Nanopartikel Oxida Besi Superparamagnetik Ultrakecil untuk Pelacakan Sel Stem dalam Terapi Parkinson
Abstrak
Penyakit Parkinson ditandai dengan kehilangan progresif neuron dopaminergik di otak tengah, dan metode transplantasi sel stem menyediakan strategi yang menjanjikan untuk pengobatan. Dalam studi ini, pelacakan perilaku biologis sel yang ditransplantasi in vivo sangat penting untuk pemahaman dasar fungsi sel stem dan evaluasi efektivitas klinis. Dalam studi saat ini, kami mengembangkan nanoparticle oksida besi superparamagnetik ultrakecil baru yang dilapisi dengan asetat poliakril (PAA) dan amina polietilena glikol metoksi (PEG) dengan metode dekomposisi termal dan modifikasi dua tahap. NP USPIO-PAA/PEG memiliki diameter seragam 10,07 ± 0,55 nm dan puncak absorpsi yang sesuai dengan ligan, seperti yang ditunjukkan oleh TEM dan FTIR. MTT menunjukkan bahwa kelangsungan sel yang diinkubasi dengan NP USPIO-PAA/PEG tetap di atas 96%. USPIO-PAA/PEG yang disintesis memiliki laju relaksasi yang baik sebesar 84,65 s−1 Mm−1, yang menunjukkan bahwa mereka dapat diambil secara efisien dan dilacak oleh MRI. Selanjutnya, sel stem yang berasal dari lemak manusia primer (HADSCs) dikarakterisasi, dilabeli dengan USPIO-PAA/PEG dan ditransplantasi ke striatum tikus model PD yang diinduksi oleh 6-hidroksidopamin (6-OHDA). Sel yang dilabeli dapat dilacak oleh MRI hingga 3 minggu setelah operasi transplantasi; selain itu, transplantasi dengan HADSCs yang dilabeli secara signifikan mengurangi rotasi yang diinduksi oleh apomorfine dalam model PD dan meningkatkan jumlah neuron dopaminergik di substantia nigra. Secara keseluruhan, pengembangan NP USPIO-PAA/PEG menyediakan alat yang menjanjikan untuk teknik pelacakan in vivo dari terapi sel dan mengidentifikasi strategi baru untuk melacak sel stem dengan potensi terapeutik pada PD.
Pendahuluan
Penyakit Parkinson adalah penyakit neurodegenereneratif yang ditandai dengan kehilangan progresif neuron dopaminergik di otak tengah. Gangguan yang relatif fokal menjadikannya kandidat yang baik untuk terapi berbasis sel. Beberapa tipe sel, yang bervariasi dari jaringan otak tengah fetal [1] hingga neuron yang diinduksi dari sel stem embryonic (ESC) atau sel stem pluripotent terinduksi (iPSC) [2], telah terlibat dalam pengobatan PD; namun, kekhawatiran etis dan risiko potensial tumorigenik tidak dapat dihindari dalam penerapannya [3]. Sel stem mesenkimal (MSC) adalah populasi sel stem multipoten yang telah dilaporkan dalam dekade terakhir sebagai alat terapeutik yang menjanjikan untuk penyakit neurodegenereneratif, termasuk PD [4, 5]. Dibandingkan dengan tipe sel lain, MSC menunjukkan proliferasi yang baik, ketersediaan yang luas di seluruh tubuh manusia dan kemampuan imunosupresi. Beberapa studi telah menunjukkan bahwa transplantasi intrakranial MSC mempromosikan neuroproteksi, diferensiasi neuron dan imunomodulasi [6,7,8]. Dalam studi ini, pelacakan kelangsungan hidup, migrasi dan integrasi sel yang ditransplantasi in vivo sangat penting untuk pemahaman dasar fungsi sel stem dan evaluasi efektivitas klinis.
Untuk menganalisis lebih baik efek terapeutik dari sel yang ditransplantasi, berbagai penelusur telah dikembangkan. Keamanan dan efektivitas penelusur adalah faktor paling kritis yang mempengaruhi penerapan. Dibandingkan dengan pelabelan dengan protein floresen [9], pelacakan menggunakan partikel oksida besi superparamagnetik (SPIO) tidak akan membawa modifikasi genetik pada sel yang ditransplantasi [10,11,12]. Beberapa studi telah menggunakan SPIO sebagai agen kontras yang efektif untuk memvisualisasikan dan melacak sel yang ditransplantasi [6, 13, 14]. Namun, beberapa SPIO yang tersedia secara komersial telah dilaporkan mempengaruhi fungsi normal MSC [15,16,17]; oleh karena itu, upaya yang luas telah dilakukan untuk mengembangkan SPIO baru. Dalam studi ini, kami menyintesis nanoparticle SPIO ultrakecil (USPIO) yang dilapisi dengan asetat poliakril (PAA) dan lapisan amina polietilena glikol metoksi (PEG) yang kemudian. USPIO-PAA/PEG baru menunjukkan internalisasi sel yang baik dan kapasitas pelacakan MRI jangka panjang in vitro dan in vivo. Selain itu, MSC yang berasal dari jaringan lemak manusia (HADSCs) yang dilabeli dengan USPIO-PAA/PEG mempertahankan fitur biologis, meningkatkan gangguan perilaku dan meningkatkan reaktivitas TH di substantia nigra model hewan PD.
