Fabrikasi, Karakterisasi, dan Sitotoksisitas dari Cangkang Kerang Emas Terkonjugasi Berbentuk Bulat Berasal Kalsium Karbonat Nanopartikel untuk Aplikasi Biomedis
Abstrak
Evolusi nanomaterial dalam sains telah membawa peningkatan yang semakin meningkat di bidang nanoteknologi, biomedis, dan teknik. Penelitian ini bertujuan untuk fabrikasi dan karakterisasi nanopartikel kalsium karbonat terkonjugasi yang berasal dari cangkang kerang emas (Au-CSCaCO3 NP) untuk aplikasi biomedis. Teknik sintetik yang digunakan menggunakan metode reduksi nanopartikel emas sitrat dan metode pengendapan sederhana yang digabungkan dengan penggunaan mekanis dari pabrik bola rol yang dapat diprogram. Nanomaterial terkonjugasi hasil sintesis dikarakterisasi sifat fisikokimianya menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM), mikroskop elektron pemindaian emisi medan (FESEM) yang dilengkapi dengan sinar-X dispersi energi (EDX) dan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR). Namun, kerumitan mekanisme seluler dapat terbukti menantang untuk nanomaterial seperti Au-CSCaCO3 NP dan dengan demikian, kebutuhan untuk penilaian sitotoksisitas. Nanopartikel berbentuk bola (hijau muda keunguan) yang diperoleh memiliki ukuran diameter rata-rata 35 ± 16 nm, komposisi karbon dan oksigen yang tinggi. Nanomaterial terkonjugasi, juga memiliki spektrum unik untuk polimorf aragonit dan ikatan karboksilat yang secara signifikan mendukung interaksi antara nanopartikel terkonjugasi. Muatan permukaan negatif dan serapan spektrum menyoroti stabilitasnya. Au-CSCaCO terkonjugasi berbentuk bola yang dihasilkan3 NP bisa menjadi bahan nano yang bagus untuk aplikasi biomedis.
Latar Belakang
Produksi nanopartikel monodispersi telah muncul signifikan dalam aplikasi elektronik, optik, biomedis, dan magnetik [1,2,3,4]. Evolusi mereka dan biomaterial telah meningkatkan obat-obatan [5], sistem biomedis [6], sistem pengiriman obat [7], kosmetik, dan pengolahan air [7,8,9]. Dalam hal yang sama, pengembangan bahan terkonjugasi yang biokompatibel, biogenik, dan tidak beracun dapat memiliki kontribusi yang berharga untuk bidang biosains dan biomedis [10]. Selain itu, biokompatibel biokompatibel logam terkonjugasi dan nanomaterial dapat berkontribusi untuk kemajuan ilmiah yang lebih untuk aplikasi biomedis seperti rekayasa jaringan [5], terapi [11], dan pengiriman obat [12]. Ini telah ditunjukkan dalam karya-karya baru-baru ini secara terperinci, seperti penggunaan hidrogel hibrida kolagen-emas yang dapat dirakit sendiri yang dapat disuntikkan [13], nanokonjugat inti-cangkang emas-kolagen koloid [14], dan obat nano bebas pembawa yang dirakit bersama untuk terapi antitumor [15]. Sejumlah penelitian juga telah mendokumentasikan bahwa nanopartikel logam dapat menghasilkan elektroda enzim pada biosensor elektrokimia dengan bahan berpori anorganik non silika [16]. Selanjutnya, nano-hibrida graphene oxide-albumin juga telah menunjukkan manfaat potensialnya terhadap terapi fotodinamik yang ditingkatkan [17]. Secara keseluruhan, ini hanya memicu lebih banyak minat dengan kemungkinan aplikasi lain seperti pencitraan biomedis dan sistem bio-sensorik [16, 18].
