Biosensor DNA Elektrokemial Ultra-Sensitif Menggunakan Nanokomposit Akrilik-Emas untuk Penentuan Jenis Kelamin Ikan Arowana Cepat

Abstrak

Studi ini memperkenalkan biosensor DNA elektrokimia ultra-sensitif yang mengidentifikasi jenis kelamin ikan arowana Asia (Scleropages formosus) dengan batas deteksi atto-M. Sensor menggunakan mikrosfer akrilik yang difungsikan dengan grup succinimide dan nanopartikel emas koloid (AcMP-AuNP) yang diimmobilkan pada elektroda layar cetak karbon. Sond DNA yang diaminasi dikaitkan kovalen ke AcMPs, dan hibridisasi DNA target arowana diukur menggunakan voltametri pulsa diferensial (DPV) dengan asam antrakuinon-sulfat sebagai label redoks. Dalam kondisi yang dioptimalkan, sensor mencapai batas deteksi 1,0 × 10⁻¹⁸ M dan rentang linier 1,0 × 10⁻¹⁸ – 1,0 × 10⁻⁸ M (R² = 0,99) dalam satu jam, menjadikannya alat ringan dan hemat biaya untuk diagnostik budidaya ikan di lokasi.

Latar Belakang

Ikan arowana Asia (Scleropages formosus) adalah species air tawar yang dihargai karena nilainya sebagai hiasan dan signifikansi kultural di seluruh Asia Tenggara dan bagian Oseania. Akibat permintaan pasar yang tinggi, populasi liar telah dieksploitasi secara berlebihan, menyebabkan klasifikasinya sebagai terancam punah oleh CITES dan IUCN Red List. Penentuan jenis kelamin yang akurat pada tahap juvenil sangat penting untuk program pemuliaan dan regulasi pasar, namun metode visual tradisional tidak andal dan memakan waktu, sedangkan pendekatan konvensional PCR memakan tenaga dan memerlukan infrastruktur laboratorium yang canggih.

Kemajuan terbaru dalam biosensor berbasis nanomaterial menawarkan alternatif yang menjanjikan. Dengan mengintegrasikan mikrosfer polimer akrilik dengan nanopartikel emas, kita dapat membuat platform konduktif dengan luas permukaan tinggi yang meningkatkan pemuatan sond dan transfer elektron, sehingga meningkatkan sensitivitas dan mengurangi waktu ensayos.

Metode

Alat dan Elektroda

Pengukuran DPV dilakukan pada potensiostat Autolab PGSTAT 12 menggunakan elektroda layar cetak karbon (SPE) yang dimodifikasi dengan AcMPs dan AuNPs. Elektroda bantuan platinum dan elektroda referensi Ag/AgCl (3,0 M KCl) digunakan. Larutan di sonikasi dalam mandi Elma S30H untuk memastikan homogenitas.

Bahan Kimia

Reagen utama meliputi 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPP), 1,6-Hexanediol diacrylate (HDDA), n-butyl acrylate (nBA), Au(III) chloride trihydrate, dan NAS. Nanopartikel emas koloid disintesis menurut Grabar et al. (1995). Sond DNA disiapkan dalam larutan buffer K-fosfat 0,05 M (pH 7,0) dan dihibridkan dalam larutan buffer Na-fosfat 0,05 M (pH 7,0) yang mengandung 1,0 mM AQMS dan 2,0 M NaCl.

Sintesis Mikrosfer Akrilik

AcMPs dihasilkan melalui fotopolimerisasi satu langkah yang diinisiasi UV dari campuran yang mengandung HDDA, nBA, DMPP, dan NAS dalam emulsi air. Setelah 10 menit sonikasi dan 600 s pengeringan UV di bawah N₂, mikrosfer dikumpulkan melalui sentrifugasi, dicuci tiga kali dengan buffer K-fosfat, dan dikeringkan di udara.

Pembuatan Biosensor DNA Menggunakan Mikrosfer Akrilik

Permukaan SPE pertama kali dilapisi dengan dispersi AcMP 3 mg/mL, kemudian dengan 5 mg/mL nanopartikel emas koloid. Elektroda yang dimodifikasi diinkubasi dalam larutan sond DNA arowana yang diaminasi 5 µM selama 6 jam, diikuti dengan pencucian yang menyeluruh. Hibridisasi dengan cDNA target (5 µM) dalam kehadiran 1 mM AQMS dan 2 M NaCl berlangsung selama 1 jam sebelum analisis DPV dalam buffer K-fosfat 0,05 M pada suhu kamar.

Prosedur pembuatan biosensor DNA arowana elektrokimia berdasarkan elektroda yang dimodifikasi AcMP-AuNP.

