Nanorods Emas Modifikasi Silika Terkonjugasi Antibodi untuk Diagnosis dan Terapi Foto-Termal Cryptococcus neoformans:Eksperimen In Vitro
Abstrak
Latar Belakang
Cryptococcus neoformans adalah ragi yang dienkapsulasi. Masih ada sedikit solusi cepat dan efektif untuk diagnosis atau pengobatan C. neoforman infeksi pada tahap awal secara klinis. Nanorod emas termodifikasi silika terkonjugasi antibodi (GNR-SiO2 -Ab) dapat mengkonjugasikan C. neoforman selektif. Ini dapat memberikan kemungkinan untuk pengobatan kriptokokosis dengan aman dan efektif.
Metode
Nanorods emas (GNRs) disintesis sesuai dengan protokol bantuan template yang dimediasi benih. Anti-C. neoforman antibodi secara kovalen berlabuh pada permukaan GNR dengan agen kopling silan. Pencitraan tomografi komputer in vitro dilakukan untuk mengeksplorasi efek diagnostik GNR-SiO2 -Ab. Kelangsungan hidup sel dievaluasi untuk mengkonfirmasi efek terapi fototermal GNR-SiO2 -Ab dikombinasikan dengan sinar laser inframerah-dekat (NIR).
Hasil
GNR-SiO2 -Ab memiliki aplikasi potensial sebagai agen kontras pencitraan sinar-X/CT positif. Antibodi dapat menginduksi agregasi GNR yang jauh lebih besar dengan mengikat permukaan C. neoforman sel menghasilkan nilai atenuasi yang jauh lebih tinggi dari sebelumnya. Setelah penyinaran, C. neoforman sel mengalami kerusakan foto-termal dan struktur normal sel dihancurkan. Kelangsungan hidup sel berkurang secara signifikan dibandingkan dengan sel yang tidak diobati.
Kesimpulan
Pekerjaan kami mengkonfirmasi bahwa nanorod emas termodifikasi silika terkonjugasi antibodi dapat meningkatkan redaman sinar-X C. neoforman sel dalam gambar CT. Dan GNR imun, yang dimediasi oleh antibodi, dapat meningkatkan efek terapi fototermal yang diinduksi NIR pada C. neoforman sel.
Latar Belakang
Cryptococcus neoformans adalah ragi enkapsulasi, yang pertama kali dijelaskan oleh Busse pada tahun 1894 [1]. Infeksi ragi berkapsul Cryptococcus neoformans dapat mengakibatkan kolonisasi yang tidak berbahaya pada saluran udara, tetapi juga dapat menyebabkan meningitis atau penyakit diseminata [2], terutama pada orang dengan imunitas yang diperantarai sel yang rusak. Cryptococcosis merupakan infeksi jamur utama yang mengancam jiwa pada pasien dengan infeksi HIV berat dan juga dapat mempersulit transplantasi organ, keganasan retikuloendotelial, pengobatan kortikosteroid, atau sarkoidosis [3]. Meningitis kriptokokus yang terkait dengan infeksi HIV bertanggung jawab atas lebih dari 600.000 kematian per tahun di seluruh dunia [4]. Meningitis kriptokokus dan penyakit diseminata selalu berakibat fatal. Pada tahun 1995, Speed dan Dunt melaporkan angka kematian 14% di antara pasien dengan penyakit kriptokokus yang diobati dengan amfoterisin B plus flusitosin [5]. Pemeriksaan pada pasien dengan dugaan kriptokokosis tergantung pada kultur jamur. Namun, masih ada sedikit solusi cepat dan efektif untuk diagnosis atau pengobatan C. neoforman infeksi pada tahap awal. Selain itu, sebagian besar pasien dengan infeksi Cryptococcal gagal menerima perawatan yang tepat, mengakibatkan tingkat kematian yang tinggi.
