Konjugasi Kimia Amina-Aldehid pada Permukaan ELISA Polistirena yang Diperlakukan Kalium Hidroksida untuk Nanosensing Antigen HIV-p24
Abstrak
Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) telah banyak digunakan untuk surveilans penyakit dan skrining obat karena akurasi dan sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi. Penyesuaian ELISA adalah wajib untuk meningkatkan deteksi spesifik biomolekul pada kelimpahan yang lebih rendah. Untuk mencapai tujuan ini, penangkapan molekul yang lebih tinggi pada permukaan ELISA polistirena (PS) sangat penting untuk deteksi yang efisien, dan itu dapat dicapai dengan melumpuhkan molekul dalam orientasi yang benar. Sangat menantang untuk melumpuhkan molekul protein dengan cara yang selaras pada permukaan ELISA karena variasi muatan. Kami menggunakan strategi kimia permukaan PS 3-(aminopropil) triethoxysilane (APTES) - dan glutaraldehid (GLU) yang digabungkan untuk menunjukkan kinerja tinggi dengan ELISA. Perlakuan kalium hidroksida diikuti dengan rasio yang sama dari 1% APTES dan perlekatan GLU ditemukan optimal, dan inkubasi yang lebih lama dengan GLU mendukung sensitivitas maksimum. p24 adalah antigen pensekresi awal yang vital untuk mendiagnosis human immunodeficiency virus (HIV), dan telah digunakan untuk deteksi yang efisien dengan bahan kimia di atas. Tiga prosedur berbeda diikuti, dan mereka mengarah pada peningkatan deteksi antigen HIV-p24 pada 1 nM, yang merupakan tingkat 30 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan permukaan ELISA konvensional. Fungsionalisasi kimia permukaan yang ditunjukkan di sini juga menampilkan spesifisitas yang lebih tinggi dengan serum manusia dan HIV-TAT. Pendekatan di atas dengan kimia permukaan yang dirancang juga dapat direkomendasikan untuk diagnosis penyakit pada permukaan penginderaan lain yang melibatkan interaksi probe dan analit dalam sampel uji heterogen.
Latar Belakang
Deteksi biomarker penyakit dan antigen permukaan pada patogen utuh diperlukan di bidang diagnosis medis untuk memperpanjang umur manusia dan mendukung kehidupan yang lebih sehat. Sistem deteksi yang berbeda tersedia untuk mendiagnosis patogen dan penyakit yang mengancam jiwa, termasuk kanker [1,2,3,4]. Kisaran probe dan strategi penginderaan telah ditunjukkan untuk mengidentifikasi beberapa penyakit [5, 6]. Di antara hasil ini, enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) adalah strategi yang mapan untuk mendeteksi dan mendiagnosis penyakit utama termasuk HIV, dan ELISA telah dianggap sebagai tes kontrol kualitas [7,8,9,10]. Sebagai immunoassay, ELISA mendeteksi antigen menggunakan antibodi yang sesuai. Untuk memenuhi peran ini, antigen diimobilisasi pada permukaan polistirena (PS) dan kemudian berinteraksi dengan antibodi pasangan (antibodi primer), diikuti oleh antibodi spesifik pejamu (antibodi sekunder) dengan enzim terkonjugasi, yang diizinkan untuk mengikat antibodi primer. Akhirnya, interaksi molekuler ini dipantau oleh substrat yang sesuai. Para peneliti telah menggunakan pendekatan berbasis ELISA yang berbeda, termasuk metode sandwich dengan antibodi poli dan monoklonal yang sesuai atau kombinasi aptamer-antibodi untuk meningkatkan deteksi [11,12,13,14].
