Bone Morphogenic Protein-2 (rhBMP2)-Loaded Silk Fibroin Scaffolds untuk Meningkatkan Osteoinduktivitas dalam Rekayasa Jaringan Tulang

Metode

Persiapan Larutan Berair SF/BMP2

Pada awalnya, SF diisolasi dari kepompong ulat sutra, Bombyx mori , sebagai larutan air. Protokol yang ditetapkan diikuti dengan sedikit modifikasi [11]. Kepompong direbus dalam 100 mL 0,02 M Na₂ CO₃ selama 20 menit dan kemudian dibilas secara menyeluruh dengan air suling untuk menghilangkan serisin dan lilin yang larut dalam air. Fibroin yang diekstraksi kemudian dilarutkan dalam larutan lithium bromida 9 M pada suhu 60 °C selama 4 jam dan selanjutnya didialisis terhadap air selama 4 hari. Konsentrasi akhir ditentukan dengan menimbang bahan kering setelah pengeringan dan ditemukan 7% w /v . Larutan ini kemudian digunakan setelah dikonsentrasikan ke tingkat yang berbeda dengan dialisis terhadap 1 L 25% polietilen glikol (PEG, 10.000 g mol ⁻¹ ) larutan pada suhu kamar. Larutan berair SF encer disiapkan dengan mengencerkan dengan air suling, dan semua larutan disimpan pada 10 ° C sampai diproses lebih lanjut. Bubuk lyophilized dari rekombinan tulang manusia morphogenic protein-2 (rhBMP2) dilarutkan dalam PBS (pH 3,8). Larutan protein disterilkan dengan filter spuit 0,22 m dan ditambahkan sebagai larutan berair ke setiap larutan fibroin dengan pengadukan terus menerus. Ikatan silang yang dimediasi glutaraldehid digunakan untuk mengasosiasikan BMP dengan fibroin. Secara singkat, untuk 10 mL campuran reaksi, masing-masing 5 mL dari 6% silk fibroin dan 1% rhBMP2 dihubungkan silang menggunakan 200 L glutaraldehid dan 40 L, 12 N HCl sebagai agen pengaktifan kelompok. Dengan prosedur ini, tiga larutan disiapkan:(i) 3% silk fibroin tanpa rhBMP2 (SF), (ii) 3% silk fibroin dengan 0,5% rhBMP2 (SF+rhBMP2), dan (iii) 12% silk fibroin dengan 0,125% rhBMP2 seperti pada (ii) (4SF+rhBMP2). Solusi ini digunakan dalam prosedur electrospinning untuk fabrikasi perancah.

Fabrikasi Scaffold dengan Electrospinning

Untuk fabrikasi scaffold, setiap larutan dimasukkan ke dalam spuit kaca 5 mL dengan jarum stainless steel (25G, ID 0,26 mm, Sigma Aldrich) yang terhubung ke suplai DC 5,5 kV. Untuk persiapan serat, laju aliran keluar dipertahankan pada 0,4 mL h ⁻¹ menggunakan pompa jarum suntik, dan serat electrospun dikumpulkan pada aluminium foil dengan jarak 15 cm dari ujung kapiler. Sampel dikumpulkan masing-masing selama 4 jam.

Memindai Mikroskop Elektron

Untuk pemeriksaan morfologi scaffolds yang telah disiapkan, SEM dilakukan menggunakan Zeiss EVO40SEM. Sampel dilapisi dengan emas sebelum pemindaian gambar diproses lebih lanjut. Penentuan diameter serat dilakukan dengan rata-rata diameter 10 serat acak dalam bingkai gambar.

Properti Mekanik Perancah

Eksperimen tekan dilakukan untuk menilai sifat mekanik perancah yang dikembangkan menggunakan tester elektromekanis atas meja kolom tunggal Instron (model 3345, Instron, Canton, MA). Serat dengan diameter 0,2 mm, diperoleh dengan elektrospinning pada durasi yang lebih lama, digunakan untuk menentukan kekuatan tarik dan perpanjangan putus dari kurva tegangan-regangan pada 25 °C dan kelembaban 50%.

Studi Pembengkakan

Untuk pengukuran rasio pengembangan, masing-masing formulasi dilarutkan dalam PBS (pH 7,4) pada suhu 37 °C. Sampel diambil pada interval waktu yang telah ditentukan, dan berat kering diukur menggunakan neraca elektronik. Pengujian dilanjutkan sampai tercapai berat keseimbangan. Rasio pembengkakan dinyatakan sebagai berikut:

di mana, A _o =berat kering awal dari matriks nanofibrous dan W _s =berat matriks nanofibrous yang membengkak pada setiap titik waktu.

