NPs menghambat pertumbuhan tumor lebih efektif daripada obat bebas. Ketika diteliti in vivo, peningkatan kemanjuran antitumor dan penurunan efek samping diamati pada kelompok NP. Selain itu, ¹⁸ Pencitraan FDG-PET/CT menunjukkan tingkat metabolisme tumor yang paling buruk dalam kelompok NP, dan dengan demikian menunjukkan kemampuan NP CDDP-Tet untuk menghambat pertumbuhan tumor.

Metode

Materi

Reagen dan Sel

CDDP (rumus molekul PtCl₂ (NH₃ )₂ ) dibeli dari Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Jinan China) [15]. Tetrandrine (rumus molekul C₃₈ H₄₂ N₂ O₆ ) diperoleh sebagai bubuk dengan kemurnian > 98% dari Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, China) [16]. Metoksipolietilenglikol [MePEG; berat molekul rata-rata (Mw = 4 kDa; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China] didehidrasi dengan distilasi azeotropik dengan toluena dan kemudian dikeringkan dengan vakum pada 50 °C selama 12 jam sebelum digunakan. -Caprolactone (ε-CL; Aldrich , USA) dimurnikan dengan mengeringkan CaH₂ pada suhu kamar diikuti dengan distilasi di bawah tekanan rendah. Alkohol polivinil (PVA; derajat polimerisasi = 500, derajat alkoholisasi = 88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., Cina) dan stannous octoate (rumus molekul SnCl2) (Sigma) digunakan saat diterima. Media RPMI 1640 (Gibco, USA), serum darah anak sapi (Lanzhou Minhai Bioengineering, China), dan dimethylthiazoly-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Amersco, USA) digunakan saat diterima.

Garis sel kanker lambung manusia yang berdiferensiasi baik MKN₂₈ , garis sel adenokarsinoma kolorektal manusia LoVo, garis sel kanker serviks manusia Hela, dan garis sel hepatoma murine H₂₂ diperoleh dari Institut Biologi Sel Shanghai (Shanghai, Cina). Semua lini sel diperbanyak dalam media RPMI 1640, dilengkapi dengan 10% serum sapi, penisilin (100 U/mL)-streptomisin (100 g/mL), piruvat, glutamin, dan insulin pada 37 ° C dalam suasana jenuh air dengan 5% CO₂ .

Sintesis Kopolimer

Seperti yang kami jelaskan sebelumnya [16, 17], kopolimer mPEG-PCL dan HO-PCL disintesis oleh kopolimerisasi pembukaan cincin. Secara singkat, jumlah -CL yang telah ditentukan sebelumnya ditambahkan ke dalam tabung polimerisasi yang mengandung PEG dan sejumlah kecil stannous octoate (0,1% berat/berat). Tabung kemudian dihubungkan ke sistem vakum, ditutup rapat, dan ditempatkan dalam penangas minyak pada suhu 130 °C selama 48 jam. Untuk sintesis kopolimer HO-PCL, jumlah -CL dan stannous octoate yang telah ditentukan sebelumnya ditambahkan ke dalam tabung polimerisasi tanpa dikeringkan. Setelah polimerisasi selesai, kopolimer mentah dilarutkan dengan kloroform dan diendapkan ke dalam metanol dingin dalam jumlah berlebih untuk menghilangkan monomer dan oligomer yang tidak bereaksi. Endapan kemudian disaring dan dicuci dengan air beberapa kali sebelum benar-benar kering pada tekanan rendah.

Persiapan Nanopartikel CDDP-Tet-Loaded

Jumlah CDDP dan nanopartikel bermuatan Tet yang telah ditentukan sebelumnya dibuat dengan metode emulsi ganda (DE) [14, 18]. CDDP dan Tet diemulsi dengan 1 mL larutan diklorometana (DCM) yang mengandung 5 mg mPEG–PCL dan 15 mg HO-PCL, dengan sonikasi selama 15 detik (15 W) dalam penangas es (larutan W1). Kemudian, 4 mL larutan PVA 3% (b/v) W2 ditambahkan dan disonikasi selama 30 detik untuk membuat emulsi W1/O/W2. Emulsi ganda diencerkan ke dalam 50 mL larutan berair PVA 0,3% (b/v) dan DCM diuapkan di bawah vakum. Nanopartikel yang diperoleh dikumpulkan, dicuci, dan dikeringkan beku (Gbr. 1).

