Satu Langkah, Sintesis Cepat dan Hijau dari Nanopartikel Emas Multifungsi untuk Pencitraan dan Terapi Target Tumor

Hasil dan Diskusi

Sintesis dan Karakterisasi DOX-GNP, NLS-GNP, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP

Dalam sintesis DOX-GNPs, ketika larutan NaOH ditambahkan ke dalam larutan campuran DOX dan larutan asam kloroaurat, warna larutan segera berubah dari oranye menjadi ungu dangkal, kemudian menjadi merah anggur pada suhu 100 °C dalam sistem refluks di bawah pengadukan magnetik dalam satu menit, menunjukkan pembentukan DOX-GNP. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kemampuan reduksi DOX sangat kuat karena DOX memiliki dua gugus hidroksil fenolik (karbon No. 6 dan No. 11) dengan kemampuan reduksi yang kuat dalam kondisi basa. Reaksi dilanjutkan selama 30 menit sampai warna tidak berubah.

Untuk menghindari kebingungan warna merah oranye DOX dan warna merah anggur GNP, kami mengajukan lebih banyak bukti dengan mengkarakterisasi spektrum penyerapan UV mereka (seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a). DOX memiliki puncak penyerapan karakteristik dekat 485 nm dan puncak pada 530 nm; namun, puncak pada 480 nm menghilang dalam spektrum larutan produk dan puncak karakteristik pada puncak penyerapan resonansi plasmon permukaan (SPR) karakteristik 520 nm dari GNP muncul. Meski begitu, pembentukan GNP masih belum sepenuhnya ditentukan antara 520 nm GNP dan 530 nm puncak DOX. Dengan mempertimbangkan bahwa GNP akan diendapkan dengan sentrifugasi berkecepatan tinggi, dan molekul DOX tidak, kita dapat melihat endapan ungu pada produk bagian bawah tabung sentrifugasi (inset dari Gambar 1a(3-4)) dan DOX melakukannya tidak memiliki keduanya (sisipan Gambar 1a (1-2)).

a Spektrum serapan UV-Visible DOX dan DOX–GNP yang disiapkan, inset dari (a ) adalah gambar DOX (1, ​​2) dan DOX-GNP (3, 4) sebelum (1, 3) dan setelah sentrifugasi (2, 4). b Gambar TEM dari DOX-GNP. c Spektrum FTIR DOX dan DOX-GNP yang disiapkan. d Spektrum XPS DOX–GNP

DOX memiliki fluoresensi merah di bawah penyinaran sinar ultraviolet 365 nm; namun, fluoresensi DOX menghilang setelah sintesis GNP. Ada dua kemungkinan alasan; yang pertama adalah bahwa koefisien kepunahan GNP sangat kuat, mereka cenderung memadamkan fluoresensi molekul ketika mereka berada dekat dengan permukaan GNP (< 5 nm) [40]. Jika jarak meningkat menjadi 20 nm atau lebih, medan plasmon nanopartikel terlalu jauh untuk memadamkan sinyal fluoresensinya [41]. Alasan lainnya adalah bahwa kelompok fluoresen DOX dihancurkan setelah memainkan peran agen pereduksi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1c, meskipun jumlah puncak serapan inframerah DOX-GNP secara signifikan lebih sedikit daripada DOX, banyak karakteristik DOX yang masih dipertahankan, seperti puncak serapan IR yang khas pada 2910 cm ⁻¹ (C-H, getaran regangan) [42], 1631 cm ⁻¹ (getaran regangan karbonil) [43], 1114 cm ⁻¹ (Getaran regangan C-O, C-N) [44], dan 867 cm ⁻¹ (N-H, C-H, getaran lentur di luar bidang) [45], masing-masing. Puncak perwakilan DOX tersebut juga ditampilkan dalam spektrum DOX-GNP, menunjukkan bahwa DOX berhasil mengikat DOX-GNP. Menariknya, puncaknya pada 1214 cm ⁻¹ puncak karakteristik untuk getaran peregangan C-O dari gugus hidroksil fenolik [46] menghilang dalam spektrum DOX-GNPs. Gugus fenolik dapat mereduksi ion Au menjadi GNP, kemudian diangkut ke gugus karbonil. Kami berspekulasi bahwa efek DOX tidak terpengaruh, karena DOX melekat ke dalam DNA oleh gugus amino karbon 7 dan gugus hidroksil dari karbon 9 [39].

