Dampak Nanopartikel Silika pada Ekspresi Gen dan Metilasi DNA pada Jaringan Paru dan Testis
Abstrak
Nanoteknologi telah berkembang pesat dan kini digunakan dalam banyak terapi medis canggih. Namun, ada kekhawatiran yang meningkat bahwa paparan nanopartikel (NP) dapat menginduksi berbagai penyakit sistemik karena mekanisme epigenetik semakin terkait dengan lebih banyak penyakit. Peran modifikasi epigenom NP penting untuk etiology penyakit. Studi kami bertujuan untuk menentukan mekanisme epigenetik dari kerusakan pada sel paru dan testis dengan mengekspos sel kepada NP SiO₂. Kami menggunakan tikus C57BL/6 jantan untuk mengkarakterisasi efek kerusakan NP SiO₂ pada sel paru dan testis serta status metilisasi pada domain terpampran Dlk1/Dio3. Sel A549 yang diekpos SiO₂ NP mengalami apoptosis, dan tikus jantan yang diekpos SiO₂ NP memiliki jaringan paru dan testis yang berubah. Gen dalam domain terpampran Dlk1/Dio3 berubah di kedua jaringan; Dlk1, Rtl1, dan Dio3 diupregulasi di testis sementara Dlk1 dan Dio3 juga diupregulasi di jaringan paru. Sequeniasi PCR bisulfit pada paru dan testis dewasa jantan sebagian besar hipometilasi, dengan beberapa CpG hipermetilasi. Temuan ini menunjukkan bahwa nanopartikel memainkan peran penting dalam metilisasi DNA gen terpampran.
Latar Belakang
Dioksida silikon adalah oksida silikon dengan rumus kimia SiO₂, yang paling umum ditemukan dalam alam sebagai kuarsa dan dalam berbagai lingkungan organik [1]. Nanopartikel yang dirancang telah meluas dalam pertumbuhan pesat dan aplikasi nanoteknologi di industri teknologi tinggi. Nanopartikel ini banyak digunakan dalam berbagai produk konsumen termasuk elektronik, produk plastik, medis, kosmetik, dan bahan pelapis karena properti fisika ilmiahnya seperti luas permukaan spesifik yang besar, situs reaktif yang melimpah, energi permukaan tinggi, ikatan kimia yang tidak terpuaskan, kemampuan adsorpsi yang kuat, dan kecenderungan kuat untuk berinteraksi dengan logam dan bahan organik, sehingga mengubah kontaminan dan transportnya di lingkungan [2]. Kehadiran nanopartikel SiO₂ (NP) dalam berbagai konsumen meningkatkan kemungkinan untuk dilepaskan ke lingkungan dan bertemu dengan populasi manusia.
Studi eksperimental sebelumnya telah menunjukkan bahwa instilasi intratrakeal satu dosis atau beberapa injeksi intraperitoneal dari spesies nanopartikel logam dan oksida logam menyebabkan efek toksik dari tingkat seluler hingga sistemik dan organisme [3]. Perlakuan SiO₂ NP menekan pertumbuhan baris sel kanker payudara dengan meningkatkan apoptosis dan mengurangi gerak sel. Selain itu, paparan SiO₂ NP secara signifikan mengganggu reseptor faktor pertumbuhan epidemis (EGFR) [4]. Ketika model tikus diobati dengan tiga ukuran berbeda nanopartikel TiO₂ dan dibandingkan dengan kontrol, pengobatan cairan cuci bronkoalveolar (BALF) dengan aerosol agregat besar (> 100 nm) menginduksi respons inflamasi akut, sementara aerosol agregat kecil (< 100 nm) menghasilkan kerusakan stres oksidasi dan sitotoksisitas yang signifikan [5].
Studi toksisitas nanopartikel pada reproduksi adalah bidang yang berkembang. Sebuah studi telah menunjukkan bahwa pada dosis perlakuan yang sama, NP Ni menginduksi toksisitas reproduksi yang lebih tinggi pada C. elegans dibandingkan NP Ni (partikel mikro). Toksisitas reproduksi yang diamati pada C. elegans meliputi ukuran tes yang lebih rendah, telur dibuahi, dan aktivasi spermatide [6]. Ada bukti yang semakin meningkat bahwa efek lingkungan tertentu dapat diturunkan ke keturunan melalui jalur paternal tanpa perubahan pada genom sperma [7, 8]. Informasi paternal tidak hanya ada dalam genom, tetapi juga dalam penanda epigenetik spesifik yang terkait, konten mRNA, dan RNA non-kode.
