Nanopartikel Terbiodegradasi Responsif Tumor untuk Citra Kanker Payudara Multi-Modus

Hasil dan Pembahasan

Sintesis dan Karakterisasi Na₂CO₃/Fe₃O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs dirancang sebagai agen kontras multi-mode yang ditargetkan RGD dengan mengenkapsulasi polimer biocompatible PLGA dengan Fe₃O₄ dan Na₂CO₃ dan agen terintegrasi integrin melalui ikatan kimia yang dapat terbiodegradasi (Skema 1b).

Citra mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs adalah bola jelas dengan partikel oksida besi yang terdistribusi secara seragam terlihat dalam cangkang (Gambar 1a). Ukuran hidrodinamis rata-rata NPs diukur sebesar 117,6 nm oleh pencaharan cahaya dinamis, dan indeks polidispersi rata-rata adalah 0,234 (Gambar 1b). Muatan permukaan NPs dikonfirmasi oleh pengukuran potensi zeta sebesar −21,7 mV (Gambar 1c). Pengukuran spektrum fluoresensi mengungkapkan bahwa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD memiliki panjang gelombang emisi maksimum pada 685 nm, menunjukkan bahwa Cy5.5 berhasil terkapsulasi dalam inti PLGA (Gambar 1d). Nilai magnetisasi jenuh untuk Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD dan NP Fe₃O₄ bebas masing-masing 32,6 dan 42,5 emu/g (Gambar 1e). Temuan ini menunjukkan karakteristik superparamagnetik nanopartikel pada suhu kamar. Spektra FTIR Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD menunjukkan bahwa getangan gerangan N-H dan puncak serapan –OH muncul sekitar 3432 cm⁻¹. Selain itu, kami menemukan peningkatan (1628 cm⁻¹) dari getangan gerangan C = O. Dibandingkan dengan NP yang tidak ditargetkan, puncak karakteristik (karboxil) pada 1735 cm⁻¹ dari NP yang ditargetkan berkurang secara signifikan. Hasil menunjukkan ikatan antara grup karboxil pada permukaan mikrosfer dan grup amino pada peptida RGD. Ikat in vitro Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs ditampilkan pada Gambar 1f.

Citra TEM (a) Distribusi ukuran (b) Potensi zeta (c) dari Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. d Spektrum emisi fluoresensi Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD dan Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/cRGD NPs. e Kurva histeresis magnetik Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs dan NP Fe₃O₄. f Spektra FTIR dari Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD yang ditargetkan dan NP PLGA yang tidak ditargetkan

Ikat in vitro Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD NPs

Integrin αvβ3 umumnya ekspresi tinggi pada sel endotel tumor kanker payudara dan dapat mempromosikan metastasis tumor [33,34,35,36]. Imunofluoresensi seluler untuk ekspresi integrin αv dalam sel MDA-MB-231 jauh lebih tinggi dari pada sel MCF-7; sel A549 berfungsi sebagai kontrol positif (Gambar 2a). Pengambilan seluler NP diteliti oleh CLSM (Gambar 2b). Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs menunjukkan tingkat ikatan yang jauh lebih tinggi pada sel MD-MB-231 dibandingkan dengan NP yang tidak ditargetkan. Citra fluoresensi juga mengungkapkan bahwa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs terikat pada citoplasma sel, dan citra gabungan menunjukkan lokasi yang sama dengan ekspresi integrin αv [37, 38].

a Citra fluoresensi konfokal dengan ekspresi integrin αv pada sel MB231, A549, dan Mcf-7. Biru dan hijau mewakili DAPI dan fluoresensi αv, masing-masing. b Citra fluoresensi konfokal sel MB231 yang diinkubasi dengan Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs yang ditargetkan dan NP yang tidak ditargetkan. Biru, merah, dan hijau, mewakili DAPI, Cy5.5, dan fluoresensi αv, masing-masing. c Viabilitas relatif sel MB231 yang diinkubasi dengan berbagai konsentrasi Fe₃O₄/Na₂CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs

Uji Sitotoksisitas

Sitotoksisitas in vitro Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs diperkirakan dalam sel MDA-MB-231 menggunakan uji CCK8, sementara sel A549 dan MCF-7 yang dirawat dengan NP digunakan sebagai kontrol (Gambar 2c). Dalam rentang konsentrasi Fe 5–80 μg/mL, viabilitas sel A549 dan MB231 tidak berkurang secara signifikan, dan keduanya di atas 70%. Sebaliknya, sel MCF-7 menunjukkan penurunan yang signifikan dalam viabilitas sel menjadi sekitar 50% pada konsentrasi Fe yang lebih tinggi dari 40 μg/mL. Hasil CCK8 menunjukkan bahwa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs menunjukkan sitotoksisitas yang jauh lebih rendah dalam sel MDA-MB-231 dalam rentang konsentrasi tertentu.