Bahan dan Metode
Bahan
Asetilasetonat besi, TREG (trietilena glikol), dietilena glikol dan PEG dibeli dari Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China). Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) dibeli dari Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, China). Medium dulbecco yang dimodifikasi (DMEM), trypsin–EDTA (0,25%) dan serum bayi sapi (FBS) dibeli dari Thermo Fisher Scientific. 1-(3-Dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimida hidroklorida dan N-Hidroksi suksinimida dibeli dari Sigma-Aldrich (China). N, N-Dimetilformamida, alkohol etil murni dan asetat etil dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Corporation. Air ultra murni dihasilkan oleh sistem pemurnian air Millipore pure and ultrapure. Anti-CD90-FITC manusia, anti-CD45-PE manusia, anti-CD34-FITC manusia dan anti-CD105-PE manusia dibeli dari Biolegend.
Sintesis USPIO
USPIO disintesis dengan metode poliol seperti penelitian sebelumnya [18,19,20,21]. Langkah eksperimen adalah sebagai berikut: asetilasetonat besi 1 mmol dan TREG 25 mL dicampur dalam kolong leher tiga, yang terhubung dengan argon, kondensor bola dan termometer. Setelah diinkubasi dengan aliran argon selama 15 menit, larutan dicampur dipanaskan ke 120℃ (laju pemanasan 3 °C/min) dan dipelihara selama 1 jam, kemudian larutan dicampur dipanaskan lebih lanjut ke 250 °C dengan laju pemanasan yang sama dan dipelihara selama 30 menit. Larutan reaksi didinginkan secara alami ke suhu ruangan, dicampur dengan 2 mL alkohol etil murni, kemudian dipresipitasi dengan asetat etil. Sedimen dikoleksi dengan sentrifugasi pada 8000 rpm selama 20 menit dan kemudian didispersikan ulang dalam alkohol etil murni. USPIO disimpan dalam alkohol etil murni pada 4 °C untuk penggunaan selanjutnya.
Persiapan USPIO Dilapisi PAA/PEG
USPIO-PAA diperoleh sesuai dengan laporan sebelumnya [22]. Secara rinci, asetat poliakril (PAA) 1,5 g dilarutkan dalam 24 mL dietilena glikol. Setelah aliran argon selama 5 menit, larutan dicampur dipanaskan ke 110 °C dan dipelihara hingga larutan benar. Larutan dispersi etanol yang berisi 28 mg USPIO yang disiapkan dalam langkah sebelumnya ditambahkan ke larutan yang diuraikan di atas setelah dispersi ultrasonik. Larutan akhirnya dipanaskan ke 210 °C dengan laju 3 °C/min. Reaksi dihentikan setelah 2 jam reflux dan didinginkan secara alami ke suhu ruangan. Setelah pendinginan, asetat etil ditambahkan ke larutan reaksi untuk mengpresipitasi NP USPIO dan kemudian difusigesenter pada 8000 rpm selama 20 menit untuk mengeluarkan supernatant. Sedimen kemudian didispersikan dalam etanol, diikuti dengan presipitasi dengan asetat etil. Setelah prosedur pencuci dilakukan tiga kali, USPIO-PAA didispersikan dalam air ultra murni untuk penggunaan selanjutnya. Untuk meningkatkan biokompatibilitas, kami lebih lanjut menghubungkan PEG ke permukaan nanoparticle dengan amidasi yang di mediated EDC dan NHS [23]. 0,45 g PEG dilarutkan dalam 5 ml air ultra murni dan ditambahkan ke 15 ml dispersi USPIO-PAA (mengandung 35 mg Fe) yang dilengkapi dengan 20 mg EDC dan 12 mg NHS. Larutan dicampur secara mekanis pada suhu ruangan selama 2 jam, kemudian 10 ml pelarut DMF ditambahkan, mengeluarkan air pada 40℃ dalam aparatur penguapan rotatif. Akhirnya, 40 mg DEC dan 24 mg NHS ditambahkan ke larutan, dicampur pada suhu ruangan selama 48 jam. Larutan reaksi dipindahkan ke kantong dialisis dalam air ultra murni selama 72 jam, selama yang air ultra murni diganti setiap 12 jam. Larutan lebih lanjut dipindahkan ke tabung ultrafiltrasi untuk mengkoleksi molekul dengan Mr > 30 kD dengan sentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit. Produk akhir dilarutkan dalam air ultra murni dan disimpan pada 4 °C. Dalam beberapa kasus, SPIO-PAA/PEG yang dilarutkan dalam air dikoleksi dengan sentrifugasi dengan tabung sentrifugasi ultrafiltraksi (> 30 KD ukuran pori, Millipore), dan pelet dikeringkan dalam oven vakum untuk eksperimen selanjutnya.