Stres oksidatif adalah mekanisme penting dalam toksisitas nanopartikel, yang dapat memicu kerusakan DNA, inflamasi, denaturasi protein, dan peroksidasi lipid [9]. Efek biologis ini dipengaruhi oleh properti fisikokimia nanopartikel, termasuk ukurannya, luas permukaan, bentuk, kimia permukaan, fungsionalisasi, dan kelarutan [10, 11]. Ada bukti yang semakin meningkat yang jelas menunjukkan paparan nanopartikel dapat memicu perubahan epigenetik dalam jaringan dan sel bahkan pada dosis rendah, non-sitotoksik [12, 13]. Epigenetik adalah studi tentang perubahan yang dapat diwariskan dalam fungsi gen yang tidak melibatkan perubahan pada urutan DNA termasuk metilisasi DNA, imprin gen, modifikasi histone, dan regulasi oleh RNA non-kode [14]. Perubahan epigenetik seperti ini terkait dengan perkembangan dan progresi berbagai kondisi patologis dan penyakit [15]. Oleh karena itu, efek epigenetik adalah bagian penting dari penyaringan risiko pasien pada tingkat seluler.
Domain terpampran Dlk1/Dio3 mengandung tiga daerah metilisasi berbeda (DMR) yang diketahui yang dimetilasi paterna: DMR antar-gen (IG-DMR), DMR 3 diekspresikan maternally (Gtl2-DMR), dan Dlk1-DMR [16]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa IG-DMR menentukan status metilisalel dari DMR promotor Gtl2, yang kemudian mengontrol ekspresi gen di seluruh kluster [17]. Genom tikus memiliki sejumlah besar gen terpampran di domain Dlk1/Dio3 di wilayah distal kromosom 12. IG-DMR yang terletak di antara gen terpampran Dlk1 dan Gtl2 secara khusus dimetilasi dalam sel germline pria dan mengatur ekspresi alele spesifik orang tua dari wilayah gen terpampran [18]. Status metilisasi IG-DMR ditetapkan sebelum lahir dan sehingga dipertahankan sepanjang hidup pria dalam germline pria selama diferenciasi sel germline pria, berarti metilisasi IG-DMR dipertahankan dalam espermatogonia dan espertosit di testis matang.
Tujuan kami adalah untuk menemukan perubahan dalam ekspresi gen germline pria selama espermatogenesis sebelum penyelamatan transkripsi dan translasi untuk menjelaskan pengaruh paternal pada keturunan melalui perubahan lingkungan. Faktor lingkungan dapat memodifikasi modifikasi transkripsi sperma, yang dapat mengakibatkan perubahan pada perkembangan keturunan. Untuk melakukan penyelidikan ini dalam karya kami, kami menggunakan baris sel dan tikus sebagai model untuk penyaringan efek toksik NP SiO₂. Seperti yang diketahui kami, ini adalah studi pertama yang mendemonstrasikan mekanisme epigenetik dari wilayah terpampran Dlk1/Dio3 yang menyebabkan kerusakan nanopartikel pada kedua jaringan paru dan testis.
Metode
Hewan Eksperimen
Penanganan hewan dilakukan sesuai dengan Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium di bawah protokol penggunaan hewan yang sesuai di Universitas Kedokteran Nanjing. Tikus diperoleh dari Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Semua hewan ditempatkan pada 23 °c dengan siklus cahaya 12 jam. Air sterilis dan pakan rodent dikonsumsi oleh tikus sesuai keinginan. Aktivitas dan perilaku tikus dipantau setiap hari. Setelah 2 minggu, tikus diinjeksi nano-SiO₂ 12,5 mg/kg.
Bahan Kimia
Nano-SiO₂ (99,5% basis logam jejak, ukuran partikel 10–20 nm) diperoleh dari Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, Amerika Serikat). Nanopartikel disusulkan dalam RPMI 1640 Medium untuk membuat larutan stok, disperdi oleh getaran ultrasonik selama 20 menit, dicampur ke konsentrasi yang sesuai, dan diperdisi selama 20 menit lagi.