Kalsium karbonat sebagai mineral alami mentah telah digunakan dalam berbagai aplikasi termasuk biomedis, industri, dan nanoteknologi [10, 19,20,21]. Aragonit sebagai polimorf kalsium karbonat kaya akan cangkang kerang (Anadara granosa ), moluska populer, juga ditemukan di Malaysia [22]. Aragonit bersifat biogenik tidak seperti polimorf kalsium karbonat lainnya dari kalsit dan vaterit, membentuk hingga 95-98% cangkang kerang. Kalsium karbonat, bahan anorganik polimorf aragonit, secara alami dan umum ada di dalam cangkang kerang [23]. Polimorf aragonit semakin menarik perhatian di bidang penelitian karena sifat biokompatibilitasnya dan potensi yang menjanjikan dalam pengembangan sistem penghantaran obat antikanker [24] dan pencitraan biomedis [25, 26]. Saat ini, sebagian besar studi penelitian sebelumnya telah mengungkapkan terutama dua metode produksi kalsium karbonat [26]. Mereka termasuk pengendapan bersama atau dekomposisi ganda dan karbonasi CO2 gas melalui kalsium hidroksida di bawah pengaturan terkontrol, yang sayangnya tidak menghasilkan kalsium karbonat biogenik [26,27,28]. Oleh karena itu, produk tersebut mengandung campuran kalsit dan vaterit dalam jumlah tinggi yang tidak sesuai untuk penggunaan biomedis karena laporan non-biokompatibilitas dan toksisitasnya yang tinggi [26].
Namun, dengan meningkatnya penggunaan nanoteknologi dalam aplikasi biomedis, penelitian ini difokuskan pada sintesis nanopartikel kalsium karbonat yang diturunkan dari cangkang kerang yang dikendalikan (CSCaCO3 NPs) dengan ukuran dan bentuk yang unik menggunakan dodecyl dimethyl betaine (BS-12) [29]. Ini terinspirasi oleh karya sebelumnya yang memanfaatkan BS-12 sebagai katalis bio mineralisasi dalam sintesis CSCaCO3 NP yang dapat dengan mudah dimanipulasi untuk aplikasi bio, hemat biaya, dan nanopartikel yang relatif murni [30]. Morfologi dan ukuran nanopartikel yang disintesis sangat penting dalam menentukan sifat fisikokimianya, dengan fokus pada nanopartikel logam mengingat potensi aplikasi biomedisnya yang luas [31]. Nanopartikel emas (AuNPs) terus digunakan karena sifat optiknya, rentang ukuran yang berbeda, dan warna yang bergantung pada variasi penyerapan maksimal atau metode sintesis yang digunakan [32]. Ukuran dan bentuk AuNP mempengaruhi karakteristik penyerapan dan emisinya dalam spektrum cahaya tampak, membuatnya bervariasi dari daerah inframerah tampak hingga dekat. Oleh karena itu, karena sintesisnya [33], sifat fisikokimia [34], biokompatibilitas [35], dan fungsionalisasi permukaan [36], mereka dapat dimanipulasi untuk aplikasi yang berbeda dan khusus [37]. Selain itu, juga telah dinyatakan bahwa dalam diagnostik medis, mereka tidak sepenuhnya digunakan dan nilainya mungkin tidak jelas [37].
Jadi mungkin pada fungsionalisasi yang tepat, mereka bisa didesain ulang untuk pencitraan kanker [38], pengobatan kanker [39], pengiriman obat [40], dan gadget sensorik [41]. Sebuah lapisan sangat penting untuk membuat biomaterial nano-hibrida dengan sifat fungsional seperti nanopartikel emas (AuNPs) terkonjugasi dengan nano-spheres kalsium karbonat berpori [16, 42]. Bahan nano karbonat emas-kalsium terkonjugasi yang dihasilkan atau hibrida nano-komposit, yang dapat mempertahankan sifat-sifat induk yang menguntungkan seperti biokompatibilitas, kelarutan yang baik, dan dispersibilitas dalam larutan [16]. Nanopartikel emas terkonjugasi yang menunjukkan perubahan warna yang kuat dan resonansi plasmon permukaan lokal (LSPR) bisa menjadi kandidat yang sangat baik untuk sistem reseptor ganda potensial seperti aptamers, peptida, dan antibodi [35, 43,44,45]. Pembuatan polimer terkonjugasi yang larut dalam air dan aplikasinya dalam biosensor, pencitraan fluoresensi, dan penghantaran obat telah berhasil direalisasikan [46,47,48]. Namun, nanopartikel terkonjugasi atau nanomaterial telah secara progresif meningkatkan keuntungan seperti stabilitas foto [48, 49] dan sitotoksisitas rendah [50] selama bertahun-tahun kecuali untuk persiapan yang lebih ramah [51] dan fitur pemisahan [48].
