Dielektroforesis Modulasi Frekuensi dari Vesikel dan Sel: Trajektori U-Turn Terprediksi pada Frekuensi Titik Potong

Latar Belakang

Polarabilitas sel didominasi oleh properti listrik membran dan sitoplasma, yang bervariasi dengan frekuensi medan yang diterapkan. Spektrum dielektrik yang bergantung pada frekuensi ini memungkinkan diskriminasi label-fre bebas dari fenotipa sel melalui spektroskopi impedansi, DEP arus bolak-balik (AC), DEP gelombang perjalanan (twDEP), dan elektrorotasi [1–16]. Dibandingkan metode labeling berbasis antibodi atau perekat, teknik listrik ini menghindari modifikasi sel dan aktivasi potensial, menjadikannya menarik untuk pengurutan sel non-invasif.

DEP timbul dalam medan listrik nonuniform, menghasilkan gaya yang proporsional terhadap gradien amplitudo medan dan bagian nyata faktor Clausius–Mossotti (CM). Gradien fase mengakibatkan twDEP atau elektrorotasi, yang memberikan informasi dielektrik komplementer. Karya kami memperluas DEP konvensional AC dengan memperkenalkan medan listrik FM, memungkinkan melintasi frekuensi titik potong f_X secara kontinu dan memungkinkan karakterisasi dielektrik yang cepat.

Dalam pengaturan DEP AC biasa, medan diterapkan antara elektroda mikrofabrikasi tetap, membatasi fleksibilitas spasial. Twezer elektron—di mana jarum elektroda mikromanipulasi memberikan medan—menawarkan alternatif bebas kontak yang serbaguna. Namun, pengukuran dielektrik memerlukan waktu paparan singkat (<30 s) untuk mengurangi efek aliran pelarut, yang sulit dengan sistem multi-elektroda. FM-DEP mengatasi ini dengan memodulasi frekuensi sambil menjaga geometri elektroda konstan.

Sistem plug-in kami (Fig. 1) employs dua jarum elektroda tungsten, masing-masing dengan diameter ujung 0,5 µm, diposisikan 100 µm terpisah. Jarum dipacu oleh generator gelombang arbitrari dan amplifier arus, dan seluruh rangkaian dipasang pada mikromanipulator patch-clamp di bawah mikroskop terbalik. Konfigurasi ini memungkinkan manipulasi nonkontak yang presisi pada vesikel atau sel individu di atas substrat.

Gelombang FM didefinisikan oleh

𝐸(𝐫,t)=𝐴(𝐫)cosθ(t),

dengan fasa terkait dengan frekuensi instan f(t) oleh θ̇=2πf(t). Kami menggunakan modulasi FM bandwidth lebar:

f(t)=fc+Δf cos(2πfmt),

di mana frekuensi modulasi f_m jauh lebih kecil dari rentang frekuensi pembawa, memenuhi kondisi batas lebar (WBL) Δf/f_m≫1.

Metode

Bahan-Bahan

MLV disiapkan dari 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC; Avanti Polar Lipids). Larutan DOPC 1 mL (20 mM) dalam kloroform/metanol (2:1 v/v) dikeringkan di bawah nitrogen dan divakum-kan selama >12 jam. Film tipis dihidrasi kembali dengan air deionisasi dan diinkubasi pada 25 °C selama beberapa jam.

Garis sel leukemia T sel manusia (JKT-β-del) dan leukemia B sel (CCRF-SB) dibudidayakan dalam RPMI 1640 yang dilengkapi dengan 10 % serum fetal bayi dan 100 mM piruvat natrium pada 37 °C, 5 % CO₂. Setelah 1 minggu, sel difusikan (370 g, 3 menit, dua kali) dan didispersikan kembali dalam 1 mL RPMI 1640. Suspensi kemudian dicairkan dalam sukrosa isotonic 200 mM untuk mencapai konduktivitas yang diinginkan.

Sel RB diisolasi dari darah sukarelawan sehat (awal dua puluh tahun). Sel didispersikan dalam campuran RPMI 1640 hematokrit 3,1 % dan dicairkan dengan sukrosa 200 mM. Semua eksperimen RB dilakukan dalam waktu 10 menit setelah pengambilan darah.

Setup Eksperimental

Konduktivitas suspensi diukur dengan meter SevenMulti (Mettler-Toledo). Medan FM atau AC dihasilkan oleh generator gelombang Agilent 33220A dan diperkuat oleh amplifier arus F30PV. Dua jarum tungsten 0,5 µm, dipisahkan 100 µm, memberikan medan. Pasang jarum diposisikan 50 µL suspensi pada panggung dipanaskan (25 °C). Pencitraan dilakukan dengan mikroskop Nikon TE2000-U dan kamera CCD Retiga Exi (25 fps). Resolusi frekuensi gelombang FM diverifikasi berada dalam kesalahan eksperimental.

Film tambahan S1–S3 menunjukkan manipulasi DEP AC sel diatom dalam air deionisasi: (S1) rotasi pada 30 kHz, (S2) mendorong ke dinding kaca pada 100 kHz, dan (S3) pengambilan pada 20 MHz.