Karakterisasi Nanopartikel
Ukuran partikel, distribusi ukuran dan morfologi sampel dianalisis dengan TEM. Lapisan lapisan diukur dengan pewarnaan negatif. Setelah dispersi ultrasonik, USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG dalam larutan air ditambahkan ke jaringan tembaga 300-mesh membran karbon pendukung, dikeringkan secara alami dan kemudian dimasukkan ke mikroskop proyeksi elektron (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) untuk pengamatan.
Analisis spektroskopi inframerah dilakukan pada Spektrometer FTIR Agilent Technologies Cary 600 Series, di mana bubuk sampel yang kering ditambahkan secara langsung ke tangki sampel untuk deteksi.
Konten Fe dalam dispersi USPIO-PAA/PEG ditentukan dengan spektrometri serapan atom api (FAAS), modelnya adalah PerkinElmer Analyst 700. Pertama, larutan standar besi 1, 2, 3, 4 dan 5 μg/mL disiapkan untuk menggambar kurva standar, dan kemudian 100 μL dispersi USPIO-PAA atau USPIO-PAA/PEG dilarutkan dengan asam nitrat, dan konten besi ditentukan dalam kolum ukur 50 mL.
Citra resonansi magnetik nanoparticle dilakukan pada scanner klinis dengan medan magnet 3 T di departemen citra dari rumah sakit pertama affiliated Universitas Soochow. Nanopartikel didispersikan dalam larutan gel agarose 1% sesuai dengan konsentrasi yang sesuai. Setelah larutan membeku, waktu relaksasi melintang sampel diukur dengan urutan multi-echo. Ekspor akuisisi MRI dalam format DICOM dan kemudian menggunakan RadiAnt DICOM Viewer untuk membuka, membaca nilai abu-abu, dengan mengimpor nilai abu-abu dari berbagai waktu echo ke origin untuk pemasangan, nilai waktu relaksasi melintang dispersi USPIO dengan berbagai konsentrasi diperoleh; akhirnya, laju relaksasi melintang r2 dari sampel USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG diperoleh dengan pemasangan linier dengan laju relaksasi melintang 1/T2 dan konsentrasi Fe dari sampel. Lister histeteris magnetik USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG diperoleh dengan menggunakan perangkat Quantum Design DynaCool-9 di Universitas Sains dan Teknologi Suzhou sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya [24].
Isolasi dan Identifikasi HADSCs
Semua studi dilakukan sesuai dengan ‘Pedoman Etika pada Penelitian Sel Stem Embryonik Manusia’ (Kementerian Ilmu Pengetahuan dan Teknologi dan Kementerian Kesehatan, Republik China, 2003) dan Deklarasi Helsinki. Sampel lemak diperoleh dengan persetujuan yang diawasi dan persetujuan etika dari rumah sakit pertama affiliated Universitas Soochow. Jaringan lemak dicuci dan dipotong menjadi potongan-potongan kecil setelah menghapus pembuluh darah dan jaringan konektif di bawah mikroskop anatomis. Blok didestraksi dengan kolagenase tipe I (0,3 pzu/mL) pada 37 °C selama 30 menit, diikuti dengan sentrifugasi pada 500g selama 10 menit. Pelet sel didispersikan dalam DMEM + 10% FBS dan ditanam dengan kepadatan 8 × 104/cm2. Setelah 48 jam, medium lama yang berisi sel yang terapung dibuang dan diganti dengan medium segar.