Sensitivitas ELISA tergantung pada parameter seperti interaksi antara antigen dan antibodi, suhu, pH, dan efisiensi perlekatan antigen pada permukaan PS. Di antara faktor-faktor ini, imobilisasi antigen atau antibodi pada pelat PS memainkan peran penting dalam meningkatkan batas deteksi. Selain itu, keterbatasan yang ditimbulkan oleh perlekatan dan distribusi protein yang tidak seragam pada permukaan PS sangat mempengaruhi sensitivitas pengujian [5]. Kuantitas yang lebih tinggi dengan imobilisasi protein yang tepat membantu dalam mencapai orientasi yang tepat pada permukaan PS untuk kemungkinan peningkatan deteksi. Strategi yang berbeda telah digunakan untuk melumpuhkan protein dengan benar pada permukaan PS. Protein atau antibodi memiliki kemampuan untuk bergerak pada pelat PS hanya dengan adsorpsi kimia atau fisik atau interaksi elektrostatik. Bora dkk. [15] protein amobil pada permukaan PS menggunakan fotokimia, dan mereka menemukan peningkatan hingga 1,5 hingga 2 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan permukaan yang tidak diberi perlakuan. Dalam studi lain, imobilisasi protein yang efisien pada pelat PS dengan polimer yang disebut polivinil benzil laktononilamida (PVLA) ditunjukkan [16]. Polimer berbasis polietilen glikol (PEG) juga telah menyediakan imobilisasi biomolekul yang efisien pada permukaan penginderaan. Laksmipriya dkk. [17] mengembangkan deteksi yang lebih baik dari faktor protein pembekuan IX dengan melumpuhkan oligomer tiolasinya bersama dengan dua polimer (PEG-b-PAAc dan N6-PEG) pada permukaan berlapis emas.
Pada permukaan pelat ELISA, PS terdiri dari rantai karbon alifatik dengan cincin benzena liontin pada setiap karbon, dan menyediakan permukaan hidrofobik. Gugus karboksil pada permukaan PS mengikat antigen atau antibodi melalui interaksi elektrostatik dengan gugus amina yang terpapar. Namun, strategi pengikatan ini memiliki kelemahan, seperti pengikatan protein yang lebih rendah dan penempatan molekul yang tidak teratur. Protein dan peptida berukuran lebih kecil dengan jumlah komposisi asam amino yang lebih rendah sangat sulit untuk diikat pada permukaan PS karena ketersediaan epitop yang lebih sedikit. Selain itu, telah ditunjukkan bahwa jika molekul pada substrat penginderaan padat, maka jarak antar probe terlalu terganggu untuk terlibat dalam interaksi asli. Oleh karena itu, meningkatkan pengikatan protein atau antibodi pada pelat PS dengan orientasi yang tepat akan meningkatkan batas deteksi. Secara umum, protein secara langsung diimobilisasi pada permukaan ELISA, dan para peneliti berfokus pada peningkatan imobilisasi protein pada permukaan ELISA untuk mengembangkan deteksi kinerja tinggi. Secara khusus, imobilisasi protein dengan fungsionalisasi kimia pada permukaan PS telah diamati oleh beberapa peneliti untuk meningkatkan strategi ini. Modifikasi kimia berbasis amina efektif dalam melumpuhkan antibodi yang berbeda melalui pengikat silang yang sesuai. 3-(Aminopropil) triethoxysilane (APTES) umumnya digunakan untuk memodifikasi permukaan penginderaan untuk digunakan dengan amina. Antibodi dapat bergerak pada permukaan APTES yang dimodifikasi amina melalui gugus COOH-nya. Namun, imobilisasi protein tidak dapat dihubungkan langsung ke permukaan amina seperti antibodi; khususnya, protein berukuran lebih kecil membutuhkan zat pengikat silang yang tepat. Di sini, kami memperkenalkan langkah sederhana imobilisasi protein menggunakan modifikasi kimia dengan APTES dan glutaraldehid (GLU). Kami melumpuhkan protein secara kovalen pada permukaan yang dimodifikasi amina dan ditautkan menggunakan GLU. GLU adalah senyawa organik dengan rumus CH2 (CH2 CHO)2 , dan telah ditemukan sebagai salah satu agen pengikat silang protein yang paling efektif [4, 18,19,20]. Ia memiliki dua gugus aldehida di ujungnya; satu ujung berikatan dengan permukaan ELISA yang dimodifikasi amina, dan ujung lainnya bebas untuk mengikat protein atau antibodi. Secara umum, imobilisasi protein atau peptida berukuran lebih kecil pada permukaan ELISA benar-benar menantang karena adanya lebih sedikit amina pada permukaannya. Dengan strategi fungsionalisasi kimia, ada kemungkinan menggunakan protein atau peptida berukuran lebih kecil untuk melumpuhkan material secara kuat pada pelat ELISA PS. Untuk metode kami, kami menggunakan APTES-GLU sebagai penghubung; dengan menggunakan modifikasi ini, kita dapat melumpuhkan semua jenis antibodi, protein, dan peptida. Peningkatan sinyal dan sensitivitas di bawah strategi ini lebih tinggi dibandingkan dengan strategi kimia lainnya yang dieksplorasi di masa lalu [3, 4].
