Biosensor Elektrokemial Berbasis Nanoflake Disulfida Timah untuk Deteksi Cepat dan Sensitif Kortisol Saliva

Abstrak

Kortisol, hormon stres inti, dikonsumsi oleh sumbu hipotalamus-hipofisis-adrenal (HPA) dan berfungsi sebagai bio penanda kritis untuk stres psikologis dan fisiologis. Ekspresi berlebihan kortisol yang berkelanjutan dapat menyebabkan gangguan serius seperti penyakit Cushing dan Addison, yang menyoroti kebutuhan akan deteksi POC (titik perawatan) yang cepat. Di sini, kami melaporkan uji elektrokimia non-invasif untuk kortisol saliva berdasarkan lapisan multilayer dari nanoflake disulfida timah (SnS2), spesifik kortisol antibody (C-M_ab), dan albumin serum sapi (BSA) yang diimmobilkan pada elektroda karbon kaca (GCE). Sensor BSA/C-M_ab/SnS2/GCE dikarakterisasi dengan spektroskopi impedansi elektrokimia (EIS) dan voltametri siklik (CV). Voltametri impuls diferensial (DPV) merespons linier terhadap konsentrasi kortisol yang berkisar dari 100 pM hingga 100 µM, dengan batas deteksi (LOD) 100 pM dan sensitivitas 0,0103 mA M⁻¹ cm⁻² (R² = 0,9979). Sampel saliva yang diukur dengan sensor cocok dengan hasil ELISA dalam selang 5 %, menunjukkan relevansi klinis dan spesifisitasnya. Perangkat ini menawarkan alternatif cepat dan hemat biaya dibandingkan imunoassay konvensional untuk pemantauan bio penanda terkait stres.

Pendahuluan

Kortisol adalah hormon steroid yang dirilis oleh sumbu HPA dan adalah bio penanda yang paling banyak digunakan untuk menilai stres psikologis. Ritme sirkadiannya mencapai puncak di pagi hari dan menurun pada malam hari, dan dysregulasi dapat memicu kondisi yang berkisar dari sindrom Cushing hingga penyakit Addison. Oleh karena itu, pemantauan kortisol yang akurat dan real-time sangat penting untuk diagnosis dan pengelolaan berbagai gangguan terkait stres, termasuk PTSD, depresi, dan gangguan spektrum autis.

Metode laboratorium saat ini—kromatografi, radioimunoassay, ELISA, SPR, dan QCM—terbatas pada laboratorium, memakan waktu, dan mahal, yang membatasi penggunaannya di lingkungan POC. Imuno sensor elektrokimia, yang bergantung pada interaksi spesifik antigen–antibody, menawarkan solusi yang menjanjikan dengan instrumentasi sederhana, bacaan cepat, biaya rendah, dan sensitivitas tinggi. Pengukuran kortisol saliva sangat menarik karena non-invasif dan memerlukan penanganan sampel minimal.

Sementara banyak nanomaterial sulfida logam telah dieksplorasi untuk biosensing, disulfida timah (SnS2) jarang digunakan sebagai matriks immobilisasi protein. SnS2 adalah semikonductor n-type dengan bandgap 2,18–2,44 eV, mobilitas pembawa yang tinggi, dan stabilitas kimia yang sangat baik, menjadikannya platform yang ideal untuk transduksi elektrokimia. Dalam penelitian ini, kami memanfaatkan nanoflake SnS2 2-D untuk membangun sensor kortisol yang sangat sensitif yang beroperasi di seluruh rentang konsentrasi fisiologis.

Bahan dan Metode

Bahan

Hidrokortison, anti-kortisol antibody kelinci (C-M_ab), kalium heksasianoferrat (II/III), beta-estradiol, testosteron, progesteron, kortikosteron, dan albumin serum sapi (BSA) diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Klorida timah(IV) pentahidrat dan tioasetamide disuplai oleh Showa (Jepang) dan Alfa Aesar (UK), masing-masing. Larutan garam fosfat (PBS) dan alumina mikro-polis diperoleh dari Sigma-Aldrich dan Buehler (UK). Semua reagens digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Kit ELISA kortisol komersial (Cat # SA E-6000) dibeli dari LDN (Jerman).

Sintesis Disulfida Timah

SnCl4·5H2O dan C2H5NS dilarutkan dalam 70 mL air deion dan disesuaikan pH 7,4. Larutan dipindahkan ke autoklave hidrotermal dan dipanaskan hingga 200 °C dalam 1 jam, kemudian dipelihara selama 11 jam. Bubuk SnS2 yang dihasilkan dicuci dengan air dan etanol pada 6000 rpm selama 15 min dan dikeringkan pada 80 °C di udara, menghasilkan nanoflake seragam.

Karakterisasi Bahan

Diffraksi sinar-X (XRD) memastikan fase SnS2 heksagonal (JCPDS 89-2358). Mikroskop skanning emisi medan (FE-SEM) mengungkap morfologi flake-seperti dengan dimensi lateral ~300 nm. Mikroskop transmisi elektron (TEM) dan difraksi area terpilih (SAED) memastikan struktur tunggal kristal dengan spasi jaringan 0,167 nm dan 0,316 nm; nanoflake kurang dari 10 nm tebal.

Pembuatan Biosensor BSA/C-M_ab/SnS2/GCE

Elektroda karbon kaca (GCE) dipolir dengan slurry alumina dan dicetuskan dengan dispersi SnS2 5 M. Elektroda kemudian diinkubasi secara berurutan dengan larutan C-M_ab 1 mg mL⁻¹ dan BSA 1 % dalam PBS. Sensor yang selesai disimpan pada 4 °C saat tidak digunakan. Konsep dan pengaturan deteksi diilustrasikan pada Gambar 1.

