Sintesis Nanopartikel SPIO dan Aplikasi Selanjutnya dalam Pelabelan Sel Punca untuk Penyakit Parkinson

Bahan dan Metode

Materi

Besi asetilasetonat, TREG (trietilen glikol), dietilen glikol dan PEG dibeli dari Aladdin Industrial Corporation (shanghai, Cina). Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) dibeli dari Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, Cina). Media elang modifikasi Dulbecco (DMEM), tripsin-EDTA (0,25%) dan serum janin sapi (FBS) dibeli dari Thermo Fisher Scientific. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride dan N-Hydroxy succinimide dibeli dari Sigma-Aldrich (Cina). N, N-Dimethylformamide, etil alkohol absolut dan etil asetat dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Corporation. Air ultra murni diproduksi oleh sistem pemurnian air murni dan ultra murni Millipore. CD90-FITC antimanusia, CD45-PE antimanusia, CD34-FITC antimanusia, dan CD105-PE antimanusia dibeli dari Biolegend.

Sintesis USPIO

USPIO disintesis dengan metode poliol seperti penelitian sebelumnya [18,19,20,21]. Langkah-langkah percobaan adalah sebagai berikut:besi asetilasetonat 1 mmol dan TREG 25 mL dicampur dalam labu leher tiga yang dihubungkan dengan argon, tabung kondensasi berbentuk bola dan termometer. Setelah diinkubasi dengan aliran argon selama 15 menit, campuran dipanaskan hingga 120℃ (laju pemanasan 3 °C/menit) dan dipertahankan selama 1 jam, kemudian campuran dipanaskan lebih lanjut hingga 250 °C pada laju pemanasan yang sama dan dipertahankan selama 30 mnt. Campuran reaksi didinginkan secara alami hingga suhu kamar, diencerkan dengan 2 mL etil alkohol absolut, diikuti dengan pengendapan dengan etil asetat. Sedimen dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 8000 rpm selama 20 menit dan kemudian disuspensikan kembali dalam etil alkohol absolut. USPIO disimpan dalam etil alkohol absolut pada 4 °C untuk penggunaan lebih lanjut.

Persiapan USPIO Dilapisi PAA/PEG

USPIO-PAA diakuisisi menurut laporan sebelumnya [22]. Secara rinci, asam poliakrilat (PAA) 1,5 g dilarutkan ke dalam 24 mL dietilen glikol. Setelah aliran argon 5 menit, campuran dipanaskan hingga 110 °C dan dipertahankan sampai larutan menjadi jernih. Larutan pendispersi etanol yang mengandung 28 mg USPIO yang disiapkan pada langkah sebelumnya ditambahkan ke larutan yang diklarifikasi di atas setelah pendispersi ultrasonik. Larutan akhirnya dipanaskan hingga 210 °C dengan laju 3 °C/menit. Reaksi dihentikan setelah 2 jam refluks dan didinginkan secara alami hingga suhu kamar. Setelah pendinginan, etil asetat ditambahkan ke larutan reaksi untuk mengendapkan NP USPIO dan kemudian disentrifugasi pada 8000 rpm selama 20 menit untuk menghilangkan supernatan. Endapan tersebut kemudian didispersikan dalam etanol, diikuti dengan pengendapan dengan etil asetat. Setelah prosedur pencucian selama tiga kali, USPIO-PAA didispersikan dalam air ultra murni untuk digunakan lebih lanjut. Untuk meningkatkan biokompatibilitas, kami selanjutnya menghubungkan PEG ke permukaan nanopartikel dengan EDC dan amidasi yang dimediasi NHS [23]. 0,45 g PEG dilarutkan dalam 5 ml air ultra murni dan ditambahkan ke 15 ml dispersi USPIO-PAA (mengandung 35 mg Fe) ditambah dengan 20 mg EDC dan 12 mg NHS. Campuran diaduk secara mekanis pada suhu kamar selama 2 jam, dan kemudian 10 ml pelarut DMF ditambahkan, menghilangkan air pada suhu 40℃ dalam alat evaporasi putar. Terakhir, 40 mg DEC dan 24 mg NHS ditambahkan ke dalam campuran, dicampur pada suhu kamar selama 48 jam. Larutan reaksi dipindahkan ke kantong dialisis dalam air ultra murni selama 72 jam, selama itu air ultra murni diganti setiap 12 jam. Campuran selanjutnya dipindahkan ke dalam tabung ultrafiltrasi untuk mengumpulkan molekul dengan Mr > 30 kD dengan sentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit. Produk akhir dilarutkan dalam air ultra murni dan disimpan pada suhu 4 °C. Dalam beberapa kasus, SPIO-PAA/PEG yang larut dalam air dikumpulkan dengan sentrifugasi dengan tabung sentrifus ultrafiltrasi (> 30 KD ukuran pori, Millipore), dan pelet dikeringkan dalam oven vakum untuk percobaan lebih lanjut.

