Biokompatibel FePO4 Nanopartikel:Pengiriman Obat, Stabilisasi RNA, dan Aktivitas Fungsional
Abstrak
FePO4 NP menjadi perhatian khusus dalam fortifikasi makanan dan pencitraan biomedis karena biokompatibilitasnya, bioavailabilitas tinggi, sifat magnetik, dan kinerja sensorik superior yang tidak menyebabkan efek organoleptik yang merugikan. Karakteristik ini juga diinginkan dalam penghantaran obat. Di sini, kami menjelajahi FePO4 nanopartikel sebagai pembawa pengiriman untuk obat antikanker, doxorubicin, dengan pemuatan obat optimal 26,81% ± 1,0%. Pemuatan ini semakin memperkuat pembentukan Fe
3+
kompleks doksorubisin menghasilkan pembentukan FePO4 - Nanopartikel DOX. FePO4 - Nanopartikel DOX menunjukkan homogenitas ukuran yang baik dan biokompatibilitas yang bergantung pada konsentrasi, dengan biokompatibilitas lebih dari 70% hingga konsentrasi 80 µg/mL. Yang penting, analisis sitotoksisitas menunjukkan bahwa Fe
3+
kompleksasi dengan DOX di FePO4 -DOX NP meningkatkan sitotoksisitas sekitar 10 kali lipat dari DOX bebas dan meningkatkan selektivitas terhadap sel kanker. Selanjutnya, FePO4 NP suhu-menstabilkan RNA dan mendukung aktivitas terjemahan mRNA menunjukkan janji untuk agen penstabil RNA. Hasilnya menunjukkan biokompatibilitas nanopartikel anorganik berbasis besi, obat dan pemuatan RNA, stabilisasi, dan aktivitas pengirimannya dengan konsekuensi potensial untuk fortifikasi makanan dan pengiriman obat/RNA.
Pengantar
Di antara berbagai nanopartikel anorganik seperti emas, silika, dan titik-titik kuantum, nanopartikel berbasis besi (Fe-NPs) banyak dieksplorasi untuk aplikasi biomedis seperti agen kontras, pembawa obat, dan terapi berbasis termal [1,2,3]. Karena sifat magnetik, bio-adaptasi yang tinggi, dan metabolisme besi endogen yang diketahui, Fe-NP adalah kandidat yang diinginkan untuk aplikasi biomedis. Dengan demikian, Fe-NP membuat mayoritas nanomedicine anorganik yang disetujui FDA [1, 2]. Ini termasuk INFeD, DexFerrum, Ferrlecit, Venofer, Feraheme, dan Injectafer yang tersedia secara komersial untuk aplikasi mereka pada anemia defisiensi besi dan defisiensi besi pada penyakit ginjal kronis [1]. Demikian pula, pemberian intravena glukonat besi kelat adalah intervensi yang dapat ditoleransi dengan baik untuk anemia [4]. Anemia adalah salah satu kekurangan gizi yang paling umum di dunia dan nanopartikel berbasis Fe seperti FePO4 dan FeSO4 telah digunakan dalam fortifikasi makanan untuk mencegah anemia. Fortifikasi pangan adalah proses penambahan zat gizi mikro pada pangan dengan tujuan untuk mengatasi kekurangan gizi pada suatu populasi [5]. FePO4 NP menjadi perhatian khusus dalam fortifikasi makanan karena biokompatibilitasnya, bioavailabilitasnya yang tinggi, dan kinerja sensorik yang superior yang tidak menyebabkan efek organoleptik yang merugikan [6,7,8,9]. Perfecto dkk. telah mendemonstrasikan FePO4 Internalisasi NP dalam sel usus manusia terjadi terutama melalui transporter logam divalen-1 (DMT-1) dan oleh karena itu dapat dengan mudah diserap [9, 10]. Feridex® dan Revosit® berbasis besi banyak digunakan sebagai agen kontras pencitraan resonansi magnetik (MRI) untuk kontras yang ditingkatkan MRI [11,12,13,14,15,16]. Sehubungan dengan laporan yang luar biasa ini, FePO4 NP menampilkan diri mereka sebagai kendaraan pengiriman yang baik. Di sini, kami menjelajahi FePO4 sebagai pembawa obat dengan memuat obat antikanker, Doxorubicin (DOX). Ion besi (Fe
3+
) dapat membentuk kompleks dengan molekul DOX yang difasilitasi oleh interaksi elektrostatik antara Fe yang kekurangan elektron dalam FePO4 dan gugus –OH yang kaya elektron dalam DOX untuk membentuk FePO yang bermuatan DOX4 NP:FePO4 -DOX NP. Kami mengevaluasi sifat fisikokimia FePO4 dan FePO4 -DOX NP dan menilai profil biokompatibilitas dan sitotoksisitasnya, masing-masing, pada sel-sel osteosarcoma K7M2 tikus dan fibroblast NIH/3T3.
