Enhanced Plasmonic Biosensors of Hybrid Gold Nanoparticle-Graphene Oxide-Based Label-Free Immunoassay

Hasil dan Diskusi

Analisis Struktur dan Morfologi

Ukuran AuNP tergantung pada sifat reduktor dan kondisi pembentukan dan penyimpanan. Analisis SEM menunjukkan bahwa lembar GO dan AuNP melekat secara seragam pada permukaan GO, dengan ukuran AuNP rata-rata 60 nm (Gbr. 3). Gambar 3a menunjukkan gambar SEM dari lembar GO pada film Au dan bahwa lembar GO kurang dari 1 μm. Membandingkan GO dan AuNP-GO, elemen emas dapat diamati dalam komposit AuNP-GO. Ini menunjukkan bahwa AuNPs telah berhasil diadsorpsi pada permukaan GO yang berkerut. Hibrida AuNP-GO yang disintesis dikarakterisasi menggunakan TEM seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b. Gambar 3b, c menunjukkan kondisi sintesis. Konsentrasi 10 ml larutan GO sheet adalah 0,1 g/l, dan 200 μl larutan AuNP memiliki konsentrasi 2,2 nM. Gambar TEM pada Gbr. 3a dengan bilah skala 100 nm dan Gbr. 3b dengan bilah skala 0,5 m menunjukkan amplifikasi ukuran yang berbeda dan dengan jelas menunjukkan bahwa AuNP tidak bergerak pada permukaan lembar GO. AuNPs memiliki bentuk bola, menunjukkan bahwa fungsi karboksilat pada permukaan lembaran GO mungkin memainkan peran penting dalam pembentukan ikatan kovalen kimia dengan AuNPs seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2b.

Analisis morfologi permukaan nanokomposit. a Gambar SEM dari lembar GO dan b Gambar TEM komposit AuNP-GO. c Gambar TEM dari film ERGO AuNP-GO

Karakterisasi GO menurut XPS, Raman, dan Spektroskopi FTIR

Gambar 4a menunjukkan analisis spektral C 1s XPS resolusi tinggi dari lembar GO. C1 dengan intensitas tertinggi pada energi ikat 284,6 eV berhubungan dengan gugus fungsi karbonil untuk C–C (sp2), dan puncak pada 285,6, 286,6, 288,2, dan 289,4 eV berhubungan dengan C–C (sp3) pada cincin aromatik , C–O dalam gugus hidroksil dan epoksi, C=O dalam gugus karbonil, dan O–C=O dalam gugus karboksil, masing-masing. Spektrum C 1s XPS dari lembaran GO pada substrat film emas menunjukkan bahwa persentase atom relatif C–C (sp2), C–C (sp3), C–O, C=O, dan O–C=O adalah 77,44, 2,16, 18,14, 1,77, dan 0,49%, masing-masing [66]. Gambar 4b menunjukkan analisis spektral Raman dari lembaran GO dalam larutan NaCl dengan puncak fitur spektral pada 1614 cm ^− 1 (G band), 1355 cm ^− 1 (pita D), 2714 cm ^− 1 (pita 2D), 2947 cm ^− 1 (G+ D band), dan ~ 3240 cm ^− 1 (pita 2D) [38, 67]. Pembentukan lembaran GO dianalisis lebih lanjut untuk menjelaskan sifat-sifat berbagai spesies teroksigenasi menggunakan spektrum ATR-FTIR seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4c. Spektrum ATR-FTIR ini juga mengungkapkan beberapa puncak karakteristik GO; C–O pada 850 cm ^− 1 karena getaran epoksida (C–O–C), C–O pada 1080 cm ^− 1 karena getaran ulur alkoksi (C–O), C=C pada 1500~1600 cm ^− 1 karena ikatan C=C aromatik, dan C–O pada 1260 cm ^− 1 karena getaran asimetris (C–O–C) epoksida. Gugus karboksilat di tepi lembaran GO menunjukkan getaran peregangan –COOH, dengan puncak pada 1652 dan 1731 cm ^− 1 sesuai dengan vibrasi ulur C=O dari gugus karbonil. Spektrum juga menunjukkan tiga puncak pada 2900 cm ^− 1 terkait dengan vibrasi regangan asimetris dan simetris –CH₂ dan puncak deformasi pada 1462 cm ^− 1 karena gugus alkena (C–H) yang terletak di bidang GO. Spektrum FTIR GO menunjukkan rentang puncak serapan pita lebar C–OH dan H₂ yang luas. O getaran pada 3370 cm ^− 1 karena getaran regangan [67].

