Biosensor DNA Elektrokimia yang Sangat Sensitif dari Nano-komposit Akrilik-Emas untuk Penentuan Jenis Kelamin Ikan Arwana
Abstrak
Penelitian ini menjelaskan metode sederhana untuk identifikasi jenis kelamin ikan arwana (Scleropages formosus ). Biosensor DNA mampu mendeteksi urutan DNA spesifik pada tingkat yang sangat rendah hingga ke rejim M. Biosensor DNA elektrokimia berdasarkan komposit hybrid microsphere-gold nanoparticle (AcMP-AuNP) akrilik telah dibuat. Mikrosfer hidrofobik poli(n-butilakrilat-N-akriloksisuksinimida) disintesis dengan prosedur fotopolimerisasi satu langkah yang mudah dan mapan dan teradsorpsi secara fisik pada AuNPs pada permukaan elektroda tercetak layar karbon (SPE). Biosensor DNA dibangun hanya dengan mencangkokkan probe DNA aminasi pada AcMPs yang difungsikan suksinimida melalui ikatan kovalen yang kuat. Respon hibridisasi DNA ditentukan dengan teknik differential pulse voltammetry (DPV) menggunakan probe redoks asam antrakuinon monosulfonat sebagai label oligonukleotida elektroaktif (Tabel 1). Batas deteksi rendah pada 1,0 × 10
−18
M dengan rentang kalibrasi linier lebar 1,0 × 10
−18
hingga 1,0 × 10
−8
M (R
2
= 0.99) dapat dicapai dengan biosensor DNA yang diusulkan dalam kondisi optimal. Deteksi elektrokimia DNA arwana dapat diselesaikan dalam waktu 1 jam. Karena ukurannya yang kecil dan bobotnya yang ringan, biosensor DNA yang dikembangkan sangat menjanjikan untuk pengembangan kit fungsional untuk penggunaan budidaya ikan.
Latar Belakang
Arwana Asia (Scleropages formoss ), ikan air tawar, [1] tersebar luas di pedesaan wilayah Asia Tenggara seperti Malaysia, Singapura, Thailand, Indonesia, Kamboja, Vietnam, Laos, Myanmar dan Filipina. Selain itu, ikan arwana juga ditemukan di Australia dan New Guinea [1,2,3,4]. Ini dikenal sebagai dragonfish, Asia bonytongue, kelisa, atau baju-rantai [5, 6]. Ini masih bertahan sebagai spesies ikan primitif dari era Jurassic [7, 8]. Orang Cina dan Asia menganggapnya sebagai simbol keberuntungan dan kebahagiaan, bersama dengan banyak budaya lain [6]. Umumnya arwana memiliki berat sekitar 7 kg dan panjang 1 m pada usia dewasa. Ikan hias ini memiliki warna dan morfologi yang menarik dan dapat dikenali dari ciri fisiknya yang khas, seperti ukuran tubuh yang relatif panjang, sirip dada yang besar, serta sirip punggung dan sirip dubur yang terletak jauh di belakang tubuh. Ada tiga varietas warna utama, yaitu emas, merah, dan hijau dari ikan air tawar yang berkerabat dekat dalam spesies arwana Asia. Ada juga beberapa spesies berbeda lainnya yang berasal dari berbagai bagian Asia Tenggara dan merupakan kawasan regional dari banyak sistem sungai [8].
Karena popularitasnya yang tinggi dan permintaan yang besar dalam tujuan hias, arwana Asia telah diburu dengan sengit untuk mendapatkan keuntungan [6], dan mengakibatkan penurunan populasinya dengan cepat. Mengingat tingginya permintaan dalam industri hias, eksploitasi berlebihan populasi alam, dan kelangkaan habitat alami karena perubahan lingkungan hidup, arwana Asia telah diklasifikasikan sebagai spesies yang terancam punah sejak tahun 1980 oleh Konvensi Perdagangan Internasional. di Endangered Species of Wild Fauna and Flora (CITES) dan baru-baru ini terdaftar sebagai terancam punah oleh Daftar Merah IUCN 2006 [1, 3, 8, 10, 11]. Namun, perdagangan komersial spesies yang terancam punah ini dilarang berdasarkan CITES kecuali di negara-negara tertentu, misalnya Indonesia, Singapura, dan Malaysia. [2, 3, 12]. Ada sejumlah pembudidaya terdaftar CITES di Asia yang aktif melakukan budidaya dan perdagangan ikan arwana [2, 12]. Ikan air tawar Asia ini terdiri dari strain yang terisolasi secara geografis, dan merupakan satu-satunya anggota spesies dengan varietas warna berbeda yang didasarkan pada distribusi geografis yang berbeda di seluruh sungai di Asia Tenggara. Penyebaran spesies ini kini jauh lebih luas, yang meluas ke Sungai Nil Afrika, Sungai Amazon Amerika Selatan, Australia, dan New Guinea [1, 4, 8].
