Frequency-Modulated Wave Dielectrophoresis of Vesicles And Cells:Periodic U-Turns pada Crossover Frequency

Hasil dan Diskusi

Pengamatan Eksperimental Sel Leukemia yang Mengalami FM-DEP

Mikroelektroda plug-in kami (lihat Gambar 1) memungkinkan medan listrik diterapkan pada partikel yang mengambang jauh di atas substrat sampel, yang praktis digunakan untuk memilih sel yang sesuai. Misalnya, File tambahan 1:Film S4 menunjukkan bahwa pasangan mikroelektroda dikendalikan untuk mendekati sel diatom segitiga mengambang yang kami terapkan medan listrik AC dengan frekuensi melompat antara 100 dan 500 kHz pada interval 0,5 s. Dalam file tambahan 1:Film S4, kita melihat sel segitiga memantul pada mikroelektroda karena lompatan frekuensi sebagai hasil awal sebelum manipulasi berikut menggunakan FM-DEP.

File tambahan 1:Film S5 dan S6 menunjukkan perilaku khas beberapa sel TL yang mengalami FM-DEP, yang mirip dengan sel mamalia yang dimanipulasi oleh pinset elektronik menggunakan elektroda tunggal AC-DEP [36]. Gambar 2 menggambarkan salah satu lintasan periodik menggunakan plot 3-D dari (x ,y ) di sepanjang t sumbu, di mana koordinat relatif (x ,y ) ditugaskan ke posisi sel sementara dengan asal (0, 0) yang terletak pada titik tertentu pada jarum mikroelektroda untuk mengekstraksi konfigurasi sel-elektroda. Sementara x sumbu mewakili garis singgung ke permukaan elektroda di (0, 0), y sumbu, tegak lurus terhadap garis singgung, terutama mencerminkan proyeksi putaran-U periodik yang dijelaskan di bawah ini. Pada Gambar. 2, kami memilih sel TL mengambang yang kami terapkan medan listrik FM dengan frekuensi modulasinya f _m diatur menjadi f _m =0,25 Hz dalam kisaran 200 kHz f (t )≤ 3 MHz. Karena kita memilikinya Δ f /f _m , f (t )/f _m <10 ⁻⁵ , kondisi WBL benar-benar berlaku, seperti yang disebutkan setelah Persamaan. (2).

Lintasan 3D dari sel TL yang ditargetkan. Putaran-U periodik karena modulasi frekuensi ditunjukkan untuk sel TL yang menjalani FM-DEP

Ditemukan dari file tambahan 1:Film S5 dan S6 serta Gambar. 2 bahwa lintasan periodik dibentuk oleh tiga bagian dari meninggalkan, mendekati, dan tinggal di mikroelektroda:(i) sel meninggalkan mikroelektroda, (ii) ia mendekati mikroelektroda setelah melakukan putaran-U, dan (iii) tetap pada permukaan mikroelektroda. Sel sering tidak dapat kembali ke posisi yang sama pada permukaan mikroelektroda karena aliran pelarut, yang tidak hanya diamati dalam File tambahan 1:Film S6, tetapi juga diwakili oleh putaran-U dengan sel yang bermigrasi di x arah pada Gambar. 2. Meskipun gangguan dengan aliran pelarut, adalah mungkin untuk membedakan saat-saat ketika sel mulai meninggalkan permukaan mikroelektroda dan melakukan U-putar dalam lintasan periodik, masing-masing. Oleh karena itu, kita dapat melihat dari Gambar 2 bahwa putaran-U ini diulang pada interval 4 detik secara kebetulan dengan frekuensi modulasi 0,25 Hz, atau periode 4 detik dari frekuensi sesaat f (t ).