Analisis spektral lembar GO. a Pemindaian resolusi tinggi XPS di wilayah C1s, b Raman, dan c FTIR

Analisis GO dan AuNP dengan Properti Interaksi Protein

Spektrum UV-vis GO dan AuNPs berair dengan dispersi interaksi protein disajikan pada Gambar 5. AuNPs memiliki koefisien kepunahan yang tinggi dan ukuran yang unik tergantung pada pita serapan plasmon permukaan (SP). AuNPs yang dimodifikasi dari dua dimensi yang berbeda adalah 15 dan 60 nm untuk spektrum serapan SP 520 dan 540 nm [68, 69]. Gambar 5a menunjukkan larutan AuNP (520 nm) yang dimodifikasi dengan Cys pada konsentrasi 5 mM dengan pita kepunahan AuNP-Cys [69]. Spektrum UV-vis dispersi GO berair menghasilkan dua puncak serapan:maksimum pada 230 nm yang sesuai dengan puncak plasmon –π* dari ikatan C–C aromatik dalam kluster sp2 aromatik yang berbeda ukuran, dan bahu pada 300 nm yang sesuai dengan n–π* puncak plasmon karena adanya ikatan epoksida dan karbonil (C=O) (Gbr. 5b) [9, 20]. Spektrum UV-vis larutan GO–EDC/NHS dan GO–EDC/NHS–BSA (Gbr. 5b) menunjukkan bahwa GO–EDC/NHS dan GO–EDC/NHS–BSA menunjukkan puncak pada sekitar 270 nm, yang mungkin karena interaksi yang kuat antara GO dan kelompok amina [70, 71]. Gambar 5c menunjukkan spektrum serapan ikatan untuk berbagai konsentrasi antiBSA dengan AuNP (60 nm). Gambar 1b menunjukkan solusi sintesis probe AuNP-antiBSA (sampel B1). Panjang gelombang memiliki puncak serapan yang jelas pada 540 dan 755 nm, dengan panjang gelombang pada 540 nm terutama disebabkan oleh AuNPs (60 nm), dan puncak pada 755 nm sesuai dengan puncak serapan kombinasi AuNP+Cys+antiBSA. Hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi antiBSA menginduksi peningkatan bertahap dalam absorbansi pada 540 nm dan peningkatan terus menerus dalam penyerapan dekat-IR pada 755 nm. Interaksi pengikatan antiBSA yang berbeda pada permukaan AuNPs menyebabkan perubahan indeks bias permukaan, yang pada gilirannya ditransduksi menjadi intensitas absorbansi LSPR. Pita LSPR dipengaruhi oleh ukuran partikel. AuNPs menunjukkan pita SPR yang kuat di wilayah yang terlihat. Dengan peningkatan indeks bias partikel berukuran sedang, pergeseran posisi puncak SPR dapat disetel dari tampak ke inframerah dekat. Dalam hasil percobaan interaksi protein, kami mencampur AuNP-antiBSA seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5d. Sensitivitas ditentukan dengan memplot panjang gelombang LSPR dari pita 500–760 nm sebagai fungsi dari indeks bias yang diukur. Kami kemudian menggunakan pengenceran berbagai konsentrasi protein antiBSA dari 1,45 nM hingga 145 fM dan mencampurnya dalam volume 200 l. Perubahan penyerapan 540 dan 760 nm disebabkan oleh perbedaan konsentrasi antiBSA dan AuNP. Pengukuran spektral kemudian dilakukan 5 menit kemudian, yang menunjukkan konsentrasi penyerapan intensitas cahaya yang berbeda, dan puncak serapan 60 nm untuk AuNP diamati pada 540 dan 755 nm. Hasil ini konsisten dengan kurva kalibrasi absorpsi AuNP-antiBSA. Kurva kalibrasi dipasang oleh y = 2.43 + 0.25× (koefisien korelasi, R ² = 0,91) untuk puncak serapan 540 nm, dan y = 2,56 + 0,31× (koefisien korelasi, R ² = 0,96) untuk puncak serapan 760-nm, di mana x adalah konsentrasi antiBSA dan y adalah absorbansi optik.