Hasil dan Pembahasan

Observasi Eksperimental Sel Leukemia yang Mengalami FM-DEP

Jarum plug-in memungkinkan penerapan medan di atas substrat, memfasilitasi seleksi sel yang presisi. Film S4 menunjukkan sel diatom segitiga merespons lompat frekuensi 100–500 kHz pada interval 0,5 detik. Film S5 dan S6 menyajikan trajetori U-turn tipis dari sel TL di bawah FM-DEP (modulasi 0,25 Hz, 200 kHz ≤ f(t) ≤ 3 MHz). Gambar 2 menampilkan trajetori 3-D (x, y, t) di mana asalnya sesuai dengan ujung jarum. Sumbu x selaras dengan tangen permukaan elektroda; sumbu y mencerminkan amplitudo U-turn.

U-turn terdiri dari tiga fase: meninggalkan jarum, mendekati setelah U-turn, dan tinggal pada permukaan elektroda. Aliran pelarut sering mencegah kembali ke tempat yang sama, namun waktu meninggalkan dan awal U-turn jelas. Periode U-turn yang diamati (≈4 detik) cocok dengan periode modulasi 0,25 Hz.

Studi Teoritis tentang FM-DEP

Untuk partikel bola dengan permitivitas dalam ε_in dan konduktivitas dalam σ_in serta luar ε_out, σ_out, gaya DEP adalah

𝐹DEP(𝐫,t)=𝐩(𝐫,t)·∇𝐸(𝐫,t),

dengan momen dipol

𝐩(𝐫,t)=4πR3εoutKH{𝐸(𝐫,t)+ (τ/Δτ) Ẽ(𝐫,t)},

di mana K_H=(ε_in–ε_out)/(ε_in+2ε_out), Δτ^–1=τ₀^–1–τ^–1, dan τ₀ dan τ adalah waktu karakteristik yang didefinisikan dalam teks. Rata-rata melalui siklus AC menghasilkan gaya DEP rata-rata

⟨𝐹DEP⟩=χ(fAC)∇𝐴RMS2,

di mana χ(f) proporsional terhadap bagian nyata faktor CM.

Mengganti medan AC dengan gelombang FM dan memanggil WBL, gaya DEP rata-rata menjadi

⟨𝐹DEP(𝐫,t)⟩=χ{f(t)}∇𝐴RMS2,

menunjukkan bahwa arah gaya berubah setiap kali f(t) melintasi f_X. Ini menjelaskan U-turn periodik yang diamati secara eksperimental.

Menyelesaikan untuk saat ketika f(t)=f_X memberikan

fX=fc–Δf cos(πfmΔtn),

di mana Δt_n adalah waktu yang diukur dari meninggalkan elektroda hingga U-turn. Dengan demikian, metode FM-DEP memberikan penentuan cepat f_X dari trajetori yang diamati.

Membandingkan Frekuensi Titik Potong dari Satu MLV yang Ditentukan dari FM- dan AC-DEP

Menggunakan suspensi MLV bebas garam, kami membandingkan f_X yang diperoleh dari FM-DEP (rentang FM 10–50 kHz, f_m=0,1 Hz, periode 10 detik) dan AC-DEP (sinus 30–100 kHz). Dari trajetori FM, waktu meninggalkan rata-rata adalah 5,8 ± 0,2 detik, menghasilkan f_X=35 ± 1 kHz. Pengukuran gaya DEP AC melalui jarum bergerak menghasilkan kurva gaya-frekuensi yang cocok dengan model

FDEP(f)= [L+(2πfτ)2H]/[1+(2πfτ)2],

dengan parameter yang diracik L=–21,02 pN, H=19,03 pN, τ=4,9 µs, menghasilkan f_X=34,15 kHz, dalam sepemu yang baik dengan hasil FM.

Ketergantungan Konduktivitas Frekuensi Titik Potong untuk Sel Biologis

Kami menerapkan FM-DEP pada sel TL, BL, dan RB dalam kisaran konduktivitas 60–160 mS m^–1 (Δf≈700 kHz, f_m=0,25 Hz). Untuk setiap jenis sel, kami mengukur waktu meninggalkan 10 sel per tetes, dirata-ratakan dari dua tetes, dan derive f_X menggunakan Eq. (10). Gambar 6 menampilkan f_X yang dihasilkan versus σ_out. Data dicocokkan ke model cangkung tunggal diperluas

fX= [σout–(σout2)/(2σcyt)]/(√2 π R Cm) + fX0,

menghasilkan kapasitansi membran C_m dan konduktivitas sitoplasma σ_cyt yang sepemu dengan nilai literatur (C_m≈0,5–1,5 µF cm^–2, σ_cyt≈0,3–0,8 S m^–1). Konsistensi di seluruh jenis sel mengonfirmasi keandalan FM-DEP untuk karakterisasi dielektrik.

Kesimpulan

Teori dan eksperimen berbasis WBL kami mengonfirmasi bahwa FM-DEP menghasilkan U-turn yang dapat diprediksi pada frekuensi titik potong, memungkinkan penentuan cepat f_X dalam waktu <30 detik. Pengukuran FM-DEP dari MLV cocok dengan pengukuran gaya DEP AC langsung, sementara data f_X bergantung konduktivitas menghasilkan kapasitansi membran yang selaras dengan literatur. FM-DEP oleh karena itu menawarkan metode nonkontak yang kuat untuk spektroskopi dielektrik vesikel dan sel, dan dapat diperluas ke partikel sub-mikron dan nanoskala dalam konfigurasi on-chip untuk spektroskopi elektrokineitik waktu nyata.