Di antara semua teknik pencitraan, X-ray computed tomography (CT) adalah salah satu alat diagnostik yang paling berguna di rumah sakit dalam hal ketersediaan, efisiensi, dan biaya [6]. CT mampu mengidentifikasi pola anatomi dan memberikan informasi anatomi pelengkap termasuk lokasi tumor, ukuran, dan penyebaran pada kontras endogen [7]. Salah satu manifestasi umum dari kriptokokosis paru adalah adanya nodul atau massa soliter atau multipel, kavitasi, atau kelainan parenkim. Manifestasi ini jelas terdeteksi oleh computerized tomography (CT) imaging [8]. Menggunakan pencitraan radiografi, fitur berikut Meningitis kriptokokus biasanya disajikan:ruang Virchow-Robin yang melebar, peningkatan meningeal, fisura koroid yang menonjol, dan kista parahippocampal [9]. Namun, kriptokokosis dini tidak dapat dideteksi dengan pencitraan radiologis. Artinya, kita tidak bisa melakukan pengobatan yang cepat pada tahap awal. Baru-baru ini, kemajuan dalam mengontrol bentuk/morfologi permukaan nanomaterial emas telah menunjukkan kemampuan hebat untuk merekayasa resonansi plasmon permukaan lokalnya [10, 11]. Di sini, kami menyelidiki sejenis bahan emas berskala nano yang disebut gold nanorods (GNRs), yang secara selektif dapat bergabung dengan jamur. Dalam pencitraan CT klinis, senyawa iodinasi adalah media kontras yang paling umum digunakan. Namun, nomor atom dan kerapatan elektron emas jauh lebih tinggi daripada yodium. Emas dapat menginduksi redaman sinar-X yang kuat, yang menjadikannya kandidat ideal untuk agen kontras CT [7]. Dengan mengkonjugasikan GNR dengan antibodi spesifik, para ilmuwan berpotensi menargetkan dan menangkap gambar dari jaringan dan patogen tertentu [12].
Amfoterisin B adalah agen terapi utama untuk pengobatan penyakit kriptokokus, yang telah digunakan sejak akhir 1960-an [13]. Namun, kemanjuran klinis amfoterisin B terbatas, dan menunjukkan nefrotoksisitas yang signifikan [14]. Kemanjuran obat ini dikompromikan oleh toksisitas, resistensi obat, atau rentang aktivitas yang tidak memadai [15, 16]. Jadi, metode terapi selektif baru untuk penyakit kriptokokus perlu dirancang. Baru-baru ini, perawatan fototermal banyak digunakan untuk menargetkan dan menghancurkan sel kanker, virus, dan bakteri [17,18,19]. Dibandingkan dengan rezim terapi tradisional, mekanisme agen terapeutik semacam itu sangat berbeda. Sinar laser inframerah-dekat (NIR) adalah metode perawatan foto-termal yang ideal, yang dapat diserap secara khusus oleh jaringan atau bahan. Cahaya dapat menembus secara efektif melalui jaringan yang menyertai kerusakan minimal pada jaringan normal [20]. GNR menyerap cahaya di wilayah NIR (650–900 nm), dan energi cahaya yang diserap dapat diubah menjadi energi panas. Berdasarkan prinsip ini, ini adalah metode yang ideal untuk menggabungkan sinar laser NIR dengan GNR untuk perawatan. Dibandingkan dengan fotosensitizer klasik, GNR memiliki beberapa keunggulan:penampang serapan tinggi, kelarutan tinggi, kompatibilitas biologis yang sangat baik, hipotoksisitas, stabilitas cahaya yang baik, dan konjugasi yang mudah dengan molekul target [21]. Beberapa laporan telah menjelaskan bagaimana GNR digunakan untuk perawatan foto-termal [22,23,24]. Carpin melakukan percobaan pada sel kanker payudara, yang mengekspresikan gen HER2 secara berlebihan dan diinkubasi dengan nanoshell silika-emas terkonjugasi anti-HER2. Selanjutnya kompleks tersebut diradiasi dengan radiasi NIR 808 nm. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, sel-sel dihancurkan [17]. Wang melaporkan bahwa GNR terkonjugasi antibodi dapat memilih target dan menghancurkan Salmonella patogen bakteri bila terkena radiasi NIR. Ada penurunan yang sangat signifikan pada Salmonella viabilitas sel [19].