Analisis spektrum serapan UV-vis untuk AuNP dengan respon interaksi antiBSA. a Spektrum serapan SP AuNPs, b BSA terikat GO, c Probe AuNP-anti-BSA, dan d Kurva kalibrasi untuk AuNP dengan respons interaksi antiBSA pada pengenceran berbagai konsentrasi protein antiBSA dari 1,45 nM~145 fM

Analisis AuNP-antiBSA dan AuNP-GO-antiBSA Berdasarkan Interaksi Immunoassay

Untuk memahami mekanisme deteksi imunologis nanokomposit GO dan AuNP-GO, analisis spektral untuk reaksi pengikatan dilakukan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6. Gambar 6a menunjukkan spektrum serapan UV-vis dari nanokomposit AuNP-GO dan GO-BSA. Untuk larutan GO sheet (0,1 g/l), terdapat puncak pada sekitar 230 nm [70] dan bahu pada sekitar 300 nm, dan konjugat GO-BSA menunjukkan puncak penyerapan pada sekitar 270 nm dan puncak pada sekitar 230 nm [9, 20, 70]. Dalam kombinasi nanokomposit AuNP-GO, tiga puncak serapan dicatat masing-masing pada 230, 300, dan 540 nm. Tumpukan –π atau interaksi ikatan kovalen antara AuNPs dan permukaan lembar GO adalah kekuatan pendorong utama yang menahan AuNPs ke bahan GO yang sangat biokompatibel. Lembaran GO dibuat untuk berkumpul di AuNP, menghasilkan pita serapan yang kuat 200–300 nm. Oleh karena itu, penyerapan lembar GO jauh lebih besar daripada penyerapan AuNPs pada pita cahaya tampak. Gambar 6b ​​menunjukkan bahwa spektrum UV-vis dari puncak serapan AuNP berada pada 540 nm [50, 68, 69]. Puncak absorpsi berada pada 540 dan 660 nm untuk konjugat AuNP+Cys; 230, 300, 540, dan 660 nm untuk konjugat AuNP+Cys+GO; dan 230, 270, 540 dan 660 nm untuk konjugat AuNP+Cys+GO+antiBSA. Lembaran GO memiliki dua puncak serapan pada 230 nm (–π* puncak plasmon) dan 300 nm (n–π* puncak plasmon). Pergeseran panjang gelombang absorpsi dicatat, dan pergeseran absorbansi ini dianggap mengindikasikan konfirmasi absorpsi antiBSA (0 fM ~ 1.45 nM) ke permukaan AuNP+Cys+GO. Gambar 6c menunjukkan sintesis larutan probe AuNP+Cys+GO+antiBSA (sampel B2) seperti pada Gambar 2b. Peningkatan konsentrasi antiBSA relatif tinggi pada 540 nm. Gambar 6c menunjukkan konsentrasi penyerapan intensitas cahaya yang berbeda, dan puncak serapan 60 nm untuk AuNP diamati pada 540 nm. Peningkatan konsentrasi antiBSA relatif tinggi pada 540 nm. Hasil ini menunjukkan bahwa AuNP-GO dapat meningkatkan karakteristik penyerapan plasmon pada 540 nm ketika konsentrasi antiBSA ditingkatkan. Selain itu, dalam percobaan immunoassay, kami mencampur target GO-BSA (1,52 μM) (sampel A) dan probe AuNP+Cys+GO+antiBSA seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6d. Selain karakteristik interaksi hidrofobik dan –π dari lembaran GO, ikatan kovalen antara protein dan gugus karboksil pada lembaran GO juga mendukung adhesi permukaan. Hasil ini kemungkinan karena struktur hibrid AuNP+GO-antiBSA untuk membentuk respons imun yang stabil dengan protein lain pada GO-BSA. Panjang gelombang memiliki puncak serapan yang jelas pada 260 nm. Selain karakteristik interaksi hidrofobik dan –π (π–π* plasmon peak) dari lembaran GO, ikatan kovalen antara protein dan gugus karboksil pada lembaran GO juga mendukung adhesi permukaan. Sebelum dan sesudah ikatan BSA dan antiBSA, nilai puncak plasmon –π* dari GO (230 dan 270 nm) bergeser secara signifikan, yang membuktikan bahwa BSA dan antiBSA terikat secara positif.