Karakteristik NP SiO₂
Ukuran dan potensi zeta dicatat menggunakan Malvern Zetasizer Nano ZSP.
Ekstraksi RNA dan qRT-PCR
Sampel paru dan testis dibeku cepat dalam nitrogen cair dan kemudian disimpan pada 80 °c setelah sekitar 4 jam. Kami melelehkan sampel sebelum kita mengekstrak sampel.
RNA total diisolasi dari sampel menggunakan 1 mL Reagen TRIzol (Invitrogen Life Technologies Co, USA). Campuran diultrasonik pada daya 80% selama 5 menit, ditambahkan 0,2 mL kloroform, dan kemudian disentrifugas pada 12.000g/min pada 4 °c selama 15 min. Kemudian, tiga langkah purifikasi fenol/kloroform ditambahkan untuk menghilangkan protein. Kemudian, kami menggunakan serap UV untuk mengukur konten dan kualitas RNA setiap sampel pada 260 dan 280 nm. Sequensi primer mRNA ditunjukkan dalam Berkas Tambahan 1: Tabel S1 dan S2. qRT-PCR dilakukan sesuai petunjuk produsen, seperti yang dijelaskan sebelumnya [19]. PCR real-time dilakukan menggunakan SYBR Green (Vazyme). Siklus PCR adalah sebagai berikut: denaturasi awal pada 95 °c selama 30 s, diikuti oleh 40 siklus denaturasi pada 95 °c selama 15 s, aneling pada 60 °c selama 15 s, dan perpanjangan pada 72 °c selama 30 s. Jumlah gen target dianalisis menggunakan metode 2^-ΔCt setelah normalisasi dengan β-aktin.
Ekstraksi DNA, Perlakuan Bisulfit, dan Sequeniasi PCR Bisulfit
DNA diisolasi dari jaringan testis dan paru menggunakan kit DNA (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. No.51304; USA) sesuai rekomendasi produsen. Konversi bisulfit 500 ng semua DNA genomik dicapai menggunakan kit (EpiTect® Bisulfite kit; Qiagen. No. 59104; USA) sesuai rekomendasi produsen. Oligonukleotida metilisasi CpG berbeda dirancang menggunakan perangkat lunak Methyl Primer Express v1.0 dan sequensinya adalah P1-F 5′-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3′, P1-R 5′-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3′; P2-F 5′-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3′, P2-R 5′-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3′; P3-F 5′- TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3′, P3-R 5′- ACCCATAACAAACCACAACA-3′; P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3′, P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3′.
Setiap sampel DNA diamplifikasi oleh PCR sebagai berikut: 2,5 μl 10 × PCR buffer reaksi PCR campuran dengan 500 ng DNA yang telah diperlakukan bisulfit, 0,5 μl masing-masing primer forward dan reverse, 0,5 μl dNTP Mix, 0,5 μl rTaq (500 U, dNTP, Mg2+) (Takara Bio, Tokyo, Jepang), penambahan ddH2O hingga volume 25 μl. Setelah aktivasi polimerase pada 94 °c selama 10 min, diikuti oleh 40 siklus urutan berikut: 30 detik pada 94 °c, 30 detik pada 58 °c, 1 menit pada 72 °c, dan perpanjangan akhir pada 72 °c selama 10 min.
Budidaya Sel dan Perlakuan
Sel A549 dibeli dari ATCC (Manassas, VA, USA) dan dibudidayakan dalam 1640 yang dilengkapi dengan 10% serum sapi fetal (FBS) pada 37 °c dan 5% CO₂ dalam inkubator lembap. Sel ditempatkan pada plate 96-lubang, diinkubasi dengan berbagai konsentrasi NP SiO₂: 62,5, 125, 250, 500, 1000, dan 2000 μg/ml selama 24 jam.