Skema persiapan CDDP-Tet NPs

Konten Pemuatan Obat dan Efisiensi Enkapsulasi

Untuk menentukan kandungan drug loading, bubuk NP CDDP–Tet-loaded beku-kering dilarutkan dalam dimetilformamida (DMF), dan 30 L larutan ini dicampur dengan 30 L 2 mmol/L HCL diikuti dengan penambahan 2,94 mL dari 0,2 mmol/L SnCl₂ larutan dalam 2 mmol/L HCL. Absorbansi pada 403 nm diukur setelah 1 jam dengan mengacu pada kurva kalibrasi menggunakan Spektrofotometer Shimadzu UV-1205 (Kyoto, Jepang). Jumlah total obat dalam NP kemudian dapat dihitung. Konten pemuatan obat dan efisiensi enkapsulasi, masing-masing, diperoleh dengan Persamaan. (1) dan (2):

$${\text{Konten pemuatan obat}}\, (\% ) =\frac{{{\text{Berat obat dalam nanopartikel}}}}{{{\text{Berat nanopartikel}}}} \times 100\,(\% )$$ (1) $${\text{Efisiensi enkapsulasi }}\,(\% ) =\frac{{{\text{Berat obat dalam nanopartikel}}}}{ {{\text{Berat obat makanan}}}} \times 100\,(\% )$$ (2)

Sitotoksisitas In Vitro dari Nanopartikel dan Studi Biokompatibilitas

Studi Serapan Seluler

Berdasarkan penelitian kami sebelumnya [15], sel LoVo ditempatkan pada penutup pelat 6-pori dengan sekitar 5 × 10⁵ sel masing-masing pori dan diinkubasi selama 24 jam (37 °C, 5% CO₂ ). NP dengan rhodamin B (21 μg/mL) ditambahkan ke dalam pori-pori. Setelah inkubasi selama 2 jam, pate dicuci dengan PBS 4°C dan 37°C masing-masing 3-4 kali. Sel LoVo pada kaca penutup kemudian diperiksa dengan mikroskop fluoresensi.

Uji Sitotoksisitas

Sitotoksisitas in vitro obat ditentukan dengan uji MTT standar menggunakan MKN28 dan H₂₂ garis sel. Secara singkat, sel-sel diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 5.000 sel per sumur 24 jam sebelum pengujian. Kemudian sel-sel terkena serangkaian dosis CDDP gratis, Tet gratis, CDDP gratis plus Tet dan nanopartikel bermuatan CDDP-Tet. Setelah inkubasi, 20 L larutan MTT 5 mg/mL ditambahkan ke setiap sumur dan cawan diinkubasi selama 4 jam, memungkinkan sel-sel yang hidup untuk mengubah MTT kuning menjadi kristal formazan biru tua, yang dilarutkan dalam 200 μL dimetil sulfoksida (DMSO). Kerapatan optik (OD) setiap sumur diukur dengan pembaca ELISA (ELX800 Biotek, USA) menggunakan panjang gelombang uji dan referensi masing-masing 490 dan 630 nm. Viabilitas sel ditentukan dengan rumus berikut:

$${\text{Kelangsungan hidup sel}}\,(\% ) =\frac{{{\text{OD (sumur uji)}}}}{{{\text{OD (sumur referensi)}}}} \ kali 100\,(\% )$$ (3)

Kompatibilitas in vitro dari nanopartikel kosong juga ditentukan dengan uji MTT menggunakan MKN₂₈ dan H₂₂ garis sel. Semua hasil yang diperoleh dari uji MTT dikonfirmasi dengan mengulangi percobaan setidaknya tiga kali secara independen dan pengujian dalam rangkap tiga setiap kali.