Dengan ini, AuNP dan CSCaCO3 NP disintesis secara terkontrol dan digunakan untuk membuat dan mengkarakterisasi nanopartikel kalsium karbonat yang diturunkan dari cangkang kerang emas terkonjugasi biogenik (Au-CSCaCO3 NPs) yang ukuran diameternya berkisar antara 19–51 nm. Awalnya, persiapan AuNPs terinspirasi oleh metode Turkevich klasik [52] dan nanopartikel yang berasal dari cangkang kerang menggunakan pendekatan sintetik dodesil dimetil betaine [26]. Modifikasi parameter sintetik seperti konsentrasi dapat mengurangi atau menambah ukurannya dengan baik. Akibatnya, nanomaterial yang disintesis dikarakterisasi dan diselidiki untuk sitotoksisitas. Au-CSCaCO3 Keuntungan tambahan persiapan NP adalah; sintesis mudah dan efisiensi biaya.
Metode/Eksperimental
Bahan dan Reagen Kimia
Garam emas (asam tetra chloroauric yang mengandung larutan emas 49%) dan tri-natrium sitrat dibeli dari prima nexus Sdn Bhd (Malaysia). Cangkang kerang segar diperoleh dari pasar lokal (Pasar borong, Seri Kembangan, Selangor, Malaysia). Dodecyl dimethyl betaine (BS-12) dan indocyanine green dye (ICG) dibeli dari Sigma-Aldrich (Steinheim, Jerman). Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), kombinasi antibiotik (glutamine 100 mmol/L, penisilin 100 U/mL, dan streptomycin 100 μg/mL), phosphate-buffered saline (PBS), dimethyl sulfoxide (DMSO) ), dan MTT (3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazolium Bromide dye) dibeli dari Naclai tesque, Inc., Kyoto, Jepang. Semua reagen lain yang digunakan adalah kelas analitis.
Sintesis Nanopartikel Emas
Sintesis dicapai dengan menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya oleh Verma et al. [53] dengan sedikit modifikasi konsentrasi, 1% asam tetra chloroauric mengandung 49% larutan emas. Kira-kira, 0,1% larutan emas disiapkan dan diencerkan dalam serangkaian konsentrasi masing-masing 15, 25, dan 20 mM dalam labu berbentuk kerucut yang berbeda. Larutan kemudian dipanaskan pada suhu 100 °C di atas hot plate yang digabungkan dengan pengaduk magnet (posisi 6, WiseStir ® Korea). Kemudian, sekitar 1% tri-natrium sitrat ditambahkan ke larutan mendidih dengan pengadukan magnetik terus menerus sampai transisi warna (larutan emas kekuningan berubah menjadi tidak berwarna kemudian menjadi hitam dan akhirnya berubah menjadi merah cemerlang) diamati. Panas dimatikan setelah 15 menit dan dibiarkan dingin pada suhu kamar. Nanopartikel emas hasil sintesis kemudian disimpan pada suhu -4°C untuk digunakan lebih lanjut. Reaksi ditunjukkan pada persamaan di bawah ini:
Persiapan dan Sintesis Nanopartikel Kalsium Karbonat Berasal dari Cangkang Kerang (CSCaCO3 NP)
Tiga kilogram cangkang kerang yang baru diperoleh dibersihkan, digosok, dan dicuci secara menyeluruh. Bubuk cangkang kerang diproduksi sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Islam et al. [54]. Cangkang kerang yang sudah dibersihkan dikeringkan dalam oven (Memmert UM500, GmbH Co, Germany) pada suhu 50 °C selama 7 hari. Cangkang kerang digiling menjadi bubuk menggunakan blender (Blender HCB, 550, USA) dan diayak dengan saringan uji laboratorium stainless (Endecott Ltd., dibuat di London, Inggris) dengan bukaan 90 μm untuk mendapatkan serbuk berukuran mikron. Serbuk dikeringkan selama 7 hari pada suhu 74°C di dalam oven. Bubuk itu selanjutnya dikemas dalam kantong plastik plastik kedap udara untuk digunakan nanti. Nanopartikel kalsium karbonat yang berasal dari cangkang kerang disintesis menurut pendekatan yang dijelaskan oleh Islam et al. [55], dengan sedikit modifikasi pada metode dan parameter sintesis. Dua gram bubuk cangkang kerang dimasukkan ke dalam labu berbentuk kerucut 250 ml diikuti dengan 50 ml air deionisasi ganda, dan BS-12 konsentrasi 0,5 ml ditambahkan ke dalam labu berbentuk kerucut. Campuran dalam labu berbentuk kerucut diaduk kuat pada 1000 rpm, dengan suhu 50 °C selama 135 menit menggunakan multi-hotplate sistematis dan pengaduk magnet dengan batang magnet kecil. Sampel yang telah disiapkan dipisahkan dari cairan induknya menggunakan kertas saring cincin ganda berukuran 125 mm (Filtres Fioroni, China). Residu kemudian dicuci secara menyeluruh untuk menghilangkan kelebihan BS-12. Produk akhir, CSCaCO3 Bubuk NP, dikemas dalam wadah dry-clean dan dikeringkan selama 3 hari (Oven Memmert UM500, GmbH Co, Jerman) pada suhu 74 °C. Wadah dibungkus dengan benar dan disegel dengan film Para setelah penambahan beberapa bola marmer kecil di dalamnya. Wadah ditempatkan di pabrik roller-ball Programmable (BML-6, Wisemix ® Korea) dengan kecepatan 200 rpm selama 5 hari. Sampel disimpan dalam plastik kedap udara dalam oven untuk digunakan lebih lanjut.
