Peningkatan Osteoinduktivitas dengan Rangka Stelo Fibroin Sutera Dimuat rhBMP‑2 untuk Rekayasa Jaringan Tulang
Abstrak
Permintaan akan formulasi rangka fibroin sutera (SF) dalam aplikasi medis terus meningkat. SF disilang dengan gluteraldehida menggunakan protein morfogen tulang manusia rekombinan osteoinduktif-2 (rhBMP2) dengan berbagai rasio, yaitu (i) 3% SF tanpa rhBMP2 (SF), (ii) 3% SF dengan jumlah rhBMP2 yang sama (SF+BMP2), dan (iii) 12% SF dengan 3% rhBMP2 (4SF+BMP2). Larutan ini digunakan dalam pembuatan nanoskafa berbasis electrospinning untuk mengevaluasi potensi osteoinduktif yang ditingkatkan pada rangka SF dengan rhBMP2. Hubungan stres–strain menunjukkan tidak ada kehilangan kekuatan mekanikal serat dengan penambahan rhBMP2, dan kekuatan mekanikal skafa meningkat seiring kenaikan konsentrasi SF. Asosiasi rhBMP2 meningkatkan kapasitas penahanan air skafa, seperti terlihat dari studi pembengkakan. Keberadaan hMSC ditemukan lebih tinggi pada skafa yang dikonjugasi, dan skafa tidak menunjukkan sitotoksisitas terhadap sel tamu. Sel ditemukan memiliki aktivitas fosfatase kapur yang lebih tinggi pada skafa yang dikonjugasi dalam kondisi in vitro dan in vivo, yang membuktikan peningkatan osteoinduktivitas pada konstruksi baru. Skafa juga ditemukan efektif untuk pembentukan tulang in vivo.
Latar Belakang
Kapasitas regenerasi tulang memungkinkan perbaikan fraktur tulang kecil secara mandiri. Tulang terbentuk, diikuti dengan penggabungan, dan akhirnya rekonstruksi bentuk asli tulang. Namun, kapasitas ini terbatas, sehingga menciptakan kebutuhan akan autograf atau alograf untuk pengobatan [1]. Alograf melibatkan pengambilan tulang dari donor terpisah yang dapat menyebabkan reaksi imunologis. Autograf, di mana tulang diambil dari tubuh pasien sendiri, tidak menciptakan masalah imunologis tetapi terbatas oleh kuantitas tulang yang cukup [2,3,4].
Rekayasa jaringan dipandang sebagai teknologi potensi untuk mengatasi keterbatasan imunologis dari alograf dan autograf. Dengan rekayasa jaringan, sel khusus seperti sel mesenkimatik manusia atau sel osteosarcoma (MG63) dikultur di lingkungan yang sesuai atas skafa yang telah difabrikasi, dan sistem sel dan skafa ini kemudian digunakan sebagai graf [5, 6].
Skafa digunakan untuk memberikan ikatan dan nich biokimia kepada sel untuk bertahan dan berkembang biak. Beberapa properti, yaitu kekuatan mekanikal, osteoinduksi, bioresorsi, porositas bertingkat, dan kompatibilitas biologis, harus dipertimbangkan saat memilih bahan untuk pembuatan skafa. Osteoinduksi (induksi pembentukan tulang) adalah salah satu properti yang diperlukan dari bahan yang digunakan dalam pembuatan skafa rekayasa jaringan tulang (BTE) [7]. Skafa dengan faktor osteogenik kuat untuk meniru proses regenerasi jaringan tulang yang menggabungkan angiogenesis dan osteogenesis yang dapat merekrut sel progenitor dan differensiasi. Protein morfogen tulang (BMPs) adalah kelas faktor pertumbuhan yang menginduksi pembentukan tulang dan diusulkan untuk aplikasi BTE bersama dengan matriks tulang demineralisasi (DBM) dan fosfat kalsium [8,9,10].
Beberapa kelompok telah melaporkan penggunaan logam, keramik, polimer sintetik dan komposit, serta fibroin sutera sebagai bahan potensial untuk pembuatan skafa dalam BTE. Fibroin sutera (SF) telah dilaporkan sebagai bahan yang cocok untuk pembuatan skafa untuk aplikasi rekayasa jaringan karena properti mekanis dan kompatibilitas biologis yang luar biasa [5]. Sampai saat ini, belum ada laporan yang diterbitkan yang mengevaluasi manfaat asosiatif BMPs dengan nanoskafa electrospun SF.