Di antara berbagai warna arwana Asiatic, ikan arwana merah dan emas adalah hewan peliharaan hias paling mahal dan populer di industri pembenihan dibandingkan dengan varietas warna hitam, hijau, perak, dan lainnya [1, 5, 10, 13]. Fenomena pencurian telur arwana asiatik ini tidak biasa dibandingkan dengan jenis ikan lainnya. Pada umumnya ikan arwana menjadi dewasa pada umur 3-4 tahun, dan mereka hanya bertelur sedikit (30-100) [14, 15] berukuran ekstra besar (berdiameter sekitar 1 cm) [16]. Menariknya, telur dan larva yang telah dibuahi tersebut kemudian dilindungi dan dibesarkan di dalam mulut ikan arwana jantan, dan menunjukkan parental care yang tinggi. Untuk mengidentifikasi jenis kelamin berdasarkan pengamatan visual bayi arwana sulit karena tidak ada organ fenotipik yang khas dari dimorfisme seksual [14, 15]. Hanya satu dari orang tua (diduga laki-laki) dapat diidentifikasi sebagai keturunan yang diambil dari mulutnya. Orang tua lainnya tidak dapat diidentifikasi dari beberapa calon orang tua [16].
Biasanya para penghobi memelihara bayi ikan arwana untuk keperluan hias di akuarium maupun untuk budidaya di peternakan ikan. Namun, semua jenis ikan arwana juvenil dijual dengan harga yang sama, karena kurangnya teknologi bantu pembeda jenis kelamin dan varietas warna. Sampai saat ini, belum ada metode yang diterbitkan untuk mengidentifikasi jenis kelamin dan warna ikan arwana pada tahap remaja. Sebagai gantinya, ratusan penelitian telah dilakukan dengan menggunakan analisis DNA berdasarkan struktur genetik dan biografi ikan arwana dalam upaya mengidentifikasi jenis kelamin dan warna pada usia dini. Metode tradisional berdasarkan estimasi ukuran tubuh dan rongga mulut hanya dapat dilakukan pada bayi arwana berusia sekitar 3 bulan untuk identifikasi jenis kelamin dan warna [17]. Namun, metode pemeriksaan visual konvensional ini memakan waktu lama dan seringkali memberikan hasil yang tidak akurat. Di sisi lain, metode standar yang banyak digunakan berdasarkan sekuensing DNA, yaitu, reaksi berantai polimerase (PCR) dan elektroforesis gel membutuhkan tenaga, waktu, dan sumber daya. Algoritme alternatif metode pemecahan masalah inventif (ARIZ) sebelumnya digunakan untuk mendeteksi deteksi jenis kelamin arwana [18]. ARIZ adalah alat alternatif untuk deteksi gender, berisi sembilan bagian berbeda dan total 40 langkah kompleks. Ini membutuhkan waktu yang sangat lama untuk belajar dan berlatih dan menuntut personel yang sangat berpengalaman untuk beroperasi. Misalnya, penerapan ARIZ di berbagai sistem rekayasa telah diterapkan, tetapi sebagian besar kasus tidak mencakup semua persyaratan dan proses ARIZ.