Di sini, kami menggunakan nanorod emas termodifikasi silika terkonjugasi antibodi untuk secara khusus mengikat C. neoforman sel. Selanjutnya, sel-sel yang mengikat kompleks dapat dengan mudah dibedakan dalam gambar CT. Nanopartikel emas ini diasosiasikan dengan C. neoforman sel melalui konjugasi imun, dan lisis fototermal menyebabkan penurunan yang signifikan dalam viabilitas sel. Studi kami mengkonfirmasi pilihan baru untuk diagnosis dan terapi foto-termal C. neoforman in vitro dan memberikan kemungkinan untuk pengobatan kriptokokosis dengan aman dan efektif.
Metode
Materi
Anti-C. neoforman antibodi dibeli dari Meridian Life Science (Memphis, TN, USA). Asam kloroaurat (HAuCl4 ·3H2 O) diperoleh dari Sigma (St. Louis, MO, USA). Perak nitrat (AgNO3 ), tetraethylorthosilicate (TEOS), 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTS), setiltrimetil amonium bromida (CTAB), natrium borohidrida (NaBH4 ), 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil)-karbodiimida (EDC), poli(natrium-4-stirenasulfonat) (PSS), dan asam askorbat diperoleh dari J &K Chemical Limited (Cina). Semua bahan kimia di atas digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Air deionisasi (kelas Millipore Milli-Q) dengan resistivitas 18,2 MΩ cm digunakan di semua preparasi.
Sintesis Nanorod Emas Termodifikasi Silika Terkonjugasi Antibodi
Dalam percobaan yang khas, GNR disintesis menurut protokol bantuan template yang dimediasi benih [25,26,27]. Jalur sintetis untuk membuat nanorod emas termodifikasi silika terkonjugasi antibodi (GNR-SiO2 -Ab) diilustrasikan pada Gambar. 1. Dua puluh lima mililiter larutan GNR disentrifugasi pada 12000 rpm selama 15 menit. Supernatan, yang sebagian besar mengandung molekul CTAB, dibuang, dan endapan disuspensikan kembali dalam 20 mL etanol anhidrat yang disesuaikan dengan pH 10 dengan 20 μL amonia 28%. Setelah sistem disonikasi, TEOS 5 mL (10 mM) ditambahkan dan kemudian seluruh sistem diaduk dengan kuat selama 24 jam. GNR berlapis silika dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 4000 rpm selama 30 menit dan dicuci tiga kali dengan air dan dua kali dengan etanol. GNR-SiO murni yang diperoleh2 sampel didispersikan kembali ke dalam 10 mL etanol untuk percobaan lebih lanjut [28]. Selanjutnya, 10 mL APTS ditambahkan untuk membentuk larutan campuran dan dibiarkan bereaksi di bawah refluks pada 60 °C selama 1 jam. Resultan dicuci dengan air deionisasi selama lima kali dan dikeringkan pada suhu 60 °C selama 3 jam dalam oven vakum untuk mendapatkan GNR-SiO2 -NH2 . Hasilnya selanjutnya dilapisi dengan polimer (PSS) dengan teknik lapis demi lapis yang menyediakan gugus amina yang dapat diakses oleh pelarut [29]. Nanorod yang diakhiri amina ini dibiarkan bereaksi dengan asam karboksilat dari antibodi murni selama 12-16 jam dengan adanya EDC, karbodiimida yang larut dalam air yang mendorong pembentukan ikatan amida antara asam karboksilat dan amina primer [30]. Setelah inkubasi, kompleks nanorod-antibodi dimurnikan dengan sentrifugasi dan disuspensikan kembali dalam PBS [31].
Prosedur sintetis GNR-SiO2 -Ab
Karakterisasi GNR-SiO2 -Ab
Ukuran dan morfologi GNR dan GNR-SiO2 -Ab dikarakterisasi menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM; Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA), yang beroperasi pada tegangan akselerasi 120 kV [20]. Spektrum UV-vis diukur pada 20 °C dengan spektrofotometer UV-tampak (Shimadzu UV-2450, Shimadzu, Jepang) yang dilengkapi dengan sel kuarsa 10 mm, dengan panjang jalur cahaya 1 cm. Panjang gelombang 200 hingga 1000 nm dipindai, karena mencakup puncak absorbansi GNR, anti-C. neoforman antibodi, dan GNR-SiO2 -Ab. GNR-SiO2 -Ab diinkubasi pada suhu 4°C selama 2 dan 4 minggu. Panjang gelombang 200 hingga 1000 nm dipindai pada dua titik waktu.