Budaya Sel

Sel punca mesenkim manusia (hMSCs) digunakan dalam penelitian ini untuk mengevaluasi potensi osteoinduktif dari nanoscaffolds yang dibuat. hMSC dikultur dan dipelihara dalam DMEM dengan 10% serum janin sapi dan 1% penisilin, pada 37 °C dalam 5% CO₂ atmosfer yang dilembabkan sampai 90% pertemuan tercapai. Sel kemudian di-tripsinisasi, disentrifugasi, dan disuspensikan kembali ke dalam medium untuk kuantifikasi.

Scaffold disterilkan dengan pencucian dengan etanol dan penyinaran dengan sinar UV selama 30 menit dan dicuci dengan PBS (pH 7,4) setelahnya. Perawatan dengan DMEM diberikan pada perancah sebelum penyemaian sel. 20 L suspensi sel ditambahkan tetes demi tetes ke setiap perancah dan film plastik yang berfungsi sebagai kontrol. Scaffolds diistirahatkan dalam atmosfer yang dilembabkan (37 °C, 5% CO₂ ) selama 30 menit. Kemudian, perancah diinkubasi dalam DMEM selama 21 hari dengan pengisian media secara teratur setiap hari.

Uji Adhesi Sel

Untuk menilai kapasitas adhesi sel dengan scaffold, jumlah sel yang tidak melekat dihitung setelah 1, 3, dan 6 jam penyemaian awal sesuai metode dalam literatur dengan sedikit modifikasi [6]. Media sel dikumpulkan dan penghitungan sel dilakukan dengan hemositometer. Perbedaan antara jumlah penyemaian awal dan jumlah sel yang tidak melekat dianggap sebagai jumlah sel yang melekat. Hasil dinyatakan dalam persen adhesi sesuai persamaan berikut:

Uji Sitotoksisitas

Untuk mengukur efek toksik dari matriks nanofibrous, dilakukan uji MTT. Setelah jangka waktu masing-masing, konstruksi diinkubasi dalam larutan MTT (1 mg mL ⁻¹ larutan stok diencerkan dalam PBS (pH 7,4) dengan perbandingan 1:10) dan diinkubasi selama 4 jam. Sel-sel yang hidup mengubah MTT menjadi garam formazan selama masa inkubasi ini. Garam formazan dilarutkan dengan penambahan DMSO dan didiamkan selama 20 menit. Absorbansi yang berasal dari garam formazan diukur secara kuantitatif dengan mencatat perubahan absorbansi pada 570 nm menggunakan pembaca lempeng mikro.

Uji Proliferasi Sel

Uji reduksi pewarna biru alamar (AB) dilakukan untuk menentukan proliferasi sel di dalam perancah. Perancah diinkubasi dalam pewarna yang diencerkan dengan DMEM selama 4 jam, dan pengurangan pewarna diukur secara spektrofotometri. Persen pengurangan AB dihitung sebagai:

dimana, ελ ₁ =koefisien kepunahan molar warna biru alamar pada 570 nm dan ελ ₂ =koefisien kepunahan molar biru alamar pada 600 nm, dalam teroksidasi (ε _sapi ) dan dikurangi (ε _merah ) formulir. Aλ ₁ dan Aλ ₂ menunjukkan absorbansi sumur uji.

A'λ ₁ =absorbansi sumur kontrol negatif pada 570 nm.

A'λ ₂ =absorbansi sumur kontrol negatif pada 600 nm.

Pengujian ALP

Alkaline phosphatase (ALP) produksi oleh hMSC berbudaya dalam perancah diukur sesuai protokol produsen dalam kit [12]. Secara singkat, PBS steril (pH 7,4) digunakan dalam pencucian dan inkubasi perancah, diikuti dengan homogenisasi dengan 1 mL buffer Tris (1 M, pH 8,0), dan sonikasi selama 3 menit di atas es. 25 L lisat kemudian diinkubasi dengan 1 mL larutan p-nitrofenil fosfat (16 mM) pada suhu 30 °C selama 5 menit. Pengukuran spektrofotometri dilakukan pada 405 nm untuk memantau produksi p-nitrofenol dengan adanya ALP.