Kita dapat mengamati bahwa ukuran partikel DOX-GNPs adalah sekitar 6 nm dari hasil TEM (Gbr. 1b). Rasio yang dihitung dari Au (I) adalah 31,93% dari spektrum XPS dari DOX-GNPs (Gbr. 1d), yang cukup tinggi untuk menjaga stabilitas koloid. Namun, ketika endapan DOX-GNPs didispersikan dalam larutan buffer PBS 0,2 M dengan sentrifugasi kecepatan tinggi setelah menghilangkan supernatan, warna larutan ini menjadi ungu kehitaman, dan terlihat flok yang tidak larut. Hal ini menunjukkan bahwa stabilitas DOX-GNPs tidak terlalu baik pada lingkungan konsentrasi garam yang tinggi. Dapat dijelaskan bahwa DOX hanya memiliki satu gugus amino tetapi tidak memiliki gugus sulfhidril, sehingga DOX tidak cukup untuk menghubungkan permukaan GNP melalui ikatan Au-S dan Au-N. Jadi diperlukan lebih banyak upaya jika DOX-GNPs digunakan sebagai zat kontras dan bahan anti-tumor untuk pencitraan dan terapi tumor.

Kami mensintesis DRN-GNP dengan DOX, peptida RGD, dan peptida NLS sebagai agen pereduksi dan penstabil. Peptida RGD dapat secara khusus menargetkan beberapa sel tumor yang mengekspresikan _v . secara berlebihan ₃ integrain, dan peptida NLS dapat secara spesifik menargetkan nukleus. Gambar 2a menunjukkan spektrum UV-Vis dari DOX-GNP, NLS-GNP, DRN-GNP yang dibuat; karakteristik puncak penyerapan plasmon permukaannya adalah 520-530 nm [33]. Orang juga dapat melihat dari awal bahwa GNP menunjukkan warna anggur merah cerah. Gambar TEM (File tambahan 1:Gambar S1) menunjukkan bahwa ukuran partikel NLS-GNPs dan DRN-GNPs sekitar 10 nm dan 5 nm, dan GNP terdistribusi secara seragam, tidak ditemukan koagulasi yang jelas.

a Spektrum serapan UV-Visible dan gambar foto DOX–GNPs (a ), NLS-GNP (b ), dan DRN-GNP (c ). b Spektrum penyerapan UV-Visible DOX dasar, peptida RGD, peptida NLS, dan supernatan DRN-GNP. c Spektrum FTIR peptida NLS, NLS-GNP, dan DRN-GNP. Jarak antara spektrum GNP dan spektrum peptida NLS diperbesar untuk kontras secara jelas

Untuk memvalidasi sintesis NLS-GNP dan DRN-GNP, kami mengkarakterisasi spektrum FTIR peptida NLS dan GNP pada Gambar. 2c. Beberapa puncak FTIR peptida NLS ditemukan dalam spektrum NLS-GNPs dan DRN-GNPs, seperti puncak serapan getaran ulur C-H (2840–2972 cm ⁻¹ ) [47], puncak serapan getaran regangan C=O (1630–1700 cm ⁻¹ ) [48], dan =C-H puncak getaran lentur dalam bidang (1300–1475 cm ⁻¹ ) [49]; itu menunjukkan bahwa peptida CCYNLS berhasil terkonjugasi pada permukaan GNP. Kami juga menemukan bahwa puncak getaran kerangka benzena terminal tirosin pada peptida NLS pada 1529 cm ⁻¹ dan puncak vibrasi regang hidroksil fenolik C-O pada 1193 cm ⁻¹ [49] menghilang dalam spektrum inframerah NLS-GNPs dan DRN-GNPs, yang berarti kerangka benzena terminal tirosin diangkut ke dalam struktur kuinon setelah memainkan perannya sebagai agen pereduksi.

Kami mensentrifugasi DRN-GNPs dengan kecepatan tinggi, mengumpulkan cairan supernatan, yang hampir tidak berwarna, dan kemudian menguji apakah ada reaktan yang tersisa melalui spektrum UV-Vis pada Gambar 2b. Puncak serapan UV peptida RGD dan NLS berasal dari residu tirosin, puncak serapannya terletak pada 275 nm. Namun, gugus hidroksil fenolik menjadi ion oksigen negatif dalam kondisi basa, yang meningkatkan kerapatan elektron cincin benzena, puncaknya berubah merah menjadi 292 nm. Kami tidak melihat puncak karakteristik dalam spektrum UV-Vis dari supernatan DRN-GNP, yang berarti bahwa kedua peptida mengambil bagian dalam reaksi. DOX memiliki tiga puncak penyerapan dalam kisaran 450-600 nm, tetapi supernatan DRN-GNP tidak memiliki puncak tersebut. Selain itu, tidak ditemukan DOX pada supernatan DRN-GNPs karena warnanya coklat muda tetapi warna DOX pada kondisi dasar adalah ungu muda transparan. Dapat disimpulkan bahwa ketiga bahan tersebut hampir bereaksi sempurna. Demikian pula, DR-GNP dan DN-GNP juga dijelaskan dengan cara ini, lihat File tambahan 1:Gambar S2.