Sintesis Nanopartikel Kalsium Karbonat Berasal dari Cangkang Emas Terkonjugasi (Au-CSCaCO3 NP) dan Kerjasama Pewarna Near Infrared (NIR)
Dalam prosedur ini, 0,2 g CSCaCO3 NP dan 5 mg infra merah dekat (NIR) Indocyanine green dye (ICG) didispersikan dalam 20 ml larutan koloid emas (pH 7) (larutan AuNPs), seperti yang dijelaskan oleh Cai et al. [16], dalam labu kerucut kosong yang bersih. Modifikasi sintesis lebih lanjut dilakukan, di mana sampel disonikasi selama 20 menit dan diinkubasi pada pengaduk magnet dengan batang magnet kecil pada 200 rpm selama 3 hari. Sampel disentrifugasi ultra pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan Au-CSCaCO3 berwarna hijau muda-ungu. komposit NP. Supernatan dituang dan pelet dicuci dengan serangkaian air deionisasi. Material komposit yang telah disiapkan dikeringkan dalam oven selama 4 hari dan disimpan dalam polietilen kedap udara dalam oven untuk analisis lebih lanjut.
Karakterisasi Nanopartikel Kalsium Karbonat Berasal dari Cangkang Emas Terkonjugasi (Au-CSCaCO3 NP)
Ukuran partikel dan morfologi nanomaterial dianalisis menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM). Nanomaterial didispersikan dalam alkohol absolut dan disonikasi selama 40 menit. Kira-kira, 5 l larutan sampel tersuspensi dipipet ke dudukan spesimen pegangan tembaga. Sampel dilihat di bawah TEM (Hitachi H-7100). Mikroskop elektron pemindaian emisi medan (FESEM) (Model JOEL 7600F) dioperasikan pada tegangan 5 KV dan dilengkapi dengan unit spektroskopi sinar-X dispersif energi (EDX). Ini digunakan untuk mengkarakterisasi fitur permukaan Au-CSCaCO3 NP. Bahan didispersikan dalam alkohol absolut dan disonikasi selama 1 jam. Sekitar 50 l larutan sampel tersuspensi dipipet ke dudukan spesimen pegangan tembaga, dikeringkan semalaman, dan dipindai menggunakan berkas elektron. Selain itu, spektrometer inframerah transformasi Fourier (FTIR) juga digunakan untuk analisis fungsional dari bahan nano terkonjugasi yang disintesis; bahan nano dikalibrasi dalam 1 wt% di Ker (FTIR Model 100, Perkin Elmer) dalam kisaran 400–4000 cm
−1
. Selanjutnya, analisis ukuran nano konjugat dan potensi zeta yang disintesis dilakukan dengan menggunakan zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments). Bahan disuspensikan dalam air deionisasi dan disonikasi selama 50 menit; suspensi homogen diendapkan dalam kuvet zetasizer dan diperiksa ukuran partikel dan potensial zeta. Keberadaan analit yang berbeda dari komposit nano terkonjugasi dipantau menggunakan spektrofotometer Uv-Vis (UV - 2600) pada panjang gelombang yang berbeda mulai dari 300 hingga 800 nm.