Seiring dengan itu, nanopartikel anorganik telah menunjukkan janji dalam stabilisasi dan pengiriman asam nukleat [17,18,19]. Dalam hal ini, nanopartikel emas telah dipelajari secara luas karena kemampuannya untuk melumpuhkan oligonukleotida di permukaannya sehingga dapat mencegah agregasi dan degradasi molekuler [17, 20]. Namun, emas bukan merupakan elemen endogen dan dengan demikian dapat membatasi aplikasi translasinya. Di sini, nanopartikel berbasis Fe seperti FePO4 nanopartikel dapat menjadi perhatian utama untuk studi stabilisasi RNA karena sifat endogennya dan profil biokompatibilitasnya. Ada dua mekanisme yang diusulkan interaksi asam nukleat (RNA/DNA) dengan Fe-NP untuk stabilisasi—(1) pembentukan ikatan hidrogen dan interaksi elektrostatik antara gugus fosfat tulang punggung asam nukleat dan Fe-NP yang menghasilkan adsorpsi nukleat asam dalam Fe-NPs, dan (2) asam nukleat dapat menyerap ke permukaan Fe-NPs melalui interaksi pasangan basa nukleotida [19, 21, 22]. Sebuah penelitian telah menunjukkan potensi nanopartikel kalsium fosfat untuk stabilisasi dan pengiriman vaksin DNA [23]. Dalam hal ini, di sini kami telah menjelajahi stabilisasi RNA dan aktivitas fungsional nanopartikel berbasis fosfat lainnya, FePO4 , untuk menyelidiki potensi multifungsi FePO4 nanopartikel berbasis, dalam pengiriman dan stabilisasi kargo.
Dengan persetujuan cepat vaksin mRNA melawan COVID19, nanopartikel vaksin mRNA sangat menarik, RNA menjadi sasaran hidrolisis cepat dan hilangnya ekspresi fungsional, nanopartikel wajib meningkatkan karakteristik penting ini. Berikut kami tampilkan FePO4 NP menstabilkan RNA dan mendukung terjemahan mRNA fungsional. Mengingat karakteristik yang sangat baik ini, FePO4 NP mungkin perlu dipertimbangkan untuk fortifikasi makanan, obat, dan pengiriman RNA, membuka aplikasi biomedis yang menarik.
Hasil dan Diskusi
FePO4 Sintesis, Karakterisasi, dan Analisis Biokompatibilitas NP
Reaksi kimia satu langkah sederhana antara (NH4 )3 PO4 dan Fe(TIDAK3 )3 memberikan FePO4 sebagai endapan yang terdispersi dalam surfaktan lipid-PEG biokompatibel yang membantu menstabilkan FePO4 nanopartikel dan mencegah agregasi. FePO4 NP menunjukkan ukuran hidrodinamik 175 ± 5 nm dengan indeks polidispersitas (PDI) 0,150 ± 0,01 menunjukkan homogenitas partikel yang baik dan distribusi ukuran yang sempit. Analisis potensial zeta menunjukkan muatan permukaan negatif FePO4 NP dengan potensi zeta 19.1 ± 8 mV. Muatan permukaan negatif selanjutnya membantu menstabilkan partikel dalam koloid sehingga mencegah opsonisasi protein, suatu mekanisme yang mencegah penargetan seluler dan mengubah farmakokinetik [24,25,26]. FePO4 selanjutnya dikarakterisasi dengan FTIR. Gambar 1c menunjukkan karakteristik spektral FePO4 nanopartikel dan prekursornya—Fe(NO3 )3 dan (NH4 )3 PO4 . FePO4 spektrum menunjukkan puncak tajam yang berbeda pada 1030 cm
−1
yang dapat dikaitkan dengan pita peregangan P–O, puncak kecil pada 520 cm
−1
sesuai dengan tekukan antisimetris O–P–O, dan rentang lebar dari 3000 hingga3500 cm
−1
mewakili getaran lentur dan regangan air dari molekul air yang teradsorpsi [27, 28]. FePO4 spektrum menunjukkan adanya PO4
3−
kelompok dan mirip dengan puncak FTIR yang dilaporkan oleh penelitian lain sehingga mengkonfirmasi pembentukan FePO4 nanopartikel [27,28,29]. Fe(TIDAK3 )3 spektrum menunjukkan puncak karakteristik untuk pita peregangan N–O pada 1326 dan 813 cm
−1
[30]. Puncak pada 1625 dapat dikaitkan dengan getaran tekuk –OH dan puncak lebar sekitar 3000 cm
−1
dapat dikaitkan dengan air lentur dan getaran peregangan [30]. Demikian juga, (NH4 )3 PO4 menunjukkan puncak karakteristik untuk gugus amonium sekitar 1500 cm
−1
dan gugus fosfat sekitar 1000 cm
−1
[31]. Tidak adanya puncak nitrat dan amonium pada FePO4 nanopartikel menunjukkan produk tersebut bebas dari kemungkinan produk sampingan dan menegaskan kemurnian sintesis.