Citra kontras in vitro

Kami menggunakan fantom agar gel untuk mempelajari performa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs in vitro pada berbagai nilai pH (Gambar 3a). Citra kontras ultrasonografi Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs signifikan ditingkatkan pada pH weakly acidic (pH 6,8) dibandingkan dengan pH 7,2, mungkin karena pH 7,2 tidak menghasilkan cukup gelembung CO₂ untuk citra ultrasonografi. Sebaliknya, ketika NP berada dalam lingkungan weakly acidic, cukup gelembung dapat dihasilkan untuk citra ultrasonografi. Karakteristik ini relevan dengan tumor, yang menunjukkan heterogenitas jaringan yang tinggi dan berbagai tingkat pH (pH 6,8–7,2) in vivo [32, 39, 40]. Intensitas sinyal citra ultrasonografi kemudian dianalisis (Gambar 3b). Rasio intensitas sinyal dari grup NP non-target (pH = 7), NP non-target (pH = 5), NP target (pH = 7), dan NP target (pH = 5) relatif terhadap intensitas sinyal grup kosong adalah 112%, 145%, 167%, dan 178 ± 4%, masing-masing, yang jelas menunjukkan bahwa grup NP target (pH = 5) memiliki sinyal US terkuat.

a Citra ultrasonik NP target dan non-target yang direkam pada berbagai nilai pH (7,2 dan 6,8), PBS sebagai kontrol. b Rasio intensitas sinyal dihitung dengan sampel/kosong, sampel mewakili intensitas ekos dari NP target dan non-target, dan kosong mewakili intensitas ekos PBS. c Citra MR T2-weighted Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs dengan berbagai konsentrasi Fe (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, dan 1 mM). d Relativitas melintang (r2) adalah 19,597 mM⁻¹ s⁻¹ untuk Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs

Untuk studi MRI in vitro, seiring meningkatnya konsentrasi Fe dalam Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs, intensitas sinyal citra T2-weighted menunjukkan penurunan yang signifikan, yang menunjukkan kemungkinan penggunaan NP ini sebagai agen kontras MR T2 (Gambar 3c). Laju relaksasi melintang (r2) dari Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs dihitung sebesar 19,597 mM⁻¹ s⁻¹. Meskipun laju relaksasi melintang (r2) dari Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs lebih rendah dari pada banyak agen superparamagnetik MRI lainnya, komposisi Fe₃O₄ dapat meningkatkan r2, yang 2,94 kali lebih tinggi dari pada r2 partikel SPIO yang digunakan secara klinis.

Citra kontras ultrasonografi Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs

Untuk menunjukkan potensi Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs untuk citra ultrasonografi tumor, kami memberikan injeksi vena ekor Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs ke tikus nude xenograft kanker payudara dan memantau citra ultrasonografi sebagai fungsi waktu (Gambar 4a). Sebelum injeksi, citra tumor, hati, dan area subkutan direkam. Segera setelah injeksi, area jaringan tumor tidak menunjukkan peningkatan kontras apa pun. Peningkatan area tumor diamati mulai 30 menit setelah injeksi dan berlangsung selama 90 menit. Hasil ultrasonografi in vivo menunjukkan bahwa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/ RGD NPs menghasilkan cukup gelembung di jaringan tumor asam untuk menghasilkan refleksi ekos untuk citra ultrasonografi. Sebagai kontrol, kami juga mendapatkan citra hati dan jaringan subkutan pada berbagai waktu setelah injeksi NP yang ditargetkan. Sepanjang periode pengamatan, tidak ada peningkatan signifikan yang ditemukan di area injeksi subkutan, dan peningkatan di hati, yang menurun seiring waktu, secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan pada tumor (Gambar 4b). Hasil ini menunjukkan bahwa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs yang beredar dalam tubuh pada pH fisiologis tidak menghasilkan sejumlah besar gelembung CO₂ untuk peningkatan kontras ultrasonografi.