Uji Apoptosis

Annexin V-FITC Kit (Bender MedSystem, USA) diadopsi untuk memeriksa perubahan tingkat apoptosis sel. MKN₂₈ sel menjadi sasaran cawan kultur 6 cm selama 24 jam. Media kultur diganti dengan masing-masing 1 g/mL CDDP gratis, 1 g/mL CDDP, dan 200 g/mL NP kosong. Kelompok kontrol diganti dengan media kultur tanpa obat. Enzim ditambahkan setelah 48 jam kultur. Sel-sel tersebut kemudian dikumpulkan, dicuci 2 kali dengan PBS, dan disuspensikan kembali dalam buffer 100 μL. Annexin V 5 L dan PI 1 L ditambahkan secara bergantian, dicampur, dan didiamkan selama 15 menit pada suhu kamar tanpa paparan cahaya. 400 mL buffer ditambahkan dan menjalani proses FCM (BD FACS CantoTM, USA) untuk analisis tingkat apoptosis sel.

Assay Respon Obat Histokultur (HDRA)

HDRA dilakukan sesuai dengan penelitian kami sebelumnya [14, 19]. Secara singkat, tikus ICR jantan disuntik secara subkutan di kedua ruang aksila dengan 4–6 × 10⁶ H₂₂ sel dalam garam. Saat tumor mencapai 400–600 mm³ dalam volume, tikus dikorbankan dengan dislokasi serviks, dan spesimen segar diambil sampelnya, dicuci dua kali dalam larutan garam, direndam dalam larutan Hank, dan dibagi menjadi beberapa bagian dengan berat sekitar 15 mg. Sampel jaringan ditempatkan dalam piring 24-sumur di mana spons gelatin persegi dengan dimensi 1 cm telah direndam dalam media RPMI 1640 yang dilengkapi dengan 20% serum janin anak sapi dan amikasin sulfat (100 IU/mL) yang mengandung CDDP atau CDDP-bebas. memuat NP pada dua konsentrasi yang berbeda. Empat spesimen tumor diinkubasi tanpa obat apapun sebagai kontrol. Jaringan kemudian dikultur selama 7 hari pada 37 °C 5% CO₂ . Larutan campuran kolagenase Tipe I (100 L, 0,6 mg/mL) dan MTT (100 L, 5 mg/mL) dalam 100 mg/mL natrium suksinat ditambahkan. Setelah inkubasi selama 24 jam lagi, formazan MTT diekstraksi dengan 1 mL DMSO, dan 100 L larutan dari setiap sumur dipindahkan ke sumur pelat mikro 96 sumur. OD masing-masing sumur di pelat mikro diukur menggunakan pembaca ELISA dengan panjang gelombang uji dan referensi masing-masing 490 dan 630 nm. Viabilitas jaringan dihitung menurut rumus berikut (4):

$${\text{Kelangsungan jaringan}}\,(\% ) =\frac{{{\text{OD (pengujian)}}/{\text{Berat (pengujian)/mg}}}}{{{\ teks{OD (kontrol)}}/{\text{Berat (kontrol)/mg}}}} \times 100\,(\% )$$ (4)

Kemanjuran Antitumor Pada Vivo

Pengukuran Volume Tumor

Tikus ICR jantan dengan berat antara 18 dan 20 g ditanamkan dengan sel murine hepatoma cell line H₂₂ dan digunakan untuk memenuhi syarat kemanjuran relatif NP yang dimuat CDDP-Tet. Dibesarkan dalam keadaan bebas patogen tertentu (SPF), tikus dilakukan sesuai dengan pedoman yang disetujui oleh Komite Perawatan Hewan di Rumah Sakit Drum Tower. 0,2 mL suspensi sel yang mengandung 4–6 × 10⁶ H₂₂ sel disuntikkan secara subkutan ke dalam ruang aksila kiri tikus. Mencit dibagi menjadi 6 kelompok:kelompok kontrol (saline), kelompok NP kosong, kelompok CDDP bebas (3 mg/kg), kelompok CDDP plus Tet bebas (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), dan kelompok CDDP- Kelompok NP dengan muatan tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg). Setiap kelompok terdiri dari 6 ekor mencit. Perawatan dimulai setelah 7-8 hari implantasi, dan hari itu ditetapkan sebagai ''Hari 0''. Setiap hewan ditimbang pada saat pengobatan sehingga dosis dapat disesuaikan untuk mencapai dosis mg/kg yang dilaporkan. Hewan juga ditimbang setiap hari selama percobaan.