Untuk mendemonstrasikan keuntungan dari bahan kimia ini, kami memilih deteksi salah satu protein utama human immunodeficiency virus (HIV) (p24), yang diekspresikan pada tahap awal infeksi HIV. Antigen p24 terdiri dari inti virus dan hadir pada tingkat yang lebih tinggi selama minggu pertama infeksi. Oleh karena itu, sangat ideal untuk menghasilkan sistem sensitif menggunakan p24 untuk deteksi HIV lebih dini. Di sini, pendeteksian p24 dihasilkan menggunakan permukaan ELISA yang dimodifikasi secara kimiawi di atas. Strategi fungsionalisasi kimia ini telah meningkatkan deteksi p24 pada permukaan PS ELISA pada beberapa lipatan, dan dapat direkomendasikan untuk mendeteksi biomarker klinis penting lainnya.
Bahan dan Metode
Reagen dan Biomolekul
Protein HIV-p24 dan Tat rekombinan dan antibodi p24 dibeli dari Abcam (Malaysia). 3-(Aminopropil) triethoxysilane (APTES), glutaraldehid (GLU), dan serum manusia dibeli dari Sigma-Aldrich (AS). Peroksidase lobak terkonjugasi anti-tikus-IgG (anti-tikus imunoglobulin HRP) diperoleh dari Thermo Scientific (USA). Piring ELISA diperoleh dari Becton Dickinson (Prancis). Sebuah buffer pelapis ELISA 5X diperoleh dari Biolegend (UK). Albumin serum sapi (BSA) dan substrat HRP [3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB)] diperoleh dari Promega (USA). Pembaca ELISA analitis diperoleh dari Fisher Scientific (Malaysia).
Level APTES dan GLU Optimal untuk Fungsionalisasi pada Permukaan PS
Optimalisasi tingkat APTES dan GLU untuk digunakan pada permukaan PS dilakukan dengan antigen p24 HIV yang ditargetkan. Untuk menentukan konsentrasi APTES dan GLU yang sesuai, permukaan ELISA pertama-tama diaktifkan oleh kalium hidroksida 1% selama 10 menit. Kemudian, tiga jumlah APTES (0,5, 1, dan 2%) yang berbeda diizinkan untuk mengikat pada permukaan ELISA, dan mereka diinkubasi semalaman pada suhu kamar (RT). Setelah itu, dua jumlah GLU yang berbeda (1 dan 2%) diaplikasikan pada permukaan PS yang dimodifikasi amina. Pada saat itu, HIV-p24 pada konsentrasi 250-nM diizinkan untuk mengikat pada permukaan yang dimodifikasi GLU, dan permukaan GLU yang tersisa diblokir dengan 2% BSA. Antibodi p24 diperkenalkan pada pengenceran 1:1000, dan kemudian IgG-HRP anti-tikus diizinkan untuk mengikat antibodi p24. Akhirnya, interaksi ini dipantau dengan menambahkan substrat (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB) untuk HRP. Setelah jumlah substrat yang optimal (100 mM) ditambahkan, absorbansi dibaca dengan pembaca ELISA pada 405 nm. Eksperimen kontrol dilakukan tanpa adanya target HIV-p24.