Dalam penelitian ini, mikrosfer polimer akrilik yang dimodifikasi dengan gugus fungsi suksinimida melalui gugus N-akriloksisuksinimida (NAS) digunakan sebagai matriks untuk imobilisasi probe DNA. Seperti yang dilaporkan sebelumnya oleh Chen dan Chiu 2000 dan Chaix et al. 2003 [19, 20], gugus fungsi suksinimida dapat bereaksi dengan gugus fungsi amina membentuk ikatan kovalen. Penggabungan fungsionalitas NAS ke dalam mikrosfer akrilik untuk aplikasi mikrobiosensor DNA memberikan keuntungan dari metode preparasi sederhana di mana bola dapat disintesis dan difungsikan melalui prosedur satu langkah menggunakan fotopolimerisasi dalam durasi singkat (beberapa menit). Selain itu, mikrosfer memiliki keuntungan dari ukuran kecil dan menyediakan area permukaan yang besar untuk imobilisasi probe DNA, sehingga mengurangi penghalang difusi untuk reaktan dan produk. Hal ini memungkinkan peningkatan kinerja biosensor dalam hal waktu respons yang lebih pendek dan rentang respons linier yang lebih luas, yang akan ditunjukkan dalam pekerjaan yang dilaporkan di sini.
Dalam penelitian ini diusulkan metode biosensor DNA elektrokimia yang sangat sensitif, sederhana, mudah dibuat, dan murah untuk penentuan jenis kelamin ikan arwana juvenil dengan akurasi tinggi. Biosensor DNA dibangun dari elektroda tercetak layar karbon (SPE) yang dimodifikasi dengan nanopartikel emas koloid (AuNPs) dan mikrosfer poliakrilat yang difungsikan dengan gugus fungsi NAS. AuNPs diimobilisasi ke permukaan karbon SPE melalui interaksi elektrostatistik dan memainkan peran penting dalam meningkatkan konduktivitas elektroda dan memfasilitasi transfer elektron, sedangkan mikrosfer akrilik (AcMPs) langsung disimpan ke SPE yang dimodifikasi AuNP melalui adsorpsi fisik. Probe DNA arwana yang diaminasi kemudian dilekatkan secara kovalen pada komposit AcMP-AuNP yang diimobilisasi pada kelompok suksinimida yang terpapar dari AcMPs. Hibridisasi target probe terdeteksi dengan label redoks antrakuinon melalui voltametri pulsa diferensial (DPV). Penggabungan AcMP berukuran kecil dan seragam mampu menampung kapasitas pemuatan DNA yang besar dan meningkatkan sensitivitas dan batas deteksi biosensor DNA elektrokimia arwana.
Metode
Peralatan dan Elektroda
Semua pengukuran elektrokimia dilakukan dengan DPV menggunakan Autolab PGSTAT 12 potensiostat/galvanostat (Metrohm) pada potensial langkah 0,02 V dalam jendela potensial 1,0 V hingga 0,1 V. SPE dari Scrint Technology Co Malaysia dimodifikasi dengan AcMPs dan AuNPs digunakan sebagai elektroda kerja. Elektroda platina (Pt) berbentuk batang dan elektroda Ag/AgCl yang diisi dengan larutan internal KCl 3,0 M digunakan masing-masing sebagai elektroda bantu dan elektroda referensi. Mandi sonikator Elma S30H digunakan untuk menyiapkan larutan homogen.
Bahan kimia
2–2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPP) dibeli dari Fluka. 1,6-Heksanadiol diakrilat (HDDA), n-butil akrilat (nBA), dan Au (III) klorida trihidrat dipasok oleh Sigma-Aldrich. AuNPs koloid disintesis menurut metode yang dilaporkan oleh Grabar et al. (1995). Sodium dodesil sulfat (SDS) dan NaCl diperoleh dari Systerm. NAS dan garam natrium monohidrat asam antrakuinon-2-sulfonat (AQMS) diperoleh dari Acros. Air Milli-Q (18 mΩ) digunakan untuk menyiapkan semua larutan kimia dan biologi. Larutan stok probe DNA diencerkan dengan 0,05 M buffer K-fosfat (pH 7,0) sedangkan solusi DNA komplementer (cDNA) dan non-komplementer (ncDNA) disiapkan dengan 0,05 M buffer Na-fosfat pada pH 7,0 yang mengandung 1,0 mM AQMS. Buffer K-fosfat memfasilitasi imobilisasi probe DNA maksimum pada bahan akrilik yang difungsikan suksinimida, sedangkan buffer Na-fosfat menyediakan kondisi optimal untuk reaksi hibridisasi DNA [21, 22].
