Imunosisasi Label-Free Ultra-Sensitif Menggunakan Biosensor Plasmonik Hibrid Nanopartikel Emas–Oksida Grafena
Abstrak
Karya ini menyajikan komposit AuNP-GO baru yang menggabungkan kompatibilitas biologis yang tinggi oksida grafena dengan resonansi plasmon permukaan lokal (LSPR) dari nanopartikel emas. Platform hibrid ini memungkinkan deteksi label-free interaksi protein dengan sensitivitas yang tak tertandingi. Menggunakan sensor AuNP-GO, anti-BSA terdeteksi pada konsentrasi rendah hingga 145 fM dalam kehadiran interferensi hCG 10 ng ml⁻¹. Rentang dinamis mencakup lima orde magnitudo (1,45 nM hingga 145 fM). Hasil ini menunjukkan potensi biosensor plasmonik AuNP-GO untuk diagnostik point-of-care yang cepat dan saringan biomarker.
Latar Belakang
Nanomaterial berbasis karbon—grafena, nanoribon karbon, dan oksida grafena (GO)—telah menjadi tonggak dalam biosensing karena sifat listrik, optik, dan kimia permukaan yang luar biasa. Struktur dua dimensi GO dan grup fungsional kaya oksigen (epoksida, hidroksil, karbosil) memberikan afinitas protein tinggi dan memungkinkan pengikatan kovalen, menjadikannya substrat yang menarik untuk sensor elektrokimia, fluoresensi, SPR, dan LSPR. Nanopartikel emas (AuNP) membawa serapan plasmonik yang dapat disesuaikan, kompatibilitas biologis, dan kimia permukaan yang mudah, memungkinkan mereka bertindak sebagai penguat sinyal atau tag optik. Saat AuNP dihiasi pada GO, hibrid ini mewarisi pengikatan cepat dari GO dan LSPR intens dari AuNP, yang mengarah pada sensitivitas yang ditingkatkan dalam imunosisasi, deteksi DNA, dan uji enzim. Meskipun banyak studi elektrokimia dan SERS, belum ada imunosisasi label-free berbasis hibrid AuNP-GO telanjang yang warnawi atau cepat yang dilaporkan hingga saat ini. Studi ini mengisi kesenjangan itu dengan mengembangkan imunosisasi berbasis kemosorpsi yang ditingkatkan LSPR yang beroperasi dalam buffer air dan tahan terhadap interferensi umum.
Metode/Eksperimen
Bahan
Grafit (Graphene Supermarket), GO (metode Hummer yang dimodifikasi, flakes 0,1–1 µm, tebal 1,1 nm), cystamine dihydrochloride (Cys, 96 %), HAuCl₄·3H₂O (99,99 %), sitrat natrium, BSA, anti-BSA (rabbit IgG), NHS, dan EDC diperoleh dari Sigma-Aldrich atau Alfa Aesar. Semua reagen digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
Sintesis AuNP
AuNP disintesis dengan reduksi sitrat: 15 mL HAuCl₄ 1 mM direfluks pada 550 °C, 1100 rpm; 1,8 mL sitrat natrium 38,8 mM ditambahkan. Setelah 5 menit, campuran direbus pada 400 °C, 900 rpm selama 30 menit dan dinginkan ke suhu ruang. Prosedur ini menghasilkan AuNP bola sekitar 15 nm; menggunakan 0,8 mL sitrat menghasilkan partikel sekitar 60 nm. Reaksi: HAuCl₄ + C₆H₅O₇Na₃ → Au(s) + CO₂ + HCOOH.
Persiapan Target Antigen GO-BSA
Lembar GO (0,1 g L⁻¹) diaktifkan dengan EDC (400 µM) dan NHS (100 µM) (rasio volume 1:1). BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) diikatan kovalen melalui pembentukan ikat amid dan dipurnikan dengan sentrifugasi berulang. Gambar 1 menggambarkan alur kerja konjugasi GO-BSA.
Interaksi GO-BSA. Grup karbosil lembar GO dapat diaktifkan menggunakan reaksi EDC/NHS dan persiapan GO berdasarkan target antigen untuk GO-BSA
Persiapan Sonde AuNP-antiBSA
AuNP difungsikan dengan Cys (10 mM, 2 jam, RT) untuk memperkenalkan grup –NH₂ yang terbuka. Anti-BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) kemudian diikatan melalui ikat amid tanpa aktivasi tambahan, diikuti dengan sentrifugasi untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Pengenceran serial dari 100 µg mL⁻¹ hingga 1 pg mL⁻¹ menghasilkan rentang sonde AuNP-antiBSA (Gambar 2a). Komposit AuNP-GO-antiBSA dirancang dengan aktivasi EDC/NHS karbosil GO dan ikatan kovalen Cys-AuNP yang dimodifikasi, kemudian pengikatan antibodi (Gambar 2b).