Unit Hounsfield dari GNR-SiO2 -Ab Pengukuran
Larutan encer GNR-SiO2 -Ab dengan konsentrasi berbeda dalam kisaran 0,04–4 mg/mL terdeteksi langsung menggunakan pemindai CT Philips Brilliance 64 (Philips Healthcare, Best, The Netherlands). Nilai redaman diperoleh dari perangkat lunak pencitraan CT.
Lampiran C. neoforman ke GNR-SiO2 -Ab
C.neoformans strain H99 tipe A diperoleh dari Shanghai Key Laboratory of Molecular Medical Mycology (Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, China). Jamur diizinkan untuk diinkubasi dengan GNR dan kompleks antibodi-nanorod selama 1 jam sebelum persiapan analisis TEM. Gambar dikumpulkan pada instrumen TEM (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA) yang beroperasi pada tegangan akselerasi 120 kV.
Pemindaian CT In Vitro Kompleks Fungus-Antibody-Nanorod
Bahan dan jamur dibagi menjadi tiga kelompok, yang meliputi kelompok jamur (N), GPR-SiO2 -Grup Ab (G), dan GPR-SiO2 -Ab-terlampir C. neoforman grup (G+N). Konsentrasi GNR-SiO2 -Ab larutan di atas adalah 4 mg/mL. Untuk pencitraan CT in vitro, larutan dari ketiga kelompok disiapkan dalam tabung Ep steril 1,5 mL. Semua CT scan dilakukan menggunakan sistem CT di atas.
Efek Terapi Foto-Termal In Vitro
C. neoforman sel diinkubasi dengan dan tanpa GNR-SiO2 -Ab disinari dengan laser NIR (LWIRL 808, Laserwave Ltd., China) selama 5 menit, dengan panjang gelombang 808 nm dan intensitas 30 mW (4 W/cm
2
). Gambar dikumpulkan pada instrumen TEM (Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA) yang beroperasi pada tegangan akselerasi 120 kV. Setelah penyinaran, sel diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C dalam gelap. C. neoforman sel diinkubasi dengan dan tanpa GNR-SiO2 -Ab dirancang sebagai kelompok kontrol. Viabilitas sel ditentukan dengan melakukan uji viabilitas sel luminescent CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, WI, USA) sesuai dengan instruksi pabrik [28]. Uji viabilitas sel khusus ini adalah metode homogen, yang dapat menentukan jumlah sel yang layak. Reaksi yang dikatalisis luciferase antara luciferin dan ATP digunakan untuk sintesis sel-sel yang aktif secara metabolik. Semua eksperimen diulang enam kali, dan nilai rata-ratanya ditentukan.
Analisis Statistik
Semua analisis dilakukan dengan menggunakan SPSS versi 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Data dinyatakan sebagai mean ± SD. P nilai kurang dari 0,05 diambil untuk menunjukkan signifikansi statistik. Semua angka yang ditampilkan dalam artikel ini diperoleh dari lebih dari tiga eksperimen independen dengan hasil serupa.
Hasil
Sintesis dan Karakterisasi GNR-SiO2 -Ab
Sebuah metode untuk GNR berlapis silika dengan TEOS sebagai sumber silika dan APTS sebagai bahan penghubung telah dilaporkan sebelumnya [30]. Bentuk atau ukuran GPR tidak berubah ketika dikonjugasikan dengan anti-C. neoforman . Gambar 2 menunjukkan gambar TEM dari GNR-SiO2 -Ab. Nanopartikel ini memiliki lebar 18,48 ± 2,39 nm dan panjang 57,56 ± 4,57 nm.