Sintesis Mikrosfer Akrilik
AcMPs disiapkan sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya dengan sedikit modifikasi [22]. Secara singkat, campuran 450 L HDDA, 0,01 g SDS, 0,1 g DMPP, 7 mL monomer nBA, dan 6 mg NAS dilarutkan ke dalam 15 mL air Milli-Q dan disonikasi pada suhu kamar (25 °C). ) selama 10 menit. Setelah itu, larutan emulsi difoto dengan sinar UV selama 600 detik di bawah aliran kontinu N2 gas. Mikrosfer poli(nBA-NAS) yang dihasilkan kemudian dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 4000 rpm selama 30 menit diikuti dengan pencucian dalam buffer K-fosfat (0,05 M, pH 7,0) selama tiga kali dan dibiarkan kering pada suhu kamar.
Fabrikasi Biosensor DNA Menggunakan Mikrosfer Akrilik
Sebelum modifikasi permukaan, karbon SPE dibilas secara menyeluruh dengan air DI, dilapisi dengan mikrosfer polimer akrilik pada 3 mg/mL, dan dibiarkan kering di udara pada kondisi sekitar, diikuti dengan pengecoran dengan 5 mg/mL AuNP koloid. Karakteristik elektrokimia karbon SPE sebelum dan sesudah modifikasi dengan AcMPs dan AuNPs diperiksa dengan metode CV. Gambar 1 menggambarkan metode, yang terdiri dari 3 langkah fabrikasi biosensor DNA elektrokimia dan deteksi cDNA arwana 1 langkah. Sekitar 10 L AuNP koloid (1 mg/300 L) pertama kali diendapkan ke karbon SPE dan dikeringkan di udara pada suhu 25 °C. Karena AcMPs (1 mg) siap disuspensikan dalam etanol (100 L) untuk membentuk dispersi yang stabil, 10 L suspensi AcMP di-drop-coated ke SPE yang dimodifikasi AuNP. Karbon SPE termodifikasi AcMP-AuNP kemudian dicelupkan ke dalam 300 L larutan probe DNA arwana 5 M selama 6 jam agar proses imobilisasi DNA berlangsung dan dicuci dengan hati-hati dengan buffer K-fosfat (0,05 M, pH 7,0) selama tiga kali untuk lepaskan probe penangkap yang tidak terikat. Probe DNA amobil kemudian direndam dalam 300 L larutan DNA target yang mengandung 2 M NaCl dan 1 mM AQMS untuk memungkinkan terjadinya hibridisasi DNA dan reaksi interkalasi dalam waktu satu jam, diikuti dengan pembilasan berurutan dengan air Milli-Q dan Na-fosfat. buffer (0,05 M, pH 7,0) untuk menghilangkan fragmen DNA non-hibridisasi dan pengikatan spesifik label elektrokimia AQMS. Semua pengukuran DPV dilakukan dalam 4,5 mL buffer K-fosfat 0,05 M pada pH 7,0 dan suhu kamar.
Prosedur pembuatan biosensor DNA arwana elektrokimia berdasarkan elektroda termodifikasi AcMP-AuNP
Optimasi Biosensor Elektrokimia DNA Arwana
Elektroda DNA yang dimodifikasi dengan masing-masing komposit AcMP, AuNP, dan AcMP-AuNP digunakan dalam pengujian cDNA (5 M) dan ncDNA (5 M) dengan metode elektroanalitik DPV dengan adanya 1 mM AQMS dan 2 M NaCl pada laju pemindaian 0,5 V/s versus elektroda referensi Ag/AgCl. Durasi imobilisasi probe DNA ditentukan dengan merendam secara terpisah sembilan unit SPE yang dimodifikasi AcMP-AuNP dalam 300 L larutan probe DNA arwana 5 M selama 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12, dan 18 jam, sebelum reaksi dengan 5 M cDNA dalam buffer hibridisasi DNA (0,05 M buffer Na-fosfat pada pH 7,0) yang mengandung 1 mM interkalator redoks antrakuinon dan 2 M NaCl. Waktu hibridisasi DNA diselidiki dengan merendam elektroda DNA dalam 300 L larutan cDNA 5 M dengan adanya 2 M NaCl dan 1 mM AQMS selama 10-100 menit. Pengaruh suhu terhadap lama hibridisasi DNA dilakukan dengan mengukur respon biosensor DNA arwana pada suhu 4, 25, 40, dan 50 °C selama 5–90 menit dalam buffer ukur menggunakan teknik DPV. Untuk studi efek pH, biosensor DNA arwana dicelupkan ke dalam 5 M larutan cDNA yang dibuat dari 0,05 M buffer Na-fosfat yang dikondisikan dengan 2 M NaCl dan 1 mM AQMS antara pH 5,5 dan pH 8,0 diikuti dengan pengukuran DPV. Pengaruh berbagai ion bermuatan positif (yaitu Ca
2+
, Na
+
, K
+
, dan Fe
3+
ion) pada elektrokimia DNA arwana dilakukan respon biosensor dengan menambahkan CaCl2 , NaCl, KCl, dan FeCl3 ke dalam 0,05 M buffer Na-fosfat (pH 7,0) sebelum reaksi hibridisasi DNA dan pengukuran DPV. Kekuatan ionik buffer hibridisasi dioptimalkan dengan memvariasikan buffer Na-fosfat dan konsentrasi NaCl masing-masing dari 0,002-0,1000 M hingga 1,52-5,50 M. Kurva kalibrasi linier biosensor DNA arwana kemudian ditetapkan melalui pengukuran kuantitatif dari serangkaian konsentrasi cDNA dari 1,0 × 10
−18
menjadi 2,0 × 10
−2
M melalui metode DPV. Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.