Di sini, kami melaporkan pembuatan skafa nanosfibrous electrospun SF baru yang dikonjugasi rhBMP2. Skafa dibandingkan dengan skafa SF murni untuk mengungkapkan efek konjugasi rhBMP2 terhadap osteoinduksi. Properti keberadaan sel dan proliferasi sel juga diukur untuk membangun potensi skafa untuk aplikasi rekayasa jaringan tulang baru dan lebih baik.
Metode
Persiapan Larutan Akuosa SF/BMP2
Pertama, SF diisolasi dari telur ulat sutera, Bombyx mori, sebagai larutan akuosa. Protokol yang telah ditetapkan diikuti dengan modifikasi kecil [11]. Telur direbus dalam 100 mL Na2CO3 0,02 M selama 20 menit dan kemudian dicuci bersih dengan air destilasi untuk menghilangkan serisin dan luka yang terlarut dalam air berlebih. Fibroin yang diekstraksi kemudian dilarutkan dalam larutan litium bromida 9 M pada 60 °C selama 4 jam dan difusilasi terhadap air selama 4 hari. Konsentrasi akhir ditentukan dengan menimbang bahan kering setelah pengeringan dan ditemukan sebesar 7% w/v. Larutan ini kemudian digunakan setelah dikonsentrasikan ke tingkat yang berbeda melalui difusilasi terhadap 1 L larutan polietilena glikol (PEG, 10.000 g mol−1) pada suhu ruangan. Larutan akuosa SF yang dihaluskan disiapkan dengan menambahkan air destilasi, dan semua larutan disimpan pada 10 °C hingga diproses lebih lanjut. Bubuk liofilisasi protein morfogen tulang manusia rekombinan-2 (rhBMP2) dilarutkan dalam PBS (pH 3,8). Larutan protein sterilisasi dengan filter suntikan 0,22 μm dan ditambahkan sebagai larutan akuosa ke setiap larutan fibroin dengan pengadukan berkelanjutan. Silang gluteraldehida digunakan untuk mengasosiasikan BMP dengan fibroin. Secara singkat, untuk campuran reaksi 10 mL, 5 mL dari 6% fibroin sutera dan 1% rhBMP2 disilang menggunakan 200 μL gluteraldehida dan 40 μL, 12 N HCl sebagai agen aktivasi grup. Dengan prosedur ini, tiga larutan disiapkan: (i) 3% fibroin sutera tanpa rhBMP2 (SF), (ii) 3% fibroin sutera dengan 0,5% rhBMP2 (SF+rhBMP2), dan (iii) 12% fibroin sutera dengan 0,125% rhBMP2 seperti pada (ii) (4SF+rhBMP2). Larutan ini digunakan dalam prosedur electrospinning untuk pembuatan skafa.
Pembuatan Skafa dengan Electrospinning
Untuk pembuatan skafa, setiap larutan dimuat ke dalam suntikan kaca 5 mL dengan jarum baja stainless (25G, ID 0,26 mm, Sigma Aldrich) yang terhubung ke supply DC 5,5 kV. Untuk persiapan serat, laju aliran keluar dipertahankan pada 0,4 mL h−1 menggunakan pompa suntikan, dan serat electrospun dikumpulkan pada foil aluminium yang ditempatkan pada jarak 15 cm dari ujung kapiler. Sampel dikumpulkan selama 4 jam masing-masing.
Mikroskopi Elektron Penyemaran (SEM)
Untuk pemeriksaan morfologi skafa yang disiapkan, SEM dilakukan menggunakan Zeiss EVO40SEM. Sampel dilapisi emas sebelum citra pemindahan diproses lebih lanjut. Penentuan diameter serat dilakukan dengan merata-ratakan diameter 10 serat acak dalam frame citra.
Properti Mekanikal Skafa
Eksperimen kompresi dilakukan untuk menilai properti mekanikal skafa yang dikembangkan menggunakan penguji elektromekanis meja tunggal Instron (model 3345, Instron, Canton, MA). Serat dengan diameter 0,2 mm, yang diperoleh dengan electrospinning selama durasi yang lebih lama, digunakan untuk menentukan kekuatan tarik dan peregangan pada putus dari kurva stres–strain pada 25 °C dan 50% kelembaban.