Uji Kehidupan Sel
Kehidupan sel dievaluasi oleh assay proliferasi CCK8. Sel ditempatkan dengan kepadatan 1,5 × 10⁴ per lubang pada plate 96-lubang dan diinkubasi selama malam hari. Setelah paparan NP SiO₂ pada berbagai konsentrasi, 100 μl CCK8 ditambahkan ke setiap lubang, dan sel diinkubasi selama 30 menit pada 37 °c untuk memungkinkan metabolisme CCK8. Terakhir, absorbansi ditentukan pada 450 nm. Tingkat inhibisi sel dihitung dan diubah menjadi IC₅₀ menggunakan SPSS 15.0.
Analisis Statistik
Semua komputasi dilakukan menggunakan perangkat lunak SPSS 15.0. Perbandingan antar grup dilakukan menggunakan uji t tidak terkait dan uji chi-square Pearson untuk BSP. Data disajikan sebagai rata-rata ± SD. Dalam semua kasus, nilai p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Karakterisasi NP SiO₂
Kami mengkarakterisasi NP SiO₂ dalam kondisi eksperimen. Radius hidrodinamis rata-rata dan potensi zeta NP SiO₂ dalam medium budidaya adalah 371,77 ± 18,46 nm dan 18,83 ± 2,12 mV, masing-masing (Gambar 1).
Karakterisasi NP SiO₂ dalam suspensi. Partikel disusulkan dalam medium budidaya sel dengan 10% FBS. a, b Ukuran dan potensi zeta NP SiO₂ dievaluasi oleh Zetasizer Nano ZSP. c Kehidupan sel ditentukan oleh assay CCK8 setelah paparan berbagai konsentrasi NP SiO₂ selama 24 jam. Rata-rata ± SD dari eksperimen duplikat, masing-masing terdiri dari tiga replik teknis. *** p < 0,001
Efek NP SiO₂ pada Baris Sel A549
Untuk menentukan toksisitas NP SiO₂, kami melakukan uji proliferasi dengan sel A549, untuk menentukan IC₅₀ NP SiO₂ pada sel A549. Seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1c, NP SiO₂ mengurangi kehidupan sel A549 secara bergantung pada konsentrasi. Pengurangan kehidupan sel signifikan pada konsentrasi NP SiO₂ lebih dari 62,5 μg/ml (p < 0,001). IC₅₀ 24 jam dari sebuah kimia didefinisikan sebagai konsentrasi yang mempengaruhi 50% sel setelah 24 jam paparan. IC₅₀ 24 jam yang ditentukan untuk NP SiO₂ adalah 4942 μg/ml.
Efek NP SiO₂ pada Paru dan Testis Tikus
Kami menentukan apakah paparan NP SiO₂ pada dosis 12,5 mg/kg berat badan akan mengakibatkan kerusakan membran paru dan bahkan kerusakan testis pada model tikus kami. Seperti yang ditunjukkan dalam gambar, paparan NP SiO₂ menyebabkan gangguan badan lamelar pada bagian histologis paru (Gambar 2a, b) dan kerusakan kristae mitokondria dibandingkan dengan grup kontrol pada testis (Gambar 2c, d). Kami kemudian menyelidiki efek NP SiO₂ pada paru dan testis pada aktivasi imprin pada wilayah terpampran Dlk1/Dio3.
Citra TEM jaringan paru dan testis tikus yang diekpos NP SiO₂. a Morfologi dievaluasi pada jaringan paru oleh SEM dalam kontrol. b Morfologi dievaluasi pada jaringan paru oleh SEM dalam grup yang diobati. c Morfologi dievaluasi pada jaringan testis oleh SEM dalam kontrol. d Morfologi dievaluasi pada jaringan testis oleh SEM dalam grup yang diobati. Skala bar mewakili 2,0 μm
Ekspresi Gen Terpampran pada Paru dan Testis Tikus
Untuk mengilustrasikan perubahan pada paru dan testis, kami mendeteksi gen terpampran dalam jaringan ini. Kami memilih 24 gen terpampran; yaitu Dio3, Ddc, Dlk1, Gpr1, Gtl2, H19, Igf2, Igf2as, Igf2r, Inpp5f, Magel2, Magi2, Mest, Mir296, Mir298, Ndn, Nnat, Peg10, Plagl1, Pwcr1, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn, dan Snurf. Tiga belas dari gen ini diekspresikan di kedua paru dan testis: Dio3, Dlk1, Gpr1, Gtl2, Igf2r, Igf2, Inpp5f, Peg10, Ndn, Nnat, Rasgrf1, Rtl1, dan Snrpn (Gambar 3a, b). Gen yang diekspresikan secara berbeda yang menjadi perhatian utama adalah pada wilayah terpampran Dlk1/Dio3, yang berisi Dlk1, Gtl2, Rtl1, dan Dio3.