Ekstraksi DNA dan Analisis DNA Arwana
Sebanyak 15 sampel jaringan ikan arwana disediakan oleh Fisheries Research Institute (FRI), Departemen Perikanan Malaysia. Semua sampel jaringan ikan disimpan dalam etanol 70% dalam chiller pada suhu 4 °C dan dikirim ke laboratorium. Sampel jaringan ikan dicuci dengan air Milli-Q dan dipotong kecil-kecil dan dikeringkan pada kondisi sekitar sebelum disimpan dalam freezer pada suhu -20 °C. DNA arwana dari setiap sampel jaringan (masing-masing 35–40 mg) kemudian diekstraksi secara terpisah menggunakan kit QIAquick PCR Purification (Manchester, UK) sesuai dengan protokol pabrik dan disimpan pada suhu -20 °C saat tidak digunakan. Amplifikasi PCR dari fragmen DNA genom kemudian dilakukan menggunakan Bio-Rad PCR thermal cycler (PTC-100, Hercules, USA). Fragmen DNA produk PCR kemudian dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1,5%. Ekstrak DNA arwana juga dianalisis dengan biosensor DNA elektrokimia untuk menentukan jenis kelaminnya. Respon DPV yang diperoleh dibandingkan dengan arus baseline yang diperoleh tanpa adanya DNA arwana. t uji diterapkan untuk menentukan perbedaan yang signifikan antara respon biosensor DNA dan arus dasar pada 4 derajat kebebasan dan tingkat kepercayaan 95%. Respons biosensor DNA yang diperoleh secara signifikan lebih tinggi dari arus awal menunjukkan ikan arwana jantan terdeteksi dan sebaliknya.
Hasil dan Diskusi
AcMPs yang disintesis diamati (Gbr. 2) di bawah mikroskop elektron pemindaian (SEM, LEO 1450VP). Distribusi ukuran miscropshere akrilik dibuat dari fotopolimerasi diilustrasikan pada Gambar. 3.
Gambar SEM mikrosfer polimer akrilik
Distribusi ukuran mikropsher akrilik yang dibuat dari fotopolimerisasi
Pengaruh kecepatan pemindaian yang berbeda dari SPE karbon yang mengandung AcMPs-AuNPs dengan adanya K3 Fe(CN)6 menunjukkan bahwa arus puncak oksidasi dan reduksi meningkat dengan meningkatnya laju pemindaian dari 0,05 menjadi 0,30 V/s (Gbr. 4). Dengan demikian, proses transfer elektron pada permukaan elektroda diharapkan bersifat reversibel [22,23,24,25].
Voltammogram siklik 1,0 mM K3 Fe(CN)6 dalam 0,05 M buffer Na-fosfat pH 7,0 dengan laju pemindaian yang berbeda (0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, dan 0,30 V/s) untuk karbon termodifikasi SPE yang mengandung bahan AcMP-AuNP pada permukaan elektroda
linearitas yang baik ditemukan antara arus puncak redoks dan akar kuadrat dari laju pemindaian dengan koefisien korelasi (R
2
) dari 0,996 dalam kisaran 50–300 mV/s seperti yang ditunjukkan oleh Persamaan. 2 dan Gambar 5a.
