Fungsionalisasi Permukaan APTES-GLU Meningkatkan Sensitivitas ELISA untuk Deteksi HIV-p24 hingga 1 nM
Abstrak
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tetap menjadi standar emas untuk penyaringan penyakit, namun sensitivitasnya sangat tergantung pada seberapa baik antigen diimmobilkan pada plates poliestren (PS). Kami mengembangkan kimia permukaan sederhana dan dapat direproduksi menggunakan 3-(aminopropil) trietoksisilan (APTES) diikuti dengan retikulasi glutaraldehida (GLU), yang menghasilkan lapisan protein dengan densitas tinggi dan terorientasi. Setelah treatment PS dengan 1% KOH, rasio 1:1 dari 1% APTES dan 1% GLU memberikan sinyal terkuat, dan inkubasi GLU selama malam mengoptimalkan binding. Dengan platform ini, kami mendeteksi HIV-p24, penanda infeksi dini, pada kadar 1 nM—30 kali lebih rendah dibandingkan ELISA konvensional. Permukaan yang dimodifikasi juga mempertahankan spesifikasi yang sangat baik terhadap serum manusia dan HIV-TAT. Kimia ini mudah ditransfer ke berbagai assay biomarker lain yang memerlukan efisiensi tangkapan yang ditingkatkan.
Latar Belakang
Deteksi yang akurat terhadap biomarker penyakit, termasuk antigen virus, sangat penting untuk diagnosis dini dan pengelolaan pasien. Popularitas ELISA berasal dari sensitivitas tinggi dan kemudahan penggunaan, namun performanya dapat terbatas oleh penangkapan antigen yang suboptimal pada permukaan PS. Adsorpsi konvensional bergantung pada interaksi elektrostatis antara karboksil permukaan dan amina protein, yang dapat menghasilkan cakupan tidak merata dan orientasi yang kurang optimal. Berbagai strategi—fotokimia, lapisan polimer seperti PVLA, dan PEGylation—dieksplorasi untuk meningkatkan immobilisasi, namun banyak masih mengalami kesulitan dengan protein atau peptida kecil.
Backbone hidrofobik poliestren menawarkan situs terbatas untuk ikutan kovalen. APTES memperkenalkan amina primer, yang memungkinkan fungsionalisasi lebih lanjut dengan cross-linker bifungsi seperti GLU yang memiliki dua grup aldehida. Pendekatan ini mengikis protein secara kovalen melalui pembentukan basis Schiff, mempromosikan lapisan yang lebih padat dan seragam. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa kimia APTES-GLU dapat meningkatkan tangkapan antibodi pada permukaan emas atau silica, namun aplikasinya pada plates ELISA untuk deteksi antigen kecil belum sepenuhnya divisualisasikan.
HIV-p24 adalah protein kapsid inti yang dirilis pada tahap awal infeksi, menjadikannya target ideal untuk assay sensitif. Di sini, kami menggunakan kimia permukaan APTES-GLU untuk mencapai deteksi p24 yang ultra-sensitif, menetapkan standar baru untuk diagnosis berbasis ELISA.
Bahan dan Metode
Reagen dan Biomolekul
Protein rekombinan HIV-p24 dan Tat, beserta anti-p24 antibody, diperoleh dari Abcam (Malaysia). APTES, GLU, dan serum manusia dibeli dari Sigma-Aldrich (USA). Anti-mouse-IgG-HRP diperoleh dari Thermo Scientific (USA). Plates ELISA berasal dari Becton Dickinson (Perancis), dan larutan pelapisan ELISA 5× dari Biolegend (Inggris). BSA dan substrat TMB dari Promega (USA). Pembaca ELISA analitis disuplai oleh Fisher Scientific (Malaysia).
Optimasi Rasio APTES dan GLU
Setelah mengaktifkan PS dengan 1% KOH selama 10 menit, kami menguji APTES pada konsentrasi 0,5%, 1%, dan 2% (v/v) selama malam pada suhu ruangan. Selanjutnya, treatment GLU pada 1% dan 2% (v/v) dilakukan. HIV-p24 pada konsentrasi tetap 250 nM kemudian diinkubasi pada setiap permukaan, diikuti dengan blocking menggunakan 2% BSA. Setelah menambahkan dilusi 1:1000 dari anti-p24 antibody dan anti-mouse-IgG-HRP, reaksi divisualisasikan dengan TMB dan diukur pada 405 nm. Kontrol tidak menyertakan antigen target.
Waktu Inkubasi GLU
Untuk mengevaluasi efek paparan GLU, permukaan diinkubasi dengan GLU selama 3 jam atau selama malam sebelum menambahkan 250 nM HIV-p24. Langkah-langkah yang tersisa mengikuti protokol sebelumnya.