Karakterisasi NP

Ukuran partikel, distribusi ukuran dan morfologi sampel dianalisis dengan TEM. Lapisan pelapis diukur dengan pewarnaan negatif. Setelah dispersi ultrasonik, USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG dalam larutan air ditambahkan ke jaringan tembaga membran pendukung karbon 300-mesh, dikeringkan secara alami dan kemudian dimasukkan ke dalam mikroskop elektron proyeksi (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) untuk observasi.

Analisis spektroskopi inframerah dilakukan pada Spektrometer FTIR Seri Agilent Technologies Cary 600, di mana bubuk sampel kering ditambahkan langsung ke tangki sampel untuk dideteksi.

Kandungan Fe dalam dispersi USPIO-PAA/PEG ditentukan dengan spektrometri serapan atom api (FAAS), yang modelnya adalah PerkinElmer Analyst 700. Pertama, larutan standar besi 1, 2, 3, 4 dan 5 μg/mL dikonfigurasikan untuk menggambar kurva standar, kemudian 100 μL larutan dispersi USPIO-PAA atau USPIO-PAA/PEG dilarutkan dengan asam nitrat, dan kandungan besi ditentukan dalam labu ukur 50 mL.

Pencitraan resonansi magnetik nanopartikel dilakukan pada pemindai klinis dengan medan magnet 3 T di departemen pencitraan rumah sakit afiliasi pertama Universitas Soochow. Nanopartikel didispersikan dalam larutan gel agarosa 1% sesuai dengan konsentrasi yang sesuai. Setelah larutan memadat, waktu relaksasi transversal sampel diukur dengan multi-echo sequence. Mengekspor akuisisi MRI dalam format DICOM dan kemudian menggunakan RadiAnt DICOM Viewer untuk membuka, membaca nilai abu-abu, dengan mengimpor nilai abu-abu dari waktu gema yang berbeda ke asal untuk pemasangan, nilai waktu relaksasi transversal dari dispersi USPIO dengan konsentrasi berbeda diperoleh; akhirnya, laju relaksasi transversal r2 sampel USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG diperoleh dengan pemasangan linier dengan laju relaksasi transversal 1/T2 dan konsentrasi Fe sampel. Loop histeresis magnetik USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG diperoleh dengan menggunakan perangkat Quantum Design DynaCool-9 di Universitas sains dan teknologi Suzhou sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya [24].

Isolasi dan Identifikasi HADSC

Semua penelitian dilakukan sesuai dengan 'Prinsip Panduan Etis tentang Penelitian Sel Punca Embrio Manusia' (dari Kementerian Sains dan Teknologi dan Kementerian Kesehatan, Republik Rakyat Tiongkok, 2003) dan Deklarasi Helsinki. Sampel adiposa diperoleh dengan persetujuan dan persetujuan etis dari rumah sakit afiliasi pertama Universitas Soochow. Jaringan adiposa dicuci dan dipotong kecil-kecil setelah mengeluarkan pembuluh darah dan jaringan ikat di bawah mikroskop anatomi. Blok dicerna dengan kolagenase tipe I (0,3 pzu/mL) pada 37 °C selama 30 menit, diikuti dengan sentrifugasi pada 500g selama 10 mnt. Pelet sel disuspensikan dengan dalam DMEM + 10% FBS dan diunggulkan pada kepadatan 8 × 10 ⁴ /cm ² . Setelah 48 jam, media lama yang berisi sel terapung dibuang dan diganti dengan media baru.

HADSC dicirikan oleh flow cytometry untuk penanda permukaan yang secara khusus melabeli sel punca mesenkim (CD90 dan CD105) dan hematopoietik (CD34 dan CD45). Sebanyak 1 × 105 sel dipanen dan diinkubasi dengan antibodi terkonjugasi PE, FITC, APC / cy7 atau PerCP terhadap CD34, CD45, CD90 dan CD105 antibodi monoklonal tikus antimanusia dan kontrol isotipe yang sesuai. Sel yang diwarnai dianalisis menggunakan flow cytometer (LSRFortessa, BD, USA), dan data dianalisis menggunakan perangkat lunak FlowJo. Empat fenotipe CD90+, CD105+, CD34− dan CD45− dipilih untuk penanda permukaan HADSC. Tingkat ekspresi penanda permukaan sel diidentifikasi dengan flow cytometry (BD LSRFortessa).