Analisis spektrum penyerapan UV-vis untuk respon imun. a GO terikat AuNP dan BSA terikat GO, b AuNPs dan anti-BSA terikat-GO, c Probe AuNP-GO-antiBSA, dan d Probe AuNP-GO-antiBSA dan target GO-BSA untuk respons imun

Gambar 7 menunjukkan bahwa hasil ini sesuai dengan kurva kalibrasi. Analisis terperinci dari hasil eksperimen di atas (Gbr. 6c, d) menunjukkan bahwa respons penginderaan terhadap ketidakakuratan rata-rata yang sesuai dari absorbansi adalah 1,3487, 1,1776, 1,0698, 0,8755, dan 0,8588 (Gbr. 7a) dan 0,9226, 0,8535, 0,7649, 0,7243 , dan 0,695 (Gbr. 7b), sesuai dengan konsentrasi protein 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM, dan 145 fM. Gambar 7a menunjukkan bahwa regresi linier dari kurva kalibrasi adalah f(x) = 0.918 + 0.124× (koefisien korelasi, R ² = 0.94) untuk pemeriksaan AuNP-GO dengan interaksi antiBSA, di mana x adalah konsentrasi protein dan y adalah absorbansi optik. Selain itu, Gambar 7b menunjukkan bahwa persamaan regresi linier dari kurva yang dipasang adalah f(x) = 0,791 + 0,057× (koefisien korelasi, R ² = 0.954) untuk GO dan AuNP-GO berdasarkan immunoassay.

Perbandingan kurva kalibrasi tanggapan penginderaan diperoleh pada konsentrasi protein yang berbeda. a Kurva kalibrasi untuk probe AuNP-GO dengan interaksi antiBSA. b Kurva kalibrasi untuk GO dan GO-AuNP berdasarkan immunoassay

Selama percobaan kuantisasi, kami menambahkan konsentrasi tetap 10 ng/ml protein human chorionic gonadotropin (hCG) untuk bertindak sebagai pengganggu. Hasil menunjukkan bahwa protein hCG pengganggu tetap pada kurva kalibrasi immunoassay dipasangkan dengan f(x) = 0.843 + 0.113× (koefisien korelasi, R ² = 0.89) untuk probe AuNP-GO dengan interaksi antiBSA (Gbr. 7a), dan f(x) = 0,722 + 0,051× (koefisien korelasi, R ² = 0.73) untuk GO dan AuNP-GO berdasarkan immunoassay (Gbr. 7b).

Selanjutnya, hasil eksperimen kami menunjukkan bahwa strategi deteksi memungkinkan regenerasi permukaan tanpa kehilangan spesifisitas (empat regenerasi) dan juga dapat digunakan untuk mendeteksi protein antiBSA dengan respons dinamis mulai dari 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM , 145 fM, dan 0 fM. The results demonstrated that with a decreased concentration of antiBSA (from 1.45 nM to 145 fM) and even without the presence of antiBSA (0 fM), the spectral absorption intensity did not change the minimum level of quantitation. The hCG protein interfered with the antibody recognition in the immunoassay to a limited extent, possibly due to non-specific adsorption. This implies a very low cross-reactivity of the hCG protein and non-specific interactions at a low adsorption. In the practical quantitative analysis with immunoassays, a LOD of 145 fM for antiBSA was achieved in both buffer and interference protein samples.