Meningkatkan Selektivitas Transduktor Amperometrik dengan Film Nanoskala Polifenilendiamin

Latar Belakang

Biosensor menawarkan alternatif hemat biaya terhadap kromatografi, spektroskopi, dan kolorimetri, namun seringkali ketinggalan dalam performa analitik. Penelitian saat ini dalam biosensorika berkembang pesat [1]. Menurut Asosiasi Internasional Peneliti dalam Kimia Dasar dan Terapan, biosensor adalah perangkat terintegrasi yang menggabungkan elemen pengenalan biologis dengan tranduser untuk memberikan analisis kuantitatif atau semi-kuantitatif [2]. Biosensor elektrokimia—amperometrik, potensiometrik, konduktometrik, dan impedimetrik—menyusun subgrup terbesar [3].

Deteksi selektif sangat penting saat menganalisis matriks biologis kompleks seperti serum darah, urin, atau cairan serebrospinal, di mana molekul endogen (asam askorbat, sittein, homosittein, asam urat, dopamin, glutatjon) dapat menghasilkan sinyal palsu. Selektivitas biosensor berasal baik dari reseptor biologis maupun tranduser; enzim dan antibodi secara inheren selektif, sedangkan elektroda biasanya tidak selektif. Oleh karena itu, strategi untuk melindungi elektroda dari interferensi adalah penting.

Ada dua strategi utama: menurunkan potensi operasi atau menambahkan membran semipermeable yang memungkinkan analit target sambil menolak interferensi yang lebih besar [4]. Depoisi film polimer nanostruktur sederhana dan minimal mempengaruhi performa sensor. Di antara membran polimer, turunan fenilendiamin (PD) telah menarik perhatian untuk arsitektur nanoporos yang memungkinkan difusi peroksida hidrogen sambil memblokir spesies yang lebih besar [5]. Film polifenilendiamin (PPD) menunjukkan pori yang mengakomodasi molekul kecil seperti H₂O₂ namun mengecualikan molekul yang lebih besar seperti asam askorbat atau dopamin, sehingga meningkatkan akurasi sensor. Pekerjaan sebelumnya telah menjelajahi isomer PD yang berbeda dan metode polimerisasi; meta-PD (m-PD) umumnya menghasilkan membran yang paling permeabel namun selektif, terutama ketika ditetapkan oleh voltametri siklus [6–9]. Studi terbaru juga menunjukkan membran berbasis PD dalam sensor non-enzim, misalnya, untuk deteksi albumin serum sapi melalui pemadaman fluoresensi [10].

Tujuan kami adalah untuk membandingkan dua teknik depoisi umum—voltametri siklus dan elektropolimerisasi potensial konstan—dan mengidentifikasi protokol optimal untuk membuat membran PPD pada elektroda disk platinum.

Metode

Bahan

Asam askorbat, sittein, asam urat, dopamin, peroksida hidrogen, m-fenilendiamin, dan HEPES dibeli dari Sigma-Aldrich (USA). Sampel serum manusia diperoleh dari Kyiv Municipal Scientific and Practical Center of Nephrology and Hemodialysis (Ukraina).

Desain Transduktor Amperometrik

Elektroda disk platinum khusus difabrikasi dengan menutup kawat platinum diameter 0,4 mm, panjang 3 mm ke dalam kapiler kaca diameter luar 3,5 mm. Ujung kawat yang terpapar berfungsi sebagai permukaan kerja. Ujung kawat dalam disolder ke kawat perak menggunakan logam Wood dan terhubung ke potensiostat. Sebelum penggunaan, elektroda dibersihkan dengan HCl 30 s, dicuci dengan etanol, dan dipoles dengan kertas asap P1500.

Metode Pengukuran

Spektrum serapan difusi UV-vis dicatat pada spektrometer Thermo Evolution 600 (200–900 nm) menggunakan standar Spectralon. Pengukuran elektrokimia menggunakan sel tiga elektroda standar (kerja, kawat platinum pembantu, Ag/AgCl referensi) yang terhubung ke potensiostat PalmSens dengan multiplexer 8-saluran. Kromoamperometri dilakukan pada 0,6 V vs. Ag/AgCl dalam 10 mM HEPES (pH 7,4) dengan sel kaca 3 mL di bawah pengadukan berkelanjutan. Konsentrasi substrat disiapkan dengan menambahkan aliquat larutan stok (50 mM H₂O₂, 20 mM asam askorbat, 3 mM sittein, 4,5 mM asam urat, 2,1 mM dopamin). Fenilendiamin dilarutkan dalam larutan fosfat 40 mM (pH 7,4). Voltametri siklus menggunakan rentang sken 0–0,9 V pada 20 mV s⁻¹, langkah 5 mV. Semua eksperimen dilakukan tiga kali; data mewakili mean ± SD (OriginPro 8,5).