Diferensiasi adipogenik dan osteogenik HADSC dievaluasi masing-masing dengan Pewarnaan Oil Red O dan Alizarin Red. HADSC dikultur dengan media Diferensiasi Adipogenik MesenCultTM (Tek sel induk, 05412) atau Kit Diferensiasi Osteogenik OriCellTM (Cyagen, HUXMA-90021). Untuk diferensiasi adipogenik HADSC, sel-sel dinilai pada hari ke-14 dengan pewarnaan Oil Red O kualitatif untuk adiposit dewasa yang diisi lipid (VivaCell Biosciences, C37A00150). Untuk diferensiasi osteogenik HADSC, sel dinilai pada hari ke 21 oleh Alizarin Red Staining untuk nodul kalsium pada osteosit dewasa (VivaCell Biosciences, C37C00150). Gambar diperoleh menggunakan mikroskop Nexcope terbalik.

Serapan Seluler In Vitro USPIO-PAA/PEG dan Evaluasi Biokompatibilitas

HADSC dilapisi dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 1 × 10 ⁶ per sumur. Sel diinkubasi dengan media yang mengandung USPIO-PAA/PEG (Fe 10 g/mL dan 0,1 μg/mL) selama 2 jam, dan diwarnai dengan pewarnaan Prussian blue (PB) untuk identifikasi Fe intraseluler.

Biokompatibilitas USPIO-PAA/PEG ditentukan dengan kolorimetri MTT dan uji penggabungan 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) (EdU proliferasi kit, Thermo). Untuk MTT, HADSC dilapisi dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 5 × 10 ³ per sumur dan diinkubasi dengan konsentrasi yang berbeda (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL) USPIO-PAA/PEG 24 jam, 48 jam atau 72 jam. 20 μl larutan MTT (5 mg/mL) ditambahkan ke setiap sumur selama 4 jam, diikuti oleh 150 μL dimetil sulfoksida untuk melarutkan kristal. Nilai absorbansi setiap lubang diukur pada OD 570 nm menggunakan instrumen berlabel enzim (BioTek Synergy HT). Untuk uji EdU, HADSC diinkubasi dengan SPIO-PAA/PEG pada 160 Fe g/mL selama 72 jam, diikuti dengan inkubasi dengan 10 μM EdU selama 24 jam. Sel dikumpulkan, difiksasi dengan paraformaldehyde 4% dan dinetralkan dengan 2 mg/mL glisin. Setelah sel permealisasi diinkubasi dengan larutan pewarna (Azide 647 kompleks), tingkat penggabungan EdU dievaluasi dengan flow cytometry.

Model PD yang Diinduksi 6-OHDA

Lima belas-dua puluh tikus Wistar jantan (kelas SPF, dengan berat 220 ± 20 g) digunakan untuk penelusuran in vivo HADSC berlabel USPIO-PAA/PEG pada hewan PD. Semua prosedur dilakukan sesuai dengan Peraturan di Tiongkok (Peraturan untuk administrasi urusan tentang hewan percobaan, 2017) dan disetujui oleh komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional di Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok. Sepanjang, hewan ditempatkan di bawah pencahayaan yang terkontrol (siklus terang/gelap 12/12 jam, "aktif" pada pukul 7 pagi) dengan akses ad libitum ke makanan dan air. Model PD disiapkan dengan injeksi 2 titik 6-hidroksidopamin (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, USA) ke dalam striatum unilateral tikus. Seperti yang dijelaskan sebelumnya [25, 26], tikus disuntik secara stereotaksis dengan 3 μL larutan 6-OHDA (5 μg/μL) pada 2 koordinat (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:4.0 hingga 6,0 mm; dan AP:1.0 mm, ML:4.4 mm, DV:4.5 hingga 6.5 mm), masing-masing. Rotasi yang diinduksi apomorfin (0,5 mg/kg, secara subkutan) digunakan untuk menguji validitas model PD. Tikus disuntik dengan apomorphine (0,5 mg/kg) secara subkutan pada 1, 2 dan 3 minggu setelah pengobatan 6-OHDA, dan skor rotasi dievaluasi selama 30 menit di lapangan terbuka. Model PD memiliki lebih dari 7 rotasi per menit yang diinduksi oleh apomorphine dan dianggap berhasil.