Optimasi Tautan Aldehid ke Grup Amina
Untuk menentukan waktu inkubasi yang cocok untuk GLU untuk menghubungkan permukaan yang dimodifikasi amina, dua waktu inkubasi yang berbeda diamati. Setelah permukaan ELISA PS dimodifikasi dengan APTES, GLU diimobilisasi selama 3 jam dan diinkubasi secara independen semalaman, dan kemudian antigen HIV-p24 250 nM diimobilisasi pada permukaan yang dimodifikasi GLU. Langkah-langkah yang tersisa diikuti seperti yang ditunjukkan pada percobaan sebelumnya.
Deteksi Perbandingan Antara Antigen HIV-p24 pada Permukaan yang Dimodifikasi GLU dan Lampiran Antigen Premixed-HIV-p24 GLU
Untuk mendeteksi antigen HIV-p24 pada permukaan ELISA, kami membandingkan dua pendekatan modifikasi permukaan yang berbeda menggunakan GLU. Yang pertama (metode 1:amina-GLU-p24), permukaan PS awalnya dimodifikasi oleh amina menggunakan 2% APTES, 2% GLU ditambahkan ke permukaan untuk menambatkan permukaan pelat dengan gugus aldehida, dan kemudian 100 nM HIV-p24 antigen ditambahkan. Pada pendekatan kedua (metode 2:amina-GLU premix p24), setelah permukaan dimodifikasi oleh amina, GLU-p24 (2% GLU dicampur dengan 100 nM antigen HIV-p24 dan dipertahankan pada RT selama 30 min) ditambahkan. Akhirnya, deteksi dilakukan dengan menggunakan antibodi p24. Langkah-langkah lain dilakukan seperti yang dijelaskan di atas. Eksperimen kontrol dilakukan tanpa target HIV-p24.
Batas Deteksi:ELISA Konvensional vs Modifikasi Kimia
Untuk memeriksa batas deteksi, konsentrasi p24 yang berbeda dititrasi dari 0,5 hingga 500 nM, dan dievaluasi menggunakan metode konvensional serta metode 1 dan 2.
Metode konvensional
Antigen HIV-p24 awalnya diencerkan dengan buffer pelapis ELISA 1%, ditambahkan ke permukaan ELISA, dan dipertahankan pada suhu 4 °C semalaman, dan kemudian area yang tersisa diblokir dengan 2% BSA selama 1 jam di RT. Setelah itu, antibodi p24 pengenceran 1:1000 ditambahkan dan diinkubasi selama 1 h, kemudian pengenceran 1:1000 anti-IgG-HRP ditambahkan ke permukaan ELISA dan didiamkan selama 1 h. Terakhir, substrat HRP (TMB) ditambahkan dan diukur pada panjang gelombang 405 nm menggunakan pembaca ELISA.
Metode 1
Konsentrasi antigen HIV-p24 yang berbeda ditambahkan ke permukaan yang dimodifikasi APTES dan GLU. Setelah antigen diimobilisasi, langkah-langkah yang tersisa diikuti seperti yang dinyatakan dalam ELISA konvensional. Pencucian dilakukan lima kali antara setiap langkah imobilisasi. Absorbansi dicatat pada panjang gelombang 405 nm menggunakan pembaca ELISA, dan foto diambil.
Metode 2
Pada pelat ELISA yang dimodifikasi APTES, konsentrasi p24 yang berbeda yang dicampur dengan GLU diimobilisasi. Semua langkah lain yang digunakan untuk ELISA konvensional diikuti. Pencucian dilakukan lima kali antara setiap langkah imobilisasi. Absorbansi dicatat pada panjang gelombang 405 nm menggunakan pembaca ELISA, dan foto-foto direkam. Eksperimen kontrol dilakukan tanpa target HIV-p24.