Kami menggunakan spektroskopi XPS untuk memeriksa valensi Au untuk NLS-GNPs dan DRN-GNPs. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 3a, b, dua puncak dengan energi ikat sekitar 83,6 eV dan 87,0 eV konsisten dengan emisi fotoelektron Au 4f7/2 dan 4f 5/2 [33]. Posisi energi ikat Au 4f7/2 mereka dari kedua GNP hampir 84,0 eV. Untuk NLS-GNP, dapat didekonvolusi menjadi Au (0) (83,5 eV) dan Au (I) (84,1 eV), rasio area puncaknya masing-masing adalah 57% dan 43%. Demikian pula, untuk DRN-GNP, dapat didekonvolusi menjadi Au (0) (83,6 eV) dan Au (I) (84,4 eV), rasio area puncak masing-masing adalah 62% dan 38%, sehingga memiliki proporsi yang lebih tinggi. dari Au(I). Muatan dapat membentuk kompleks Au (I)-S, yang membantu menjaga stabilitas koloid GNP. Menariknya, kami mengidentifikasi tiga jenis S dalam spektrum XPS dari NLS-GNPs, DN-GNPs, dan DRN-GNPs dalam file tambahan 1:Gambar S3. Kurva biru dan hitam mewakili bilangan oksidasi belerang, kurva ungu mewakili ikatan S-H, dan kurva hijau mewakili ikatan Au-S. Pembentukan ikatan Au-S menggambarkan bahwa peptida NLS berhasil terkonjugasi pada permukaan ketiga GNP tersebut.

Spektrum XPS dari Au 4f dari (a ) NLS-GNP, (b ) DRN-GNP. Energi ikat Au 4f7/2 dari spektrum asli (hitam) dan hasil pas (merah) dapat didekonvolusi menjadi dua komponen, kurva Au(0)-biru dan kurva Au(I)-ungu. Spektrum serapan UV-Visible dan gambar DRN-GNP yang terdispersi masing-masing dalam PBS, NaCl, NaOH, dan HCl (c ).

Selain itu, puncak spektrum XPS N 1s, C 1s, dan O 1s menunjukkan bahwa peptida dan DOX melekat pada GNP (File tambahan 1:Gambar S4).

Spektrum XRD (File tambahan 1:Gambar S5) menunjukkan bahwa struktur kristal GNP ini adalah struktur kristal kubik berpusat muka, karena semua spektrum XRD mereka mengandung empat puncak pada 38,2°, 44,5°, 64,7°, dan 77,8° sesuai dengan (111), (200), (220), dan (311) pesawat [33].

Stabilitas DRN-GNP

Data hamburan cahaya dinamis (DLS) dan potensi zeta dari lima GNP ini ditampilkan pada Tabel 1; ukuran hidrodinamiknya lebih besar daripada yang dicirikan oleh TEM, yang dapat dikaitkan dengan sejumlah molekul terhidrasi di sekitar inti GNP yang larut dalam air. Potensi zeta mereka negatif karena gugus karboksil terkonjugasi pada permukaan GNP. Solusi GNPs menunjukkan stabilitas koloid yang baik ketika nilai absolut dari potensial zeta lebih besar dari 30 mV; semakin besar nilai absolutnya, semakin baik stabilitasnya. Seseorang dapat melihat bahwa mereka semua memiliki stabilitas koloid yang baik dari Tabel 1. Sebagai perbandingan, nilai potensial zeta NLS-GNPs adalah yang tertinggi, mungkin karena permukaannya penuh dengan peptida NLS yang dapat membentuk ikatan Au-S yang kuat melalui kelompok tiol. Nilai absolut dari potensi zeta DOX-GNP mendekati 30 mV; itu konsisten dengan yang disebutkan sebelumnya bahwa DOX-GNP tidak terlalu stabil ketika mereka terdispersi dalam larutan buffer PBS. Data spektrum ditampilkan dalam file tambahan 1:Gambar S6.