Transplantasi Sel dan Pencitraan MRI In Vivo

HADC diinkubasi dengan USPIO-PAA/PEG (konsentrasi besi adalah 10 μg/mL) selama 2 jam ketika mencapai 80% pertemuan. 3 minggu setelah persiapan model PD, 3 × 10 ⁶ HADC atau saline berlabel USPIO-PAA/PEG disuntikkan ke striatum kiri model tikus PD pada koordinat berikut (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:− 4.0 hingga 6,0 mm). Hewan yang menerima transplantasi diadministrasikan dengan buprenorfin (0,5 mg/kg) segera setelah operasi dan selama 2 hari sesudahnya. Hewan-hewan ini menjadi sasaran tes rotasi yang diinduksi apomorfin pada 1, 2 atau 3 minggu setelah operasi transplantasi.

Untuk MRI in vivo, hewan dicitrakan menggunakan sistem pencitraan hewan kecil in vivo imaging system (IVIS) (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) pada hari ke-3, 9, 15, dan 21 setelah injeksi saline atau HADSC.

Analisis Histologi

Otak model tikus yang tersisa dipanen dan dipotong dengan ketebalan 30 mm untuk analisis 3 minggu pasca transplantasi sel induk (n = 5 per kelompok). Bagian diinkubasi dengan anti-tirosin hidroksilase (TH, abcam, Inggris) dan divisualisasikan dengan antibodi anti kelinci terkonjugasi Alexa-594 (Abcam). DAPI digunakan untuk counterstaining dengan inti. Gambar diambil menggunakan mikroskop confocal Leica TCS SP5.

Analisis Statistik

Data numerik dinyatakan sebagai mean ± SD. Data menjadi sasaran uji Student t 2-tailed atau ANOVA satu arah menggunakan GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) untuk mengevaluasi perbedaannya. * menunjukkan p < 0,05 dan NS menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan.

Hasil

Sintesis dan Karakterisasi Nanopartikel

Desain eksperimental ditunjukkan pada Gambar. 1. NP USPIO hidrofobik disiapkan dengan menggunakan metode dekomposisi termal. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a–c, diameter NP USPIO asli adalah 4,07 ± 0,57 nm; dengan melapisi dengan PAA, diameter NP USPIO-PAA meningkat menjadi 6,34 ± 0,54 nm; modifikasi lebih lanjut dari NP dengan PEG membuat diameter NP USPIO-PAA/PEG mencapai 10,07 ± 0,55 nm. Ketiga nanopartikel berbentuk bulat dan tersebar merata. Analisis statistik menunjukkan bahwa ada perbedaan yang signifikan (F = 10, **p < 0.01, ##p < 0.01) di antara diameter NP USPIO, USPIO-PAA, dan USPIO-PAA/PEG, menunjukkan modifikasi yang berhasil dengan PAA dan PEG (Gbr. 2d).

Ilustrasi skema desain eksperimental

Karakterisasi nanopartikel. a–c Gambar TEM representatif dari NP USPIO (a ), NP USPIO-PAA (b ) dan NP USPIO-PAA/PEG (c ). d Analisis statistik menunjukkan perbedaan yang signifikan antara ukuran partikel USPIO, USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG (n = 20 per kelompok). e Inframerah transformasi Fourier dari nanopartikel USPIO, USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG NPs. Panah menunjukkan puncak penyerapan spesifik pada 1728 cm ⁻¹ karena modifikasi PAA, 1595 cm ⁻¹ dan 3440 cm ⁻¹ karena modifikasi PEG. Data numerik disajikan sebagai mean ± SD, **p < 0.01 versus NP USPIO, ##p < 0,01 versus NP USPIO-PAA/PEG. Bilah mewakili 20 nm

Dengan menggunakan metode penyerapan inframerah, kami menemukan bahwa USPIO-PAA memiliki puncak serapan karbonil yang jelas pada 1728 cm ⁻¹ karena puncak getaran peregangan karbonil dalam molekul PAA; USPIO-PAA/PEG memiliki puncak getaran lentur dalam bidang ikatan karbon-nitrogen pada 1595 cm ⁻¹ dan puncak vibrasi regangan gugus hidroksil pada 3440 cm ⁻¹ (Gbr. 2e). Semua data ini lebih lanjut menegaskan bahwa molekul PAA atau PEG telah berhasil dimodifikasi ke permukaan NP.