Studi Kultur Sel dan Sitotoksisitas
Garis sel adenokarsinoma payudara manusia (JCRB:MCF-7) dan garis sel fibroblas tikus (JCRB:NIH3T3) dikultur dalam DMEM (glukosa tinggi) yang dilengkapi dengan 10% FBS dan kombinasi antibiotik (glutamin 100 mmol/L, penisilin 100 U/ mL, dan streptomisin 100 μg/mL). Labu kultur (kultur Eppendorf T-25 dan T-75) diinkubasi dalam 5% karbondioksida pada 37°C, dan sel pada pertemuan 80-90% digunakan untuk proses penyemaian dan perawatan.
Pembibitan dan Perawatan Sel
Sel-sel diunggulkan ke dalam pelat steril 96-sumur dengan kepadatan 5 × 10
3
sel per sumur dan diinkubasi selama 24 jam semalaman. Media di setiap sumur dikeluarkan, dan sel diperlakukan dan dikultur bersama dalam ulangan dengan suspensi komposit nano terkonjugasi (Au-CSCaCO3 NP) untuk jangka waktu 24, 48, dan 72 jam. Setelah pemaparan perlakuan selesai, media di dalam sumur diaspirasi dan dicuci dengan PBS sebelum diganti dengan media baru lainnya sebelum perlakuan eksperimental.
Persiapan Au-CSCaCO3 NP untuk Perawatan
Solusi stok Au-CSCaCO3 NP pada konsentrasi 1 mg/ml dalam media DMEM bebas serum 10% disiapkan. Setelah penyemaian sel sel MCF-7 dan sel NIH3T3 di pelat 96-sumur, pelat diperlakukan dan diinkubasi dengan konsentrasi berbeda dalam mikrogram (100-1,56) Au-CSCaCO3 Solusi NP.
(MTT) 3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazolium Bromide Reagen Preparasi dan Protokol
Biasanya, 5 mg bubuk reagen MTT dilarutkan dalam 1 ml PBS yang difasilitasi oleh sonicator vortex untuk campuran yang seragam. Setelah penyemaian sel dan perawatan, pelat sumur dibersihkan dan 20 l reagen MTT ditambahkan ke setiap sumur. Segera setelah itu, pelat dibiarkan diinkubasi selama 3-4 jam untuk memungkinkan pengikatan MTT ke mitokondria sel. Setelah inkubasi, 1 ml DMSO ditambahkan ke masing-masing sumur yang melepaskan produk warna ke dalam larutan. Pelat disimpan di ruangan gelap selama 30 menit, dan kerapatan optik (OD) larutan diukur dengan pembaca pelat mikro pada panjang gelombang 570 nm [56]. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga untuk setiap baris sel, dan nilai rata-rata dicatat. Persentase viabilitas sel ditentukan dengan menggunakan rumus di bawah ini.
dimana AContoh adalah pembacaan OD rata-rata dari sel-sel yang dirawat diinkubasi yang berbeda dari kedua garis sel dan AKontrol adalah pembacaan OD rata-rata dari sel-sel yang diinkubasi berbeda dalam media kultur lengkap saja. Sitotoksisitas sel kemudian dinilai dari nilai rata-rata rangkap tiga dan ditunjukkan sebagai mean ± standar deviasi (SD).
Analisis Statistik
Analisis data statistik dilakukan dengan menggunakan software SPSS (Versi 10, Chicago, USA). Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga dan dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (M ± SD). Ambang batas signifikansi adalah p < 0.01.
Hasil dan Diskusi
Sifat Fisikokimia Au-CSCaCO Terkonjugasi3 NP
Mikroskop Transmisi Elektron
Tujuan dari mikrograf TEM adalah untuk menilai ukuran Au-CSCaCO3 terkonjugasi yang disintesis NP yang menunjukkan nanopartikel terdispersi dengan baik dengan ukuran diameter rata-rata 35 ± 16 nm dalam kisaran (19–51 nm). Perbedaan ukuran yang dikaitkan dengan kondisi sintesis seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1.