Studi Teoritis tentang FM-DEP

Untuk menjelaskan lintasan eksperimental, termasuk putaran U periodik, kami menganggap objek bola sebagai model sel tunggal yang disederhanakan, di mana medan listrik berubah-ubah terhadap waktu E (r ,t ) diterapkan. Gambar 3 menunjukkan skema gaya DEP bergantung waktu yang bekerja pada benda berbentuk bola [9]. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 3, permitivitas dan konduktivitas di dalam objek bola diwakili oleh ε _di dan σ _di , masing-masing, dan subskrip “keluar”, seperti ε _keluar dan σ _keluar , menunjukkan bagian luar. Secara umum, F _DEP (r ,t ) berhubungan dengan momen dipol induksi p (r ,t ) sebagai [17–19]

Model teoritis. Representasi skema gaya FM-DEP yang diberikan pada sel yang dimodelkan sebagai model bola homogen yang memiliki permitivitas dan konduktivitas ε _di dan σ _di , masing-masing. Bola dikelilingi oleh media elektrolit dengan permitivitas dan konduktivitas ε _keluar dan σ _keluar , masing-masing. Model bola homogen adalah penyederhanaan dari model cangkang tunggal bulat yang menganggap sel sebagai sitoplasma berlumuran yang dikelilingi oleh membran [9]

dimana K _H dan Δ τ didefinisikan sebagai berikut:K _H =(ε _di ε _keluar )/(ε _di +2ε _keluar ), dan \(\Delta \tau ^{-1}=\tau _{0}^{-1}-\tau ^{-1}\) menggunakan jari-jari R dari objek bola dan dua karakteristik waktu τ ₀ =(ε _di ε _keluar )/(σ _di σ _keluar ) dan τ =(ε _di +2ε _keluar )/(σ _di +2σ _keluar ).

Mengganti medan listrik AC E _AC (r ,t )=A (r ) cos(2π f _AC t ) ke dalam Persamaan. (3) sampai (5), kita memperoleh gaya DEP rata-rata <F _DEP (r ,t )> yang telah dirata-ratakan selama siklus medan AC [9, 15, 20]:

dimana A _RMS menunjukkan vektor akar rata-rata kuadrat (RMS) yang memenuhi \(\boldsymbol {A}_{\text {RMS}}^{2}=\boldsymbol {A}^{2}/2\), dan χ (f _AC )≡2π R ³ ε _keluar Re[K (f _AC )] tergantung pada frekuensi yang diterapkan f _AC karena Re[K (f _AC )], bagian real dari faktor CM [9, 15, 20]:

dimana K _L =(σ _di σ _keluar )/(σ _di +2σ _keluar ) dan K _H , yang didefinisikan di atas, sesuai dengan nilai CM nyata dalam batas frekuensi rendah dan tinggi, masing-masing, dan nilai batas ini, K _L dan K _H , harus memiliki tanda yang berlawanan sehingga f _X didefinisikan oleh χ (f _X )=0 mungkin ada [9, 15, 20].

Persamaan (6) dan (7) menunjukkan bahwa medan listrik AC menciptakan gaya DEP yang arahnya bergantung pada frekuensi yang diberikan f _AC melalui χ (f _AC ) diberikan oleh Persamaan. (7), yang menjelaskan sel diatom yang memantul dalam file tambahan 1:Film S4 sebagai berikut (lihat juga Gambar 3). Ketika frekuensi yang diterapkan memberikan tanda plus dari bagian nyata dari faktor CM (yaitu, χ (f _AC )>0), kita dapat mengamati sel-sel yang tertarik ke ujung jarum elektroda (DEP positif) di mana kekuatan medan AC, yang diterapkan melalui sepasang jarum elektroda, adalah yang terbesar. Tanda faktor CM real dapat dibalik ke negatif di f _X , frekuensi hilang dari faktor CM nyata (yaitu, χ (f _X )=0), di mana kita memiliki gaya dielektroforesis nol seperti yang ditemukan dari Persamaan. (6). Dalam tanda negatif dari faktor CM (yaitu, χ (f _AC )<0), koloid individu ditolak dari pasangan jarum elektroda (DEP negatif). Sel diatom segitiga dalam file tambahan 1:Film S2 memantul karena arah berlawanan dari AC-DEP yang diinduksi oleh medan AC dengan frekuensi 100 dan 500 kHz; menggabungkan Persamaan. (6) dan arah dielektroforesis yang diamati, kami menemukan bahwa χ (100 kHz)>0 dan χ (500 kHz)<0.