Aktivitas ALP in vivo

Sembilan ekor tikus putih jantan athymic dengan berat masing-masing 100-120 g diambil dan dibedah secara bilateral pada otot perut untuk dibuat kantong. Model tikus telanjang digunakan untuk menunjukkan potensi osteoinduktif dari perancah in vivo. Salah satu dari masing-masing tiga jenis perancah (5 mm × 5 mm) dipotong dan dikemas ke dalam kantong otot secara terpisah. Kantong kemudian ditutup dengan jahitan yang tidak dapat diserap. Setelah 14 hari operasi, implan diambil dengan mengeksisi otot perut rekti dan disimpan di PBS. Flap otot dieksisi, dan diperoleh jaringan eksplan yang dihomogenkan dalam buffer ekstraksi untuk melepaskan alkaline phosphatase. 50 L alikuot larutan digunakan untuk pengukuran aktivitas ALP.

Analisis Statistik

Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, dan data yang disajikan diformat sebagai mean ± standar deviasi (SD) sampel, kecuali disebutkan. Analisis varians satu arah (ANOVA) dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak statistik Origin 6.0, untuk mengevaluasi perbedaan yang tidak pasti dan perbedaan yang signifikan. P nilai 0,05 atau kurang menandakan perbedaan yang signifikan antara kelompok belajar.

Hasil

Morfologi Perancah

Gambar SEM (Gbr. 1) dari perancah fabrikasi mengungkapkan struktur nanofibrous pintal halus. Diameter rata-rata serat dalam perancah SF dan SF+BMP2 tampak serupa, berkisar antara 100 hingga 900 nm, pada semua konsentrasi, karena diameter ditemukan sebagai fungsi waktu saat elektrospinning dilakukan [13], sedangkan SF nanofibers ditemukan seragam, dan konjugasi BMP2 menyebabkan ketidakseragaman dalam diameter serat. Ukuran pori perancah tampaknya homogen dalam perancah fabrikasi dan ditemukan tidak tergantung pada konsentrasi fibroin. Konsentrasi SF tidak mempengaruhi ukuran pori secara signifikan [11].

Mikrograf SEM dari perancah yang disiapkan. a SF. b SF+rhBMP2. c 4SF+rhBMP2

Properti Mekanik Perancah

Kurva tegangan-regangan perancah nanofibrous diwakili pada Gambar. 2. Diamati bahwa penambahan BMP tidak mengubah sifat mekanik perancah SF, tetapi dengan peningkatan konsentrasi bahan fabrikasi (SF), sifat tarik matriks ditingkatkan . Ini mungkin karena pembentukan ikatan antar serat selama ikatan silang. Dengan demikian, serat SF konsentrasi rendah tidak menunjukkan kekuatan mekanik yang lebih baik dibandingkan dengan serat yang lebih tinggi.

Hubungan tegangan-regangan nanofiber electrospun. Hubungan tegangan-regangan dibandingkan antara (a) SF, (b) SF+rhBMP2, dan (c) perancah 4SF+rhBMP2

Studi Pembengkakan

Pembengkakan rasio sebagai fungsi waktu untuk perancah diwakili pada Gambar. 3. Perancah membengkak baik dengan waktu seragam awalnya dan mencapai keseimbangan di sekitar 380 menit. Serat terkait rhBMP2 menyerap lebih banyak air dibandingkan dengan perancah khusus SF yang menunjukkan peningkatan kantong hidrofilik karena asosiasi BMP2. Serat SF diseimbangkan pada 70% sedangkan serat yang mengandung BMP2 diseimbangkan pada 81% air.

Pembengkakan properti perancah fabrikasi. Perubahan sifat pembengkakan perancah SF diamati setelah modifikasi dengan SF+rhBMP2 dan 4SF+rhBMP2

Uji Adhesi Sel

Kepatuhan sel pada scaffold diperlukan untuk pertumbuhan sel dan induksi untuk diferensiasi. Dalam penelitian ini, kami mengamati bahwa hMSC melekat dengan baik pada perancah, dan kepatuhan hMSC pada perancah 4SF-BMP2, SF-BMP2, dan SF ditunjukkan pada Gambar. 4.