TEM (a , b ) gambar Au-CSCaCO3 NP yang mengkarakterisasi ukuran nanopartikel mereka yang berbeda
Mikrograf TEM dari konjugat nano menunjukkan diameter berkisar 19–51 nm dan nanopartikel terdispersi. Ukuran nano yang diperoleh secara unik dapat dikaitkan dengan kondisi sintetis terkontrol yang digunakan. Penjelasan lain yang mungkin untuk dispersi nanopartikel dapat disebabkan oleh lapisan ion sitrat bermuatan negatif yang membantu dalam tolakan nanopartikel satu sama lain dan juga, karena tolakan elektrostatik dan lapisan permukaan hidrasi konjugasi yang mencegah agregasi dan meningkatkan stabilitas konjugasi seperti yang dilaporkan. oleh Jazayeri dkk. [56]. Selanjutnya, reagen capping sitrat berperan dalam sintesis, yang memungkinkan lebih banyak dispersi dan stabilitas konjugat nanopartikel seperti yang dilaporkan oleh Rawat et al. [57]. Ukuran partikel yang unik menunjukkan perbedaan nanopartikel emas yang diserap di dalam matriks nano-sphere kalsium karbonat mirip dengan pekerjaan yang dilakukan oleh Cai et al. [16], berkontribusi pada ukuran partikel yang dihasilkan yang diamati. Namun, hasil ini juga mengkonfirmasi laporan bahwa kalsit memiliki kemampuan yang buruk untuk menampung nanopartikel emas [16].
Field Emission Scanning Electron Microscopy (FESEM) dan Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX)
Mikrograf FESEM menilai morfologi dan bentuk nanopartikel yang disintesis yang menunjukkan Au-CSCaCO berbentuk bulat dan seperti rantai3 Nanopartikel NP dengan tingkat agregasi kecil seperti yang ditampilkan pada Gambar 2. Spektrum dasar (Gbr. 2b) menganalisis komposisi unsur dari nanopartikel terkonjugasi yang menampilkan 64,98% karbon, 13,53% oksigen, 0,02% kalsium, 17,63% tembaga, dan 3,85% emas seperti yang disajikan pada Tabel 1.
FESEM a Mikrograf FESEM dari Au-CSCaCO3 NP menggambarkan morfologi. b Spektrum EDX dari Au-CSCaCO3 NP
Mikrograf FESEM menggambarkan morfologi yang unik sebagai bentuk bulat, permukaan halus, dan nanopartikel terkonjugasi terstruktur seperti rantai yang sifat fisik atau kimianya dapat dijelaskan sebagai hasil dari kondisi preparasi dan metode sintetik [58]. Demikian pula sifat struktural bola yang ditampilkan oleh nanopartikel konjugasi mirip dengan yang dilaporkan oleh Verma et al. [53], tetapi bertentangan dengan tingkat kecil agregasi yang disajikan. Akun yang mungkin untuk hasil ini bisa jadi karena interaksi hidrofobik dan elektrostatik antara nanopartikel emas dan nanopartikel kalsium karbonat yang berasal dari cangkang kerang yang mengarah ke pengikatan yang kuat [48]. Selain itu, peran BS-12 yang digunakan dalam sintesis tercermin dalam pemecahan nanopartikel menjadi bentuk bola yang analog dengan pekerjaan yang didokumentasikan oleh Islam et al. [55]. Profil dasar (Tabel 1) mengungkapkan tidak ada perubahan signifikan yang bertentangan dengan hasil yang diharapkan. Demikian pula, temuan yang diamati dengan komposisi kimia dari nanopartikel terkonjugasi didokumentasikan seperti sebelumnya ditunjukkan dalam karya sebelumnya [26, 54].
Surface Charge dan Distribusi Ukuran menurut Intensitas
Potensi zeta dari nanopartikel terkonjugasi dilakukan, untuk menilai muatan permukaan, stabilitas, dan distribusi ukurannya berdasarkan intensitas yang mengungkapkan muatan negatif 16.4 ± 3.81 mV dan ukuran rata-rata nanopartikel terkonjugasi 57,97 nm seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3 dan Tabel 2.