HADSCs dikarakterisasi dengan sitometrika aliran untuk penanda permukaan yang secara spesifik melabeli sel stem mesenkimal (CD90 dan CD105) dan hematopoietik (CD34 dan CD45). Total 1 × 105 sel dipanen dan diinkubasi dengan antibodi yang dikonjugasi dengan PE, FITC, APC/cy7 atau PerCP terhadap CD34, CD45, CD90 dan CD105 monoklonal antihuman tikus serta kontrol isotipe yang sesuai. Sel yang diwarnai dianalisis menggunakan sitometer aliran (LSRFortessa, BD, USA), dan data dianalisis dengan perangkat lunak FlowJo. Fenotipe CD90+, CD105+, CD34− dan CD45− dipilih untuk penanda permukaan HADSCs. Tingkat ekspresi penanda permukaan sel diidentifikasi dengan sitometrika aliran (BD LSRFortessa).
Diferensiasi adipogenik dan osteogenik HADSCs dievaluasi dengan pewarnaan Oil Red O dan Alizarin Red, masing-masing. HADSCs dibudidayakan dengan medium Diferensiasi Adipogenik MesenCultTM (Stem cell Tech., 05412) atau Kit Diferensiasi Osteogenik OriCellTM (Cyagen, HUXMA-90021). Untuk diferensiasi adipogenik HADSCs, sel dinilai pada hari ke-14 dengan pewarnaan kualitatif Oil Red O untuk adiposit matang yang terisi lipid (VivaCell Biosciences, C37A00150). Untuk diferensiasi osteogenik HADSCs, sel dinilai pada hari ke-21 dengan pewarnaan Alizarin Red untuk nodul kalsium dalam osteosit matang (VivaCell Biosciences, C37C00150). Citra diperoleh menggunakan mikroskop terbalik Nexcope.
Pengambilan USPIO-PAA/PEG oleh Sel In Vitro dan Evaluasi Biokompatibilitas
HADSCs ditanam dalam paparan 6-lubang dengan kepadatan 1 × 106 per lubang. Sel diinkubasi dengan medium yang berisi USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL dan 0,1 μg/mL) selama 2 jam, dan diwarnai dengan pewarnaan biru Prussia (PB) untuk identifikasi Fe intrakeluler.
Biokompatibilitas USPIO-PAA/PEG ditentukan dengan warna MTT dan uji insersi etinil-2′-deoksiurosidin (EdU) (kit proliferasi EdU, Thermo). Untuk MTT, HADSCs ditanam dalam paparan 96-lubang dengan kepadatan 5 × 103 per lubang dan diinkubasi dengan berbagai konsentrasi (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL) USPIO-PAA/PEG 24 jam, 48 jam atau 72 jam. 20 μl larutan MTT (5 mg/mL) ditambahkan ke setiap lubang selama 4 jam, diikuti dengan 150 μL dimetil sulfoksida untuk melarutkan kristal. Nilai serapan setiap lubang diukur pada OD 570 nm menggunakan instrumen terlabel enzim (BioTek Synergy HT). Untuk uji EdU, HADSCs diinkubasi dengan SPIO-PAA/PEG pada 160 Fe μg/mL selama 72 jam, diikuti dengan penginobatan dengan 10 μM EdU selama 24 jam. Sel dikoleksi, dikonstanzikan dengan paraformaldehida 4% dan dinetralkan dengan glisin 2 mg/mL. Setelah permeabilisasi sel diinkubasi dengan larutan pewarna (kompleks Azide 647), tingkat insersi EdU dievaluasi dengan sitometrika aliran.
Model PD yang Diinduksi oleh 6-OHDA
Belas delapan tikus Wistar jantan (grade SPF, berat 220 ± 20 g) digunakan untuk pelacakan in vivo HADSCs yang dilabeli dengan USPIO-PAA/PEG pada hewan PD. Semua prosedur dilakukan sesuai dengan Peraturan di China (Peraturan untuk administrasi urusan mengenai hewan percobaan, 2017) dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusi di Akademi Ilmu Pengetahuan China. Sepanjangnya, hewan dipegang di bawah iluminasi yang dikontrol (siklus cahaya/gelap 12/12 jam, “nyala” pukul 7 pagi) dengan akses bebas ke makanan dan air. Model PD disiapkan dengan injeksi 2 titik 6-hidroksidopamin (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, USA) ke dalam striatum unilateral tikus. Seperti yang dijelaskan sebelumnya [25, 26], tikus disuntik stereotaksi dengan 3 μL larutan 6-OHDA (5 μg/μL) pada 2 koordinat (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: − 4,0 hingga 6,0 mm; dan AP: − 1,0 mm, ML: 4,4 mm, DV: − 4,5 hingga 6,5 mm), masing-masing. Uji rotasi yang diinduksi oleh apomorfine (0,5 mg/kg, subkutan) digunakan untuk menguji validitas model PD. Tikus disuntik apomorfine (0,5 mg/kg) subkutan pada 1, 2 dan 3 minggu setelah perawatan 6-OHDA, dan skor rotasi dievaluasi selama 30 menit di lapangan terbuka. Model PD memiliki lebih dari 7 rotasi per menit yang diinduksi oleh apomorfine dan dianggap berhasil.