Selanjutnya, kami mempertimbangkan FM-DEP dengan memasukkan fase yang diberikan oleh Persamaan. (1) dan (2) ke dalam Persamaan. (3) sampai (5). Sebagaimana dibuktikan dalam file tambahan 2, kondisi WBL gelombang FM memvalidasi bentuk perkiraan integrasi dalam Persamaan. (5), dengan demikian memberikan

yang menjadi bentuk yang sama dengan AC-DEP ketika frekuensi bergantung waktu f (t ) diganti dengan frekuensi konstan f _AC . Dengan demikian kita memperoleh bentuk pembatas dari gaya DEP rata-rata <F _DEP (r ,t )> yang telah dirata-ratakan selama siklus θ (t ) di bidang FM (lihat Persamaan (A1), (A13) dan (A14) di File tambahan 2):

memiliki bentuk yang mirip dengan Persamaan. (6) untuk AC-DEP. Perbedaannya adalah apakah koefisien χ {f (t )} tergantung pada t melalui f (t ), yang berubah secara siklis sesuai dengan modulasi frekuensi dengan periode T _m =1/f _m .

Berdasarkan ekspresi sederhana (9) dari FM-DEP, kami mengilustrasikan dengan Gambar 4 mekanisme putaran-U di atas karena gelombang FM. Gambar 4 menunjukkan skema DEP yang diinduksi oleh gelombang FM di WBL ketika kisaran f (t ) mencakup frekuensi persilangan f _X sedemikian rupa sehingga f _c Δ f f _X f _c +Δ f . Hal ini seharusnya pada Gambar. 4 bahwa ketergantungan frekuensi dari bagian nyata dari faktor CM, atau χ {f (t )}, memberikan perubahan tanda alternatif sebagai berikut:tanda minus (χ {f (t )}<0) untuk f (t )<f _X dan tanda tambah (χ {f (t )}>0) untuk f (t )>f _X , yang merupakan kasus dengan eksperimen kami. Periode sebelumnya memuaskan f (t )<f _X memiliki durasi waktu, sedangkan yang terakhir f (t )>f _X telah dipertahankan selama periode istirahat:satu siklus diklasifikasikan menjadi dua periode yang masing-masing ditandai merah dan biru, pada Gambar 4.

Arah gaya berhubungan dengan modulasi frekuensi. Ilustrasi putaran U periodik karena gelombang FM dengan frekuensi bergantung waktu f (t ) meliputi frekuensi persilangan f _X

Sama halnya dengan AC-DEP, Persamaan. (9) menyiratkan bahwa tanda minus (χ {f (t )}<0) menciptakan gaya DEP tolak-menolak antara sel dan mikroelektroda sambil memenuhi f (t )<f _X . Akibatnya, sel meninggalkan area di sekitar ujung jarum mikroelektroda di mana besarnya medan listrik terbesar:sel mengalami DEP negatif selama periode merah Δ t _n pada Gambar. 4. Saat ini t _X sebagai solusi dari f (t _X )=f _X , χ (f ) menghilang, diikuti dengan perubahan tanda menjadi χ (f )>0 saat f (t )>f _X , dan dengan demikian gaya DEP dialihkan ke gaya tarik di t _X . Setelah melakukan putar balik di t _X karena pembalikan arah gaya DEP, sel yang ditargetkan mulai mendekati mikroelektroda yang bermigrasi ke arah yang berlawanan dan akhirnya terperangkap di antara ujung jarum elektroda atau menempel pada salah satu elektroda:sel mengalami DEP positif selama periode biru Δ t _p pada Gambar 4. Gambar 4 menunjukkan bahwa siklus meninggalkan, mendekati dan tinggal di mikroelektroda harus diulang dengan periode modulasi T _m , sesuai dengan Gambar 2:Δ t _n +Δ t _p =T _m . Mekanisme dielektroforesis yang digambarkan pada Gambar 4 dengan demikian dapat menjelaskan putaran-U periodik yang diamati pada File tambahan 1:Film S5 dan S6 serta Gambar 2.