Interaksi AuNP-antiBSA dan AuNP-GO-antiBSA. Persiapan a AuNP dan b sonde AuNP-GO berdasarkan antibodi
Teknik Karakterisasi
Karakterisasi struktural dan optik menggunakan FE-TEM, HR-TEM, SEM (JEOL JSM-7800F), spektroskopi UV-vis (U-2900, Hitachi), mikroskopi Raman (MRI, Protrustech), FTIR (Bruker Vertex 80v ATR), dan XPS (Pusat Sinrotron Sinar X Nasional). Ukuran, distribusi, dan kimia permukaan AuNP dikonfirmasi di semua sampel.
Hasil dan Pembahasan
Morfologi dan Komposisi
SEM dan TEM mengungkapkan AuNP 60-nm yang seragam dan terdistribusi merata pada lembar GO yang berkerut (Gambar 3). XPS mengonfirmasi kehadiran grup fungsional C–C (sp²), C–C (sp³), C–O, C=O, dan O–C=O pada GO, sementara puncak Au 4f memverifikasi integrasi AuNP.
Analisis morfologi permukaan nanokomposit. a Citra SEM lembar GO dan b citra TEM komposit AuNP-GO. c Citra TEM film AuNP-GO ERGO
Karakterisasi Spektroskopik GO
Spektra XPS C 1s resolusi tinggi, Raman, dan ATR-FTIR mengonfirmasi grup fungsional oksigenasi karakteristik GO (C sp², epoksida, hidroksil, karbonil, karbosil). Puncak Raman pada 1355 cm⁻¹ (D), 1614 cm⁻¹ (G), dan 2714 cm⁻¹ (2D) mengesampingkan struktur berlapis (Gambar 4).
Analisis spektral lembar GO. a Scan resolusi tinggi XPS di wilayah C1s, b Raman, dan c FTIR
Interaksi Protein dan Respons LSPR
Spektra UV-vis AuNP (15 nm dan 60 nm) menunjukkan puncak LSPR pada 520 nm dan 540 nm, masing-masing. GO sendirinya menunjukkan absorpsi π–π* pada 230 nm dan n–π* pada 300 nm. Setelah difungsikan, konjugat AuNP-Cys-antiBSA menunjukkan puncak ganda pada 540 nm (AuNP) dan 755 nm (AuNP-Cys-antiBSA) dengan geser yang bergantung pada konsentrasi (Gambar 5). Kurva kalibrasi (y = 2,43 + 0,25 x, R² = 0,91 untuk 540 nm; y = 2,56 + 0,31 x, R² = 0,96 untuk 760 nm) mengonfirmasi linearitas di seluruh 1,45 nM hingga 145 fM anti-BSA.
Analisis spektrum absorpsi UV-vis untuk respons interaksi AuNP dengan antiBSA. a Spektra absorpsi SP AuNP, b BSA yang terikat GO, c sonde AuNP-anti-BSA, dan d Kurva kalibrasi untuk respons interaksi AuNP dengan antiBSA pada pengenceran berbagai konsentrasi protein antiBSA dari 1,45 nM ~ 145 fM
Hibrid AuNP-GO-antiBSA lebih memperkuat sinyal LSPR. Setelah penambahan target GO-BSA, puncak 540-nm bergeser secara linier dengan konsentrasi anti-BSA (1,45 nM–145 fM), menghasilkan LOD sebesar 145 fM (Gambar 6). Kalibrasi untuk sonde AuNP-GO (f(x) = 0,918 + 0,124 x, R² = 0,94) dan untuk GO sendirinya (f(x) = 0,791 + 0,057 x, R² = 0,954) menunjukkan sensitivitas yang unggul dari sistem hibrid.
Analisis spektrum absorpsi UV-vis untuk respons imun. a AuNP yang terikat GO dan GO yang terikat BSA, b AuNP dan GO yang terikat anti-BSA, c sonde AuNP-GO-antiBSA, dan d sonde AuNP-GO-antiBSA dan target GO-BSA untuk respons imun
Studi interferensi dengan 10 ng ml⁻¹ hCG menunjukkan reaktivitas silang yang minimal (R² = 0,89 untuk AuNP-GO; 0,73 untuk GO sendirinya), yang mengonfirmasi keandalan uji. Sensor mempertahankan performa setelah empat siklus regenerasi, yang menunjukkan stabilitas permukaan yang tinggi.
Kesimpulan
Kami telah merancang hibrid AuNP-GO yang kompatibel biologis yang memanfaatkan LSPR untuk mencapai deteksi label-free anti-BSA pada 145 fM. Nanokomposit ini menunjukkan afinitas bio yang tinggi, respons cepat, dan ketahanan terhadap interferensi umum, menjadikannya platform yang menarik untuk imunosisasi point-of-care. Pekerjaan masa depan akan menjelajahi deteksi multiplex, integrasi ke dalam perangkat mikrofluida, dan adaptasi terhadap biomarker yang relevan klinis.