Transplantasi Sel dan Citra MRI In Vivo
HADCs diinkubasi dengan USPIO-PAA/PEG (konsentrasi besi 10 μg/mL) selama 2 jam ketika mereka mencapai 80% konfluensi. 3 minggu setelah persiapan model PD, 3 × 106 HADCs yang dilabeli dengan USPIO-PAA/PEG atau saline disuntik ke striatum kiri model tikus PD pada koordinat berikut (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: − 4,0 hingga 6,0 mm). Hewan yang menerima transplantasi diberi buprenorphine (0,5 mg/kg) segera setelah operasi dan selama 2 hari setelahnya. Hewan ini diadili dengan uji rotasi yang diinduksi oleh apomorfine pada 1, 2 atau 3 minggu setelah operasi transplantasi.
Untuk citra MRI in vivo, hewan diimaj menggunakan sistem citra in vivo (IVIS) sistem citra hewan kecil (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) pada hari ke-3, ke-9, ke-15 dan ke-21 setelah injeksi saline atau HADSCs.
Analisis Histologi
Otak sisa model tikus dipanen dan diekstrak menjadi tebal 30 mm untuk analisis 3 minggu setelah transplantasi sel stem (n = 5 per kelompok). Potongan diinkubasi dengan anti-hidroksil tirosinase (TH, abcam, Inggris) dan divisualisasikan dengan antibodi anjing anti kelinci yang dikonjugasi Alexa-594 (Abcam). DAPI digunakan untuk pewarnaan kontras dengan inti sel. Citra ditangkap dengan mikroskop konfokal Leica TCS SP5.
Analisis Statistik
Data numerik dinyatakan sebagai rata-rata ± SD. Data dilakukan uji t 2-ekor Student atau ANOVA satu arah menggunakan GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) untuk mengevaluasi perbedaan. * menunjukkan p < 0,05 dan NS menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan.
Hasil
Sintesis dan Karakterisasi Nanopartikel
Desain eksperimental ditampilkan pada Gambar 1. Nanopartikel USPIO hidrofobik disiapkan dengan menggunakan metode dekomposisi termal. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 2a–c, diameter nanoparticle USPIO asli adalah 4,07 ± 0,57 nm; dengan pelapisan PAA, diameter nanoparticle USPIO-PAA meningkat menjadi 6,34 ± 0,54 nm; modifikasi lebih lanjut nanoparticle dengan PEG membuat diameter nanoparticle USPIO-PAA/PEG mencapai 10,07 ± 0,55 nm. Ketiga nanoparticle berbentuk bola dan terdistribusi merata. Analisis statistik menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan (F = 10, **p < 0,01, ##p < 0,01) di antara diameter nanoparticle USPIO, USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG, yang menunjukkan modifikasi yang berhasil dengan PAA dan PEG (Gambar 2d).
Ilustrasi skematik desain eksperimental
Karakterisasi nanoparticle. a–c Citra TEM representatif dari NP USPIO (a), NP USPIO-PAA (b) dan NP USPIO-PAA/PEG (c). d Analisis statistik menunjukkan perbedaan yang signifikan di antara ukuran partikel USPIO, USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG (n = 20 per kelompok). e Inframerah Fourier-transform dari nanoparticle USPIO, USPIO-PAA dan NP USPIO-PAA/PEG. Panah menunjukkan puncak absorpsi spesifik pada 1728 cm−1 karena modifikasi PAA, 1595 cm−1 dan 3440 cm−1 karena modifikasi PEG. Data numerik ditampilkan sebagai rata-rata ± SD, **p < 0,01 versus NP USPIO, ##p < 0,01 versus NP USPIO-PAA/PEG. Bar mewakili 20 nm
Dengan menggunakan metode absorpsi inframerah, kami menemukan bahwa USPIO-PAA memiliki puncak absorpsi karbonil yang jelas pada 1728 cm−1 karena puncak getaran stretching karbonil dalam molekula PAA; USPIO-PAA/PEG memiliki puncak getaran bending dalam bidang ikatan karbon–nitrogen pada 1595 cm−1 dan puncak getaran stretching hidroksil pada 3440 cm−1 (Gambar 2e). Semua data ini lebih lanjut mengonfirmasi bahwa molekul PAA atau PEG telah berhasil dimodifikasi pada permukaan NP.