Mari kita perhatikan solusi periodik dari persamaan, f (t _X )=f _X . Seperti yang terlihat dari Gambar 4, t _X dinyatakan sebagai t _X =n T _m +0,5Δ t _p =n T _m +0,5(B _m Δ t _n ) menggunakan bilangan bulat n =0, ±1, ±2,⋯, yang selanjutnya berbunyi

Mengganti Persamaan. (10) ke dalam Persamaan. (2), kita punya untuk n =0 itu

mengklarifikasi bahwa metode FM-DEP menentukan frekuensi crossover jika durasi waktu Δ t _n mulai dari meninggalkan mikroelektroda hingga melakukan putaran-U dapat diukur dengan tepat.

Membandingkan Frekuensi Crossover dari MLV Tunggal yang Ditentukan dari FM- dan AC-DEP

Kami menyelidiki akurasi eksperimental Persamaan. (11). Secara eksperimental, sel-sel biologis seringkali perlu didispersikan dalam elektrolit. Untuk MLV, bagaimanapun, penggunaan air deionisasi diperbolehkan selama proses persiapan rehidrasi dan pengenceran. Oleh karena itu, kami menggunakan suspensi MLV bebas garam untuk membandingkan frekuensi crossover yang ditentukan dari AC- dan FM-DEP.

Putaran U dielektroforesis dari MLV yang ditargetkan diinduksi oleh gelombang FM dalam kisaran 10 kHz f (t )≤ 50 kHz (yaitu, f _c =30 kHz dan Δ f =20 kHz) dengan pengaturan yang f _m =0,1 Hz, dan dengan demikian FM-DEP memiliki periode 10 detik. Dalam percobaan, dibutuhkan waktu kurang dari 30 detik untuk mengamati beberapa putaran U dari MLV yang ditargetkan dari meninggalkan hingga mendekati mikroelektroda. Dari lintasan tersebut, kami memperoleh rata-rata waktu keluar yang \(\overline {\Delta t_{n}}=5.8\pm 0.2\) s. Karena kondisi WBL berlaku untuk eksperimen ini yang memenuhi f _m /Δ f /f _m , f _, m /f (t )<10 ⁻⁵ , frekuensi crossover dievaluasi menjadi f _X =35±1 kHz from substituting \(\overline {\Delta t_{n}}=5.8\pm 0.2\) s into Eq. (11).

For comparison, we made use of the programmable manipulator in the AC-DEP method that tries to evaluate the crossover frequency of the same targeted MLV to which the sinusoidal electric field with a frequency in the range of 30 to 100 kHz was applied via the electrode needle pair for inducing the AC-DEP. Because the programmable manipulator carries the electrode needle pair at a constant speed in one direction, we can measure the dielectrophoretic force similarly to the laser-trapping experiments [39]. Attaching the MLV on an electrode tip that undergoes uniform linear motion, not only the AC-DEP force but also the hydrodynamic force caused by the one-dimensional motion are exerted on the MLV. With the gradual increase of electrode velocity, F _DEP eventually becomes smaller than the hydrodynamic force. As a result, the MLV initially attached to the moving electrode, owing to the DEP attraction, is desorbed by the hydrodynamic force. Defining the critical value, v _c , by the maximum velocity value of the microelectrode pair prior to the desorption, the force balance equation between the DEP and hydrodynamic forces reads [39]

where F _DEP (f _AC )e ≡<F _DEP> with the unit vector e defined by \(\boldsymbol {e}=\nabla {\boldsymbol {A}}^{2}_{\text {RMS}}/|\nabla {\boldsymbol {A}}^{2}_{\text {RMS}}|\), η the water viscosity at 25 °C and 2R the diameter of the MLV.