Deteksi Spesifik Antigen HIV-p24 pada Permukaan yang Dimodifikasi APTES
Untuk memeriksa spesifisitas pengujian, kami melakukan dua eksperimen kontrol yang berbeda. Alih-alih antigen HIV-p24, kami menggunakan serum manusia atau protein HIV-TAT yang dicampur dengan 1% GLU dan menambahkannya ke permukaan yang dimodifikasi APTES. Semua langkah lain diikuti seperti yang dijelaskan di atas. Eksperimen kontrol dilakukan tanpa adanya target HIV-p24.
Hasil dan Diskusi
Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) adalah immunoassay efektif yang membantu peneliti mengidentifikasi berbagai biomolekul menggunakan antibodi yang sesuai. Imobilisasi tinggi analit (protein, peptida, antibodi, dan aptamers) [21,22,23] dan kemampuan untuk menangkap molekul (antibodi monoklonal, antibodi poliklonal, dan daerah Fc antibodi) [24, 25] dapat secara dramatis meningkatkan batas deteksi dan membantu dalam mendukung kekhususan analisis. Dengan pemikiran ini, beberapa jenis penelitian difokuskan pada modifikasi kimia permukaan ELISA untuk menangkap probe atau analit yang berorientasi dengan benar pada jumlah yang lebih tinggi. Secara umum, antibodi atau protein diimobilisasi pada permukaan ELISA PS melalui interaksi elektrostatik antara gugus karboksil pada PS dan gugus amina pada protein atau antibodi. Namun, metode ini tidak cukup efisien untuk mencapai sensitivitas dan spesifisitas yang lebih tinggi karena keterbatasan pengikatannya. Untuk mengatasi masalah mendasar ini, selama penyelidikan ini, kami menyiapkan permukaan ELISA yang difungsikan secara kimia menggunakan 3-(aminopropil) triethoxysilane (APTES) dan glutaraldehid (GLU) untuk imobilisasi protein yang efisien. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a, permukaan PS yang diaktifkan kalium hidroksida dimodifikasi oleh amina menggunakan APTES dan kemudian dihubungkan silang dengan GLU untuk menempelkan protein. Dengan tidak adanya perlakuan kalium hidroksida, tingkat optimal APTES yang melekat pada permukaan PS secara signifikan lebih rendah karena tidak adanya akseptor ikatan hidrogen polar yang meningkatkan adsorpsi awal dan akan memicu pengikatan APTES yang lebih tinggi. Gambar 1b menunjukkan usulan deteksi protein amobil pada permukaan ELISA yang dimodifikasi secara kimia dengan antibodi mitranya.