Karakterisasi dan biokompatibilitas FePO4 nanopartikel. a Distribusi ukuran hidrodinamik FePO4 NP, b zeta pengukuran potensial FePO4 NP menunjukkan muatan permukaan, c FTIR FePO4 NP dan prekursornya-Fe(NO3 )3 dan (NH4 )3 PO4 , dan d biokompatibilitas FePO4 NP pada osteosarcoma tikus K7M2 dan garis sel fibroblast tikus NIH/3T3. NP diperlakukan pada berbagai konsentrasi selama 48 jam (a, b data mewakili mean ± s.d.; n =3 ulangan. d mewakili mean ± s.d., n = 6 ulangan).
Dengan jaminan keberhasilan sintesis, kemurnian, homogenitas ukuran yang baik, dan muatan permukaan FePO yang stabil4 NP, kami melanjutkan untuk menganalisis biokompatibilitas FePO4 NP. Untuk tujuan ini, kami menggunakan sel kanker dan non-kanker:osteosarcoma tikus K7M2 dan fibroblast tikus NIH/3T3 dan menganalisis biokompatibilitas NP pada konsentrasi yang bervariasi dalam hal viabilitas sel menggunakan uji MTT. FePO4 NP menunjukkan biokompatibilitas yang bergantung pada konsentrasi di kedua garis sel-K7M2 dan NIH/3T3, dalam kisaran konsentrasi 20 hingga 600 g/mL (Gbr. 1d). FePO4 NP menunjukkan biokompatibilitas yang baik hingga konsentrasi 80 µg/mL dengan viabilitas sel lebih besar dari 70%. Biokompatibilitas relatif lebih tinggi pada sel non-kanker NIH/3T3 dibandingkan dengan sel kanker K7M2.
Pemuatan Doksorubisin di FePO4 dan Sitotoksisitas FePO4 -DOX
Doksorubisin dimuat dalam FePO4 melalui metode co-incubation-presipitasi dimana larutan doksorubisin dicampur dengan prekursor FePO4 yang menghasilkan pembentukan FePO yang dimuat DOX4 . Tiga formulasi berbeda untuk memuat DOX digunakan seperti yang dibahas dalam metode. Formulasi 1 menunjukkan efisiensi pemuatan terbaik sebesar 26,81% ± 1 sedangkan formulasi 2 menunjukkan efisiensi pemuatan sebesar 8,83% ± 2 dan formulasi 3 tidak menunjukkan pemuatan apapun (Gbr. 2a). Untuk pemuatan, kami menambahkan larutan DOX ke prekursor Fe(NO3 )3 dalam formulasi 1 dan untuk (NH4 )3 PO4 pada formulasi 2, sedangkan pada formulasi 3, kami menambahkan larutan DOX ke FePO4 NP secara langsung. Data pemuatan dengan jelas menunjukkan bahwa menambahkan DOX ke FePO4 NP tidak mempertahankan DOX saat menambahkan DOX ke salah satu prekursor:Fe(NO3 )3 dan (NH4 )3 PO4 solusi membantu dalam pemuatan dan retensi DOX. Hal ini dapat dijelaskan dengan fakta bahwa Fe
3+
dari Fe(TIDAK3 )3 dapat membentuk kompleks dengan gugus oksigen kaya elektron yang ada di Doksorubisin [32, 33]. Fe
3+
Kompleks -DOX kemudian diendapkan dengan penambahan (NH4 )3 PO4 menghasilkan FePO4 -DOX, yang ditandai dengan perubahan warna dari kuning samar menjadi coklat samar (Gbr. 2b). Meskipun terjadi perubahan warna, tidak ada perubahan pada spektrum emisi FePO4 -DOX yang menunjukkan emisi maksimum pada 590 nm mirip dengan DOX Gratis, saat dieksitasi pada 480 nm (Gbr. 2c). FePO4 NP -DOX menunjukkan ukuran hidrodinamik 187 ± 7 nm dan PDI 0,143 ± 0,02, mirip dengan FePO4 (Gbr. 2d). Namun, terdapat perbedaan yang signifikan pada muatan permukaan FePO4 -DOX NP (-8,89 ± 5 mV), dibandingkan dengan FePO4 NP (-19.1 ± 8 mV) (Gbr. 2e). Perubahan potensi zeta menunjukkan perubahan fungsional pada sifat permukaan nanopartikel. Di sini, pengurangan potensi zeta dari 19,1 menjadi 8,89 mV dapat dikaitkan dengan kompleksasi DOX yang menambahkan sifat kationik dalam kompleks.