USPIO-PAA/PEG Menunjukkan Respons Magnet In Vitro yang Baik dan Biokompatibilitas dengan HADSC
Kemampuan citra in vitro USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG dievaluasi dengan nilai abu-abu citra MRI pada berbagai konsentrasi (setara dengan konsentrasi Fe). Setelah pemasangan, nilai waktu relaksasi melintang dari dispersi pada berbagai konsentrasi diperoleh. Dengan menetapkan laju relaksasi melintang 1/T2 sebagai koordinat vertikal dan konsentrasi Fe sebagai koordinat horizontal, laju relaksasi melintang USPIO-PAA dihitung sebesar 107,94 s−1 mm−1 (Gambar 3a), dan 84,65 s−1 mm−1 untuk USPIO-PAA/PEG (Gambar 3b). Keduanya menunjukkan properti citra MRI yang baik. Lister histeteris magnetik SPIO-PAA dan SPIO-PAA/PEG menunjukkan bahwa nilai magnetisasi saturasi SPIO-PAA adalah 57 emu/g di atas 10.000 Oe (Gambar 3c), dan untuk SPIO-PAA/PEG adalah 40 emu/g di atas 10.000 Oe (Gambar 3d). Gaya paksa dan remanensi mendekati nol (Gambar 3c, d), lebih lanjut menunjukkan bahwa baik SPIO-PAA maupun SPIO-PAA/PEG adalah superparamagnetik.
Respons magnet in vitro dari NP USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG yang disintesis. a, b MRI dan laju relaksasi melintang dari NP USPIO-PAA (a) dan NP USPIO-PAA/PEG (b). r2 mewakili laju relaksasi. Laju relaksasi dari NP USPIO-PAA dan USPIO-PAA/PEG adalah 107,94 s−1 mM−1 dan 84,65 s−1 mM−1. c, d lister histeteris magnetik dari NP USPIO-PAA (c) dan NP USPIO-PAA/PEG (d). Lister histeteris magnetik diukur pada 295 k (21,85 °C) dengan intensitas medan magnet maksimum 50.000 Oe (5 Tesla). Nilai magnetisasi saturasi mendekati 57 emu/g untuk SPIO-PAA dan 40 emu/g untuk SPIO-PAA/PEG. Histeteris magnetisasi pada kedua kurva mendekati nol
Dengan menginkubasi NP USPIO-PAA/PEG dengan HADSCs untuk berbagai waktu, kami menemukan bahwa NP USPIO-PAA/PEG tidak memiliki efek signifikan terhadap kelangsungan sel (p > 0,05). Kelangsungan hidup HADSCs tetap di atas 96% ketika konsentrasi Fe setara berkisar dari 0 hingga 160 μg/mL. Selain itu, peningkatan waktu inkubasi (dari 24 hingga 72 jam) tidak mengakibatkan kehilangan sel yang signifikan pada setiap konsentrasi Fe (Gambar 4a). Pengamatan serupa diperoleh ketika NP USPIO-PAA/PEG diinkubasi dengan iPSC pada berbagai konsentrasi (Gambar 4b). Meski HADSCs dirawat dengan USPIO-PAA/PEG 160 μg Fe/mL selama 72 jam, kemampuan proliferasi, seperti yang diindikasikan oleh tingkat insersi EdU, tidak terganggu oleh kehadiran USPIO-PAA/PEG (Gambar 4c). Semua data ini mengindikasikan biokeamanan NP USPIO-PAA/PEG yang disintesis.
NP USPIO-PAA/PEG yang disintesis menunjukkan biokompatibilitas dan kemampuan pelabelan yang baik. a, b HADSCs atau iPSC diinkubasi dengan NP USPIO-PAA/PEG pada konsentrasi yang bervariasi (setara dengan konsentrasi Fe pada 0, 10, 20, 40, 80 dan 160 μg Fe/mL) selama 24, 48, dan 72 jam, dan kelangsungan sel ditentukan dengan metode MTT dan ditampilkan pada a, b, masing-masing. Tidak ada perbedaan yang signifikan di antara kelangsungan hidup pada konsentrasi NP yang berbeda (n = 5) atau waktu inkubasi (n = 5). c Analisis sitometrika aliran menunjukkan bahwa tingkat insersi EdU serupa pada HADSCs yang diinkubasi dengan atau tanpa kehadiran USPIO-PAA/PEG (160 μg Fe/mL selama 72 jam). HADSCs yang tidak dirawat dengan EdU digunakan sebagai kontrol negatif. d USPIO-PAA/PEG pada 10 μg Fe/mL dan waktu inkubasi selama 2 jam menghasilkan hampir 100% efisiensi pelabelan HADSCs, seperti yang dievaluasi dengan pewarnaan biru Prussia. Perhatikan bahwa USPIO-PAA/PEG pada 0,1 μg Fe/mL (waktu inkubasi 2 jam) menghasilkan pewarnaan PB yang ringan namun merata pada HADSCs. Data numerik ditampilkan sebagai rata-rata ± SD. Bar mewakili 20 μm
Untuk mengidentifikasi apakah sel dapat difabeli secara efektif oleh NP USPIO-PAA/PEG, kami telah menginkubasi HADSCs dengan NP USPIO-PAA/PEG pada konsentrasi Fe setara 10 μg/mL atau 0,1 μg/mL selama 2 jam. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 4d, sejumlah besar NP yang diwarnai biru diamati dalam hampir 100% HADSCs dalam kehadiran USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL). Meskipun dosis USPIO-PAA/PEG dikurangi menjadi 0,1 μg Fe/ml, kami masih mengamati pewarnaan PB yang cukup merata dan terdistribusi dalam hampir semua HADSC. Dibandingkan dengan beberapa SPIO yang telah dilaporkan sebelumnya [14, 27, 28], USPIO-PAA/PEG menunjukkan efisiensi penyerapan sel yang tinggi.