Pengujian Imunofluoresensi

Jaringan tumor dari tikus dalam kelompok kontrol dan yang menerima CDDP plus NP Tet dan CDDP-Tet gratis dipilih untuk pengamatan histologi pada hari ke-21 setelah perawatan. Tumor dibedah dan difiksasi dalam formalin buffer netral 10%, secara rutin diproses menjadi parafin, dipotong dengan ketebalan 5 mm. Bagian jaringan diamati di bawah mikroskop confocal Zeiss LSM510 Meta setelah sampel diwarnai dengan (40,6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI, biru) dan terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL, hijau) [20] .

¹⁸ Pencitraan FDG-PET/CT

Tikus dari kelompok CDDP plus Tet gratis dan kelompok NP yang dimuat CDDP-Tet kemudian menerima pencitraan PET/CT pada hari ke-6 setelah perawatan. Puasa 4 jam dilakukan sebelum injeksi pelacak. 14,8 MBq (400 lCi) dari ¹⁸ F-FDG disuntikkan melalui vena ekor sebagai radiotracer. Gambar diproduksi dengan gabungan pemindai PET/CT (Jemini JXL, Philips, USA). Gambar PET resolusi tinggi dan bidang tampilan CT yang sama diperoleh dengan tikus 45 menit setelah pemberian ¹⁸ F-FDG. Gambar PET dikoreksi untuk redaman dan hamburan berdasarkan data CT. Fusi gambar dilakukan oleh sistem fusi gambar otomatis, menggunakan perangkat lunak yang disediakan vendor. Nilai serapan FDG maksimum dalam tumor diperoleh untuk perhitungan nilai serapan standar (SUV), menerapkan koreksi untuk berat badan dan aktivitas yang disuntikkan.

Metode Statistik

Analisis statistik data dilakukan dengan menggunakan t . Siswa tes. Data terdaftar sebagai mean ± SD, dan nilai P < 0,05 diterima sebagai perbedaan yang signifikan secara statistik.

Hasil

Sintesis dan Karakterisasi Kopolimer

Menurut penelitian kami sebelumnya, kami mensintesis NP dengan PEG-PCL dan HO-PCL (rasio optimal adalah 1:3) [14]. Diameter, polidispersitas, berat molekul rata-rata jumlah (Mn), dan berat molekul rata-rata berat (Mw) dari NP kopolimer PEG-PCL yang optimal ditunjukkan dalam File tambahan 1:Tabel S1. Ketika dimuat dengan CDDP dan Tet, konten pemuatan obat dan efisiensi enkapsulasi juga diukur (File tambahan 1:Tabel S2), yang mirip dengan NP kopolimer PEG-PCL yang dimuat CDDP. Namun, konten pemuatan obat dan efisiensi pemuatan Tet lebih rendah dibandingkan dengan NP kopolimer PEG–PCL dengan muatan Tet, yang mungkin ada hubungannya dengan komponen HO-PCL.

Melalui hamburan cahaya dinamis (DLS), diameter NP kopolimer PEG–PCL yang dimuat CDDP-Tet adalah 359,1 ± 5,3 nm dengan polidispersitas sekitar 0,231. Ketika diamati oleh TEM dan AFM (File tambahan 1:Gambar S1a dan S1b), NP menyajikan bentuk bola biasa dan ukuran serupa yang kebetulan dengan data dari DLS. Juga, tetesan kecil tersebar di nanopartikel, yang menegaskan nanopartikel memang struktur emulsi ganda.