Pemuatan Doksorubisin (DOX) di FePO4 NP dan karakterisasi FePO4 -DOX. a Efisiensi pemuatan DOX dalam tiga formulasi FePO yang berbeda4 NP dan DOX, b representasi bergambar perubahan warna dari kuning menjadi coklat setelah pemuatan DOX dalam FePO4 untuk merumuskan FePO4 -DOX, c karakterisasi spektrum emisi FePO bermuatan DOX4 NP (FePO4 -DOX) setelah eksitasi pada 480 nm, d distribusi ukuran hidrodinamik FePO4 -NP DOX, dan e zeta karakterisasi potensial FePO4 -DOX NP menunjukkan muatan permukaan (data mewakili mean ± s.d.; n = 3 ulangan)
Mengikuti karakterisasi fisikokimia, sitotoksisitas FePO4 -DOX dianalisis dalam sel K7M2 dan NIH/3T3 dan dibandingkan dengan DOX gratis (Gbr. 3). FePO4 -DOX menunjukkan sitotoksisitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan Free DOX pada konsentrasi DOX yang setara di kedua lini sel. Nilai IC50 menunjukkan penurunan sekitar 10 kali lipat dengan FePO4 -Perlakuan DOX, dari 2,61 hingga 0,248 µM dalam sel NIH/3T3 dan 1,01 hingga 0,107 µM dalam sel K7M2. Pengurangan drastis nilai IC50 di kedua garis sel ini menunjukkan peningkatan profil sitotoksisitas FePO4 -DOX NP. FePO yang setara4 konsentrasi dalam rentang konsentrasi IC50 FePO4 -DOX adalah 40 µg/mL (0,107 µM dalam sel K7M2) dan 100 µg/mL (0,248 µM dalam sel NIH/3T3), keduanya berada dalam kisaran biokompatibel FePO4 konsentrasi, dengan viabilitas sel lebih dari 70%. Oleh karena itu, peningkatan FePO4 Sitotoksisitas -DOX dapat dikaitkan dengan Fe
3+
-Pembentukan kompleks DOX dan bukan pada kontribusi individu FePO4 dan DOX. Literatur telah menunjukkan peningkatan efek sitotoksik antrasiklin seperti doksorubisin dengan adanya besi [34,35,36,37]. Laporan ini selanjutnya didukung oleh pengurangan sitotoksisitas Fe-DOX dengan penggunaan chelators besi [35,36,37]. Salah satu mekanisme yang diusulkan adalah kompleks Fe-DOX mempotensiasi toksisitas spesies oksigen reaktif (ROS) turunan DOX yang mengubah ROS yang relatif aman (O
2·
– dan H2 O2 ) menjadi ROS yang jauh lebih beracun yang menyebabkan peningkatan kerusakan DNA dan kematian sel [34, 36]. Mekanisme lain yang diusulkan adalah interaksi DOX dengan fungsi protein pengatur besi dan feritin dengan adanya kelebihan Fe sehingga mempengaruhi homeostasis besi yang mengarah pada kerusakan yang bergantung pada ROS dan independen serta kematian sel apoptosis [36, 38].