USPIO-PAA/PEG Menunjukkan Respon Magnetik In Vitro yang Baik dan Biokompatibilitas dengan HADSC

Kemampuan pencitraan in vitro USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG dievaluasi dengan nilai skala abu-abu gambar MRI pada konsentrasi yang berbeda (setara dengan konsentrasi Fe). Setelah pemasangan, diperoleh nilai waktu relaksasi transversal dari dispersi pada konsentrasi yang berbeda. Dengan menetapkan laju relaksasi transversal 1/T2 sebagai koordinat vertikal dan konsentrasi Fe sebagai koordinat horizontal, laju relaksasi transversal USPIO-PAA dihitung sebagai 107,94 s ⁻¹ mm ⁻¹ (Gbr. 3a), dan 84,65 d ⁻¹ mm ⁻¹ untuk USPIO-PAA/PEG (Gbr. 3b). Kedua partikel menunjukkan sifat pencitraan MRI yang baik. Loop histeresis magnetik SPIO-PAA dan SPIO-PAA/PEG menunjukkan bahwa nilai magnetisasi saturasi SPIO-PAA adalah 57 emu/g di atas 10.000 Oe (Gbr. 3c), dan salah satu SPIO-PAA/PEG adalah 40 emu/g di atas 10.000 Oe (Gbr. 3d). Gaya koersif dan remanensi mendekati nol (Gbr. 3c, d), yang selanjutnya menunjukkan bahwa SPIO-PAA dan SPIO-PAA/PEG adalah superparamagnetisme.

Respons magnetik in vitro dari NP USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG yang disintesis. a , b MRI dan tingkat relaksasi transversal NP USPIO-PAA (a ) dan NP USPIO-PAA/PEG (b ). r ₂ mewakili tingkat relaksasi. Tingkat relaksasi NP USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG adalah 107,94 s ⁻¹ mM ⁻¹ dan 84,65 d ⁻¹ mM ⁻¹ . c , d loop histeresis magnetik NP USPIO-PAA (c ) dan NP USPIO-PAA/PEG (d ). Histeresis magnetik diukur pada 295 k (21,85 °C) dengan intensitas medan magnet maksimal 50.000 Oe (5 Telsa). Nilai magnetisasi saturasi mendekati 57 emu/g untuk SPIO-PAA dan 40 emu/g untuk SPIO-PAA/PEG. Histeresis magnetisasi di kedua kurva mendekati nol

Dengan menginkubasi NP USPIO-PAA/PEG dengan HADSC untuk waktu yang berbeda, kami menemukan bahwa NP USPIO-PAA/PEG tidak memiliki efek signifikan terhadap kelangsungan hidup sel (p> 0,05). Viabilitas sel HADSC tetap di atas 96% ketika konsentrasi Fe yang setara berkisar antara 0 hingga 160 μg/mL. Selain itu, peningkatan waktu inkubasi (dari 24 menjadi 72 jam) tidak menyebabkan hilangnya sel yang signifikan pada setiap konsentrasi Fe (Gbr. 4a). Pengamatan serupa diperoleh ketika NP USPIO-PAA/PEG diinkubasi dengan iPSC pada konsentrasi yang berbeda (Gbr. 4b). Meskipun HADSC diperlakukan dengan 160 μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG selama 72 jam, kemampuan proliferasi, seperti yang ditunjukkan oleh tingkat penggabungan EdU, tidak terganggu dengan adanya USPIO-PAA/PEG (Gbr. 4c). Semua data ini menunjukkan keamanan hayati NP USPIO-PAA/PEG yang disintesis.