a Citra ultrasonografi in vivo tumor, hati, dan area subkutan pada berbagai waktu setelah injeksi Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. b Rasio intensitas ekos sebagai fungsi waktu dihitung dengan jaringan/kosong, jaringan mewakili intensitas ekos tumor, hati, atau area subkutan, kosong mewakili intensitas ekos sebelum injeksi

MRI Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs

Untuk MRI in vivo, untuk menunjukkan bahwa NP dapat digunakan untuk citra tumor spesifik, Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs diinjeksi langsung ke dalam tumor dan otot. Hasil menunjukkan bahwa area tumor menunjukkan penurunan yang signifikan dalam kontras T2-MR setelah injeksi NP yang ditargetkan, dan intensitas sinyal berkurang secara signifikan dari 8875 pada 0 menit menjadi 5972 pada 120 menit setelah injeksi (Gambar 5a, b). Namun, dengan jumlah nanoparticle yang sama, area otot subkutan menunjukkan penurunan sinyal T2 yang jauh lebih rendah. Temuan ini menunjukkan efektivitas Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs dengan agen kontras T2-MR target integrin yang hipersensitif untuk digunakan dalam citra target tumor. Dalam grup injeksi vena ekor, citra T2-MR juga menunjukkan penurunan kontras yang jelas dalam tumor pada 24 jam pasca-injeksi, yang menunjukkan akuisisi tumor yang tinggi dari Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs (Gambar 5c, d). Selain itu, penurunan sinyal T2 diamati di hati dan ginjal, menunjukkan bahwa ion besi dalam NP dapat dengan cepat dibersihkan dari tubuh. Oleh karena itu, MRI mengungkapkan bahwa nanoparticle Fe₃O₄ yang dibungkus PLGA menunjukkan targetisasi tumor pasif yang efisien melalui efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR), terutama targetisasi yang di-mediakan RGD, tetapi dapat terdekomposisi dan dibuang dengan cepat in vivo.

a Citra T2-MR in vivo jaringan subkutan normal dan tumor sebelum dan setelah injeksi Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. b Intensitas sinyal rata-rata dalam otot dan tumor untuk injeksi Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. c Citra T2-MR axial dan koronal tikus dengan tumor MDA-MB-231 sebelum dan setelah injeksi intravena Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. d Rasio intensitas sinyal dihitung dengan jaringan/otot, jaringan berdiri untuk intensitas sinyal tumor, hati, dan ginjal sebelum dan setelah injeksi NP yang ditargetkan, otot berdiri untuk intensitas sinyal otot pada waktu yang sama

Citra fluoresensi dan histologi

Dua ratus mikroliter NP diinjeksi secara intravena ke dalam tikus untuk citra fluoresensi in vivo. Dalam grup yang diinjeksi dengan NP yang ditargetkan RGD, sinyal fluoresensi Cy5.5 secara bertahap meningkat di area tumor dan mencapai puncak pada 4 jam setelah injeksi, menunjukkan bahwa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs dapat secara efektif mengakumulasi di tumor. Dalam grup yang tidak ditargetkan, NP terdistribusi di seluruh tubuh setelah injeksi dan dengan cepat dibersihkan, dan mereka tidak mengakumulasi di tumor untuk waktu yang lama (Gambar 6a). Tikus kemudian dibedah, dan organ utama serta tumor dikumpulkan untuk citra fluoresensi in vitro, yang mengungkapkan akuisisi tumor yang tinggi dari NP yang ditargetkan (Gambar 6b, c). Intensitas fluoresensi Cy5.5 dalam tumor tikus yang diinjeksi dengan NP yang ditargetkan adalah 1,5 kali dari pada tikus yang diinjeksi dengan NP yang tidak ditargetkan.

a Citra fluoresensi in vivo hewan pada 0, 0,5, 1, 2, dan 3 jam pasca-injeksi setelah injeksi NP yang ditargetkan dan yang tidak ditargetkan. b Citra fluoresensi ex vivo tumor dan organ utama (hati, limpa, paru-paru, jantung, dan ginjal) yang dikumpulkan dari hewan. c Intensitas fluoresensi rata-rata berbagai organ dan tumor