Serapan Seluler NP CDDP-Tet-Loaded

Pemuatan partikel dengan pewarna fluoresen telah diterapkan sebagai metode umum untuk mengeksplorasi serapan seluler, yang mewujudkan deteksi visual dan waktu nyata. Kami telah menunjukkan bahwa NP yang mengandung pewarna dapat memasuki sel melalui endositosis. Dalam penelitian ini, rhodamin-B bersifat hidrofilik dan dapat dideteksi pada saluran fluoresensi PI, yang digunakan untuk mensimulasikan CDDP. Sebagai simulasi Tet, kumarin-6 bersifat hidrofobik, yang sinyalnya dapat diterima di saluran fluoresensi FITC. Setelah diinkubasi bersama dengan NP yang diisi dengan kumarin-6 dan rhodamin-B selama 2 jam, sel LoVo dideteksi melalui mikroskop fluoresensi dan lensa optik (200 ×). Seperti dapat dilihat pada Gambar. 2, sinyal fluoresensi dapat dideteksi di saluran fluoresensi PI, saluran fluoresensi FITC, serta saluran fluoresensi ganda PI/FITC. Hasilnya menegaskan bahwa NP dapat membawa kumarin-6 dan rhodamine-B ke sel tumor secara bersamaan, berdasarkan itu kami dapat menyimpulkan bahwa CDDP dan Tet dapat dimuat dalam NP dan diserap oleh sel tumor secara bersamaan.

Foto-foto sel LoVo setelah 2 jam pewarnaan dengan NP yang diisi dengan rhodamin B dan kumarin-6 (200 × ; bar:50 um). a Morfologi sel di bawah mikroskop cahaya, b morfologi sel di bawah mikroskop fluoresensi (saluran fluoresensi PI), c morfologi sel di bawah mikroskop fluoresensi (saluran fluoresensi FITC), dan d morfologi sel di bawah mikroskop fluoresensi (saluran fluoresensi ganda PI/FITC)

Sitotoksisitas In Vitro dari Nanopartikel

Sitotoksisitas CDDP bebas, Tet bebas, CDDP bebas plus Tet, dan NP bermuatan CDDP-Tet dibandingkan dalam garis sel lambung MKN28. Konsentrasi Tet 2,4 kali lebih besar dari konsentrasi CDDP. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, sitotoksisitas NP yang dimuat CDDP-Tet paling kuat di antara keempat kelompok. Perbedaan sitotoksisitas antara Tet bebas dan kelompok NP dan tiga kelompok obat bebas lainnya menjadi menonjol dengan meningkatnya konsentrasi. Hasil serupa diamati pada sel kanker serviks manusia Hela dan sel karsinoma hepatoseluler H₂₂ (File tambahan 1:Gambar S2a, S2b).

Sitotoksisitas in vitro dari nanopartikel. a Viabilitas sel MKN28 setelah dikultur bersama dengan obat-obatan selama 48 jam. Konsentrasi Tet 2,4 kali lebih besar dari konsentrasi CDDP. b Foto sel MKN28 di bawah mikroskop cahaya (200 ×) setelah dikultur bersama dengan obat-obatan selama 48 jam

Studi toksisitas NP kosong telah dilakukan dalam pekerjaan kami sebelumnya. Dalam penelitian sebelumnya, blanko NP memiliki sedikit toksisitas pada garis sel tumor, yang menunjukkan bahwa NP blanko memiliki biokompatibilitas yang memuaskan [14, 16].

Analisis Apoptosis In Vitro dari CDDP-Tet-Loaded NP

Kami mengukur dampak CDDP gratis 1 μg/mL, Tet gratis 2,4 μg/mL, CDDP plus Tet gratis (1 μg/mL + 2.4 μg/mL), dan NP yang dimuat CDDP-Tet (1 μg/mL + 2.4 μg /mL) pada tingkat apoptosis sel MKN28 setelah dikultur bersama selama 48 jam. Tingkat apoptosis sel dihitung sebagai Q2 + Q4 (ditunjukkan pada Gambar. 4). Perubahan tingkat apoptosis sel serupa antara CDDP bebas ditambah Tet, CDDP bebas, dan kelompok Tet bebas (Gbr. 4a-c). Namun, tingkat apoptosis sel MKN28 yang diinduksi oleh CDDP-Tet-loaded NPs secara signifikan lebih tinggi daripada tiga kelompok lainnya (Gbr. 4d).

Analisis apoptosis in vitro dengan flow cytometry a CDDP gratis, b Tet gratis, c CDDP + Tet dan d . gratis CDDP-Tet NP

Assay Respon Obat Histokultur (HDRA)

Untuk mengevaluasi efektivitas antitumor NP secara lebih komprehensif, kami mengevaluasi efek antitumor dari CDDP gratis, CDDP plus Tet gratis, dan NP bermuatan CDDP-Tet pada H₂₂ garis sel menggunakan HDRA. Sebagai metode klinis untuk memprediksi kemosensitivitas, HDRA mensimulasikan kondisi praktis jaringan tumor lebih otentik daripada percobaan sitologi [19], yang hasilnya dapat dipengaruhi oleh lingkungan mikro dan struktur mikro jaringan tumor seperti penetrasi obat, nilai pH ekstraseluler, interstisial tekanan fluida, dll.