Representasi skema ELISA yang dimodifikasi secara kimia (a ). Permukaan ELISA dimodifikasi secara kimia menggunakan APTES dan GLU setelah perlakuan kalium hidroksida. Antigen diimobilisasi pada permukaan yang dimodifikasi GLU. b Antigen amobil dideteksi oleh antibodi pasangannya
Untuk mengumpulkan bukti tentang strategi deteksi ini, kami ingin menggunakan protein penting dari human immunodeficiency virus (HIV) yang disebut p24. Antigen HIV-p24 adalah salah satu protein yang dapat diekspresikan selama tahap awal infeksi HIV, dan berlipat ganda di sistem pejamu seperti yang terungkap dalam sistem virus lain (Gbr. 2). HIV utuh memiliki glikoprotein pada amplop yang menutupi kapsid, dan antigen HIV-p24 berada di wilayah kapsid (Gbr. 3a). Sebelum mendeteksi antigen HIV-p24, kami awalnya mengoptimalkan konsentrasi penghubung kimia untuk menangkap antigen HIV-p24 pada permukaan ELISA. Kami menjelajahi berbagai konsentrasi dan kombinasi APTES dan GLU pada permukaan ELISA dan mengevaluasi hasilnya menggunakan konsentrasi konstan antigen HIV-p24 250 nM. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b dan c, aplikasi APTES dan GLU pada 1% menunjukkan tingkat pengikatan antigen HIV-p24 yang jenuh. Jika APTES hadir kurang dari 1%, absorbansi pengikatan (OD) lebih rendah, pada tingkat waktu yang sama dengan APTES 2%, karena peningkatan nonspesifisitas (mengacu pada eksperimen kontrol). Untuk GLU, tingkat 2% menunjukkan deteksi yang baik dari antigen HIV-p24 pada absorbansi 0,25, dan secara bersamaan, eksperimen kontrol (tanpa HIV-p24) menampilkan absorbansi tertinggi (0,16). APTES dan GLU 1% optimum menunjukkan absorbansi terendah pada percobaan kontrol (0,08) dan absorbansi tertinggi (0,22) selama deteksi spesifik antigen HIV-p24. Hasil ini terjadi karena, dengan peningkatan APTES dan GLU, dimungkinkan untuk menangkap antibodi pada permukaan amina bebas yang tersisa (berasal dari APTES) dan permukaan aldehida (berasal dari GLU). Hasil ini sama bahkan ketika daerah permukaan bebas diblokir dengan BSA dalam kasus di atas. Untuk menyempurnakan metode lebih lanjut, kami juga berupaya meningkatkan konsentrasi BSA untuk meminimalkan sinyal latar belakang. Namun, bahkan pada konsentrasi APTES dan GLU yang lebih tinggi, terjadi biofouling. Berdasarkan hasil ini, kondisi yang dioptimalkan adalah 1% APTES dan GLU, seperti yang digunakan dalam eksperimen.
HIV dan interaksi sel inang. Strategi umum penggandaan HIV ditampilkan
a Struktur HIV yang utuh. Antigen p24 diindikasikan. b Optimalisasi APTES dan GLU. APTES (0,5, 1, dan 2%) dan GLU (1 dan 2%) digunakan dengan kombinasi yang berbeda untuk mendeteksi konsentrasi konstan (250 nM) antigen HIV-p24
Setelah optimasi APTES dan GLU, kami juga menyesuaikan waktu inkubasi untuk menghubungkan GLU ke permukaan yang dimodifikasi APTES. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, menginkubasi GLU semalaman menghasilkan absorbansi tertinggi dibandingkan dengan waktu inkubasi yang lebih pendek (3 h). Hasil ini terjadi karena waktu inkubasi yang tidak cukup bagi GLU untuk terhubung ke permukaan yang dimodifikasi APTES; akhirnya, antibodi mampu mengikat permukaan APTES yang tersisa. Dengan bertambahnya waktu inkubasi GLU, senyawa ini berpeluang menutupi permukaan APTES secara sempurna. Saturasi ini meningkatkan imobilisasi protein pada permukaan GLU dan meningkatkan sensitivitas pengujian. Pada konsentrasi 250-nM HIV-p24, penyerapannya hampir dua kali lipat lebih tinggi dengan inkubasi GLU semalaman (Gbr. 4a).