Ekspresi gen terpampran pada paru dan testis. a Ekspresi gen terpampran pada paru. b Ekspresi gen terpampran pada testis. *P < 0,05. **P < 0,01. Uji t Student
Ekspresi Wilayah Terpampran Dlk1/Dio3
Wilayah terpampran Dlk1/Dio3 mengandung tiga gen yang berkode protein (Dlk1, Gtl2, Rtl1, dan Dio3) pada alele yang diwarisi [20] (Gambar 4c). Untuk menguraikan peran wilayah Dlk1/Dio3 dalam respons jaringan paru dan testis terhadap perlakuan NP SiO₂, kami menganalisis pola metilisasi DMR dibandingkan dengan kontrol. Berbagai gen ditargetkan oleh metilisasi pada paru dan testis. Ekspresi Dlk1 dan Dio3 diupregulasi di kedua paru dan testis, sementara Rtl1 diupregulasi hanya pada testis (Gambar 4a, b).
Ekspresi wilayah terpampran Dlk1/Dio3. a Gen wilayah Dlk1/Dio3 yang diekspresikan pada paru. b Gen wilayah Dlk1/Dio3 yang diekspresikan pada testis. c Skema wilayah Dlk1/Dio3. *P < 0,05. **P < 0,01. Uji t Student
Metilisasi Wilayah DMR Dlk1/Dio3
Untuk menyelidiki lebih lanjut apakah ekspresi gen berubah sebagai respons terhadap metilisasi DNA, kami mengevaluasi status metilisasi wilayah ini pada paru dan testis tikus. Dalam analisis metilisasi DNA, kami menentukan urutan tiga bagian pulau CpG. Pada testis, mereka hipometilasi; namun, pada pulau CpG 1, mereka secara signifikan hipermetilasi (Gambar 5). Pada paru, metilisasi keseluruhan sama seperti pada testis, sementara pulau CpG 2 menunjukkan hipermetilasi (Gambar 6).
Metilisasi wilayah DMR Dlk1/Dio3 pada testis. a Metilisasi pulau CpG 1 pada jaringan kontrol dan yang diobati. b Metilisasi pulau CpG 2 pada jaringan kontrol dan yang diobati. c Metilisasi pulau CpG 3 pada jaringan kontrol dan yang diobati
Metilisasi wilayah DMR Dlk1/Dio3 pada paru. a Metilisasi pulau CpG 1 pada jaringan kontrol dan yang diobati. b Metilisasi pulau CpG 2 pada jaringan kontrol dan yang diobati. c Metilisasi pulau CpG 3 pada jaringan kontrol dan yang diobati
Diskusi
Penggunaan nanomaterial yang semakin meningkat telah menimbulkan kekhawatiran tentang dampak potensial pada kesehatan manusia dan dampak lingkungan. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa NP SiO₂ dapat menyebabkan kerusakan paru dan kardiovaskular, seperti inflamasi paru dan kerusakan isemik miokard pada tikus tua [21]. Selain itu, nanopartikel dapat berpengaruh pada germline, karena sel-sepertinya lebih sensitif terhadap efek toksik NP Ag dan menunjukkan efek buruk setelah paparan pada dosis yang lebih rendah. Paparan NP Ag meningkatkan jumlah abnormalitas yang diamati pada sel sperma tikus dan mengurangi integritas akrosoma dan membran plasma selain mengurangi aktivitas mitokondria [22]. Penyelidikan kami adalah bagian dari serangkaian studi yang menggunakan platform eksperimental untuk mengevaluasi potensi nanopartikel untuk menargetkan organisme pria bahkan keturunan yang tidak diekpos mereka.