NP USPIO-PAA/PEG yang disintesis menunjukkan biokompatibilitas dan kemampuan pelabelan yang baik. a , b HADSCs atau iPSCs diinkubasi dengan NP USPIO-PAA/PEG pada berbagai konsentrasi (setara dengan konsentrasi Fe pada 0, 10, 20, 40, 80 dan 160 g Fe/mL) selama 24, 48, dan 72 jam, dan viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT dan ditunjukkan dalam a , b , masing-masing. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara viabilitas pada konsentrasi NP yang berbeda (n = 5) atau waktu inkubasi (n = 5). c Analisis flow cytometry menunjukkan bahwa tingkat penggabungan EdU serupa pada HADSC yang diinkubasi dengan ada atau tidak adanya USPIO-PAA/PEG (160 μg Fe/mL selama 72 jam). HADSC yang tidak diobati dengan EdU disajikan sebagai kontrol negatif. d USPIO-PAA/PEG pada 10 g Fe/mL dan waktu inkubasi selama 2 jam menghasilkan efisiensi pelabelan HADSC yang hampir 100%, sebagaimana dievaluasi dengan pewarnaan biru Prusia. Perhatikan bahwa USPIO-PAA/PEG pada 0,1 μg Fe/mL (waktu inkubasi 2 jam) menghasilkan noda PB yang ringan namun seragam di HADSC. Data numerik disajikan sebagai mean ± SD. Bilah mewakili 20 μm

Untuk mengidentifikasi apakah sel dapat diberi label secara efektif oleh NP USPIO-PAA/PEG, kami telah menginkubasi HADSC dengan NP USPIO-PAA/PEG pada Fe 10 μg/mL atau 0,1 μg/mL yang setara selama 2 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4d, sejumlah besar NP yang diwarnai menjadi biru diamati di hampir 100% HADSC dengan adanya USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL). Meskipun dosis USPIO-PAA/PEG dikurangi menjadi 0,1 g Fe /ml, kami masih mengamati pewarnaan PB yang agak seragam dan tersebar di hampir semua HADSC. Dibandingkan dengan beberapa SPIO lain yang dilaporkan [14, 27, 28], USPIO-PAA/PEG menunjukkan efisiensi penyerapan sel yang tinggi.

Pelacakan Jangka Panjang HADSC berlabel USPIO-PAA/PEG NPs dalam Model Tikus PD

HADSC yang diberi label dengan NP USPIO-PAA/PEG ditransplantasikan ke striatum kiri model tikus PD dengan injeksi stereotactic. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, kami mengamati sinyal MRI yang jelas di striatum kiri 3 hari setelah transplantasi HADSC, menunjukkan penelusuran in vivo yang tepat dari sel yang ditransplantasikan. Pengamatan dinamis pada D3, D9, D15 dan D21 setelah transplantasi menunjukkan bahwa sel yang ditransplantasikan dengan pelabelan NP dapat dilacak dengan jelas hingga 3 minggu, dan sinyal MRI tidak menunjukkan pengurangan yang jelas selama proses. Hasil ini menunjukkan bahwa nanopartikel yang disintesis memiliki potensi yang baik untuk penelusuran in vivo sel yang ditransplantasikan.

Gambar MRI otak yang representatif pada 3 hari, 9 hari, 15 hari, dan 21 hari diikuti dengan transplantasi dengan label USPIO-PAA/PEG HADSC atau saline. Gambar MRI dari kontrol yang sesuai, yaitu tikus normal atau model tikus PD yang disuntik dengan saline, masing-masing ditampilkan pada baris ke-1 dan ke-2. Perhatikan bahwa dibandingkan dengan sinyal negatif dalam kontrol, otak tikus yang ditransplantasikan dengan HADSC berlabel USPIO-PAA/PEG menunjukkan sinyal MRI yang konstan dan jelas hingga 21 hari. Bilah mewakili 5 mm

USPIO-PAA/PEG NPs-Labeled HADSCs Menunjukkan Efek Terapi pada Model PD

Untuk mengevaluasi apakah HADSC berlabel NP menunjukkan efek terapeutik, pertama-tama kami melakukan karakterisasi fenotipik HADSC yang diisolasi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, HADSC yang dikultur adalah sel berbentuk gelendong. Analisis flow cytometry menunjukkan bahwa HADSC adalah penanda yang sangat terekspresi untuk sel mesenkim, seperti CD90 (> 99%) dan CD105 (> 99%), sedangkan beberapa dari mereka mengekspresikan penanda hematopoietik seperti CD34 dan CD45 (Gbr. 6b–g ). HADSC dapat berdiferensiasi menjadi garis keturunan adipogenik atau osteogenik dalam kondisi tertentu, dan kapasitas diferensiasi masing-masing ditunjukkan oleh Oil Red O atau Alizarin Red Staining (Gbr. 5h). Perhatikan tetesan lipid atau nodul terkalsifikasi dalam HADSC yang berbeda, sementara tidak ada struktur seperti itu di sel HEK293 kontrol (Gbr. 6h). Semua ini menunjukkan bahwa HADSC memenuhi kriteria sel mesenkim.

