Pengiriman Anti‑Tumor Terpadu Metotreksat melalui Nanogel Berbasis Sulfat Kondroitin
Abstrak
Nanogel (NG) yang diformasi sendiri dibuat dengan mengonjugasi kovalen metotreksat (MTX) ke glikosaminoglikan sulfat kondroitin (CS). Nanogel MTX‑CS menunjukkan peningkatan keberlarutan air yang dramatis dan distribusi biodistribusi yang lebih baik, berkat affinnya CS terhadap reseptor CD44 yang ekspresi berlebih pada banyak sel tumor. Eksperimen in vivo mengonfirmasi bahwa nanogel MTX‑CS menyampaikan konsentrasi obat intratumoral yang lebih tinggi sambil secara signifikan mengurangi toksisitas sistemik dibandingkan MTX bebas. Hasil ini mendirikan konjugat berbasis CS sebagai platform yang kuat untuk pengiriman terpadu agen antikaner yang sedikit larut dalam air.
Latar Belakang
Metotreksat (MTX), analog folat yang diperkenalkan pada tahun 1950-an, tetap menjadi sumuran kemoterapi untuk berbagai maligan. Utilitas klinisnya, however, terbatas oleh keberlarutan air yang buruk, klarifikasi cepat, dan efek samping bergantung pada dosis, terutama mukositis dan mielosupresi.1‑3 Bukti terbaru menunjukkan bahwa pengiriman terpadu dapat mengatasi hambatan ini dengan meningkatkan penyerapan tumor sambil melindungi jaringan normal.4‑6
Nanoteknologi menawarkan serangkaian alat serbaguna untuk meningkatkan farmakokinetika obat. Self-assembly dari konjugat obat‑polimer menjadi nanogel menyediakan cangkung hidrofilik pelindung, waktu sirkulasi yang diperpanjang, dan peluasan terkontrol.7‑13 Sulfat kondroitin (CS), glikosaminoglikan yang terjadi secara alami, berikatan dengan reseptor CD44 dengan affin yang tinggi, jalur yang sering dieksploitasi oleh kanker metastatik.14‑18 Nanopartikel berbasis CS telah menunjukkan janji dalam targeting tumor,19‑22. Berdasarkan kemajuan ini, kami merancang nanogel CS‑MTX yang bertujuan untuk memaksimalkan manfaat terapeutik sambil meminimalkan toksisitas.
Metode
Bahan dan Sampel
Sulfat kondroitin (MW 100–200 kDa) diperoleh dari Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. Reagen lainnya, termasuk 4‑metilmorfolina, tetrahidrofuran (THF), dan 2‑kloro‑4,6‑dimetoksi‑1,3,5‑triazina, diperoleh dari Sun Chemical Technology. Serum sapi fetus (FBS) dibeli dari HyClone. Tikus Lewis (Sprague‑Dawley, 200 ± 10 g) digunakan untuk studi in vivo.
Sintesis DMT‑MM
DMT‑MM disiapkan dengan bereaksi 2‑kloro‑4,6‑dimetoksi‑1,3,5‑triazina (0,769 g) dengan 4‑metilmorfolina (18,79 mL) dalam THF (200 mL) di bawah pengadukan selama 30 menit. Hasil endapan putih difilter, dicuci tiga kali dengan THF, dan dikeringkan vakum selama 24 jam.
Jalur sintesis DMT‑MM
Sintesis MTX‑CS
CS (1,0 g) dilarutkan dalam 20 mL air ultra murni dan diaktifkan dengan DMT‑MM (0,769 g). Setelah 30 menit pada suhu ruangan, MTX (0,5 g) ditambahkan dan campuran diaduk selama 24 jam. Konjugat difusilasi (MWCO 3,5 kDa) terhadap air selama 48 jam, dengan pertukaran yang sering, kemudian liofilisasi menjadi bubuk kuning. FTIR (400–4000 cm⁻¹) dan ¹H‑NMR (400 MHz) mengonfirmasi konjugasi yang berhasil.
Jalur sintesis MTX‑CS
Sitotoksisitas Nanogel MTX‑CS
Sel A549T, HeLa, dan HUVEC ditanam pada 5 × 10³ sel/well dalam papan 96‑well dan diinkubasi 24 jam (37 °C, 5% CO₂). Sel kemudian diperlakukan dengan nanogel MTX‑CS pada konsentrasi yang berkisar dari 0 hingga 400 µM (berdasarkan kandungan MTX) selama 48 jam tambahan. Keberadaan sel dikuantifikasi melalui uji MTT: 20 µL buffer CCK‑8 ditambahkan, papan diam 4 jam, dan absorpsi diukur pada 490 nm (referensi 570 nm) pada pembaca MULTISKAN GO.
Hewan dan Desain Eksperimen
Tikus Sprague‑Dawley pria diacak menjadi tiga kelompok (n = 6): (i) kontrol salin, (ii) MTX bebas (1,25 µmol kg⁻¹ hari⁻¹), dan (iii) nanogel MTX‑CS (setara dengan 1,25 µmol kg⁻¹ hari⁻¹ MTX, 25 mg kg⁻¹ hari⁻¹ NG). Perlakuan diberikan intraperitoneally selama 14 hari (7 injeksi). Berat badan dan kelangsungan hidup dipantau; hewan dipecat setelah perawatan untuk pengumpulan organ.