Analisis Elektrokimia

Spektroskopi impedansi elektrokimia (EIS) dan voltametri siklik (CV) digunakan untuk menilai perilaku elektroaktif sensor. Semua pengukuran menggunakan sel tiga elektroda: BSA/C-M_ab/SnS2/GCE sebagai elektroda kerja, kawat Pt sebagai elektroda sebaliknya, dan elektroda kalomel terpenuhi sebagai referensi, dalam PBS 10 mM (pH 7,4) yang mengandung Fe(CN)6³⁻/⁴⁻ 5 mM. Skor CV dan voltametri impuls diferensial (DPV) dilakukan dari –0,4 V hingga 1,0 V pada 10 mV s⁻¹.

Pengumpulan Sampel Saliva dan Sensing Elektrokimia

Dua sukarelawan sehat memberikan 2 mL sampel saliva pada siang hari. Sampel dibeku pada –20 °C, dilelehkan, dikonsentrifugasi (3500 rpm, 15 min), dan sobrenatan digunakan untuk analisis. Pengukuran kortisol sensor dibandingkan dengan hasil kit ELISA.

Studi Interferensi

Potensi interferensi—beta-estradiol, testosteron, progesteron, kortikosteron (masing-masing 100 nM)—diuji dengan menginkubasi sensor selama 10 min dan mengukur respons CV. Pengaruh pada deteksi kortisol di bawah 5 %.

Deteksi Kortisol Saliva oleh ELISA

ELISA mengikuti protokol produsen. Kurva standar dibuat dengan enam konsentrasi kortisol (0, 0,1, 0,4, 1,7, 7,0, 30 ng mL⁻¹). Absorbansi dibaca pada 450 nm dan kurva yang dihasilkan digunakan untuk mengkuantifikasi sampel yang tidak diketahui.

Hasil dan Pembahasan

Analisis Material SnS2

Pola XRD (Gambar 2a) cocok dengan fase SnS2 heksagonal (JCPDS 89-2358). Citra FE-SEM (Gambar 2b,c) menunjukkan partikel flake-seperti seragam 300 nm. TEM (Gambar 2d–f) memastikan flake tunggal kristal dengan spasi lapisan 0,167 nm dan 0,316 nm, dan tebal total di bawah 10 nm.

Respons Elektrokimia Elektroda

Penambahan SnS2 pada GCE secara signifikan meningkatkan arus oksidasi (Gambar 3a,b). Modifikasi antibody dan BSA selanjutnya meningkatkan resistensi transfer muatan, seperti yang tercermin dalam data EIS (Gambar 3b). CV dari BSA/C-M_ab/SnS2/GCE pada laju sken 10–100 mV s⁻¹ menunjukkan peningkatan linier arus puncak (Gambar 3c,d), mengonfirmasi proses redoks reversibel yang dikontrol permukaan.

Kedua CV dan DPV menunjukkan penurunan monoton arus puncak dengan kenaikan konsentrasi kortisol. DPV menghasilkan hubungan linier: y = –0,0103 x + 0,0443 (R² = 0,9979), dengan LOD 100 pM dan sensitivitas 0,0103 mA M⁻¹ cm⁻². Rentang dinamis sensor (100 pM–100 µM) mencakup seluruh spektrum fisiologis kortisol saliva.

Studi Stabilitas Penyimpanan

CV dilakukan pada sensor yang disimpan selama 1 hari hingga 1 minggu dalam dua kondisi: kering vakum dan 4 °C. Penyimpanan 4 °C mempertahankan 91 % arus puncak redoks setelah 7 hari, dibandingkan 82 % di bawah vakum, menunjukkan stabilitas aktivitas antibody yang lebih baik pada suhu lebih rendah.

Studi Interferensi

Inkubasi dengan 100 nM beta-estradiol, testosteron, progesteron, dan kortikosteron menghasilkan <5 % perubahan pada sinyal kortisol (Gambar 5a), mengonfirmasi spesifitas analisis yang tinggi.

Deteksi Kortisol Saliva Menggunakan Metode ELISA dan Elektrokimia

Sampel saliva dari dua sukarelawan menghasilkan konsentrasi kortisol 1,105 × 10⁻⁸ M dan 3,998 × 10⁻⁹ M oleh ELISA, dan 1,046 × 10⁻⁸ M dan 3,911 × 10⁻⁹ M oleh sensor elektrokimia—hanya selang 2–5 %—mengonfirmasi akurasi sensor.

Perbandingan dengan Studi Lainnya

Tabel 2 dan 3 (tidak ditampilkan) membandingkan sensor kami dengan sensor kortisol non-perak. Keuntungan karya ini meliputi: (1) biaya bahan yang jauh lebih rendah; (2) protokol pembuatan yang cepat dan sederhana; dan (3) LOD yang sebanding atau lebih baik dari perangkat yang ada.

Kesimpulan

Kami telah menunjukkan sensor biosensor elektrokimia berbasis nanoflake disulfida timah yang memberikan LOD 100 pM dan rentang deteksi 100 pM–100 µM untuk kortisol saliva, cocok dengan akurasi ELISA. Sensor menunjukkan interferensi <5 % dari steroid yang struktural serupa dan mempertahankan >90 % aktivitas setelah 7 hari pada 4 °C. Biaya rendahnya, pemasangan sederhana, dan bacaan cepat menjadikannya calon yang menarik untuk pemantauan stres POC.