Plot arus puncak oksidasi (ip/μA) versus akar kuadrat laju pemindaian ((mV/s)
1/2
) (a ) dan plot log arus puncak oksidasi (ip/μA) versus log laju pemindaian (log (mV/s)) (b )
Hal ini menunjukkan bahwa reaksi pada permukaan elektroda yang dimodifikasi adalah reaksi yang dikendalikan difusi [22,23,24,25].
Selanjutnya, berdasarkan Gambar 5b, ketika nilai log arus oksidasi diplot terhadap nilai log laju pemindaian, diperoleh garis linier dengan kemiringan 0,65, yang mendekati nilai teoritis 0,50 untuk proses yang dikendalikan difusi. . Oleh karena itu, penelitian telah menunjukkan bahwa reaksi pada permukaan SPE yang dimodifikasi sebagian besar dikendalikan difusi.
Untuk kasus ideal dari proses transfer satu elektron yang cepat, reversibel, dan satu elektron, Ep =0,059 V pada 298 K. Namun, pergeseran potensial puncak yang meningkat dengan laju pemindaian menunjukkan pemisahan potensial puncak yang lebih besar lebih dari 0,059 V (Gbr 4 ). Ini menyiratkan bahwa proses transfer elektron pada permukaan elektroda lambat [22, 25, 26], mungkin karena resistensi yang diciptakan oleh adanya bahan AcMP yang menutupi permukaan elektroda.
Gambar 6 menunjukkan respon DPV biosensor DNA arwana berdasarkan SPE karbon termodifikasi AcMP, AuNP, dan AcMP-AuNP. Perbedaan arus DPV yang signifikan yang diamati antara percobaan (a) dan (c) mengungkapkan bahwa probe DNA arwana berhasil dicangkokkan ke AcMPs melalui ikatan kovalen yang kuat antara kelompok fungsional suksinimida dari AcMP dan kelompok fungsional amina dari probe DNA aminasi, dan yang tidak bergerak. Probe DNA arwana hanya selektif terhadap cDNA-nya [19, 20]. AuNPs berperan untuk membantu konduktivitas elektron dari AQMS yang diselingi ke permukaan elektroda yang dibuat. Tanpa dimasukkannya AuNPs dalam bahan komposit (f), hanya nanopartikel emas (e), dan nanopartikel emas dan komposit AcMP (d), hanya sangat sedikit respons arus yang dapat diamati. Arus DPV rendah yang diperoleh dalam percobaan (b) adalah karena tidak terjadi reaksi hibridisasi DNA dengan ncDNA, yang juga menunjukkan tidak ada penyerapan spesifik indikator redoks AQMS pada permukaan elektroda [27, 28].
Sinyal DPV dari elektroda DNA berbasis AcMP-AuNP pada hibridisasi dengan cDNA (a ) dan DNA non-pelengkap (b ), respons DPV dari AcMP (f ) dan SPE yang dimodifikasi AuNP (e ), dan SPE termodifikasi komposit AcMP-AuNP serta respon biosensor DNA berdasarkan probe DNA SPE termodifikasi komposit AcMP-AuNP (c ) sebelum reaksi dengan cDNA dengan adanya 1 mM AQMS pada laju pemindaian 0,5 V/s versus elektroda referensi Ag/AgCl
Untuk durasi imobilisasi probe DNA, Gambar 7a menunjukkan respons biosensor DNA meningkat perlahan selama 1-3 jam pertama waktu imobilisasi probe DNA dan peningkatan mendadak dalam respons biosensor DNA dapat dilihat antara 3 dan 6 jam durasi imobilisasi probe DNA . Ini karena waktu imobilisasi yang lebih lama diperlukan untuk meningkatkan jumlah probe DNA yang lebih besar untuk dipasang pada elektroda yang dimodifikasi AcMP-AuNP. Pada perpanjangan lebih lanjut dari waktu imobilisasi probe DNA, tidak ada perubahan nyata dalam respons biosensor DNA yang dirasakan karena situs pengikatan AcMP yang diimobilisasi telah sepenuhnya terikat dengan probe DNA. Respon biosensor DNA arwana juga bergantung pada waktu hibridisasi DNA. Profil respons biosensor yang diilustrasikan pada Gambar 7b menunjukkan tren respons arus DPV yang meningkat dengan durasi hibridisasi DNA dari 10 hingga 60 menit, setelah itu respons saat ini menjadi hampir stabil. Pada tahap ini, probe DNA amobil pada elektroda telah sepenuhnya dihibridisasi dengan cDNA [29].