Pelacakan Jangka Panjang HADSCs yang Dilabeli dengan NP USPIO-PAA/PEG dalam Model Tikus PD
HADSCs yang dilabeli dengan NP USPIO-PAA/PEG ditransplantasi ke striatum kiri model tikus PD dengan injeksi stereotaktik. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 5, kami mengamati sinyal MRI yang jelas di striatum kiri 3 hari setelah transplantasi HADSC, yang menunjukkan pelacakan in vivo yang tepat dari sel yang ditransplantasi. Observasi dinamis pada D3, D9, D15 dan D21 setelah transplantasi menunjukkan bahwa sel yang ditransplantasi dengan pelabelan NP dapat dilacak secara jelas hingga 3 minggu, dan sinyal MRI tidak menunjukkan penurunan yang jelas selama proses tersebut. Hasil ini menunjukkan bahwa nanoparticle yang disintesis memiliki potensi yang baik untuk pelacakan in vivo dari sel yang ditransplantasi.
Citra MRI representatif dari otak pada 3 hari, 9 hari, 15 hari dan 21 hari diikuti oleh transplantasi dengan HADSCs yang dilabeli dengan USPIO-PAA/PEG atau saline. Citra MRI dari kontrol yang sesuai, yaitu tikus normal atau model tikus PD yang diuntik saline, ditampilkan pada baris pertama dan kedua, masing-masing. Perhatikan bahwa dibandingkan dengan sinyal negatif pada kontrol, otak tikus yang ditransplantasi dengan HADSCs yang dilabeli dengan USPIO-PAA/PEG menunjukkan sinyal MRI yang konstan dan jelas hingga 21 hari. Bar mewakili 5 mm
HADSCs yang Dilabeli dengan NP USPIO-PAA/PEG Menunjukkan Efek Terapetik dalam Model PD
Untuk mengevaluasi apakah HADSCs yang dilabeli dengan NP menunjukkan efek terapetik, kami terlebih dahulu melakukan karakterisasi fenotipik dari HADSCs yang terisolasi. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 6a, HADSCs yang dibudayakan adalah sel berbentuk fusiform. Analisis sitometrika aliran menunjukkan bahwa HADSCs sangat mengekspresi penanda untuk sel mesenkimal, seperti CD90 (> 99%) dan CD105 (> 99%), sedangkan sebagian kecil dari mereka mengekspresi penanda hematopoietik seperti CD34 dan CD45 (Gambar 6b–g). HADSCs dapat berbeda menjadi linia adipogenik atau osteogenik dalam kondisi tertentu, dan kapasitas diferensiasi ditampilkan oleh pewarnaan Oil Red O atau Alizarin Red, masing-masing (Gambar 5h). Perhatikan titik-titik lemak atau nodul terkalsium pada HADSCs yang berbeda, sementara tidak ada struktur tersebut pada sel kontrol HEK293 (Gambar 6h). Semua ini menunjukkan bahwa HADSCs memenuhi kriteria sel mesenkimal.