Histogram mewakili persentase adhesi versus waktu untuk tiga titik waktu. Perubahan tingkat adhesi pada (a) SF, (b) SF+rhBMP2, dan (c) 4SF+rhBMP2 scaffold

Ada kekhawatiran hilangnya kepatuhan dalam perancah campuran yang dikesampingkan dengan hasil yang diamati. Pencampuran dengan BMP2 tidak mengurangi daya lekat scaffold. Seperti terlihat dari Gambar. 3, dipahami dengan baik bahwa dengan peningkatan ukuran pori (penurunan konsentrasi SF), kepatuhan sel ke perancah meningkat. ANOVA di antara ketiga formulasi secara signifikan membedakan variasi pada jam ke-3 dan ke-6. Namun, tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada jam pertama.

Uji Sitotoksisitas dan Uji Proliferasi Sel

Viabilitas sel meningkat secara signifikan dalam perancah terkonjugasi rhBMP2, dan perancah yang dibangun tidak menciptakan efek sitotoksik apa pun pada sel tamu yang bersangkutan (Gbr. 4), dan sel berkembang biak dengan baik di semua perancah secara komparatif. tren peningkatan viabilitas dengan jumlah hari, dan perancah SF+BMP2 menunjukkan toksisitas paling rendah pada setiap titik waktu. ANOVA mengungkapkan perbedaan yang signifikan antara nilai-nilai viabilitas sel dari tiga formulasi yang bersangkutan.

Uji viabilitas sel direpresentasikan sebagai histogram untuk empat titik waktu. Uji viabilitas sel dilakukan dengan uji MTT, dan hasilnya disajikan sebagai persentase relatif terhadap kontrol

Dari Gambar. 6, proliferasi sel dapat diperiksa. Sel berkembang biak dengan baik di ketiga persiapan perancah dengan SF+BMP2 terbaik setiap titik waktu. Pori-pori yang lebih besar pada scaffold SF + BMP2 memberikan ruang maksimum untuk pertumbuhan sel. Signifikansi perbedaan di antara kelompok itu ditetapkan dengan baik dari ANOVA.

Representasi proliferasi sel sebagai persentase reduksi zat warna alamar blue pada empat titik waktu untuk SF, SF+BMP2, dan 4SF+BMP2

Pengujian ALP

Aktivitas ALP adalah penanda standar properti osteoinduktif dari lingkungan sekitar sel [13]. Dalam percobaan kami, kami mengamati aktivitas ALP yang lebih tinggi dalam konstruksi SF+BMP2 dibandingkan dengan konstruksi SF saja (Gbr. 7). Scaffold berstrukturnano SF mampu menunjukkan osteoinduksi sendiri juga tetapi terbukti dari Gambar. 7 dan ANOVA, scaffold SF+BMP2 terbukti menjadi yang terbaik di antara scaffold yang bersangkutan. Konsentrasi ALP meningkat seiring waktu percobaan, dan konstruksi dengan konsentrasi SF yang lebih tinggi, bagaimanapun, menunjukkan aktivitas ALP yang lebih rendah dibandingkan dengan konstruksi dengan konsentrasi SF yang lebih rendah.

Representasi aktivitas ALP di antara tiga strategi fabrikasi scaffold yang berbeda pada titik waktu yang berbeda. (a) SF (b) SF+rhBMP2 (c) perancah 4SF+rhBMP2

Aktivitas ALP in vivo

Gambar 8 menggambarkan aktivitas ALP eksplan untuk (a) SF, (b) SF+rhBMP2, dan (c) 4SF+rhBMP2. Seperti yang diharapkan, eksplan dari pengobatan yang mengandung rhBMP2 menginduksi aktivitas ALP yang lebih tinggi sementara tikus yang diberi perancah bebas rhBMP2 menghasilkan aktivitas ALP yang lebih rendah.

Aktivitas ALP in vivo dari eksplan diperoleh setelah perlakuan. Model tikus telanjang digunakan untuk menunjukkan potensi osteoinduktif dari perancah in vivo

Diskusi

Rekayasa jaringan berbasis perancah telah membuktikan potensinya dalam pengobatan regeneratif dan telah menyaksikan kemajuan yang mengesankan sebagai alat untuk BTE. Studi sebelumnya telah menetapkan peran penting arsitektur mikro dan sifat fisik struktur dalam menerjemahkan konstruksi perancah sel yang direkayasa secara in vitro ke dalam jaringan tulang [14,15,16].