Pengaruh waktu imobilisasi probe DNA (a ) dan waktu hibridisasi DNA (b ) pada respon biosensor DNA arwana menggunakan probe DNA 5 M dan cDNA dengan adanya 1 mM AQMS pada kekuatan ion 2 M
Juga diperhatikan bahwa waktu hibridisasi DNA dari biosensor DNA arwana fabrikasi bergantung pada suhu, dan sebagai keuntungan besar, kami memperoleh respons arus maksimum pada suhu kamar dalam waktu 30 menit (Gbr. 8). Pada suhu rendah, yaitu 4 °C, waktu yang lama diperlukan untuk reaksi hibridisasi DNA yang lengkap karena suhu dingin memperlambat laju reaksi hibridisasi DNA. Waktu hibridisasi DNA yang lebih cepat dapat dicapai pada suhu di atas 25 °C karena laju reaksi hibridisasi DNA yang lebih tinggi terjadi antara probe DNA yang diimobilisasi dan cDNA untuk membentuk DNA dupleks pada suhu tinggi. Namun, suhu tinggi dapat secara permanen merusak struktur heliks ganda DNA, dan regenerasi molekul DNA tidak dimungkinkan bahkan setelah penyesuaian suhu ke nilai optimal [28, 30].
Pengaruh suhu terhadap waktu hibridisasi DNA biosensor DNA arwana. Respon DPV diukur dalam 0,05 M buffer K-fosfat (pH 7,0) pada 4, 25, 40, dan 50 °C untuk periode percobaan 5–90 menit
Sebagai bagian dari optimasi respon biosensor DNA arwana, pengaruh pH larutan pada reaksi hibridisasi DNA diselidiki. Biosensor DNA menunjukkan perubahan arus yang dapat diabaikan antara pH 5,5 dan pH 6,5 karena protonasi tulang punggung fosfodiester DNA, yang mengurangi kelarutan molekul DNA dalam lingkungan berair (Gbr. 9). Peningkatan pH lebih lanjut dari media hibridisasi DNA, respons biosensor DNA arwana meningkat secara tiba-tiba pada pH 7,0, setelah itu penurunan tajam arus DPV terlihat karena lingkungan pH berubah ke kondisi dasar karena denaturasi DNA yang tidak dapat diubah pada pH yang lebih tinggi. rentang [23, 24, 31,32,33]. Karena respons DPV maksimum diperoleh pada pH netral, evaluasi elektrokimia berikutnya dari respons biosensor DNA arwana dipertahankan pada pH 7,0 menggunakan buffer Na-fosfat 0,05 M.
Respon DPV biosensor DNA arwana berbasis SPE karbon termodifikasi komposit AcMP-AuNP antara pH 5,5 dan pH 8,0. Pengukuran DPV dilakukan dalam buffer K-fosfat 0,05 M (pH 7,0) pada 25 °C dan laju pemindaian 0,5 V/s versus elektroda referensi Ag/AgCl
Pengaruh valensi kation terhadap reaksi hibridisasi DNA dilakukan dengan menggunakan kation garam yang berbeda, mis. Ca
2+
, Na
+
, K
+
, dan Fe
3+
ion dalam buffer hibridisasi DNA. Ion bermuatan positif dapat berinteraksi secara elektrostatik dengan rantai fosfodiester bermuatan negatif dari molekul DNA untuk mengatasi hambatan sterik dan tolakan elektrostatik antara probe DNA yang diimobilisasi dan DNA target, sehingga memfasilitasi proses hibridisasi DNA [34]. Gambar 10 menunjukkan bahwa reaksi hibridisasi DNA menguntungkan dengan adanya kation dalam orde Na
+
> K
+
> Fe
3+
> Ca
2+
. Kehadiran Ca
2+
dan Fe
3+
ion diketahui menyebabkan penurunan yang luar biasa dalam respon arus biosensor DNA arwana dibandingkan dengan Na
+
dan K
+
ion. Fenomena ini dikaitkan dengan pembentukan garam kalsium fosfat dan ferrum (III) fosfat yang sedikit larut dalam buffer hibridisasi DNA [22], yang mengurangi kandungan ionik larutan dan menyebabkan tolakan elektrostatik yang tinggi antara molekul DNA. Akibatnya, tingkat hibridisasi DNA menurun dan menyebabkan kinerja biosensor yang buruk. Respon biosensor DNA tertinggi diperoleh saat Na
+
ion ditambahkan ke buffer fosfat hibridisasi DNA karena ukurannya yang kecil dan afinitas yang kuat terhadap ikatan fosfodieter DNA.