a , b Gambar TEM dari GNR-SiO2 -Ab. Nanorods menyajikan penampilan seperti batang. Bentuk atau ukuran GPR tidak berubah ketika dikonjugasikan dengan anti-C. neoforman
Sifat Spektroskopi dan Stabilitas GNR-SiO2 -Ab
Mengenai properti foto-fisik GNR-SiO2 -Ab, Gbr. 3 menunjukkan spektrum absorbansi GNR-SiO2 , GNR-SiO2 -Ab, dan anti-C. neoforman antibodi. Spektrum GNR-SiO2 menunjukkan bahwa GNR-SiO2 memiliki dua pita serapan, panjang gelombang resonansi plasmon permukaan melintang lemah (TSPRW) sekitar 520 nm dan panjang gelombang resonansi plasmon permukaan memanjang (LSPRW) yang kuat sekitar 808 nm. Setelah terkonjugasi dengan antibodi, TSPRW dan LSPRW dari GNR-SiO2 -Ab masing-masing adalah 540 dan 835 nm. Dalam perbandingan antara spektrum antibodi dan GNR-SiO2-Ab, keduanya memiliki puncak khusus yang sama di sekitar 280 nm. Hasil ini membuktikan bahwa anti-C. neoforman antibodi berhasil terkonjugasi dengan GNR-SiO2 . Setelah diinkubasi pada suhu 4 °C selama 2 minggu, TSPRW dan LSPRW GNR-SiO2 -Ab masing-masing adalah 540 dan 835 nm. Dan data yang sama diamati pada 4 minggu. TSPRW dan LSPRW dari GNR-SiO2 -Ab tidak berubah setelah diinkubasi selama 4 minggu. Ini mengkonfirmasi stabilitas GNR-SiO2 -Ab.
Spektrum serapan:GNR+SiO2 +Ab (A), GNR+SiO2 (B), dan anti-C. neoforman antibodi (C). GNR-SiO2 memiliki dua pita serapan, panjang gelombang resonansi plasmon permukaan melintang lemah (TSPRW) sekitar 520 nm dan panjang gelombang resonansi plasmon permukaan memanjang (LSPRW) yang kuat sekitar 808 nm. Setelah terkonjugasi dengan antibodi, TSPRW dan LSPRW dari GNR-SiO2 -Ab masing-masing adalah 540 dan 835 nm
Unit Hounsfield dari GNR-SiO2 -Ab Pengukuran
Satuan Hounsfield (Hu) dari GNR-SiO2 -Ab seperti yang dievaluasi oleh CT klinis. Gambar 4 menampilkan gambar CT dalam kisaran 0,04–4 mg/mL GNR-SiO2 -Ab. Sebagai konsentrasi GNR-SiO2 -Ab meningkat, intensitas sinyal CT terus meningkat. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, Hu sebagai fungsi GNR-SiO2 -Konsentrasi Ab menunjukkan hubungan linier yang berkorelasi baik (R
2
= 0.9903), dijelaskan oleh persamaan tipikal berikut:y = 12,52x + 11.971. Hasil ini menunjukkan bahwa GNR-SiO2 -Ab memiliki aplikasi potensial sebagai agen kontras pencitraan sinar-X/CT positif.
Unit Hounsfield dari GNR-SiO2 -Ab. a Gambar CT in vitro dari GNR-SiO2 -Ab ditangguhkan di PBS. Konsentrasi (mg/mL) di setiap sampel disediakan di bagian atas gambar masing-masing. b Plot redaman CT GNR-SiO2 -Ab pada berbagai konsentrasi dalam kisaran 0,04 hingga 4 mg/mL
Lampiran C. neoforman Sel ke GNR-SiO2 -Ab
Gambar TEM menunjukkan fitur morfologi C. neoforman sel dan kompleks jamur-antibodi-nanorod. Sel-sel ini memiliki diameter mulai dari 2 hingga 20 m. Gambar 5a menampilkan gambar TEM dari C. neoforman sel yang dikelilingi oleh kapsul polisakarida. Sel-sel ini berdiameter 4–6 m tanpa mengikat struktur apa pun. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b, C. neoforman sel ditutupi oleh banyak GNR-SiO2 -Ab, setelah inkubasi dengan kompleks antibodi-nanorod. Kami menginkubasi sel jamur dengan GNR-SiO2 untuk mengeksplorasi apakah GNR-SiO2 dilampirkan ke C. neoforman. Hasil kami menunjukkan bahwa GNR-SiO2 tersebar seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5c. Studi kami menunjukkan bahwa C. neoforman sel dapat berkonjugasi dengan GNR-SiO2 -Ab selektif.