Optimalisasi masa inkubasi GLU. a Dioptimalkan untuk memiliki masa inkubasi 3 h dan inkubasi semalam menggunakan 1% GLU pada permukaan yang dimodifikasi APTES 1%. b Deteksi 125 nM p24 dengan tiga pendekatan berbeda, konvensional, APTES-GLU-p24 (metode 1), dan p24 premiks APTES-GLU (metode 2)
Karena sinyal asli yang lebih tinggi setelah inkubasi GLU semalam dengan peningkatan absorbansi dan deteksi spesifik p24, kami menggunakan kondisi serupa untuk eksperimen lebih lanjut. Dalam hal ini, kami melumpuhkan GLU pada permukaan yang dimodifikasi APTES dan kemudian menempelkan protein (metode 1). Kami juga mencoba pendekatan lain; pertama, kami mencampur 1% GLU dengan antigen HIV-p24 125 nM dan kemudian menambahkan campuran ini ke permukaan PS yang dimodifikasi amina (metode 2). Anehnya, ada peningkatan absorbansi dengan konsentrasi antigen HIV-p24 yang sama (dari OD 0,161 menjadi 0,23) seperti konsentrasi yang digunakan dalam metode 2. Ketika kami mengizinkan protein untuk mengikat GLU sebagai premiks, hampir semua protein mampu mengikat GLU, dan kemudian campuran ini dengan mudah teradsorpsi ke permukaan yang dimodifikasi amina. Namun, ketika protein diizinkan untuk mengikat permukaan GLU pra-imobilisasi, sebagian besar gugus aldehida dari GLU tidak tersedia. Gambar 4b menunjukkan bahwa metode pencampuran menunjukkan deteksi konsentrasi antigen HIV-p24 yang serupa (125 nM) dengan absorbansi yang lebih tinggi. Selain itu, metode 1 dan 2 menunjukkan absorbansi yang lebih tinggi dibandingkan dengan metode konvensional di bawah konsentrasi antigen HIV-p24 yang sama.
Setelah optimasi lengkap langkah-langkah deteksi, untuk menemukan batas deteksi, kami melakukan titrasi antigen HIV-p24 dari rentang picomolar hingga nanomolar (500 pM hingga 500 nM). Kami membandingkan tiga metode yang berbeda, yaitu, APTES-GLU-p24 konvensional (metode 1:p24 diimobilisasi pada APTES diikuti dengan modifikasi GLU), dan HIV-p24 dengan premiks APTES-GLU (metode 2:premix p24 dan diikuti GLU dengan imobilisasi pada APTES) dengan konsentrasi p24 yang sama. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, batas deteksi untuk p24 ditemukan adalah 30 nM untuk ELISA konvensional. Dalam metode 1, batas deteksi ditingkatkan delapan kali (4 nM) dibandingkan dengan ELISA konvensional. Hasil ini terjadi karena ketika kami menggunakan permukaan PS yang dimodifikasi secara kimia, imobilisasi protein stabil di bawah pengaturan yang seragam dan tingkat imobilisasi juga cukup tinggi dibandingkan dengan adsorpsi protein konvensional pada permukaan ELISA. Vasist dkk. [12] sudah menunjukkan bahwa imobilisasi yang lebih tinggi dari antibodi pada permukaan ELISA yang dimodifikasi APTES dikaitkan dengan tingkat deteksi yang meningkat secara dramatis dibandingkan dengan ELISA konvensional [12]. Dalam pekerjaan mereka, amina dalam APTES dapat mengikat gugus karboksil pada antibodi, dan dengan cara itu, mereka melumpuhkan antibodi secara kimiawi pada permukaan ELISA. Dengan menggunakan metode ini, kami hanya dapat melumpuhkan antibodi pada permukaan ELISA melalui gugus karboksilnya, tetapi imobilisasi antigen berbasis protein tidak dimungkinkan pada APTES. Untuk tujuan itu, kami memperkenalkan tautan GLU untuk melumpuhkan protein pada permukaan ELISA PS. Dengan penghubung kimia ini, tidak hanya protein tetapi juga antibodi secara kimiawi dihubungkan melalui kopling amina ke aldehida pada glutaraldehida. Lampiran nonspesifik biomolekul pada substrat ELISA dipantau menggunakan eksperimen kontrol. Eksperimen kontrol dilakukan tanpa molekul target (HIV-p24). Tanpa target, antibodi spesifik untuk p24 tidak dapat mengikat pada permukaan, dan dengan demikian, antibodi sekunder terkonjugasi enzim juga tidak bergerak pada permukaan ELISA. Dalam hal ini, ketika kami menambahkan substrat (TMB), kami tidak dapat menemukan perubahan dalam absorbansi.