Studi Pembengkakan
Untuk pengukuran rasio pembengkakan, setiap formulasi dilarutkan dalam PBS (pH 7,4) pada 37 °C. Sampel diambil pada interval waktu yang ditentukan sebelumnya, dan berat kering diukur menggunakan neraca elektronik. Uji dilanjutkan hingga berat setara tercapai. Rasio pembengkakan dinyatakan sebagai berikut:
di mana, Wo = berat kering awal matriks nanosfibrous dan Ws = berat matriks nanosfibrous yang membengkak pada setiap titik waktu.
Kultur Sel
Sel mesenkimatik manusia (hMSCs) digunakan dalam studi ini untuk mengevaluasi potensi osteoinduktif nanoskafa yang difabrikasi. hMSCs dikultur dan dipertahankan dalam DMEM dengan 10% serum kalba fetus dan 1% penicillin, pada 37 °C dalam atmosfer 5% CO2 yang lembap hingga 90% konfluensi tercapai. Sel kemudian ditripsinisasi, difugasi, dan disuspendasi kembali dalam medium untuk kuantifikasi.
Skafa sterilisasi dengan mencuci dengan etanol dan irradiasi dengan cahaya UV selama 30 menit dan dicuci dengan PBS (pH 7,4) selanjutnya. Perawatan dengan DMEM diberikan pada skafa sebelum penanaman sel. 20 μL suspensi sel ditambahkan secara titik-titik ke setiap skafa dan plastik film sebagai kontrol. Skafa diam dalam atmosfer lembap (37 °C, 5% CO2) selama 30 menit. Kemudian, skafa diinkubasi dalam DMEM selama 21 hari dengan penggantian medium rutin setiap hari sekali.
Uji Asosiasi Sel
Untuk menilai kapasitas asosiasi sel dengan skafa, jumlah sel yang tidak terasosiasi dihitung setelah 1, 3, dan 6 jam penanaman awal sesuai dengan metode dalam literatur dengan modifikasi kecil [6]. Medium sel dikumpulkan dan perhitungan sel dilakukan dengan hemositometer. Selisih antara jumlah penanaman awal dan jumlah sel yang tidak terasosiasi dianggap sebagai jumlah sel yang terasosiasi. Hasil dinyatakan dalam persentase asosiasi sesuai persamaan berikut:
Untuk mengukur efek toksis matriks nanosfibrous, uji MTT dilakukan. Setelah interval waktu yang sesuai, konstruksi diinkubasi dalam larutan MTT (1 mg mL−1 larutan stok yang dicampur dalam PBS (pH 7,4) dengan rasio 1:10) dan diinkubasi selama 4 jam. Sel yang hidup mengubah MTT menjadi garam formazan selama periode inkubasi ini. Garam formazan dilarutkan dengan penambahan DMSO dan diam selama 20 menit. Absorpsi yang berasal dari garam formazan diukur secara kuantitatif dengan merekam perubahan absorpsi pada 570 nm menggunakan pembaca mikropapan.
Uji Proliferasi Sel
Uji reduksi warna Alamar blue (AB) dilakukan untuk menentukan proliferasi sel dalam skafa. Skafa diinkubasi dalam warna yang dicampur dengan DMEM selama 4 jam, dan reduksi warna diukur spektrofotometrik. Persentase reduksi AB dihitung sebagai:
di mana, ελ1 = koefisien absorpsi molar alamar blue pada 570 nm dan ελ2 = koefisien absorpsi molar alamar blue pada 600 nm, dalam bentuk oksidasi (εox) dan reduksi (εred). Aλ1 dan Aλ2 menunjukkan absorpsi papan uji.
A’λ1 = absorpsi papan kontrol negatif pada 570 nm.
A’λ2 = absorpsi papan kontrol negatif pada 600 nm.
Uji ALP
Produksi fosfatase kapur (ALP) oleh hMSC yang dikultur dalam skafa diukur sesuai protokol produsen dalam kit [12]. Secara singkat, PBS sterilisasi (pH 7,4) digunakan untuk mencuci dan menginkubasi skafa, diikuti dengan homogenisasi dengan 1 mL buffer Tris (1 M, pH 8,0), dan sonikasi selama 3 menit pada es. 25 μL lisat kemudian diinkubasi dengan 1 mL larutan fosfat p-nitrofenil (16 mM) pada 30 °C selama 5 menit. Pengukuran spektrofotometrik dilakukan pada 405 nm untuk memantau produksi p-nitrofenol dalam kehadiran ALP.