Konsentrasi Tet adalah 2,4 kali lebih banyak dari konsentrasi CDDP. Seperti ditunjukkan pada Gambar 5, pada konsentrasi terendah, efek antitumor kelompok CDDP dan Tet bebas lebih baik daripada CDDP namun efeknya serupa dengan peningkatan konsentrasi obat. Sesuai dengan analisis apoptosis, NP CDDP-Tet-loaded memiliki efek antitumor yang jauh lebih baik di antara tiga kelompok pada semua konsentrasi yang diuji.

Uji respons obat histokultur

Analisis Kemanjuran Antitumor Di Vivo

Evaluasi Khasiat dan Efek Samping

Model murine yang dibentuk oleh H₂₂ pencangkokan garis sel diperlakukan dengan 3 mg/kg CDDP gratis, CDDP gratis bersama-sama dengan Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg), NP berisi CDDP-Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/ kg), masing-masing. Tumor diperoleh 12 hari setelah perawatan obat. Ukuran tumor dideteksi setiap 2 hari untuk menentukan kandungan penghantaran obat yang paling optimal. Seperti yang ditunjukkan pada kurva pertumbuhan tumor (Gbr. 6), tren pertumbuhan tumor dari kelompok kontrol serta kelompok nanopartikel kosong serupa tetapi terdapat penghambatan tumor yang menonjol pada tiga kelompok lainnya dengan penghantaran obat. Dibandingkan dengan grup CDDP gratis, grup CDDP plus Tet gratis menunjukkan kemanjuran antitumor yang lebih baik selama 6 hari pertama. Namun, setelah 6 hari, perbedaan tingkat penghambatan tumor antara kedua kelompok mulai menyempit dan setelah 10 hari, CDDP plus Tet gratis memiliki efek antitumor yang lebih buruk.

Volume tumor H₂₂ xenografts pada tikus ICR selama terapi di bawah perawatan yang berbeda. Tikus diperlakukan dengan strategi yang berbeda pada hari ke 0 seperti yang ditunjukkan pada gambar:3 mg/kg CDDP gratis, CDDP gratis bersama dengan Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg), dan NP yang dimuat CDDP-Tet ( CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), masing-masing. Berarti ± SD (n = 6) setiap kelompok diukur

Selama 6 hari pertama, efek antitumor dari kelompok NP CDDP plus Tet dan CDDP Tet-loaded gratis serupa. Oleh karena itu, murine yang menerima NP CDDP-Tet-loaded menunjukkan kemanjuran antitumor yang lebih baik sejak hari ke-6 setelah pengobatan. File tambahan 1:Gambar S3a menampilkan ukuran tumor yang berbeda dari setiap kelompok. Volume tumor dari kelompok NP yang dimuat CDDP-Tet adalah yang terkecil, yang dapat dianggap sebagai refleksi langsung dari efek antitumor yang menonjol. Selain kapasitas penghambatan tumor, dibandingkan dengan kelompok CDDP gratis atau CDDP gratis plus Tet, ada lebih sedikit pembuluh darah yang terletak di permukaan tumor). Demikian pula, seperti yang ditunjukkan pada file tambahan 1:Gambar S3b, kepadatan vaskular adalah yang terendah pada kelompok NP relatif terhadap kelompok kontrol dan CDDP bebas ditambah kelompok Tet.

Untuk menyelidiki lebih lanjut rasio sel apoptosis dalam jaringan tumor in vivo, uji TUNEL dilakukan untuk mendeteksi sel apoptosis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, sel-sel apoptosis pada tumor dapat diwarnai dengan fluoresensi hijau untuk menunjukkan apoptosis. Gambar yang digabungkan menunjukkan lebih sedikit daerah fluoresen hijau pada kelompok kontrol dan kelompok CDDP plus Tet Gratis, yang menunjukkan adanya lebih sedikit sel apoptosis. Selain itu, sejumlah besar daerah fluoresen hijau diamati pada kelompok yang diobati dengan CDDP-Tet NP, yang menunjukkan sejumlah besar sel apoptosis. Hasilnya menegaskan bahwa CDDP-Tet NPs dapat mempromosikan apoptosis tumor in vivo.