Batas deteksi antigen HIV-p24. P24 dititrasi dari 0,5 hingga 500 nM. Tiga pendekatan berbeda diikuti, konvensional dan metode 1 dan 2
Untuk meningkatkan batas deteksi, kami mencoba mencampurkan GLU dan antigen HIV-p24 sebelum langkah imobilisasi pada permukaan yang dimodifikasi APTES. Diharapkan bahwa campuran antigen GLU dan HIV-p24 akan meningkat dengan imobilisasi protein yang lebih besar pada permukaan ELISA. Ketika kita mencampur GLU dengan antigen HIV-p24, rasio pengikatan aldehida terhadap GLU tinggi. Ketika kita menambahkan campuran ini ke permukaan ELISA, itu meningkatkan tingkat imobilisasi. Dixit dkk. menemukan bahwa ketika mereka mencampur antibodi dan APTES sebelum imobilisasi pada pelat ELISA, pendekatan mereka meningkatkan imobilisasi antibodi pada permukaan ELISA dan batas deteksi meningkat [12]. Dalam penelitian kami, seperti yang diharapkan, ketika kami mencampur antigen GLU dan HIV-p24 sebelum imobilisasi, batas deteksi ditingkatkan menjadi 1 nM dan 30 kali lipat lebih tinggi daripada ELISA konvensional, yang menunjukkan batas deteksi 30 nM. Strategi kami tidak hanya meningkatkan batas deteksi, tetapi juga meningkatkan absorbansi untuk semua konsentrasi antigen HIV-p24. Pada 250 nM p24, kami mengamati bahwa absorbansinya adalah 0,35, yang hampir dua kali lipat dari ELISA konvensional dengan konsentrasi antigen HIV-p24 yang sama. Dengan semua konsentrasi antigen HIV-p24, perbedaan besar dalam absorbansi dicatat dibandingkan dengan ELISA konvensional (Gbr. 5), sebagai bukti dalam deteksi antigen HIV-p24 yang dapat dipercaya.
Untuk mengevaluasi spesifisitas pengujian, kami melakukan pengujian dengan dua eksperimen kontrol yang berbeda. Kami memilih serum manusia dan HIV-TAT dan dicampur dengan GLU sebagai pengganti antigen HIV-p24 sebelum digunakan, dan kami mengevaluasi spesifisitasnya. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, dalam kasus serum manusia dan HIV-TAT, tidak ada absorbansi yang signifikan; namun, antigen HIV-p24 250 nM menunjukkan peningkatan absorbansi yang jelas. Hasil ini mengkonfirmasi deteksi spesifik antigen HIV-p24 pada permukaan ELISA yang dimodifikasi secara kimia dengan sensitivitas yang lebih tinggi.
Deteksi spesifik antigen HIV-p24. Alih-alih HIV-p24, serum manusia dan protein HIV-TAT digunakan untuk memeriksa spesifisitas
Kesimpulan
Imobilisasi yang lebih tinggi dan tepat dari protein atau antibodi pada permukaan ELISA secara dramatis meningkatkan batas deteksi. Di sini, kami telah memperkenalkan metode fungsionalisasi kimia yang menarik untuk melumpuhkan jumlah protein atau antibodi yang terikat pada permukaan ELISA PS, yang dibantu oleh APTES dan GLU. Untuk mendemonstrasikan deteksi, kami menggunakan antigen p24 dari HIV. Batas deteksi ditingkatkan 30 kali lipat dibandingkan dengan ELISA konvensional. Perkembangan lebih lanjut dari penyelidikan ini dapat mengarah pada perbaikan berbasis kimia serupa pada permukaan penginderaan lain dan akan berguna untuk mendeteksi antigen yang berbeda pada kelimpahan yang lebih rendah, yang akan mewakili kemajuan dalam diagnosis medis.