Additional file 1:Movies S7 and S8 demonstrates the force measurement using the above AC-DEP method at the applied frequency of f _AC =60 kHz. In Additional file 1:Movie S7, the velocity of the electrode pair controlled by the programmed manipulator is 110 μ m/s, which is lower than v _c ; therefore, the MLV remains attached to one part of the electrode pair owing to the dielectrophoretic attraction. Additional file 1:Movie S8, on the other hand, shows the higher electrode speed of 120 μ m/s, under which the dielectrophoretic force becomes smaller than the hydrodynamic force that is exerted on the MLV, thereby desorbing the MLV from the electrode. Accordingly, v _c is evaluated to be 110 μ m/s ≤v _c ≤ 120 μ m/s, and we can calculate F _DEP (60 kHz) using Eq. (12).

We can determine f _X from the experimental results of F _DEP at various external frequencies. Figure 5 shows the frequency dependence of F _DEP , indicating that the DEP force experienced by the MLVs was reduced by lowering the applied frequency. It is found from Eqs. (6) and (7) that the fitting function of F _DEP (f _AC ) can be expressed as

Frequency dependence of F _DEP . The FM-DEP force (F _DEP ) as a function of external frequency (f _AC ) of applied AC field where F _DEP has been evaluated from Eq. (12), the balance equation between the FM-DEP and hydrodynamic forces exerted on a single MLV. It can be seen that F _DEP is increased and saturated as f _AC is higher, reflecting a typical behavior of the relaxation spectrum of the real CM factor. The solid line represents the best-fit result of Eq. (13)

implying that

Equation (13) is depicted by the solid line in Fig. 5 that has been fitted to the experimental data using the best-fit results of three parameters:L =−21.02 pN, H =19.03 pN, and τ =4.9 μ S. Substituting these results into Eq. (14), we evaluate that f _X =34.15 kHz, which coincides with the result of f _X =35±1 kHz evaluated from the FM-DEP method. The FM-DEP method is thus validated in terms of the consistency with the direct force measurement using the AC-DEP method.

Conductivity Dependencies of the Crossover Frequencies for Biological Cells

Let us return to the dielectrophoretic U-turns of biological cells mentioned in Fig. 2 to assess the practical reliability of the crossover frequencies when the FM-DEP method is applied to cell suspensions. Recently, an elaborate theory [40] has investigated, in more detail than before, the relationship between the homogeneous sphere model (see Fig. 3) and the single-shell model where the inner structure of cell is represented by a smeared-out cytoplasm surrounded by a membrane. As a result, the relation between f _X and the suspension conductivity σ _keluar has been formulated using radius R of a cell, membrane capacitance C _m , and cytoplasmic conductivity σ _cyt [40]:

dimana f _{X 0} is the extrapolated value to the crossover frequency at σ =0 mS/m and will be treated as a fitting parameter herein. The elaborate treatment adds the squared term, the second term on the right hand side of Eq. (15), to the conventional linear relation which has mainly been used for evaluating C _m from f _X [40–45]. Theoretically, it has still been claimed [40] that Eq. (15) is valid within a lower range of σ _keluar such that σ _keluar <10 mS/m; however, it should be better to include the squared term in the evaluation of C _m , considering that our range of σ _keluar is relatively high compared with previous results in the range of 10 mS/m ≤σ _keluar ≤ 100 mS/m [40–45]. Hence, we determined σ _cyt as well as C _m from fitting Eq. (15) to the experimental results of f _X as an increasing function of σ _keluar .