Sitotoksisitas FePO4 -DOX NP. a, b Sitotoksisitas Free Doxorubicin (DOX) dan FePO4 -DOX NPs dalam sel-line fibroblast tikus NIH/3T3 dan osteosarcoma K7M2, masing-masing, pada berbagai konsentrasi setara DOX. Sitotoksisitas dianalisis dalam persentase viabilitas sel setelah perlakuan partikel selama 48 jam. c, d Perbandingan persentase viabilitas sel FePO4 -DOX NPs dan Free DOX dalam garis sel NIH/3T3 dan K7M2, masing-masing, pada konsentrasi DOX yang setara. Sisipan di tengah mewakili nilai IC-50 Free DOX dan FePO4 -DOX NP dalam sel NIH/3T3 dan K7M2 (data mewakili mean ± s.d.; n = 6 ulangan)
Seiring dengan peningkatan sitotoksisitas, FePO4 -DOX menunjukkan selektivitas terhadap sel kanker dengan perilaku sitotoksisitas yang lebih tinggi mirip dengan Free DOX. Gambar 3c menunjukkan 0,1 µM FePO setara DOX4 -DOX menunjukkan 53% viabilitas sel untuk sel kanker K7M2 dibandingkan dengan 72% viabilitas sel untuk NIH/3T3 non-kanker. Demikian juga, Free DOX juga menunjukkan perilaku sitotoksisitas yang lebih tinggi terhadap sel kanker, dengan viabilitas sel 54% pada sel K7M2 dibandingkan dengan 66% pada NIH/3T3. Namun, perbedaannya meningkat dalam kasus FePO4 -DOX, dengan 19% perbedaan viabilitas sel antara sel kanker dan non-kanker dibandingkan dengan 12% pada DOX Gratis. Analisis sitotoksisitas menunjukkan bahwa kompleksasi Fe dengan DOX dalam FePO4 -DOX NP telah secara signifikan meningkatkan sitotoksisitas dan meningkatkan selektivitas terhadap sel kanker.
Internalisasi Seluler FePO4 -DOX NP
Perilaku internalisasi FePO4 -DOX NP dianalisis menggunakan mikroskop confocal setelah studi internalisasi bergantung waktu (Gbr. 4). DOX bebas digunakan sebagai kontrol positif. Keduanya FePO4 NP -DOX dan DOX Gratis tidak menunjukkan internalisasi yang signifikan pada titik waktu inkubasi awal 0,5 dan 1 jam. Namun, pada inkubasi 3 jam, keduanya menunjukkan internalisasi seperti yang digambarkan oleh fluoresensi DOX merah pada gambar confocal. Warna biru berasal dari pewarnaan nukleus dengan DAPI. Analisis menunjukkan bahwa dalam 3 jam, FePO4 -DOX NP menginternalisasi ke sel mengikuti perilaku internalisasi yang serupa dengan DOX Gratis. Penting untuk dicatat bahwa, karena perubahan warna FePO4 -DOX yang berwarna kecoklatan dibandingkan dengan warna merah pada Free DOX, kami tidak dapat membandingkan secara kuantitatif profil internalisasi relatif FePO4 -DOX. Meskipun demikian, uji internalisasi menegaskan bahwa FePO4 -DOX diserap oleh sel dalam waktu 3 jam. Mengingat mekanisme penanganan zat besi yang dipahami dengan baik oleh tubuh kita, NP yang diusulkan dapat menjanjikan dalam pengembangan terapi antikanker berbasis zat besi dengan kemampuan untuk memantau respons terapeutik dalam satu sesi terapi.