Aktivitas ALP In Vivo
Sembilan tikus nude pria, masing-masing berat 100–120 g, diambil dan diseksi bilateral pada otot perut untuk membuat kantong. Model tikus nude digunakan untuk menunjukkan potensi osteoinduktif skafa in vivo. Salah satu dari masing-masing tiga jenis skafa (5 mm × 5 mm) dipotong dan dimasukkan ke dalam kantong otot secara terpisah. Kantong kemudian ditutup dengan jahitan yang tidak dapat terserap. Setelah 14 hari operasi, implantasi diambil dengan mencabut otot recti abdominal dan disimpan dalam PBS. Lapisan otot dicabut, dan jaringan explant diperoleh yang kemudian dihomogenkan dalam buffer ekstraksi untuk melepaskan fosfatase kapur. 50 μL alikot larutan digunakan untuk pengukuran aktivitas ALP.
Analisis Statistik
Semua eksperimen dilakukan dalam triplikasi, dan data yang disajikan diformat sebagai rata-rata ± deviasi standar (SD) dari sampel, kecuali disebutkan lain. Analisis variansi satu arah (ANOVA) dilakukan menggunakan perangkat lunak statistik Origin 6.0, untuk mengevaluasi perbedaan yang tidak pasti dan perbedaan yang signifikan. Nilai P sebesar 0,05 atau lebih rendah menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok studi.
Hasil
Morfologi Skafa
Citra SEM (Gambar 1) dari skafa yang difabrikasi mengungkapkan struktur nanosfibrous yang halus. Diameter rata-rata serat pada skafa SF dan SF+BMP2 tampak serupa, berkisar dari 100 hingga 900 nm, pada semua konsentrasi, karena diameter ditemukan sebagai fungsi dari waktu electrospinning dilakukan [13], sedangkan serat nanos SF ditemukan seragam, dan konjugasi BMP2 menyebabkan tidak seragamnya diameter serat. Ukuran pori skafa tampak homogen pada skafa yang difabrikasi dan ditemukan independen dari konsentrasi fibroin. Konsentrasi SF tidak mempengaruhi ukuran pori secara signifikan [11].
Mikrograf SEM skafa yang disiapkan. a SF. b SF+rhBMP2. c 4SF+rhBMP2
Properti Mekanikal Skafa
Kurva stres–strain skafa nanosfibrous ditunjukkan dalam Gambar 2. Terjadi bahwa penambahan BMP tidak mengubah properti mekanikal skafa SF, namun seiring kenaikan konsentrasi bahan pembuatan (SF), properti tarik matriks meningkat. Ini mungkin disebabkan oleh pembentukan ikatan inter-serat selama silang. Oleh karena itu, serat SF konsentrasi rendah tidak menunjukkan kekuatan mekanikal yang lebih baik dibandingkan yang lebih tinggi.
Hubungan stres–strain serat nanosfibrous electrospun. Hubungan stres–strain dibandingkan antara (a) SF, (b) SF+rhBMP2, dan (c) skafa 4SF+rhBMP2
Studi Pembengkakan
Rasio pembengkakan sebagai fungsi waktu untuk skafa ditunjukkan dalam Gambar 3. Skafa membengkak dengan baik seiring waktu secara merata pada awalnya dan mencapai kesetimbangan dalam sekitar 380 menit. Serat yang terhubung rhBMP2 menyerap lebih banyak air dibandingkan skafa hanya SF, yang menunjukkan peningkatan kantong hidrofilik karena asosiasi BMP2. Serat SF mencapai kesetimbangan pada sekitar 70% sedangkan serat yang mengandung BMP2 mencapai kesetimbangan pada sekitar 81% air.
Properti pembengkakan skafa yang difabrikasi. Perubahan properti pembengkakan skafa SF diamati setelah modifikasi dengan SF+rhBMP2 dan 4SF+rhBMP2
Uji Asosiasi Sel
Asosiasi sel ke skafa diperlukan untuk pertumbuhan sel dan induksi differensiasi. Dalam studi ini, kami mengamati bahwa hMSC terasosiasi baik pada skafa, dan asosiasi hMSC pada skafa 4SF-BMP2, SF-BMP2 dan SF ditunjukkan dalam Gambar 4.