There are three kinds of biological cell used:TL and BL cells of human leukemia and RB cells of three human volunteers. In all the experiments using any species of cell, the conductivities were within the range of 60 to 160 mS/m, and the modulation frequency was set to be 0.25 Hz. Regarding the instantaneous frequency, most of the experiments adopted the range from 100 to 1.5 MHz (i.e., f _c =800 kHz and Δ f =700 kHz); exceptionally for leukemia cells, the frequency range was extended to 50 kHz ≤f (t )≤1550 kHz (i.e., f _c =800 kHz and Δ f X =750 kHz) in the conductivity range of 60 mS/m≤σ ≤80 mS/cm because f _X in this σ -range has been found to be lower than 100 kHz, and we were unable to observe the DEP U-turns in the range of 100 kHz ≤f (t )≤1500 kHz. Both of these frequency sets satisfy the WBL condition of Δ f /f _m , f (t )/f _m <10 ⁻⁵ as before.

Each time we measured the leaving times of cells dispersed in a suspension, we looked for an appropriate spot at which a few cells having a similar size could simultaneously experience the FM-DEP above the substrate, and the microelectrode tips were placed at the measurable position using the micromanipulator. We continued such scanning inside the cell suspensions until the FM-DEP trajectories of 10 cells were collected in total at a couple of appropriate positions. For each kind of cell, the measurement of 10 cells was repeated twice using different drops of the same cell suspension. As mentioned, it is indispensable for the implementation of the FM-DEP measurement at each spot to suppress the electrically induced solvent flows as much as possible. Hence, we traced only two cycles of the U-turn path so that the duration time of applying the electric field could be adjusted to be less than 10 s, and, correspondingly, the leaving time of each cell is given as the average of each trajectory, including the two U-turns. The mean leaving time \(\overline {\Delta t_{n}}\) of each cell suspension is thus obtained from averaging the leaving times of 20 cells. Particularly for human RB cells, we further averaged three sets of the mean crossover frequencies obtained for three RB cell suspensions of three human beings, supposing that cells of the same species are similar in C _m and σ _cyt as well as in R . The two-step averaging of Δ t _n will be denoted by \(\left <\overline {\Delta t_{n}}\right>\). Substituting into Eq. (10) the experimental data of either \(\overline {\Delta t_{n}}\) or \(\left <\overline {\Delta t_{n}}\right>\), the mean crossover frequency <f _X > was obtained.

Figure 6 shows the σ _keluar -dependencies of <f _X > measured for the above three kinds of biological cells using the FM-DEP method. The solid lines in Fig. 6 depict the best-fit results of Eq. (15). We evaluated C _m and σ _cyt from the best fitting of Eq. (15) into which the observed radii (R _obs ) were inserted. Table 1 lists the fitting results of C _m and σ _cyt , where we used the observed radii of 10 μ m ≤ 2R _obs ≤ 15 μ m for TL and BL cells, and 7.5 μ m ≤ 2R _obs ≤ 10 μ m for RB cells in evaluating C _m . It is to be noted from Table 1 that different species have different membrane capacitances, which are in good agreement with those reported in the literature [40–47]; the C _m values of RB cells with stationary whole blood samples from normal (healthy) donors are in excellent agreement with our value [46, 47], but are substantially higher than those of washed RB cells in isotonic buffered saline as noted in [47]. The best-fit results simultaneously provided cytoplasmic conductivities, which were consistently similar as seen from Table 1, but were slightly lower than the range of previous reports that 0.2 S/m ≤σ _cyt ≤1 S/m [40, 45, 48–51]. These results support that the FM-DEP method retains the practical reliability needed for the treatment of living cells.

Conductivity dependences of crossover frequencies. Mean crossover frequency, <f _X >, of TL cells (blue triangles), BL cells (green diamonds), and RB cells (red circles) varying with increase of solution conductivity σ _keluar . The best-fit results of Eq. (15) are delineated by the solid lines