Gambar TEM menggambarkan interaksi antara GNR-SiO2 -Ab dan C. neoforman sel. a Gambar TEM dari C. neoforman sel. b Gambar TEM kompleks jamur-antibodi-nanorod. c Gambar TEM dari C. neoforman sel diinkubasi dengan GNR-SiO2
Pemindaian CT In Vitro Kompleks Fungus-Antibody-Nanorod
Kami melakukan analisis kuantitatif intensitas sinyal CT melalui program tampilan standar pabrikan (portal Philips, Philips Healthcare, Best, The Netherlands). Gambar 6 menggambarkan nilai redaman sinar-X dari ketiga grup. Nilai kelompok G+N secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok G dan N. Selanjutnya, nilai redaman sinar-X dari kelompok G secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok N. Hasil ini sesuai dengan temuan literatur sebelumnya [31].
a , b Pemindaian CT in vitro dari kelompok yang berbeda. Nilai kelompok G+N secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok G dan N. Selanjutnya, nilai redaman sinar-X dari kelompok G secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok N
Efek In Vitro dari Terapi Foto-Termal
Kami mengevaluasi viabilitas sel dengan melakukan uji viabilitas sel dalam instrumen CellTiter-Glo®luminescent. Sel tanpa penyinaran memiliki viabilitas yang lebih besar daripada sel yang diiradiasi NIR (P < 0,05). Selain itu, viabilitas jamur lebih tinggi daripada sel yang digabungkan dengan GNR-SiO2 -Ab setelah penyinaran NIR (P < 0,05). Selain itu, sel memiliki viabilitas yang lebih tinggi daripada kompleks jamur-antibodi-nanorod (P < 0,05). Gambar 7 dengan jelas menggambarkan variasi dalam kelangsungan hidup C. neoforman sel dengan perlakuan yang berbeda. Setelah penyinaran, C. neoforman sel mengalami kerusakan foto-termal dan struktur normal sel dihancurkan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8, sel-sel menunjukkan penampilan atrofi, ireguler, dan kolaps. Kapsul polisakarida yang khas rusak.
Viabilitas sel yang diperlakukan berbeda. Sel tanpa penyinaran memiliki viabilitas yang lebih besar daripada sel yang diiradiasi NIR (P < 0,05). Selain itu, viabilitas jamur lebih tinggi daripada sel yang digabungkan dengan GNR-SiO2 -Ab setelah penyinaran NIR (P < 0,05). Selain itu, sel memiliki viabilitas yang lebih tinggi daripada kompleks jamur-antibodi-nanorod (P < 0,05)
a , b Gambar TEM menunjukkan kerusakan foto-termal C. neoforman sel yang digabungkan dengan GNR-SiO2 -Ab. Sel-sel menunjukkan penampilan atrofi, ireguler, dan kolaps. Kapsul polisakarida yang khas rusak
Diskusi
Silika memiliki banyak keunggulan dibandingkan polimer [32]. Proses persiapan yang terlibat cukup lancar, dan ketebalan cangkang silika dapat diubah ke ukuran dan porositas yang diinginkan. Selain itu, silika sangat stabil dan memiliki biokompatibilitas, tidak mengalami pembengkakan atau perubahan porositas dengan perubahan pH, dan tidak rentan terhadap serangan mikroba. Selain itu, silika memiliki kemudahan modifikasi permukaan dengan berbagai gugus fungsi menggunakan kimia silan dan reagen organosilikon yang tersedia secara komersial untuk biotargeting. GNR berlapis silika mempertahankan sifat optik superior GNR dan dapat meningkatkan stabilitas termalnya di bawah iradiasi energi tinggi. Dalam penelitian kami, setelah dilapisi dengan silika dan dikonjugasi dengan anti-C. neoforman antibodi, GNR keduanya menunjukkan pergeseran merah di puncak resonansi plasmon permukaan, karena peningkatan indeks bias media sekitarnya [32, 33]. Hasil juga menunjukkan bahwa ukuran sampel menjadi lebih besar dan lebih besar setelah modifikasi dan konjugasi. Data ini menunjukkan bahwa kami berhasil mengkonjugasikan nanopartikel emas dengan anti-C. neoforman antibodi. Namun, kami tidak dapat mengesampingkan kemungkinan bahwa GNR-SiO2 luka memiliki kekuatan khusus untuk mengkonjugasikan sel setelah berikatan dengan antibodi, dan kami akan melakukan penelitian lebih lanjut di masa mendatang. Dalam studi ini, kami berhasil melampirkan GNR-SiO2 -Ab ke kapsul sel melalui reaksi antigen-antibodi sederhana. Selain itu, kami berhasil memastikan bahwa kompleks kami menargetkan antigen pada kapsul sel.