a Distribusi ukuran partikel menurut intensitas Au-CSCaCO3 NP. b Potensi Zeta dari Au-CSCaCO3 NP menunjukkan muatan permukaan
Potensi zeta merupakan assay penting dalam menilai muatan elektrostatik permukaan nanopartikel yang ditentukan menggunakan zeta sizer. Ini lebih lanjut menjelaskan dispersi nanomaterial dalam larutan, memungkinkan kita untuk memahami stabilitas keseluruhan, umur simpan nanopartikel, interaksi partikel antara partikel bermuatan, dan implikasinya [59]. Penilaian potensi zeta dari nanomaterial terkonjugasi menunjukkan stabilitas nanopartikel pada 16,4 mV dan indeks dispersi poli (PdI) kurang dari 0,5. Penjelasan yang mungkin dapat dikaitkan dengan adanya tolakan elektro yang lebih besar antara partikel dalam suspensi selama pengukuran. Selanjutnya, kecenderungan aglomerasi mungkin juga mempengaruhi distribusi ukuran yang mengarah ke ukuran yang lebih besar karena metode sintetis. Studi sebelumnya oleh Hoque et al. juga telah didokumentasikan [60] bahwa potensi zeta yang sangat positif atau negatif menurunkan agregasi dan meningkatkan stabilitas. Selain itu, perbedaan fisikokimia nanopartikel yang disintesis dapat diperhitungkan dengan metode sintesis yang digunakan. Karya Kanaujia dan rekan kerja [61] juga telah menekankan bahwa nilai potensial zeta negatif atau positif yang lebih tinggi menunjukkan stabilitas dan mencegah agregasi partikel, karena tolakan listrik yang menstabilkan dispersi nanopartikel secara elektrik juga dilaporkan oleh Isa et al. [62].
Fourier–Transform Infrared spectrometer (FTIR)
Spektrum FTIR Au-CSCaCO3 NP menunjukkan bahwa puncak paling menonjol muncul pada 1455,09 cm
−1
diikuti oleh puncak yang teramati pada 1059,12 cm
−1
, 854,80 cm
−1
, dan 464,16 cm
−1
, masing-masing. Selain itu, puncak lemah diamati pada 706,40 cm
−1
dan 1785,68 cm
−1
seperti yang disajikan pada Gambar. 4.
Spektrometer inframerah transformasi Fourier dari puncak karakteristik utama Au-CSCaCO3 NP. Semua tanda sesuai dengan frekuensi yang dibahas dalam teks
Spektrum FTIR Au-CSCaCO3 NP seperti yang disajikan menunjukkan bahwa puncak yang paling menonjol muncul pada 1455,09 cm
−1
, membuktikan ikatan oksigen-hidrogen (O–H) yang ada dalam gugus karboksilat nanopartikel emas [14] dan nanopartikel cangkang kerang, diikuti oleh puncak yang paling baik menunjukkan keberadaan penanda polimorf aragonit yang diamati pada 1059,12 cm
−1
, 854,80 cm
−1
, dan 706,40 cm
−1
, yang diketahui melaporkan gugus alkil yang terjadi pada nanopartikel yang berasal dari cangkang kerang yang konsisten dengan puncak spektrum [55]. Demikian pula, puncak lemah diamati pada 1785,68 cm
−1
karena adanya gugus karboksilat [54], dan puncak tambahan diamati pada 464,16 cm
−1
. Semua puncak menunjukkan karakteristik signifikan dari adanya ikatan kovalen, ikatan karbon-karbon (C–C), karbon-oksigen (C–O), dan karbon-nitrogen (C–N) yang gugus fungsi yang sesuai hadir dalam konjugasi kami. nanopartikel. FTIR pada dasarnya mengidentifikasi gugus fungsi yang ada, dengan memperoleh puncak spektrum inframerah dari nanomaterial terkonjugasi dan secara bersamaan mengumpulkan data resolusi spektral tinggi pada rentang spektral yang luas (400–4000 cm
−1
) [63]. Namun, polimorf kalsit kalsium karbonat dilaporkan memiliki puncak berkisar antara 2000 hingga 2900 cm
−1
dengan nanopartikel yang dibuat dengan metode karbonasi [64].
Spektrofotometer Uv-Vis
Nanopartikel terkonjugasi yang disintesis menunjukkan puncak serapan berat pada 530 nm seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5.