karakterisasi HADSC. a Gambar representatif di bawah mikroskop kontras frase yang menunjukkan bahwa HADSC memiliki fenotipe seperti gelendong yang khas. b–g HADSC diinkubasi dengan antibodi yang terkonjugasi dengan pewarna berbeda terhadap penanda CD45, CD105, CD34 dan CD90 dan menjadi sasaran analisis aliran sitometrik. Diagram pencar ditunjukkan dalam b, c , dan histogram ditampilkan dalam d–g . Perhatikan bahwa sebagian besar sel diekspresikan CD90 dan CD105, tetapi tidak CD34 dan CD45. h Diferensiasi adipogenik dan diferensiasi osteogenik sel HADSC versus HEK293 dievaluasi masing-masing oleh Oil Red O atau Alizarin Red Staining. Bilah mewakili 20 μm

Rotasi yang diinduksi apomorfin adalah 17,1 ± 1,79, 28,7 ± 1,77 dan 31,86 ± 1,72 per menit pada minggu ke-1, ke-2 dan ke-3 setelah injeksi 6-OHDA, yang mengkonfirmasi keberhasilan pembentukan model PD tikus. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, jumlah rotasi model tikus PD berkurang menjadi 32.59 ± 1.12, 31.85 ± 1.98 dan 31.54 ± 1.73 pada minggu ke-1, ke-2 dan ke-3 diikuti dengan transplantasi HADSC berlabel NP di striatum sisi lesi. Analisis statistik mengungkapkan perbedaan yang signifikan antara saline dan kelompok yang diberikan HADSC dari minggu ke-2 setelah operasi transplantasi (p < 0.01 pada minggu ke-2, p < 0.01 pada minggu ke-3; n = 5 di setiap kelompok), menunjukkan HADSC berlabel NP meningkatkan gangguan perilaku dalam model PD.

Model tikus PD diberikan dengan HADSC berlabel saline atau USPIO-PAA/PEG di striatum ipsilateral yang terganggu dengan 6-OHDA, dan angka rotasi per menit dinilai dan dibandingkan. Ada pengurangan yang signifikan dari jumlah rotasi pada minggu ke-2, ke-3 setelah tikus PD yang menerima HADSC, dibandingkan dengan tikus PD yang menerima saline. n menunjukkan perubahan yang tidak signifikan, dan ** menunjukkan p < 0.01. n = 5 untuk setiap grup

PD ditandai dengan hilangnya neuron yang mengekspresikan tirosin hidroksilase (TH) di substansia nigra. By using immunostaining against TH, we found that 6-OHDA reduces the TH-expressing neurons in the substantia nigra, and the transplantation with HADSCs in the striatum of PD rat models could alleviate such reduction (Fig. 8). Combined with the observation that cell transplantation alleviates the behavioral impairments of PD rats, we concluded that USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs exert therapeutic effects in PD rat models.

Immunostaining against TH in the substantia nigra of the rats receiving saline (a , d , g ), PD rats receiving saline (b , e , h ) or PD rats receiving USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs (c , f , i ). The area in the dashed frame indicates the compact area of substantia nigra (SNc) and the ventral tegmental area (VTA). Images in the boxes of d , e , f are enlarged and shown in g , h , i , masing-masing. There are less TH-expressing cells in the SNc and VTA regions in the rats receiving 6-OHDA injection, as compared to the controls receiving saline. Following by HADSC transplantation, more of TH-expressing cells in the SNc of PD rats could be observed. The bar represents 100 μm

Discussion

Cell therapy is a promising strategy for the treatment of neurodegenerative diseases and has been in the front edge of preclinical research over the last 20 years [29, 30]. Tracing the transplanted cells is an indispensable part for the clarification of underlying mechanisms as well as the evaluation of clinical effects; however, it is challenging and to some extent, hampered the application of cell therapy [31, 32]. Computed tomography (CT), near-infrared fluorescence imaging (NIFI) and MRI are the most commonly used methods for the in vivo tracking of transplanted cells [31, 32]. Compared to the rather high radiation of CT and low sensitivity of NIFI, MRI shows good imaging of deep tissue, high contrast and low ionizing radiation, making it a good candidate for the in vivo tracing [33,34,35,36]. The development of proper tracers for MRI therefore becomes an indispensable part of promoting the application of cell therapy.