Hasil dan Pembahasan

Untuk menilai manfaat lapisan PPD, kami pertama mengevaluasi sensitivitas dan selektivitas dasar elektroda platinum telanjang terhadap peroksida hidrogen dan interferensi umum. Menggunakan tiga tingkat konsentrasi—(1) konsentrasi fisiologis (serum), (2) pencairan 20 kali, dan (3) pencairan 100 kali—kami amati bahwa dopamin dan asam askorbat menghasilkan sinyal terkuat, sedangkan sittein menghasilkan yang terlemah. Bahkan setelah pencairan 100 kali, respons interferensi masih sekitar 20 % dari sinyal H₂O₂, yang menunjukkan bahwa elektroda telanjang saja tidak cukup untuk sampel biologis kompleks.

Kami kemudian membandingkan dua strategi depoisi. Dalam metode CV, elektroda dipadati dengan sweeps potensial berurutan (CVA) dalam larutan PD 30 mM; setiap CVA memakan waktu ~2 menit. Dalam metode potensial konstan, elektroda dipegang pada +0,7 V selama 40 menit dalam larutan yang sama. Tabel 3 menunjukkan bahwa membran yang dibentuk oleh CV secara signifikan menekan interferensi (terutama sittein) dan meningkatkan sensitivitas H₂O₂ sebesar 2,6×, kemungkinan karena aktivasi permukaan platinum. Pendekatan potensial konstan tidak meningkatkan sensitivitas dan membutuhkan waktu depoisi yang lebih lama. Oleh karena itu, CV lebih disukai karena kecepatan, selektivitas, dan peningkatan sensitivitas, meskipun keterbatasannya adalah satu elektroda per sken.

Analisis spektroskopi mengonfirmasi pembentukan PPD: spektrum serapan difusi film menunjukkan pita intens pada 222 nm dan 315 nm (transisi π→π* seperti monomer) dan ekor lebar dari 400–800 nm yang mengindikasikan konjugasi yang diperluas dalam polimer.

Kami mengoptimalkan jumlah CVA dan konsentrasi PD. Satu CVA menghasilkan membran yang tidak cukup; meningkatkan menjadi tiga CVA menghapus respons dopamin dan asam urat sambil mempertahankan sensitivitas H₂O₂. Mengurangi PD menjadi 5 mM mempertahankan selektivitas untuk sampel cair tetapi mengakibatkan kinerja yang tidak baik pada matriks tidak dicerna. Konsentrasi 30 mM PD dengan tiga CVA menghasilkan penekanan interferensi yang lengkap dan respons H₂O₂ yang dapat diterima; konsentrasi lebih tinggi (>50 mM) membuat lapisan lebih tebal dan mengurangi sensitivitas.

Tes stabilitas menunjukkan bahwa membran mempertahankan selektivitasnya selama 2 jam operasi berkelanjutan, dengan sedikit peningkatan respons H₂O₂ dan penekanan interferensi yang lebih lanjut—kemungkinan karena penutupan pori oleh spesies yang lebih besar. Penyimpanan pada −18 °C selama 8 hari meningkatkan sensitivitas H₂O₂ sebesar 2,5× tanpa mempengaruhi penolakan interferensi, yang mengindikasikan pembengkakan lambat lapisan meningkatkan permeabilitas.

Akhirnya, aplikasi pada sampel biologis nyata (serum dan lisat neuron) menunjukkan bahwa elektroda yang tidak dimodifikasi menghasilkan sinyal berisik, sedangkan elektroda yang dimodifikasi PPD menunjukkan respons yang tidak signifikan, mengonfirmasi kesesuaiannya untuk matriks kompleks.

Kesimpulan

Elektropolimerisasi polifenilendiamin melalui voltametri siklus menawarkan cara yang cepat dan efektif untuk membuat membran semipermeable yang menekan interferensi pada tranduser amperometrik disk platinum. Tiga sken CV dalam 30 mM PD sepenuhnya menghilangkan dampak interferensi umum, sedangkan 5 mM PD cukup untuk sampel cair untuk mempertahankan sensitivitas H₂O₂ yang lebih tinggi. Membran yang dihasilkan tetap selektif selama setidaknya 2 jam operasi dan stabil setelah 8 hari penyimpanan beku. Temuan ini mendukung penggunaan elektroda yang dimodifikasi PPD dalam desain biosensor yang andal untuk cairan biologis kompleks.