Selanjutnya, targetisasi spesifik tumor Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs diverifikasi oleh citra fluoresensi jaringan dari bagian tumor beku (Gambar 7a). Pewarnaan imunofluoresensi bagian tumor dengan antibodi terhadap integrin αv dan β3 mengungkapkan ekspresi yang signifikan integrin αvβ3 dalam jaringan tumor. Fluoresensi αv dan β3 integrin digabungkan dengan fluoresensi Cy5.5 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs untuk mendapatkan citra pewarnaan imun yang mengungkapkan kolokalisasi. Hasil imunofluoresensi dalam jaringan tumor menunjukkan bahwa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs secara spesifik terikat pada integrin αvβ3 dalam kanker payudara ganas MB231. Selain itu, pewarnaan H&E Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs dibandingkan dengan grup yang tidak ditargetkan menunjukkan bahwa semua bagian jaringan organ memiliki morfologi patologis normal dan tidak ada respons kerusakan histopatologis (Gambar 7b). Semua hasil di atas dari analisis sitotoksisitas dan histologi menunjukkan bahwa Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs tidak menyebabkan toksisitas yang signifikan pada jaringan organ utama in vivo, dan biokompatibilitas yang baik dapat dengan wajar diatribusikan pada PLGA.

a Citra fluoresensi bagian tumor beku MDA-MB-231 dari tikus yang diinjeksi dengan NP yang ditargetkan dan yang tidak ditargetkan. Hijau, merah, ungu, dan biru mewakili fluoresensi αv, β3, Cy5.5, dan DAPI, masing-masing. b Irisan tumor yang dipewarnai H&E yang dikumpulkan dari tikus setelah injeksi NP yang ditargetkan dan yang tidak ditargetkan

Kesimpulan

Secara kesimpulan, hasil di atas menunjukkan pendekatan yang kreatif dan sukses untuk MRI kanker payudara melalui sistem targetisasi magnetik dan sistem menghasilkan gas yang diaktifkan di mikroenvironment tumor. Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs menunjukkan performa citra yang baik dan biokompatibilitas yang baik dalam mode citra MR/ultrasonografi/fluoresensi. Karya kami menunjukkan potensi yang kuat untuk diagnosis tumor dengan citra multi-mode yang ditingkatkan.

Bahan dan Metode

Bahan

Poly (laktat-ko-glikolat asam) (PLGA) (laktida:glikolida = 75:25, Mw = 20.000), pigmen Cyanine5.5, dan alkohol polyvinyl (PVA) dibeli dari Sigma-Aldrich Company (Shanghai, China). Peptida RGD disesuaikan dan disintesis oleh GenicBio BioTech Co. Ltd. (Shanghai, China). Nanopartikel Fe₃O₄ dan natrium karbonat (Na₂CO₃) dibeli dari Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, China). Klorida metilena (CH₂Cl₂) dan dimetil sulfoksida (DMSO) diperoleh dari Solarbio Company (Beijing, China). Semua kimia adalah kelas analitis.

Sintesis Nanopartikel Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD

Pertama, 12,5 mg PLGA dan 0,25 mL kloroform dicampur bersama. Kemudian, 5 μL Cy5.5, 15 μL nanopartikel magnetik yang dimodifikasi asam oleat yang disperdi dalam kloroform (OA@Fe₃O₄, 10 mg/mL), 5 μL natrium karbonat (Na₂CO₃), dan 1,5 mL larutan PVA 1% ditambahkan secara berurutan dan diemulsikan dengan prosesor ultrasonik selama 2 menit. Kemudian, 12,5 mL larutan PVA 0,3% ditambahkan dan diaduk selama 3–4 jam pada suhu kamar, dan 12,5 mL larutan PVA 0,4% ditambahkan untuk diaduk (500 rpm/min) selama malam untuk menghilangkan sisa pelarut organik. Larutan di atas melalui beberapa kali pencucian ultrafiltirasi dengan ddH₂O dan kemudian dicairkan dengan larutan penampang PB (pH = 7,4) hingga volume akhir 1,25 mL. Selanjutnya, 0,25 mg EDC dan 1,25 mg NHS ditambahkan ke dalam larutan campuran di atas. Campuran diaduk selama 30 menit pada 25 °C kemudian dicuci tiga kali dengan ultrafiltirasi dan di-resuspend dalam larutan penampang PB (pH = 7,4). Selanjutnya, 1,25 mg cRGD ditambahkan ke dalam larutan dan diaduk pada 4 °C selama malam. Untuk menghilangkan EDC, NHS, dan sisa cRGD apa pun, larutan transparan difilter melalui tabung ultrafiltirasi. Terakhir, NP Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD di-resuspend dalam 1,25 mL air deionisasi dan disimpan pada 4 °C.