Sel-sel apoptosis dideteksi dengan uji TUNEL (hijau) dan diwarnai dengan pewarnaan nuklir DAPI (biru)

Selain kemanjuran antitumor yang lebih baik daripada CDDP gratis dan CDDP gratis plus kelompok Tet, NP yang dimuat CDDP-Tet juga menunjukkan lebih sedikit efek samping. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8a, CDDP gratis dan CDDP gratis plus Tet menyebabkan penurunan berat badan yang signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol, yang menunjukkan toksisitas dengan pemberian obat langsung. Kurva perubahan berat kelompok NP kosong serupa dengan kelompok kontrol, menunjukkan toksisitas NP kosong dapat diabaikan. Penurunan berat badan yang disebabkan oleh NP yang dimuat CDDP-Tet dan kelompok kontrol sebanding selama 6 hari pertama. Dari hari ke-6 sampai hari ke-12, tingkat berat badan murine pada kelompok NPs sedikit lebih rendah dari pada kelompok kontrol, tetapi lebih tinggi dari CDDP gratis atau CDDP gratis ditambah kelompok Tet. Perlu dicatat bahwa CDDP plus kelompok Tet gratis berkontribusi pada penurunan berat badan yang nyata dan penurunan nafsu makan tikus selama 4 hari pertama, yang menunjukkan bahwa penyerapan obat berbahaya bagi seluruh tubuh. Sebaliknya, NP CDDP-Tet-loaded dapat dilepaskan perlahan-lahan di jaringan dan mempertahankan konsentrasi ke tingkat yang stabil; oleh karena itu, efek sampingnya jelas lebih rendah dibandingkan dengan pemberian obat langsung. Kemudian, efek samping pengobatan juga dievaluasi dengan biopsi hati (Gbr. 8b). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, batas antara sel-sel hati dari kelompok obat telanjang obat ganda kabur, beberapa sel hati mengalami perubahan yang menggelembung, badan sel menyusut, piknosis nuklir, dan peningkatan eosinofilia (panah kuning), sedangkan obat ganda kelompok nanopartikel. Struktur sel punca normal, ruang antar sel jelas, dan tidak ada perubahan patologis yang jelas. Hasil ini menunjukkan ada sedikit gangguan yang disebabkan oleh pengiriman NP.

Evaluasi efek samping a berat badan H₂₂ xenografts pada tikus ICR selama terapi di bawah perawatan yang berbeda. b Spesimen hati yang diwarnai HE pada pengamatan mikroskopis cahaya (400 ×)

PET–CT

Untuk lebih membandingkan efek terapi in vivo dari masing-masing kelompok, tikus menjalani CT, PET/CT scan pada hari ke-6 setelah pengobatan. Gambar perpaduan CT dan PET scan ditampilkan pada Gambar. 9. PET/CT adalah metode yang efisien dalam mencerminkan perubahan metabolik melalui ¹⁸ Deteksi serapan FDG [21]. As shown in CT scan (Fig. 9), the tumor volume of free CDDP plus Tet group and CDDP-Tet-loaded NPs group were comparable (Fig. 9a) but the tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group was significantly higher than NPs group (Fig. 9b). The decreased intensity at the tumor site of the murine received CDDP-Tet-loaded NPs symbolized poor metabolism rate of the tumor, and thereby indicating the capability of NPs to retard tumor growth.