Dalam studi in vitro kami sebelumnya, kami melaporkan bahwa paparan jangka pendek terhadap beberapa nanopartikel mengakibatkan apoptosis sel dan ekspresi gen terpampran yang tidak normal pada sel Sertoli TM-4. Temuan ini menunjukkan bahwa ekspresi gen terpampran yang tidak normal mungkin menjadi mekanisme dasar untuk nanopartikel dalam menginduksi toksisitas reproduksi [23]. Selain itu, dalam studi in vivo kami sebelumnya, beberapa faktor lingkungan, seperti penghambat endokrin, juga mempromosikan fenotipe atau kondisi penyakit tidak hanya pada individu yang diekpos tetapi juga pada generasi keturunan berikutnya. Epi-mutasi pada germline yang terprogram secara permanen dapat memungkinkan transmisi fenotipe transgenerasional epigenetik [19]. Tujuan studi ini adalah untuk menyelidiki perubahan yang dilakukan pada status epigenetik oleh perlakuan NP SiO₂ dalam model tigus untuk melandasi dasar mekanisme efek transgenerasional pria.
Status epigenetik adalah istilah yang digunakan untuk menentukan modifikasi kimia yang terjadi dalam genom tanpa mengubah urutan DNA [24]. Mekanisme epigenetik, termasuk metilisasi DNA, gen terpampran, modifikasi histone, dan ekspresi RNA non-kode, dapat mempengaruhi fungsi genom dalam lingkungan eksogen [25]. Seperti yang diketahui kami, studi kami adalah pertama untuk menyelidiki NP SiO₂ yang menginduksi toksisitas paru dan testis pada tingkat epigenetik.
Kami pertama kali memeriksa toksisitas akut NP SiO₂ pada sel A549, baris sel epitel paru manusia. Namun, temuan kami pada tikus eksperimental mengungkapkan cedera pada sel epitel tipe II paru laminar dan cedera mitokondria testis setelah kontak dengan NP SiO₂ pada konsentrasi lingkungan [26]. Untuk lebih memahami mekanisme patologi paru dan testis, kami mengekspresikan gen terpampran. Imprin genomik merujuk pada penyelamatan satu alele orang tua dalam zigot gamet tergantung pada asal orang tua; penyelamatan ini terjadi melalui proses epigenetik seperti metilisasi DNA dan/atau modifikasi histone [27]. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa ekspresi gen terpampran pada domain Dlk1/Dio3 penting untuk pertumbuhan janin [28], waktu pubertas manusia [29], dan kerentanan terhadap penyakit metabolik [30]. Studi telah menunjukkan bahwa IG-DMR menentukan status metilisasi alele dari DMR promotor Gtl2, yang kemudian mengontrol ekspresi gen di seluruh wilayah Dlk1/Dio3 [17]. Fungsi utama dari wilayah kontrol terpampran ini adalah untuk mewarisi metilisasi DNA yang dijalankan sel germline sebagai sinyal gametik, dan kemudian untuk mempertahankan pola metilisasi DNA spesifik alele selanjutnya dalam sel somatik [31]. Studi kami menunjukkan bahwa NP SiO₂ menginduksi perubahan pada ekspresi wilayah Dlk1/Dio3 baik pada jaringan paru maupun testis. Pada wilayah Dlk1/Dio3, gen yang diekspresikan patern (Dlk1, Rtl1, dan Dio3) sangat tidak normal dibandingkan dengan kontrol setelah perlakuan NP. Hasil sequeniasi PCR bisulfit menunjukkan tingkat hipometilisasi yang berbeda pada paru dan testis. Status metilisasi IG-DMR umumnya lebih rendah pada jaringan yang diobati, dan hipometilisasi ini mungkin mewakili mekanisme ekspresi gen terpampran yang berbeda.
Kesimpulan
Simpulan, hasil kami menunjukkan bahwa paparan NP SiO₂ dapat menginduksi perubahan metilisasi DNA yang penting yang memicu kerusakan selular dan bahwa perubahan ini sangat penting untuk ekspresi kluster gen terpampran Dlk1/Dio3. Pentingnya, perubahan metilisasi DNA mempengaruhi kedua jaringan paru dan testis. Hasil ini memainkan peran penting dalam penelitian kami di masa depan yang memeriksa efek epigenom nanopartikel yang diwarisi oleh keturunan dari model yang diekpos dan klarifikasi mekanisme molekuler yang memediasi perubahan epigenetik seperti itu.