Karakterisasi Nanopartikel

Diameter dinamis dan potensi zeta nanoparticle diukur oleh Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK). Morfologi nanoparticle diperoleh menggunakan mikroskop elektron transmisi FEI Tecnai F20. Muatan Cy5.5 dicatat oleh spektrometro fluoresensi Hitachi F-7000. FTIR dilakukan menggunakan spektrometro inframerah transformasi Fourier (Alpha II, Bruker, Swiss). Magnetometer getaran (VSM, Lake Shore 7410) diterapkan untuk menentukan kurva histeresis nanoparticle dan Fe₃O₄ bebas.

Sel dan Hewan

Sel kanker payudara manusia MDA-MB-231 diberikan dengan baik oleh Bank Sel Stem, Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok. Sel dipertahankan pada 37 °C dalam 95% udara dan 5% CO₂. Tikus BALB/c betina (4 minggu) dibeli dari Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. dan dipertahankan sesuai protokori yang disetujui oleh Pusat Laboratorium Hewan Universitas Kedokteran Guangxi. Percobaan hewan dilakukan sesuai Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium, yang diterbitkan oleh Komite Etika Hewan Pusat Laboratorium Hewan, Universitas Kedokteran Guangxi. Sel kanker payudara MDA-MB-231 ditransplantasi ke sisi kanan flank tikus BALB/c (2 × 10⁶ dalam 200 μl sel per tikus) dan diizinkan untuk tumbuh selama 10–14 hari (diameter rata-rata 5 mm) sebelum citra.

Ekspresi Seluler Integrin αv

Imunofluoresensi seluler dilakukan untuk mengonfirmasi ekspresi tinggi integrin αv dalam sel MDA-MB-231. Sel A549 dan MCF-7 digunakan sebagai kontrol. Sel ditanam pada piring kultur kaca dasar 35 mm (MatTek, USA) pada 2 × 10⁴ sel mL⁻¹ selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel diperbaiki selama 20 menit pada suhu kamar dengan paraformaldehida 4%. Kemudian, sel diinkubasi dengan antibodi monokal rabbit anti-integrin αv (ab179475, Abcam) pada 4 °C selama malam dan antibodi IgG rabbit selama 1 jam pada suhu kamar. Akhirnya, sel dipewarnai dengan DAPI. Citra diperoleh oleh mikroskop laser konfokal (TCS SP8, Leica, Jerman).

Untuk menilai efektivitas targetisasi nanoparticle, studi pengambilan seluler dilakukan dengan menggunakan mikroskop laser konfokal (CLSM). Sel ditanam pada piring kultur kaca dasar 35 mm (MatTek, USA) pada 2 × 10⁴ sel mL⁻¹ selama 24 jam. Kemudian, sel diinkubasi dengan NP yang ditargetkan RGD (30 μg mL⁻¹, 0,5 mL) pada pH 7,4 selama 2 jam, dan NP yang tidak ditargetkan digunakan sebagai kontrol. Setelah inkubasi, sel diperbaiki dengan paraformaldehida 4% selama 20 menit dan kemudian diinkubasi dengan antibodi αv. Dengan kolokalisasi, kami memverifikasi ikatan targetisasi nanoparticle pada integrin pada sel.

Uji CCK8

Biokompatibilitas nanoparticle Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD dievaluasi oleh studi sitotoksisitas. Sel MDA-MB-231, A549, dan MCF-7 ditanam pada papan 96-lubang pada 5 × 10³ sel mL⁻¹ selama 24 jam. Kemudian, 0,1 mL suspensi NP Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD pada konsentrasi Fe 5, 10, 20, 40, dan 80 μg/mL ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi selama 24 jam. Akhirnya, 10 μL larutan CCK8 ditambahkan, dan suspensi diinkubasi selama 1 jam lagi. Hasil ditentukan oleh pembaca mikropapan (Thermo Scientific, USA) pada 450 nm.