GNR telah mendapatkan perhatian luas selama dekade terakhir. Hainfeld dkk. [34] pertama kali melaporkan bahwa GNR dapat digunakan sebagai agen kontras sinar-X. GNR memberikan beberapa keuntungan dibandingkan molekul iodinasi, agen kontras bersyarat. Karena nomor atom dan kerapatan elektron yang tinggi, GNR menunjukkan koefisien redaman sinar-X yang relatif tinggi. Nomor atom dan kerapatan elektron emas (79 dan 19,32 g/cm
3
, masing-masing) lebih tinggi daripada yodium (53 dan 4,9 g/cm
3
) [7]. Yodium sebagai zat kontras sinar-X memiliki banyak efek samping yang serius, seperti nefrotoksisitas dan reaksi alergi yang parah. Namun, GNR bertahan di tubuh lebih lama daripada agen kontras yodium, yang berarti ada cukup waktu untuk mengamati gambar. Selanjutnya, GNR dapat menargetkan sel kanker, virus, dan bakteri, melalui fungsionalisasi permukaan dengan berbagai molekul, seperti peptida atau antibodi. Reuveni dkk. [31] telah menunjukkan bahwa beberapa jenis molekul yang berbeda dapat melekat pada permukaan GNR. Pada penelitian ini intensitas sinyal CT terus meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi GNR-SiO2 -Ab, menghasilkan gambar yang lebih cerah. GNR-SiO2 -Ab menunjukkan potensi positif yang signifikan sebagai agen kontras pencitraan sinar-X/CT, serta GNR. Penyerapan sinar-X dari nanorod emas tetap tidak terpengaruh, bahkan dengan modifikasi permukaan. Data ini menunjukkan bahwa sifat redaman sinar-X dari GNR-SiO2 -Ab tidak berubah secara signifikan sebagai akibat dari modifikasi permukaan. Ini sependapat dengan temuan yang dilaporkan dalam literatur sebelumnya [35,36,37]. Fungsionalisasi permukaan adalah alat yang ampuh yang memungkinkan penargetan pasif atau aktif GNR ke situs tertentu yang diminati. Dalam penelitian kami, kami berhasil melampirkan GNR-SiO2 -Ab ke kapsul C. neoforman . Selain itu, kami menentukan apakah partikel terkonjugasi antibodi ini dapat digunakan sebagai nanoprobe saat melakukan pencitraan CT target C. neoforman sel secara invitro. Kami mengamati bahwa gambar CT dari C. neoforman sel yang tersebar di PBS tampak sangat mirip dengan gambar yang berasal dari C. neoforman sel terdispersi dalam air. Namun, sulit untuk membedakan gambar jamur dari jaringan lunak. Antibodi dapat menginduksi agregasi GNR yang jauh lebih besar dengan mengikat permukaan C. neoforman sel menghasilkan nilai atenuasi yang jauh lebih tinggi dari sebelumnya. Dengan demikian, kita dapat berhasil mencapai pelemahan sinar-X yang dapat dibedakan dari jamur. Berdasarkan hasil kami, deteksi C. neoforman oleh pencitraan CT dapat dicapai dan membawa peluang baru dalam diagnostik.