Male ICR mice bearing a subcutaneous H₂₂ tumor at the left axillary (arrows). CT, PET and fused PET/CT images are arranged in the figure from left to right. Tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group (blue arrow) was significantly higher than NPs group (yellow arrow)

Diskusi

Considering the heterogeneity and complexity of tumor, combination therapy has become a standard strategy in the clinical treatment of tumor [22]. Nevertheless, simple combination of two individual therapeutics can't necessarily reach anticipated effect because of the different physicochemical and pharmacokinetic properties of the two drugs [23]. To deliver different drugs to tumor cells in a synergistic ratio, a combination therapy vehicle has been designed in this study. CDDP is hydrophilic while Tet is hydrophobic, which cause problems for the loading method. In this study, we used the amphiphilic copolymer with PCL as the hydrophobic core and PEG as the hydrophilic corona [14]. By the improved double emulsion method, Tet located in the oil layer and CDDP located in the water layer, the unique structure imparts the NPs with the capacity to simultaneous encapsulation of Tet and CDDP to form NPs. CDDP and Tet are located in different layers of NPs, resulting in low interfering effect and high stability [24].

The combination therapy vehicle loaded with CDDP and Tet can enhance the efficacy of CDDP-Tet combination. Not only in the cellular experiments, CDDP-Tet NPs also significantly inhibit tumor tissue viabilities in the HDRA assays, validating the anti-tumor effect of the NPs in the model which take into account of tumor microenvironment [19]. As to in vivo study, antitumor efficacy was observed in tumor volume change, which demonstrated that CDDP-Tet NPs effectively suppressed tumor growth with lower proliferation level. ¹⁸ FDG-PET/CT imaging revealed that the glucose metabolism of the tumors in the CDDP-Tet group was inhibited more prominently and early by inducing higher apoptosis level of tumors, which was confirmed in the immunofluorescence assays [21]. Compared with free CDDP plus Tet, CDDP-Tet NPs are faster and safer to take effect, which can be explained by the three mechanisms as follows.

Firstly, as a lipid-soluble drug, Tet can hardly distribute in the ECM and therefore rarely diffuse around tumor cells [9]. Located in the oil phase of NPs, Tet is endowed with better solubility and bioavailability, reaching the tumor sites in the same synergistic ratio as CDDP. Furthermore, CDDP, which used to have systemic side effect, once carried by the nanoparticle, can easily reach the interstitium of tumor tissues from leaky tumor blood vessels and be held within the tumor on account of pressure made by destitute lymphatic drainage [25]. The more CDDP tumor tissues hold, the less damage will be done to normal organs. As a result of passive targeting strategies, CDDP-Tet NPs are much safer than free CDDP plus Tet, which can be observed in the murine body weight changes and liver biopsies.

Drug resistance is regarded as one of the greatest challenges in cancer treatment, not only because of genetic changes at the level of a single cell, but also due to tumor tissues and microenvironment [26]. On one hand, Tet is alkaline, so it will be protonated in the acidic tumor microenvironment and thus can’t cross the electronegative tumor cytomembranes, which is called pH-induced physiological drug resistance [27]. On the other hand, large distances between blood vessels in solid tumors and high interstitial fluid pressure contribute to limited distribution of CDDP and Tet [28]. Carried by the nanovehicle, Tet can enter tumor cells via endocytosis without influence of tumor microenvironment, overcoming the pH-induced physiological drug resistance. The small size of nanocarriers allows them to enter tumor vasculature and preferentially accumulating at the tumor site in vivo [29, 30].

In summary, this study represents an example of delivering a chemotherapeutic drug along with a chemosensitizer simultaneously. Carried by the NPs, both drugs are targeted to tumor site passively, reducing systemic toxicity. Besides, NPs offer a solution to physiological drug resistance by helping the chemosensitizer enter tumor cells more and faster, which play an important role in improving the efficacy of tumor chemotherapy. Therefore, we believed that this PEG–PCL block copolymeric NPs could be a promising carrier for combined chemotherapy.

Conclusions

Based on our previous studies [8, 14, 16], this paper investigated the application of PEG–PCL/HO-PCL NPs for delivery of the combination of two drugs with different physicochemical properties. For in vitro studies, NPs exhibited superior antitumor effect with great biocompatibility. Enhanced antitumor efficacy was observed in tumor volume change and ¹⁸ FDG-PET/CT Imaging as to in vivo study in murine model. The mice in NPs group also exhibited reduced side effects. Additionally, the apoptosis rate of tumor cells was promoted by NPs in both in vitro and in vivo studies. In summary, this block copolymeric NPs could be a promising carrier for the delivery of Cisplatin–Tetradrine combinations and other combinations, with enhanced antitumor effect and reduced toxicity, for the treatment of cancer.