Studi Histologis
Limpah diambil, dicuci dengan PBS, diperap dengan paraformaldehida 4% (pH 7,4) selama 24 jam, ditanam dalam parafin, difeksi, dan diwarna dengan hematoxylin & eosin. Slides diperiksa di bawah mikroskop cahaya untuk bukti kerusakan jaringan.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi Nanogel MTX‑CS
Spektrum FTIR (Gambar 1) menampilkan puncak karakteristik MTX (3355, 2951, 1646, 1600, 1540, 1493, 1403, 1207 cm⁻¹) yang tetap ada dalam konjugat, mengonfirmasi pelampungan yang berhasil. ¹H‑NMR (Gambar 2) mengungkapkan sinyal yang sesuai dengan moiety benzoyl (δ ≈ 6,9 ppm, 7,8 ppm) dan pteridinyl (δ ≈ 8,7 ppm) MTX, sementara sinyal CS (δ 3,2–5,4 ppm) tetap tidak berubah, memvalidasi konjugasi lebih lanjut. Efisiensi konjugasi, yang ditentukan oleh UV‑vis pada 309 nm, adalah 13,65 % MTX per massa nanogel.
Gambar 1 : Spektrum FTIR CS (a), MTX (b), dan MTX‑CS (c).
Gambar 2 : Spektrum ¹H‑NMR CS (a), MTX (b), dan CS‑MTX (c).
Pencaharan cahaya dinamis (DLS) mengungkapkan diameter hidrodinamis ~200 nm (Gambar 3b), sedangkan mikroskopi gaya atom (AFM) dan mikroskopi elektron transmisi (TEM) mengonfirmasi morfologi bola dengan diameter 200–240 nm (Gambar 3c‑e). Ukuran nano adalah optimal untuk efek penetrasi dan retensi yang ditingkatkan (EPR) dan endositosis yang dimediasi CD44.
Gambar 3 : (a) Skematis nanogel MTX‑CS; (b) distribusi ukuran DLS; (c) citra AFM; (d‑e) mikroskop TEM.
Sitotoksisitas In Vitro
Nanogel MTX‑CS secara signifikan mengurangi keberadaan sel A549T dan HeLa dibandingkan MTX bebas dan MTX dicampur dengan CS (Gambar 5). Untuk HeLa, keberadaan sel turun dari 73,8 % (MTX bebas) menjadi 60,2 % (nanogel MTX‑CS) pada 10 µM, sedangkan untuk A549T penurunan adalah 80,2 % menjadi 46,0 % pada 50 µM. Sebaliknya, obat bebas menunjukkan aktivitas minimal pada konsentrasi yang serupa, dan campuran MTX+CS bahkan mempromosikan pertumbuhan sel. Temuan ini menegaskan peran penyerapan yang dimediasi CD44 dalam meningkatkan pengiriman MTX intracellular. Uji HUVEC menunjukkan peningkatan keberadaan sel sebesar 9,9 % pada 10 µM nanogel MTX‑CS versus 63,6 % untuk MTX bebas, yang menunjukkan penurunan toksisitas off‑target.
Gambar 5 : Keberadaan sel setelah perawatan 48 jam dengan MTX bebas, MTX+CS, dan nanogel MTX‑CS pada A549T (a), HeLa (b), dan HUVEC (c).
Toksisitas dan Efek In Vivo
Pemantauan berat badan selama 14 hari menunjukkan bahwa tikus yang menerima MTX bebas kehilangan berat badan yang signifikan, sedangkan kelompok nanogel MTX‑CS mempertahankan berat badan hampir normal (Gambar 6). Pemeriksaan histologis limphah menunjukkan keresahan berat dan penambahan hemosiderin pada kelompok MTX, tetapi hanya perubahan ringan pada kelompok nanogel MTX‑CS, mengonfirmasi pengurangan toksisitas sistemik (Gambar 7).
Gambar 6 : Trajektur berat badan untuk kelompok salin, MTX bebas, dan nanogel MTX‑CS.
Gambar 7 : Bagian limphah yang diwarna H&E – (a,b) kontrol, (c,d) MTX bebas, (e,f) nanogel MTX‑CS.
Kesimpulan
Kami berhasil merancang nanogel MTX‑CS berukuran 200‑nm yang menggabungkan keberlarutan tinggi, targeting yang dimediasi CD44, dan toksisitas sistemik yang diminimalkan. Data in vitro dan in vivo menunjukkan efek anti‑tumor yang lebih unggul relatif terhadap MTX bebas, dengan efek samping yang jauh lebih rendah. Temuan ini memvalidasi konjugat obat berbasis CS sebagai strategi serbaguna untuk pengiriman agen antikaner yang sedikit larut dalam air dengan indeks terapeutik yang ditingkatkan.