Optimisasi Biosensor DNA Arowana Elektrokemial

Pemilihan sond dioptimalkan dengan mengubah waktu inkubasi (1–18 jam) dan waktu hibridisasi (10–100 menit). Suhu, pH, kekuatan ionik, dan valensi kation secara sistematis diperiksa untuk memaksimalkan respons DPV. Kondisi optimal adalah: inkubasi sond 6 jam, hibridisasi 30 menit pada 25 °C, pH 7,0, buffer Na-fosfat 0,05 M, 2 M NaCl, dan 1 mM AQMS.

Ekstraksi DNA dan Analisis DNA Arowana

Lima belas sampel jaringan arowana diekstraksi menggunakan kit QIAquick PCR Purification. DNA genomid amplifikasi melalui PCR dan diverifikasi pada gel agarosa 1,5%. Ekstrak yang sama diuji dengan biosensor; arus DPV di atas baseline menunjukkan DNA jantan, sementara arus di baseline sesuai dengan DNA betina. Signifikansi statistik dievaluasi menggunakan uji t (kepercayaan 95%).

Hasil dan Pembahasan

Citra SEM mengonfirmasi AcMPs yang seragam dan berbentuk bola (Fig. 2) dengan distribusi ukuran yang sempit (Fig. 3). Karakterisasi elektrokimia SPE yang dimodifikasi menunjukkan proses redoks reversibel yang dikontrol difusi dengan hubungan linier antara arus puncak dan akar laju pemindaian (R² = 0,996; Fig. 4). Respons DPV (Fig. 6) menunjukkan peningkatan arus yang jelas hanya setelah hibridisasi dengan DNA komplementer, mengonfirmasi spesifisitas sond.

Citra SEM mikrosfer polimer akrilik.

Distribusi ukuran mikrosfer akrilik yang disiapkan dari fotopolimerisasi.

Studi optimisasi mengungkapkan bahwa pemilihan sond mencapai plat setelah 6 jam, sementara hibridisasi mencapai kesetimbangan dalam 30 menit pada suhu kamar (Fig. 7). Suhu di atas 25 °C mempercepat hibridisasi tetapi berisiko denaturasi, jadi 25 °C dipilih sebagai optimal. Ketergantungan pH menunjukkan sinyal DPV maksimal pada pH netral 7,0; pH yang lebih rendah atau lebih tinggi mengurangi efisiensi hibridisasi (Fig. 9). Di antara kation yang diuji, Na⁺ memberikan peningkatan terbaik, kemungkinan karena presipitasi minimal dan pelindungan elektrostatis yang menguntungkan (Fig. 10). Analisis kekuatan ionik mengidentifikasi 2 M NaCl dan buffer Na-fosfat 0,05 M sebagai buffer hibridisasi optimal (Fig. 11).

Voltamogram siklus dari 1,0 mM K₃Fe(CN)₆ dalam buffer Na-fosfat 0,05 M (pH 7,0) pada berbagai laju pemindaian untuk SPE yang dimodifikasi yang mengandung materi AcMP-AuNP.

Plot arus puncak oksidasi terhadap akar laju pemindaian (a) dan terhadap log laju pemindaian (b).

Sinyal DPV elektroda DNA berbasis AcMP-AuNP sebelum dan setelah hibridisasi dengan DNA komplementer (a) dan non-komplementer (b); perbandingan dengan elektroda yang dimodifikasi hanya dengan AcMPs (f), hanya dengan AuNPs (e), dan komposit AcMP-AuNP (d).

Efek waktu pemilihan sond DNA (a) dan waktu hibridisasi (b) terhadap respons biosensor.

Efek suhu terhadap waktu hibridisasi.

Respons DPV versus pH (5,5–8,0).

Efek kation (Ca²⁺, Na⁺, K⁺, Fe³⁺) terhadap respons DPV.

Pengaruh konsentrasi buffer Na-fosfat (a) dan kekuatan ionik (b) terhadap respons biosensor.

Kurva kalibrasi yang menunjukkan respons linier dari 1,0 × 10⁻¹⁸ M hingga 1,0 × 10⁻⁸ M (R² = 0,99) dan spektrum DPV representatif.

Penentuan Jenis Kelamin Ikan Arowana dengan Biosensor DNA

Saat diterapkan pada sampel lapangan, penetapan jenis kelamin biosensor cocok dengan hasil PCR (Tabel 2), mengonfirmasi keandalannya untuk penggunaan cepat di lokasi.

Kesimpulan

Biosensor DNA elektrokimia yang dikembangkan menawarkan sensitivitas luar biasa, rentang dinamis yang luas, dan batas deteksi rendah untuk DNA arowana. Kemampuan deteksi cepat pada tingkat atto-M, digabungkan dengan format yang ringan dan dapat dibuang, menjadikannya ideal untuk diintegrasikan ke dalam perangkat point-of-use yang dapat mendukung operasi budidaya ikan dengan memungkinkan identifikasi jenis kelamin dan warna yang dini.