Spektrofotometer serapan spektrum Uv-Vis Au-CSCaCO3 NP seperti yang dibahas dalam teks
Struktur nano emas memiliki absorbansi cahaya yang luas karena efek resonansi plasmon permukaan terlokalisasi dari AuNPs [65, 66]. Sejumlah laporan telah menunjukkan bahwa partikel emas sering memiliki puncak serapan tajam yang diamati antara 500–520 nm [66,67,68,69]. Teknik ini memungkinkan penilaian lebih lanjut dari Au-CSCaCO3 . terkonjugasi Ukuran NP, konsentrasi, dan tingkat agregasi [65]. Pita absorbansi juga diketahui bergeser ke panjang gelombang yang lebih kecil yang menunjukkan pengurangan ukuran partikel, dan bentuk simetris dari spektrum serapan menunjukkan distribusi ukuran partikel yang sempit [70], sehingga mengkonfirmasi Au-CSCaCO3 NP yang menampilkan puncak serapan yang lebih lebar antara 500–550 nm dan titik tertinggi pada panjang gelombang 530 nm. Dapat diterima di daerah spektrum tampak inframerah dekat, di mana cahaya mudah dilemahkan oleh jaringan dan puncak penyerapan bergeser secara signifikan ke panjang gelombang yang lebih panjang [71]. Penjelasan yang mungkin untuk ini bisa jadi karena sintesis dan konjugasi nanomaterial. Juga konsisten dengan Srinath et al., yang mengungkapkan bahwa posisi pita serapan sebagian besar tergantung pada variasi warna, agregasi dan spesies yang teradsorpsi permukaan [72]. Selanjutnya, spektrum serapan nanopartikel dapat berubah tergantung pada warna, morfologi, dan ukuran karena sifat resonansi plasmon emas [73]. Struktur nano dengan sifat termal foto NIR memiliki kemampuan untuk menghamburkan cahaya dengan kuat, yang memiliki aplikasi signifikan dalam pencitraan biomedis [74, 75].
Studi sitotoksisitas pada sel karsinoma payudara manusia (MCF-7) dan sel fibroblas embrionik tikus (NIH3T3) mengungkapkan bahwa Au-CSCaCO3 NP menghambat lebih dari 70% proliferasi sel yang menyebabkan kematian sel kanker dan hampir 40% penghambatan sel fibroblas pada dosis 100 g. IC50 dan dosis konsentrasi yang lebih rendah seperti 25 μg juga terbukti beracun bagi sel kanker yang menunjukkan viabilitas sel yang rendah dan juga menghambat lebih dari 50% proliferasi sel kanker untuk nanopartikel. Di sisi lain, dosis konsentrasi yang identik dengan sel fibroblas menunjukkan viabilitas sel yang meningkat dan konsisten dari sel fibroblas. IC50 menunjukkan viabilitas sel hingga 80% dari sel fibroblas, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6.
Penilaian sitotoksisitas dari MCF-7 dan NIH3T3 yang diobati dengan Au-CSCaCO3 Sel NP menggunakan uji MTT memberikan persentase viabilitas sel
3-Dimethylthiazo-2,5-diphynyltetrazolium Bromide (MTT) adalah uji kolorimetri yang dapat diterima digunakan untuk menentukan viabilitas sel [76]. Utilizing mitochondrial enzymes in the electron transport chain [77], viable cells with active metabolism converted MTT into purple-colored formazon crystals in the cellular cytosol [78]. The crystals were dissolved after cell lysis on adding an organic solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) which is proportional to live cell number, unlike dead cells, due to cytotoxicity that are unable to carry out the reaction [79]. The conjugated nanoparticles displayed consistent cell death against the cancer cells and reliable cell viability of the fibroblast cells with concentration doses ranging from 25–100 μg. Furthermore, attesting low cytotoxicity and highlighting the biocompatibility of Au-CSCaCO3 NPs and potential usefulness for biomedical applications, the cytotoxicity could be due to the internalization of the nanoparticles which possibly triggered intracellular responses and thus induced cellular damage because of interaction with cell organelles. Despite contrary cytotoxicity findings with works done on HeLa cells (human cervical cancer cell line) due to nanoparticles inducing oxidative damage [35, 80], Zhang et al. demonstrated the biocompatibility of the nanoparticles and its likely use for drug delivery systems [80]. Similarly, reports of gold nanoparticles confirmed nontoxic dependent on their size [81] and concentration [39]. Studies strongly confirmed that biogenic gold conjugates are stable and nontoxic nanocarrier used in biomedical application [35, 39] suggesting use for biomedical applications such as drug delivery and cancer therapy [82].
Conclusions
Spherical-shaped conjugated gold-cockle shell-derived calcium carbonate nanoparticles (Au-CSCaCO3 NPs) were obtained. The conjugated nanoparticles were synthesized using a simpler, environmental friendly, and cost-efficient synthetic approach. Furthermore, based on the results, the obtained conjugated nanoparticles were relatively pure and stable. The source of material used for the cockle shell-derived nanoparticles is biogenic, readily available, and naturally occurring as seawater mollusca cockle shell. Based on the presented evidences, the conjugated Au-CSCaCO3 NPs could be a good biomaterial for biomedical applications.