Karakterisasi HADSCs. a Citra representatif di bawah mikroskop kontras fasa yang menunjukkan bahwa HADSCs memiliki fenotipik fusiform khas. b–g HADSCs diinkubasi dengan antibodi yang dikonjugasi dengan pewarna yang berbeda terhadap penanda CD45, CD105, CD34 dan CD90 dan diadili dengan analisis sitometrika aliran. Diagram sipit ditampilkan pada b, c, dan histogram ditampilkan pada d–g. Perhatikan bahwa sebagian besar sel mengekspresi CD90 dan CD105, tetapi tidak CD34 dan CD45. h Diferensiasi adipogenik dan osteogenik HADSCs versus sel HEK293 dievaluasi dengan pewarnaan Oil Red O atau Alizarin Red, masing-masing. Bar mewakili 20 μm
Rotasi yang diinduksi oleh apomorfine adalah 17,1 ± 1,79, 28,7 ± 1,77 dan 31,86 ± 1,72 per menit pada minggu pertama, kedua dan ketiga setelah injeksi 6-OHDA, mengonfirmasi pembentukan model tikus PD yang berhasil. Seperti yang ditampilkan pada Gambar 7, jumlah rotasi model tikus PD berkurang menjadi 32,59 ± 1,12, 31,85 ± 1,98 dan 31,54 ± 1,73 pada minggu pertama, kedua dan ketiga diikuti oleh transplantasi HADSCs yang dilabeli dengan NP di striatum sisi lesi. Analisis statistik menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok yang diberi saline dan kelompok yang diberi HADSC sejak minggu kedua setelah operasi transplantasi (p < 0,01 pada minggu kedua, p < 0,01 pada minggu ketiga; n = 5 di setiap kelompok), yang menunjukkan bahwa HADSCs yang dilabeli dengan NP meningkatkan gangguan perilaku dalam model PD.
Model tikus PD diberi saline atau HADSCs yang dilabeli dengan USPIO-PAA/PEG di striatum ipsilateral yang rusak oleh 6-OHDA, dan jumlah rotasi per menit dicatat dan dibandingkan. Terdapat penurunan yang signifikan pada jumlah rotasi pada minggu kedua dan ketiga setelah tikus PD menerima HADSCs, dibandingkan dengan tikus PD yang menerima saline. ns menunjukkan perubahan yang tidak signifikan, dan ** menunjukkan p < 0,01. n = 5 untuk setiap kelompok
PD ditandai dengan kehilangan neuron yang mengekspresi hidroksil tirosinase (TH) di substantia nigra, dan oleh kekurangan tingkat dopamin dalam jaringan dopaminergik [1]; yang paling terpengaruh adalah jalur nigrostriatal termasuk striatum. Dalam studi ini, kami mentransplantasi HADSCs yang dilabeli dengan USPIO-PAA/PEG ke striatum model tikus PD, dan menemukan bahwa transplantasi tersebut meningkatkan gangguan perilaku; selain itu, mengurangi kehilangan neuron dopaminergik di substantia nigra hingga beberapa tingkat. Demikian pula, Ardeshir et al. melaporkan bahwa transplantasi MSC yang berasal dari jaringan lemak tikus mengurangi rotasi yang diinduksi oleh apomorfine dalam model PD [48]. Berbeda dengan transplantasi jaringan otak tengah fetal [49] atau prosesor neuron dopaminergik [50], HADSCs menunjukkan efek terapitiknya terutama melalui efek parakrin [51, 52], bukan dengan menggantikan jaringan yang rusak. Studi telah menunjukkan bahwa MSC bertindak sebagai promotor imunomodulasi, neuroproteksi dan diferensiasi neuron, dan efek ini pada dasarnya dimediasi oleh sekresi yang dirilis oleh MSC [6, 7, 51]. Hasil kami konsisten dengan observasi ini; selain itu, menunjukkan bahwa penelusur USPIO-PAA/PEG baru tidak mengganggu efek neuroproteksi HADSCs.
Kesimpulan
Kami telah mengembangkan penelusur USPIO-PAA/PEG baru yang menunjukkan efisiensi penyerapan sel yang tinggi, biokompatibilitas yang luar biasa dan kapasitas pelacakan MRI jangka panjang. HADSCs yang dilabeli dengan USPIO-PAA/PEG dapat dilacak dengan MRI selama 3 minggu setelah transplantasi sel. Selain itu, HADSCs yang dilabeli secara signifikan mengurangi gangguan perilaku model PD, dan meningkatkan jumlah neuron dopaminergik di substantia nigra. Pengembangan penelusur USPIO-PAA/PEG dapat menyediakan alat yang menjanjikan dalam penelitian dan aplikasi sel stem.
Ketersediaan Data dan Bahan
Semua data yang mendukung kesimpulan artikel ini termasuk dalam artikel.
Singkatan
SPIO:
Oksida besi superparamagnetik kecil
USPIO:
Oksida besi superparamagnetik ultrakecil
PAA:
Asetat poliakril
PEG:
Amin polietilena glikol metoksi
HADSCs:
Sel stem yang berasal dari lemak manusia
USPIO-PAA/PEG:
Nanopartikel oksida besi superparamagnetik ultrakecil yang dilapisi dengan asetat poliakril dan amina polietilena glikol metoksi