Histogram yang mewakili persentase asosiasi versus waktu untuk tiga titik waktu. Perubahan tingkat asosiasi pada (a) SF, (b) SF+rhBMP2, dan (c) skafa 4SF+rhBMP2
Ada kekhawatiran tentang kehilangan asosiasi pada skafa campuran yang diatasi dengan hasil yang diamati. Campuran dengan BMP2 tidak mengurangi kapasitas asosiasi skafa. Seperti terlihat dari Gambar 3, dipahami dengan baik bahwa seiring peningkatan ukuran pori (penurunan konsentrasi SF), asosiasi sel ke skafa meningkat. ANOVA di antara ketiga formulasi secara signifikan membedakan variasi pada jam ke-3 dan ke-6. Namun, tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada jam pertama.
Uji Sitotoksisitas dan Uji Proliferasi Sel
Keberadaan sel meningkat secara signifikan pada skafa yang dikonjugasi rhBMP2, dan skafa yang dibangun tidak menciptakan efek sitotoksis pada sel tamu yang bersangkutan (Gambar 4), dan sel berkembang biak baik pada semua skafa secara relatif Gambar 5. Ada tren meningkat dalam keberadaan sel seiring bertambahnya hari, dan skafa SF+BMP2 menunjukkan toksisitas terendah pada setiap titik waktu. ANOVA menunjukkan perbedaan signifikan di antara nilai keberadaan sel dari ketiga formulasi yang bersangkutan.
Uji keberadaan sel yang ditampilkan sebagai histogram untuk empat titik waktu. Uji keberadaan sel dilakukan dengan uji MTT, dan hasil disajikan sebagai persentase relatif terhadap kontrol
Dari Gambar 6, proliferasi sel dapat diperiksa. Sel berkembang biak baik pada ketiga skafa dengan yang terbaik pada SF+BMP2 setiap titik waktu. Pori yang lebih besar pada skafa SF + BMP2 memberikan ruang maksimal untuk pertumbuhan sel. Signifikansi perbedaan di antar kelompok terbukti dengan baik dari ANOVA.
Representasi proliferasi sel sebagai persentase reduksi warna alamar blue pada empat titik waktu untuk SF, SF+BMP2, dan 4SF+BMP2
Uji ALP
Aktivitas ALP adalah penanda standar properti osteoinduktif lingkungan di sekitar sel [13]. Dalam eksperimen kami, kami mengamati aktivitas ALP yang lebih tinggi pada konstruksi SF+BMP2 dibandingkan konstruksi hanya SF (Gambar 7). Skafa nanosstruktur SF mampu menunjukkan osteoinduksi sendirian juga tetapi seperti terlihat dari Gambar 7 dan ANOVA, skafa SF+BMP2 terbukti sebagai yang terbaik di antara skafa yang bersangkutan. Konsentrasi ALP meningkat seiring berjalannya waktu eksperimen, dan konstruksi dengan konsentrasi SF yang lebih tinggi, justru menunjukkan aktivitas ALP yang lebih rendah dibandingkan konstruksi dengan konsentrasi SF yang lebih rendah.
Representasi aktivitas ALP di antara tiga strategi pembuatan skafa yang berbeda pada berbagai titik waktu. (a) SF (b) SF+rhBMP2 (c) skafa 4SF+rhBMP2
Aktivitas ALP In Vivo
Gambar 8 menggambarkan aktivitas ALP explant untuk (a) SF, (b) SF+rhBMP2, dan (c) 4SF+rhBMP2. Seperti yang diharapkan, explant dari perawatan yang mengandung rhBMP2 menginduksi aktivitas ALP yang lebih tinggi sedangkan tikus yang dirawat skafa bebas rhBMP2 menghasilkan aktivitas ALP yang lebih rendah.
Aktivitas ALP in vivo dari explant yang diperoleh setelah perawatan. Model tikus nude digunakan untuk menunjukkan potensi osteoinduktif skafa in vivo
Diskusi
Rekayasa jaringan berbasis skafa telah membuktikan potensinya dalam obat regeneratif dan telah mengalami kemajuan yang mengesankan sebagai alat untuk BTE. Studi sebelumnya telah mendirikan peran krusial mikroarkitektur dan properti fisik struktur dalam menerjemahkan konstruksi sel skafa yang dirancang in vitro menjadi jaringan tulang [14,15,16].