GNR telah banyak digunakan untuk terapi foto-termal tumor [22, 38, 39]. Studi kami menunjukkan bahwa GNR-SiO2 -Ab bisa menjadi alat selektif untuk menghancurkan C. neoforman sel. Hasil kami menegaskan bahwa membran sel C. neoforman sel mengalami kerusakan yang tidak dapat diperbaiki dan parah setelah disinari oleh NIR. Selain itu, kelangsungan hidup sel berkurang secara signifikan dibandingkan dengan sel yang tidak diobati. Hasil ini menunjukkan bahwa radiasi NIR saja menyebabkan kematian C. neoforman sel. Namun, kelangsungan hidup sel yang diinkubasi dengan GNR-SiO2 -Ab juga mengalami depresi. Dalam sel yang diinkubasi dengan GNR-SiO2 -Ab dan dikenakan iradiasi NIR, viabilitas sel berkurang secara signifikan dibandingkan dengan kelompok lain. Kami memastikan bahwa GNR-SiO2 -Ab terkonjugasi dengan jamur secara selektif dan meningkatkan efek radiasi NIR. GNR-SiO2 -Ab memiliki kemampuan efek terapi foto-termal selektif pada C. neoforman sel. Mekanisme efeknya belum pernah dilaporkan sebelumnya. Kami berspekulasi bahwa gangguan pada membran sel mungkin disebabkan oleh kematian sel yang diinduksi iradiasi. Norman dkk. [18] melaporkan bahwa kelangsungan hidup Pseudomonas aeruginosa berkurang secara signifikan ketika spesies ini terkena iradiasi dan diikat dengan nanorods emas, yang secara kovalen terkonjugasi dengan antibodi spesifik. Sel-sel ini juga menunjukkan area membran sel yang rusak parah dengan kerusakan yang tidak dapat diperbaiki, yang disebabkan oleh paparan iradiasi NIR. Ketika nanopartikel terkena radiasi NIR, membran sel rusak karena beberapa faktor, termasuk ledakan nanopartikel, gelombang kejut, pembentukan gelembung, dan disintegrasi termal [40].
Dalam penelitian ini, kematian atau penurunan aktivitas C. neoforman sel terjadi ketika membran sel hancur dan dihancurkan oleh energi panas. Namun, penelitian lebih lanjut harus dilakukan untuk mengkonfirmasi hipotesis ini. C. neoforman sel-sel rusak oleh faktor-faktor berikut:peningkatan suhu lokal, ledakan nanopartikel, gelombang kejut, pembentukan gelembung, dan disintegrasi termal yang disebabkan oleh radiasi NIR. Khususnya, C. neoforman sel secara substansial rusak ketika hanya terkena radiasi NIR. Ada dua kemungkinan alasan untuk menjelaskan cara menargetkan GNR-SiO2 -Ab merangsang radiasi NIR dengan menimbulkan penghancuran foto-termal C. neoforman sel. Satu kemungkinan adalah bahwa dalam kapsul C. neoforman sel, GNR-SiO yang ditargetkan2 -Ab menginduksi peningkatan suhu lokal. Kemungkinan kedua adalah karena reaksi antigen-antibodi antara GNR-SiO2 -Ab dan kapsul C. neoforman sel, terjadi perubahan struktur pada dinding sel dan kapsul. Karena perubahan tersebut, sel akan lebih sensitif terhadap pengobatan foto-termal [41]. Penelitian sebelumnya telah mengkonfirmasi toksisitas rendah dari nanorod emas [22, 42, 43], dan penelitian lebih lanjut akan diperlukan untuk menyelidiki efek terapi foto-termal in vivo. Yang paling disesalkan dari penelitian kami adalah kami tidak membahas kapasitas pemuatan GNR-SiO2 -Ab. Studi lebih lanjut akan berkonsentrasi pada hubungan antara kapasitas pemuatan GNR-SiO2 -Ab dan efek foto-termal.
Kesimpulan
Kami berhasil membuat GNR-SiO2 -Ab, yang ditargetkan ke C. neoforman sel. Nanorod emas terkonjugasi antibodi spesifik ini meningkatkan redaman sinar-X C. neoforman sel dalam gambar CT. Hasil kami menunjukkan bahwa GNR imun, yang dimediasi oleh antibodi, meningkatkan efek terapi fototermal yang diinduksi NIR pada C. neoforman sel. Selanjutnya, GNR-SiO2 -Ab memungkinkan manipulasi yang mudah dan prosedur invasif minimal dalam diagnosis dan pengobatan C. neoforman infeksi, dengan fokus pada aplikasi klinis potensial dari pendekatan ini.