Sifat mekanik yang optimal (ukuran pori, kekuatan tarik, dll.) dan biokompatibilitas konstruksi adalah fitur potensial yang harus dipertimbangkan untuk kolonisasi dan organisasi sel [17]. Karya yang disajikan menjelaskan fabrikasi dan karakterisasi perancah untuk rekayasa jaringan tulang menggunakan kombinasi sifat menguntungkan dari bahan yang diusulkan untuk hal yang sama. Sementara SF menyediakan platform kuat dan biokompatibel yang sesuai, rhBMP2 tertanam menginduksi pembentukan osteosit baru. SF sedang dipelajari secara ekstensif oleh beberapa kelompok dalam formulasi yang berbeda untuk proliferasi sel osteoblastik [18] dan regenerasi jaringan termasuk ligamen, tendon, tulang rawan, tulang, hati, kulit, trakea, kornea, saraf, gendang telinga, dan kandung kemih [19, 20].

Kami telah menggunakan larutan berair SF dan SF + rBMP2 untuk penelitian kami karena larutan berair lebih disukai daripada pelarut organik untuk persiapan larutan SF karena degradasi SF tidak menguntungkan dalam larutan organik [18]. Serat SF electrospun sebelumnya dilaporkan memiliki struktur serat yang homogen dengan diameter yang seragam, dan mesh sangat berpori dengan pori-pori yang saling terkait dan terhubung silang yang sesuai dengan penelitian kami juga [21, 22]. Tidak ada pengamatan pembentukan struktur seperti manik-manik dalam serat SF di perancah kami dan yang dilaporkan sebelumnya [21]. Diameter serat SF murni sebelumnya dilaporkan berkurang dengan meningkatnya campuran [11, 21]; namun, kami tidak mengamati hilangnya diameter karena pencampuran. Tetapi keseragaman serat terganggu dalam serat campuran mungkin karena asosiasi rBMP2 yang tidak merata ke serat SF.

Kekuatan mekanik yang cukup adalah properti penting untuk perancah jaringan. Pencampuran SF murni meningkatkan fleksibilitas nanofiber dalam percobaan kami, dan laporan sebelumnya juga mengungkapkan tren serupa dalam peningkatan sifat mekanik pada pencampuran SF dengan bahan lain untuk menghasilkan biomaterial campuran yang dapat digunakan [21, 23]. Jadi, perancah fabrikasi kami memiliki kekuatan mekanik dan fleksibilitas penting yang diperlukan dalam aplikasi rekayasa jaringan.

Scaffolds untuk rekayasa jaringan harus dapat menempelkan sel di atasnya, harus memfasilitasi proliferasi sel dan osteoinduksi dan harus paling sedikit sitotoksik untuk penerimaan yang lebih baik. Laporan sebelumnya tentang perancah SF telah menetapkan aktivitas non-sitotoksik dan proliferasi selnya [21, 24], dan penelitian kami sangat sesuai dengan hasil yang dilaporkan sebelumnya.

Karena sifat osteoinduktifnya, rhBMP2 digunakan dalam rekayasa jaringan tulang oleh beberapa kelompok [25,26,27]. Studi-studi ini telah mengungkapkan bahwa sel-sel yang dikultur di atas perancah yang mengandung BMP2 memiliki aktivitas ALP yang lebih tinggi, sebuah biomarker osteoinduksi. Efek dari asosiasi BMP2 lebih kontras dengan waktu inkubasi berlangsung. Kim dkk. memanfaatkan mikrosfer berpori terkait BMP2 dan mengamati peningkatan serupa dalam osteoinduksi [25].

Kesimpulan

Kami berhasil membuat perancah berserat berbasis SF yang mengandung rhBMP2. Perancah ini homogen dan ditemukan memiliki sifat mekanik dan biokompatibilitas yang memadai. Asosiasi rhBMP2 lebih lanjut dikaitkan dengan potensi osteoinduktif dari perancah yang dibuat. Perancah dievaluasi lebih lanjut untuk aplikasi in vivo dan ditemukan cocok untuk aplikasi yang melibatkan rekayasa jaringan tulang.

Singkatan

ALP:

Alkali fosfatase

BTE:

Rekayasa jaringan tulang

hMSC:

Sel punca mesenkim manusia

rhBMP2:

Protein morfogenik tulang manusia rekombinan-2

SF:

Fibroin sutra

Mekanisme Konduksi dan Peningkatan Daya Tahan pada RRAM Berbasis HfO2 dengan Perawatan Nitridasi Studi Antitumor dari Chondroitin Sulfate-Methotrexate Nanogels