Studi internalisasi seluler. Internalisasi seluler FePO4 -DOX NP dan DOX Gratis pada sel K7M2 setelah 3 jam, 1 jam, dan 0,5 jam. Sel diperlakukan dengan 200 L konsentrasi DOX 5 g/mL. Warna merah yang diamati pada garis sel yang diberi perlakuan nanopartikel menandakan internalisasi nanopartikel yang berhasil. Warna merah disebabkan oleh karakteristik fluoresensi DOX. Tidak ada sinyal merah yang diamati pada sel kontrol yang tidak diberi perlakuan
Stabilisasi RNA dan Ekspresi mRNA
Seperti dapat dilihat pada Gambar. 5a, sedangkan nanopartikel tembaga (Cu NP) dan karbon nanotube (CNT) mempercepat degradasi hidrolitik RNA (intensitas pita lebih rendah daripada kontrol), FePO4 dan nanopartikel kontrol perak (Ag) menstabilkan RNA seperti yang ditunjukkan oleh intensitas pita yang relatif kuat dalam elektroforesis gel agarosa RNA (RAGE). FePO4 dan nanopartikel seng oksida kontrol (ZnO NP) juga memberikan beberapa ketahanan terhadap degradasi dalam serum, seperti yang digambarkan oleh intensitas pita yang sedikit lebih tinggi daripada kontrol (Gbr. 5b). Yang penting dalam aktivitas fungsional, ekspresi mRNA lebih tinggi daripada kontrol non-nanopartikel, sedangkan Cu NP yang mendegradasi RNA menyebabkan hilangnya ekspresi mRNA yang diukur dengan unit cahaya relatif (Gbr. 5c). Hasil ini menunjukkan bahwa FePO4 NP membantu menstabilkan RNA dan dapat digunakan sebagai agen penghantar penstabil untuk penghantaran RNA terapeutik. Eksperimen pendahuluan sebelumnya telah menunjukkan rentang kerja translasi normal yang ditunjukkan adalah dua eksperimen independen untuk sampel perlakuan non-nanopartikel kontrol yang menunjukkan 2393 dan 2630 RLU/sumur yang representatif. Peningkatan dua kali lipat yang konsisten dengan data di atas menunjukkan FePO44 NP mendukung terjemahan sedangkan konsisten dengan denaturasi/degradasi RNA di atas, NP Cu menekan terjemahan. Berbagai sistem nanopartikel anorganik telah dieksploitasi untuk stabilisasi dan pengiriman RNA terapeutik termasuk; emas, perak, tembaga, oksida besi, nanopartikel silika mesopori (MSN), polimer berbasis karbon, komposit, dan lain-lain [39-45]. Misalnya kelompok kami telah melaporkan kompleksasi nanopartikel ke RNA makromolekul dapat menyebabkannya menolak degradasi oleh RNase, atau nuklease yang ada dalam serum dan jaringan. Vaksin mRNA COVID-19 telah memperbaharui minat pada terapi RNA makromolekul yang melampaui vaksin, di mana nanopartikel tidak hanya melindungi RNA dari hidrolisis dan pencernaan yang dimediasi nuklease, tetapi kompleksasi pada NP harus mempertahankan fungsi RNA, misalnya , ekspresi mRNA. Sebelumnya kami telah melihat RNA makromolekul kompleksasi nanopartikel tembaga menyebabkan denaturasi RNA [46] Jadi kami menyelidiki efek kompleksasi NP terhadap RNA makromolekul menggunakan Torula yeast RNA (TY-RNA) atau reporter membangun mRNA yang mengekspresikan Luciferase.
hidrolisis RNA. a Model RNA yang telah kami gunakan di sejumlah publikasi kami serupa dalam ukuran dan komposisi urutan untuk sebagian besar mRNA dari ragi torula (TY-RNA) digunakan. RNA diinkubasi dalam air suling ganda dari waktu ke waktu dengan ada atau tidak adanya nanopartikel baik tembaga (Cu NP), besi fosfat (FePO4), perak (Ag NP) atau karbon nanotube (CNT) pada 37 derajat celcius dan sampel dihilangkan pada suhu 37 derajat celcius. titik waktu yang sama dan diuji dengan elektroforesis gel agarosa RNA (RAGE). Hilangnya intensitas pewarnaan pita menunjukkan degradasi RNA sedangkan pemeliharaan intensitas pewarnaan pita RNA menunjukkan stabilisasi. b Serupa dengan di atas, RNA diinkubasi dalam 10% FBS/DMEM pada suhu kamar dengan adanya zinc oxide (ZnO) NP atau FePO4 NP versus kontrol yang merupakan RNA saja tanpa adanya nanopartikel. Sekali lagi sampel dikeluarkan dari waktu ke waktu dan diuji dengan RAGE, keberadaan pita RNA yang diwarnai dari waktu ke waktu menunjukkan stabilitas dan resistensi dari degradasi nuklease atau RNase dari serum. c mRNA encoding Luciferase diterjemahkan secara in vitro dari retikulosit kelinci standar dan pendaran relatif terstandarisasi menjadi RNA dengan ada atau tidak adanya besi fosfat (FePO4 ) atau nanopartikel tembaga (Cu)