SPIO is a simple and reliable labeling strategy for MRI visualization. To achieve long-term in vivo tracing of the transplanted cells, the SPIO particles is required to have a uniform and ultrasmall size, since large particles may lead to uneven distribution of the tracers and interfere with the normal blood circulation [33]. Moreover, the internalization efficiency and biocompatibility of nanoparticles are another important index to evaluate the tracers. Nanoparticles usually enter cells through liquid phase endocytosis [37], receptor-mediated endocytosis [38] and phagocytosis [39]. To achieve a better cellular uptake, the SPIO particles are usually modified with intermediate ligands [18, 40, 41].

Besides cell tracking, SPIO has also been applied for drug delivery [42]. The tissue distribution and pharmacokinetic clearance are important index for both applications. Compared to the NPs-PAA, NPs-PAA/PEG showed longer retention time in blood and slower urinary clearance [43]. NPs densely coated with PEG provide much more uniform distribution over mucosal epithelial surfaces, including the gastrointestinal tract [44], respiratory system [45, 46] and brain tumor [42], etc. Moreover, PEG coating reduces the attachment of proteins and formation of corona, which in turn might promote uniform distribution of the NPs at the cost of reduced uptake [47]. As a potential good diagnostic and therapeutic tool, the labeling capacity of SPIO-PAA/PEG to MSCs and its further application in brain disorders such as PD have not been well studied, and the present study was designed to answer this question. In the present study, we synthesized a novel ultrasmall USPIO-PAA/PEG nanoparticles, modifying the SPIO cores with PAA and PEG ligands, respectively. The USPIO-PAA/PEG NPs have uniform ultrasmall diameter (10.07 ± 0.55 nm), good dispersion in aqueous solution, biocompatibility with various cell types as well as good magnetic response effect in vitro and in vivo. Importantly, the signals of labeled HADSCs could be clearly detected under MRI after brain transplantation for up to three weeks, indicating the good potential for clinical application.

PD is characterized by a progressively loss of dopaminergic neurons in the substania nigra, and by the deficiency of dopaminergic levels in the dopaminergic networks [1]; the most affected one is the nigrostriatal pathway including the striatum. In the present study, we transplanted USPIO-PAA/PEG-labeled HADSCs into the striatum of PD rat models, and found that such transplantation improved the behavioral impairments; moreover, it attenuated the loss of dopaminergic neurons in the substania nigra to some extent. Similarly, Ardeshir et al. reported that transplanting the MSCs derived from rat adipose tissues attenuated apomorphine-induced rotations in PD models [48]. Different from transplanting fetal midbrain tissues [49] or dopaminergic neural progenitors [50], HADSCs exert its therapeutic effects mainly through the paracrine effects [51, 52], rather than substituting for the impaired tissues. Studies have shown that MSCs act as promoters of immunomodulation, neuroprotection and neuronal differentiation, and these effects are essentially mediated by the secretome released by MSCs [6, 7, 51]. Our result is consistent with these observations; moreover, it indicates that the novel USPIO-PAA/PEG tracers did not interfere with the neuroprotection effects of HADSCs.

Conclusions

We have developed a novel USPIO-PAA/PEG tracers showing high cell uptake efficiency, excellent biocompatibility and long-term MRI tracing capacities. The HADSCs labeled with USPIO-PAA/PEG could be traced with MRI for 3 weeks after cell transplantation. Moreover, the labeled HADSCs significantly attenuated the behavioral impairments of PD models, and increase the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra. The development of USPIO-PAA/PEG tracer may provide a promising tool in stem cell research and application.

Ketersediaan data dan materi

All data supporting the conclusions of this article are included within the article.

Singkatan

SPIO:

Small superparamagnetic iron oxide

USPIO:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide

PAA:

Polyacrylic acid

PEG:

Methoxypolyethylene glycol amine

HADSCs:

Human adipose-derived stem cells

USPIO-PAA/PEG:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles coating with the polyacrylic acid and methoxypolyethylene glycol amine

6-OHDA:

6-Hydroxydopamine

CT:

Computed tomography

NIFI:

Near infrared fluorescence imaging

MRI:

Magnetic resonance imaging

TH:

Tyrosine hydroxylase

TEM:

Mikroskop elektron transmisi

Merencanakan Dosis Hipertermia Nanopartikel Cs0.33WO3 Teriradiasi NIR untuk Sel Kanker Hepatik HepG2 Panduan Cahaya Optimalisasi Ketebalan Lapisan untuk Peningkatan Efisiensi Ekstraksi Cahaya Ultraviolet Light–Emitting Diodes