Properti mekanikal optimal (ukuran pori, kekuatan tarik, dll.) dan kompatibilitas biologis konstruksi adalah fitur potensial yang harus dipertimbangkan untuk kolonisasi dan organisasi sel [17]. Pekerjaan yang disajikan menggambarkan pembuatan dan karakterisasi skafa untuk rekayasa jaringan tulang menggunakan kombinasi properti manfaat dari bahan yang diusulkan untuk tujuan yang sama. Sementara SF memberikan platform yang kuat dan kompatibel biologis, rhBMP2 yang tersemat menginduksi pembentukan osteosit baru. SF sedang diteliti secara ekstensif oleh beberapa kelompok dalam berbagai formulasi untuk proliferasi sel osteoblastik [18] dan regenerasi jaringan termasuk ligament, tendon, kartilase, tulang, hati, kulit, trakea, kornea, saraf, telinga tengah, dan kandang kemih [19, 20].
Kami telah menggunakan larutan akuosa SF dan SF+rBMP2 untuk studi kami karena larutan akuosa dipilih dibandingkan pelarut organik untuk persiapan larutan SF karena degradasi SF tidak menguntungkan dalam larutan organik [18]. Serat SF electrospun sebelumnya dilaporkan memiliki struktur serat homogen dengan diameter seragam, dan jaringannya sangat berpori dengan pori yang saling terhubung dan bersilang yang sesuai dengan studi kami juga [21, 22]. Tidak ada pengamatan pembentukan struktur seperti manik pada serat SF pada skafa kami dan yang telah dilaporkan sebelumnya [21]. Diameter serat SF murni sebelumnya dilaporkan berkurang seiring kenaikan campuran [11, 21]; namun, kami tidak mengamati kehilangan diameter karena campuran. Namun, keseragaman serat terganggu pada serat campuran kemungkinan karena asosiasi rBMP2 yang tidak merata pada serat SF.
Kekuatan mekanikal yang cukup adalah properti yang penting untuk skafa jaringan. Campuran SF murni meningkatkan fleksibilitas nanofibre dalam eksperimen kami, dan laporan sebelumnya juga mengungkapkan tren yang sama dalam peningkatan properti mekanikal setelah campuran SF dengan bahan lain untuk menghasilkan bahan biomatrik campuran yang dapat digunakan [21, 23]. Jadi, skafa yang kami buat memiliki kekuatan mekanikal dan fleksibilitas yang diperlukan yang dibutuhkan dalam aplikasi rekayasa jaringan.
Skafa untuk rekayasa jaringan harus dapat melampirkan sel di atasnya, harus memfasilitasi proliferasi sel dan osteoinduksi dan harus paling sedikit sitotoksis untuk penerimaan yang lebih baik. Laporan sebelumnya tentang skafa SF telah mendirikan aktivitas non-sitotoksis dan proliferatif sel [21, 24], dan studi kami sesuai dengan hasil yang telah dilaporkan sebelumnya.
Karena properti osteoinduktifnya, rhBMP2 digunakan dalam rekayasa jaringan tulang oleh beberapa kelompok [25,26,27]. Studi ini telah mengungkapkan bahwa sel yang dikultur di atas skafa yang mengandung BMP2 memiliki aktivitas ALP yang lebih tinggi, biomarker osteoinduksi. Efek asosiasi BMP2 lebih kontras seiring bertambahnya waktu inkubasi. Kim et al. menggunakan mikrosfer pori yang dikaitkan BMP2 dan mengamati peningkatan osteoinduksi yang serupa [25].
Kesimpulan
Kami berhasil membuat skafa fibrous berbasis SF yang mengandung rhBMP2. Skafa ini homogen dan ditemukan memiliki properti mekanikal yang memadai dan kompatibilitas biologis. Asosiasi rhBMP2 yang lebih lanjut berkontribusi pada potensi osteoinduktif skafa yang difabrikasi. Skafa kemudian dievaluasi untuk aplikasi in vivo dan ditemukan cocok untuk aplikasi yang melibatkan rekayasa jaringan tulang.