Strategi Deteksi Komparatif
Kami membandingkan dua pendekatan yang dimediasi GLU: (1) "amine-GLU-p24" di mana PS yang telah di-treatment GLU langsung diekspos pada 100 nM p24, dan (2) "amine-GLU premix" di mana GLU (2%) dicampur dengan 100 nM p24 selama 30 menit pada suhu ruangan sebelum diadsorpsi pada plates yang telah dimodifikasi APTES. Deteksi dilakukan dengan urutan inkubasi antibody yang sama.
Penilaian Batas Deteksi
Dilusi serial p24 (0,5–500 nM) disiapkan. Untuk setiap dilusi, kami melakukan ELISA konvensional dan dua metode APTES-GLU (metode 1 dan 2). Densitas optik pada 405 nm dicatat setelah langkah pencucian standar.
Pengujian Spesifikitas
Untuk memverifikasi spesifikitas assay, serum manusia dan protein HIV-TAT (dicampur dengan 1% GLU) diuji dalam kondisi identik, menggantikan p24. Tidak ada sinyal signifikan yang diamati dibandingkan dengan kontrol positif p24.
Hasil dan Pembahasan
Modifikasi permukaan melalui aktivasi KOH, amination APTES, dan retikulasi GLU menciptakan platform yang kimiawi kuat untuk tangkapan protein. Gambar 1a menggambarkan urutan: aktivasi KOH → APTES → GLU → immobilisasi antigen → deteksi antibody.
Representasi skematis ELISA yang dimodifikasi kimiawi (a). Permukaan ELISA dimodifikasi kimiawi menggunakan APTES dan GLU setelah treatment kalium hidroksida. Antigen diimmobilkan pada permukaan yang dimodifikasi GLU. b Antigen yang diimmobilkan dideteksi oleh antibody pasangannya.
Dalam optimasi konsentrasi APTES/GLU, 1% masing-masing menghasilkan sinyal spesifik tertinggi (OD ≈ 0,22) dengan latar belakang minimal (OD ≈ 0,08). Konsentrasi yang lebih tinggi (2%) meningkatkan binding non-spesifik, kemungkinan karena grup aldehida berlebihan yang melibatkan situs permukaan lain. Inkubasi GLU selama malam menghasilkan OD sekitar dua kali lipat dibandingkan paparan 3 jam, yang menunjukkan cakupan permukaan yang lebih sempurna (Gambar 4a).
Optimasi periode inkubasi GLU. a Dioptimalkan untuk periode inkubasi 3 jam dan inkubasi selama malam menggunakan 1% GLU pada permukaan yang dimodifikasi 1% APTES. b Deteksi 125 nM p24 dengan tiga pendekatan berbeda, konvensional, APTES-GLU-p24 (metode 1), dan APTES-GLU-p24 premixed (metode 2).
Saat membandingkan dua strategi GLU, pendekatan premix (metode 2) konsisten menghasilkan nilai OD yang lebih tinggi di semua konsentrasi, menekankan manfaat pre-binding GLU ke antigen sebelum adsorpsi pada plates.
Batas deteksi untuk antigen HIV-p24. p24 dititrasi dari 0,5 hingga 500 nM. Tiga pendekatan berbeda diikuti, konvensional dan metode 1 dan 2.
ELISA konvensional mencapai LOD sebesar 30 nM. Metode 1 menurunkan LOD menjadi 4 nM—peningkatan 7,5 kali—sedangkan metode 2 mencapai LOD yang mengesankan sebesar 1 nM, peningkatan 30 kali. Peningkatan sensitivitas yang dramatis ini dikaitkan dengan densitas protein yang lebih tinggi dan orientasi optimal yang diberikan oleh kimia APTES-GLU.
Deteksi spesifik antigen HIV-p24. Alih-alih HIV-p24, serum manusia dan protein HIV-TAT digunakan untuk memeriksa spesifikitas.
Pengujian spesifikitas mengonfirmasi bahwa baik serum manusia maupun HIV-TAT tidak menghasilkan sinyal signifikan, memperkuat selektivitas assay terhadap p24.
Kesimpulan
Immobilisasi kovalen antigen yang dioptimalkan pada plates ELISA PS melalui APTES dan GLU secara signifikan meningkatkan batas deteksi. Dengan memungkinkan lapisan protein yang padat dan terorientasi, kimia permukaan ini mencapai LOD yang 30 kali lebih rendah untuk HIV-p24, menggambarkan potensinya untuk biomarker dengan kelimpahan rendah lainnya. Metode ini sederhana, dapat diskalakan, dan kompatibel dengan alur kerja ELISA yang ada, membuka jalan untuk diagnosis yang lebih sensitif dan relevan klinis.