Efek dari Ca
2+
, Na
+
, K
+
, dan Fe
3+
ion-ion dalam buffer hibridisasi DNA (0,05 M buffer Na-fosfat pada pH 7,0) terhadap respon DPV biosensor DNA arwana
Konsentrasi buffer NaCl dan Na-fosfat (pH 7.0) juga harus dioptimalkan untuk memberikan kekuatan ionik yang optimal untuk buffer hibridisasi. Gambar 11b menunjukkan bahwa kekuatan ion di bawah dan di atas 2 M tidak dapat mengatasi tolakan elektrostatik yang tinggi antara untaian DNA. Sekitar 0,05 M buffer Na-fosfat (Gbr. 11a) dan 2 M NaCl ditemukan memberikan kekuatan ionik optimum untuk pengujian DNA target arwana dengan kinerja biosensor maksimum. Kondisi buffer hibridisasi yang optimal dalam hal pH, kapasitas buffer, dan kekuatan ionik akan memungkinkan reaksi hibridisasi DNA terjadi pada halangan sterik yang paling minimum [30].
Tren respons biosensor DNA arwana sebagai a Konsentrasi buffer Na-fosfat dan b kekuatan ion dari buffer hibridisasi bervariasi dari 0,002–0,100 M dan 1,52–5,50 M, masing-masing
Biosensor DNA yang dioptimalkan kemudian digunakan untuk mendeteksi serangkaian konsentrasi cDNA arwana antara 1,0 × 10
−12
dan 1,0 × 10
−2
M. Biosensor DNA menunjukkan rentang respons linier yang luas dari 1,0 × 10
−18
menjadi 1,0 × 10
−8
M (R
2
=0,99). Batas deteksi (LOD) diperoleh pada 1,0 × 10
−18
M dihitung berdasarkan tiga kali simpangan baku respons biosensor pada kurva respons yang mendekati LOD dibagi dengan kemiringan kalibrasi linier. Ukuran partikel AcMP yang homogen dalam kisaran mikrometer menunjukkan pengaruh yang signifikan terhadap sensitivitas dan reproduktifitas biosensor DNA (RSD =5,6%). Area permukaan pengikatan yang besar dari AcMP yang difungsikan dengan NAS yang diimobilisasi memungkinkan sejumlah besar molekul DNA untuk mengikat secara kovalen ke permukaan elektroda, sehingga meningkatkan kinerja analitik biosensor DNA sehubungan dengan rentang linier dinamis dan batas deteksi biosensor DNA arwana (Gbr. . 12).
The arowana DNA biosensor response curve (a ) and linear calibration range (b ) and the DPV voltammogram (c ) obtained using 1.0 × 10
−18
to 1.0 × 10
−2
μM cDNA at pH 7.0
Determination of Arowana Fish Gender with DNA Biosensor
The developed electrochemical DNA biosensor has been validated with the standard PCR-based method to determine the gender of Asian arowana fish. With the results tabulated in Table 2, both methods provided the same result for the gender determination of arowana fish. This indicates that the proposed DNA biosensor can be used for accurate determination of arowana gender in a simple and fast way.
Conclusions
The electrochemical DNA biosensor developed in this study demonstrated good sensitivity, wide linear response ranges, and low detection limit in the determination of arowana target DNA. In addition, the DNA biosensor showed a good response towards arowana cDNA, which implies that the electrochemical DNA biosensor could be used to successfully detect the arowana DNA segments. The developed arowana DNA biosensor can be further redesigned into a point-of-use device prototype that offers a great potential for the application in the fish culture for early identification of arowana gender and colour, which is economically advantageous in fishery and aquaculture sectors.