Citra ultrasonografi dengan peningkatan kontras

Citra ultrasonografi nanoparticle dilakukan dengan menggunakan sistem ultrasonografi Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Kanada). NP yang ditargetkan RGD dan yang tidak ditargetkan ditambahkan ke model agar, dan PBS digunakan sebagai kontrol. Citra direkam dalam mode B dan mode CEUS dengan berbagai larutan penampang pH 7,2 dan 6,8. Area minat digambar, dan nilai abu-abu rata-rata diukur dalam citra mode B.

Untuk citra ultrasonografi in vivo, tikus dianestesikan dengan isoflurane 2% (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China), dan suhu tubuh dijaga pada 37 °C dengan selang pemanas. Total 200 μL NP yang ditargetkan RGD diinjeksi melalui vena ekor. Hewan kontrol menerima injeksi subkutan dengan jumlah NP yang sama. Citra ultrasonik direkam dengan transducer 7-MHz untuk terus-menerus mendapatkan citra ultrasonik tumor, hati, dan area subkutan. Zona fokus akustik ditempatkan di pusat tumor dengan potongan lintasan terbesar, dan bidang pandang yang berisi tumor dan jaringan di dekatnya diperoleh.

Citra resonansi magnetik

Uji MRI Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs dilakukan menggunakan MR 3,0 T (GE Healthcare, USA) dan coil hewan (RF TECH LIMITED, China). NP dengan berbagai konsentrasi Fe 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5, dan 1 mM dipindai dalam tabung Eppendorf 1 mL, dan PBS digunakan sebagai kontrol. MRI T2 dilakukan untuk setiap tabung dengan urutan T2-weighted FSE (tebal iris 3 mm, TR/TE 2000/74,4 ms, FOV 8 × 8 cm, dan matriks 320 × 256). Relaxivitas (r2) dihitung dengan fitting linier dari waktu relaksasi invers sebagai fungsi konsentrasi Fe.

Untuk MRI in vivo, tikus dibagi secara acak ke dalam dua grup (n = 3) untuk pemindaian MR yang menerima (1) injeksi lokal Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs dalam jaringan otot subkutan dan tumor atau (2) injeksi vena ekor Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs. Citra dasar tikus diambil sebelum injeksi nanoparticle. Untuk grup satu, jumlah NP yang sama diinjeksi ke dalam jaringan subkutan dan tumor, dan pemindaian MRI dilakukan setiap 30 menit untuk merekam transisi sinyal jaringan. Untuk grup dua, citra tumor dilakukan dalam posisi axial dan koronal, dan parameter MRI sama dengan yang digunakan untuk citra in vitro. Intensitas sinyal (SI) dalam area minat (ROI) diukur dan dibandingkan dengan sinyal jaringan pada berbagai waktu sebelum dan setelah injeksi.

Citra fluoresensi tumor

Untuk citra fluoresensi in vivo, sistem citra fluoresensi in vivo (FX PRO, Bruker, Swiss) digunakan untuk pemindaian, dan tikus dibagi secara acak ke dalam dua grup (n = 3): (1) NP yang ditargetkan RGD dan (2) NP yang tidak ditargetkan. Citra diambil setiap 30 menit selama periode 4 jam setelah injeksi. Selanjutnya, organ penting dan tumor dipanen dan dicitrakan, dan distribusi fluoresensi dalam organ tubuh diamati. Analisis kuantitatif intensitas fluoresensi dilakukan menggunakan perangkat lunak citra molekuler (Bruker, Swiss). Organ penting ini kemudian melalui pewarnaan H&E untuk mengevaluasi toksisitas jaringan. Irisan tumor beku juga melalui pewarnaan imunofluoresensi dengan antibodi terhadap integrin αv dan integrin β3.

Ketersediaan Data dan Bahan

Kesimpulan yang dibuat dalam naskah ini berdasarkan data yang semua disajikan dan ditampilkan dalam artikel ini.

Singkatan

Cy5.5:

Sulfo-Cyanine5.5 NHS ester

DAPI:

4′,6-diamidino-2-phenylindole

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimida hidroklorida

FSE:

Fast spin echo

MR:

Resonansi magnetik

NHS:

N-hidroksisuksinimida

PB:

Penampang fosfat

PBS:

Larutan penampang fosfat garam

PEG:

Polietilena glikol

PVA:

Alkohol polyvinyl

RGD:

Arginin–glisin–aspartat

TE:

Waktu echo

TR:

Waktu repetisi