Kesimpulan
FePO4 nanopartikel berhasil disintesis mengikuti teknik ko-inkubasi-presipitasi sederhana yang menghasilkan pembentukan partikel berukuran homogen 175 ± 5 nm. Analisis FTIR mengkonfirmasi adanya gugus fosfat dan tidak adanya pengotor prekursor dalam nanopartikel. Analisis biokompatibilitas mengungkapkan biokompatibilitas yang bergantung pada konsentrasi dengan viabilitas sel lebih dari 70% hingga 80 µg/mL. Selanjutnya, DOX dimuat secara efektif di FePO4 menghasilkan FePO4 -DOX NP yang menunjukkan sifat fisikokimia yang mirip dengan FePO4 . Analisis sitotoksisitas mengungkapkan bahwa kompleksasi Fe dengan DOX dalam FePO4 -DOX NP meningkatkan sitotoksisitas, dengan sekitar 10 kali peningkatan IC50, dan meningkatkan selektivitas terhadap sel kanker. Selain itu, uji internalisasi menunjukkan FePO4 -DOX NP diinternalisasi secara efisien dalam sel pada titik waktu inkubasi 3 jam. Studi stabilisasi RNA menunjukkan bahwa FePO4 nanopartikel secara efisien menstabilkan RNA, mencegah degradasi yang cepat, dan mempertahankan aktivitas fungsional yang menunjukkan janji untuk pengiriman RNA terapeutik. Mengingat homogenitas ukuran yang baik, kisaran biokompatibilitas, efisiensi pemuatan obat, profil sitotoksisitas yang ditingkatkan, sifat penstabil RNA, dan serapan seluler yang efisien, FePO4 NP menunjukkan karakteristik yang diinginkan untuk kendaraan pengiriman obat dan RNA. Selanjutnya, hasilnya menunjukkan prospek yang menjanjikan untuk menggunakan FePO4 -obat NP dalam fortifikasi makanan untuk pengembangan platform obat berbasis makanan.
Metode
Sintesis dan Karakterisasi FePO4 Nanopartikel
FePO4 nanopartikel disintesis dengan teknik presipitasi kimia yang mengoptimalkan protokol oleh Sokolova et al. [47]. Secara singkat, Amonium fosfat ((NH4 )3 PO4, 16 mg/mL) dan besi nitrat (Fe(NO3 )3, 8 mg/mL) larutan disiapkan. Untuk 1 mL Fe(TIDAK3 )3 , 1 mL (NH4 )3 PO4 ditambahkan tetes demi tetes dengan pengadukan konstan yang menghasilkan pengendapan besi fosfat (FePO4 ). Kelebihan (NH4 )3 PO4 digunakan sehingga semua Fe dari Fe(NO3 )3 mengendap sebagai FePO4. Jadi larutan besi fosfat yang terbentuk dicuci dengan air 3 kali untuk menghilangkan produk sampingan dengan cara disentrifugasi pada 300 g selama 2 menit. Akhirnya, FePO4 endapan didispersikan dengan larutan DSPE-PEG-COOH (10% b/b) dalam air untuk membentuk FePO4 nanopartikel. FePO4 NP dikarakterisasi untuk ukuran dan properti permukaan menggunakan hamburan cahaya dinamis (DLS) dan karakteristik spektral menggunakan Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR).
Doxorubicin (DOX) Memuat di FePO4 Nanopartikel
Doksorubisin dimuat di FePO4 nanopartikel dengan metode co-incubation-presipitasi. Tiga DOX-FePO berbeda4 Formulasi NP dieksplorasi untuk mengoptimalkan efisiensi pemuatan terbaik. Pada formulasi pertama, DOX-FePO4 NP diformulasikan dengan menambahkan 100 µg DOX dalam 1 mL Fe(NO3 )3 (8 mg/mL) diikuti dengan penambahan 1 mL (NH4 )3 PO4 (16 mg/mL) tetes demi tetes dengan pengadukan konstan. Pada formulasi kedua, 100 µg DOX pertama kali ditambahkan ke 1 mL (NH4 )3 PO4 (16 mg/mL) diikuti dengan penambahan 1 mL Fe(NO3 )3 (8 mg/mL) tetes demi tetes dengan pengadukan konstan. Pada formulasi ketiga, 100 µg DOX ditambahkan ke FePO4 solusi NP. Demikian dirumuskan FePO4 -DOX NP dicuci tiga kali dengan air dan jumlah doksorubisin dalam FePO4 -DOX diukur secara spektrofluorimetri dengan mengukur eksitasi dan emisi DOX pada 490 nm dan 595 nm.
Efisiensi pemuatan DOX dihitung dengan persamaan berikut:
Biokompatibilitas FePO4 NP dan Sitotoksisitas FePO4 -DOX NP
Biokompatibilitas FePO4 NP dan sitotoksisitas FePO4 -DOX NP diuji pada osteosarcoma tikus K7M2 dan fibroblas tikus NIH/3T3 menggunakan uji MTT mengikuti protokol yang ditetapkan [48, 49]. Secara singkat, 10.000 sel diunggulkan dalam 96 pelat sumur dan diinkubasi selama 24 jam dalam 37 °C 5% CO2 inkubator. Kemudian, media dikeluarkan dan media segar dengan konsentrasi nanopartikel yang bervariasi diperlakukan ke sel dan dibiarkan inkubasi selama 48 jam. Sel kontrol dipertahankan dengan media saja. FePO4 Konsentrasi NP berkisar antara 20 hingga 600 g/mL dan konsentrasi DOX berkisar antara 0,05 hingga 5 M. Setelah inkubasi NP, media dikeluarkan dan sel diinkubasi dengan larutan MTT (0,5 mg/ml) dalam media bebas serum selama 2 jam untuk memungkinkan pembentukan kristal formazan. Larutan MTT dihilangkan dan kristal formazan dilarutkan dalam DMSO dan dibiarkan selama 15 menit pada suhu kamar untuk pencampuran yang tepat. Kemudian absorbansi larutan DMSO diukur pada 550 nm menggunakan pembaca pelat mikro (BioTek, Synergy H1 Hybrid Reader) dan persentase viabilitas sel dihitung.
Internalisasi Seluler melalui Mikroskop Confocal
Internalisasi seluler FePO4 NP -DOX dianalisis dalam sel osteosarkoma tikus K7M2 menggunakan mikroskop confocal [49,50,51]. Secara singkat, 12.000 sel diunggulkan dalam pelat 8-sumur dan diinkubasi selama 24 jam dalam 37°C 5% CO2 inkubator. Kemudian, 200 L konsentrasi DOX 5 g/mL dalam media dirawat selama 3 jam, dan sel difiksasi dengan Paraformaldehyde 4% untuk pencitraan. Nukleus diwarnai oleh DAPI dan sel-sel diamati di bawah Mikroskop Pemindaian Laser Confocal (Carl Zeiss, LSM-700). Di sini, emisi maksimum DOX pada 560 nm dapat dimanfaatkan untuk melacak internalisasinya yang memberikan warna merah pada mikroskop confocal. Menggunakan protokol yang sama, uji internalisasi bergantung waktu dilakukan dengan menginkubasi FePO4 -DOX NP dan DOX Gratis masing-masing selama 0,5, 1, dan 3 jam.
Stabilitas dan Ekspresi RNA
Torula ragi RNA (Sigma-Aldrich) dilarutkan pada 1 mg/ml dalam air deionisasi steril dan 2 g alikuot terkena 20 ug/mL nanopartikel (CNT, Cu, Ag, ZnO NP atau FePO4 ) diinkubasi pada 37 ° C dan diuji dari waktu ke waktu dengan elektroforesis gel agarosa RNA seperti yang telah kami laporkan sebelumnya [42, 52]. Titik waktu yang ditunjukkan pada Gambar 5 adalah semalam. Demikian pula, RNA dengan/tanpa nanopartikel terkena 10% FBS/DMEM dan diuji lagi dengan RAGE seperti di atas. mRNA fLuc diperoleh dari Trilink Biotechnologies, 2 l diinkubasi dalam retikuloysat kelinci yang dilengkapi dengan Methinine, Cysteine and Leucine (ProMega Corp) selama 30 derajat selama 1,5 jam dengan atau tanpa nanopartikel pada 20 g/ml, ditambahkan reagen Luciferin standar, dan pengukuran luminesensi diambil pada pembaca pelat Biotek Synergy H1 dalam kondisi standar.
Analisis Statistik
Semua data mewakili setidaknya tiga ulangan independen dan dinyatakan sebagai mean ± s.d. bila memungkinkan. Data viabilitas sel mencakup enam ulangan.
Availability of Data and Materials
The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.