Perubahan pita resonansi plasmon permukaan (SPR) karakteristik GNP dapat digunakan untuk menentukan agregasi GNP dengan memanfaatkan spektrometri UV-Vis [49]. Kami mengukur spektrum UV-Vis mereka dan mengambil foto DRN-GNPs (Gbr. 3c) ketika mereka terdispersi dalam garam tinggi (1 M NaCl dan 0,2 M PBS), asam kuat (0,5 M HCl), dan basa kuat ( larutan 0,5 M NaOH). Perubahan warna larutan maupun pergeseran spektrum UV-vis tidak teramati di bawah berbagai kondisi yang keras kecuali dalam larutan HCl, di mana warnanya berubah menjadi sedikit ungu dan puncak serapan ultraviolet bergeser merah sekitar 20 nm, yang berarti GNP sedikit terkoagulasi dalam kondisi asam kuat. . Alasan mungkin bahwa stabilitas koloid GNP bermuatan negatif dipengaruhi dalam kondisi asam kuat, tetapi tidak dipengaruhi dalam buffer PBS netral dan lingkungan alkali. Kami dapat menyimpulkan bahwa DRN-GNP sangat stabil di bawah kondisi garam dan alkali yang tinggi, menunjukkan bahwa DRN-GNP yang kami sintesis diharapkan dapat digunakan untuk pencitraan sel in vitro dan terapi anti-tumor in vivo.

Pencitraan Hamburan Medan Gelap Plasmonic Sel Tumor dan Mikroskop TEM Sel

Untuk pencitraan target spesifik sel tumor dengan DRN-GNP, kami memilih sel Hela sebagai kelompok uji dan sel MCF-7 sebagai kelompok kontrol. Alasannya adalah bahwa sel Hela mengekspresi integrin secara berlebihan _{v 3} [50] tetapi sel MCF-7 tidak, sehingga tidak memiliki pengikatan spesifik RGD; itu adalah kelompok kontrol yang baik [51]. Penyerapan DRN-GNPs oleh dua garis sel ini setelah inkubasi selama 24 jam dengan konsentrasi akhir 35 g/mL dinilai dengan mikroskop fluoresensi tegak lurus dalam model medan gelap. Sel-sel yang dirawat tanpa GNP tidak menunjukkan hamburan cahaya plasmonik (Gambar 4 sel A-Hela, sel 5C-MCF-7). Gambar sel Hela yang dirawat dengan DRN-GNP menunjukkan bahwa sinyal hamburan dari GNP sangat terlokalisasi di nukleus (Gbr. 4b dan 5e). Namun, kami hampir tidak dapat melihat hamburan cahaya dari sel MCF-7 setelah mereka diinkubasi dengan DRN-GNP, meskipun sejumlah kecil GNP mungkin telah memasuki sel tumor melalui efek permeasi dan retensi pasif sel tumor yang ditingkatkan (EPR effect) (Figs. 4d and 5f), the enhanced permeability and retention (EPR) effect is a unique phenomenon of solid tumors related to their anatomical and pathophysiological differences from normal tissues. For example, angiogenesis leads to high vascular density in solid tumors, large gaps exist between endothelial cells in tumor blood vessels, and tumor tissues show selective extravasation and retention of macromolecular drugs [52]. So they might not be clearly detected under the same experimental condition. The results demonstrated that the endocytosis of Hela cells via receptor-mediated endocytosis was facilitated by the RGD peptides on the GNPs’ surface. The NLS peptides could also maintain their activity to specifically targeted nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be a very potential contrast agent for tumor targeted imaging.

The contents of the rows are listed as follows:“PBS buffer” represents the cells incubate with PBS buffer, “DRN-GNPs” represents the cells incubate with DRN-GNPs. The subscript of “1” represents the bright field images of cells, “2” represents the dark field images of cells, and “3” represents the overlapping images (bright-field and dark-field) of cells. All of the scale bars are 20 μm. The picture of E is a small region chosen from B₃ in Fig. 4, the picture of F is a small region chosen from D₃ in Fig. 4, the scale bars are 10 μm

TEM images of DRN-GNPs incubated in Hela and MCF-7 cells for 24 h. A₁ , A₂ , and A₃ are corresponding to HeLa cells while B₁ and B₂ are to MCF-7 cells

Table 2 shows the ratio values between the cells’ densitometric mean grey and the background in the same image, which has a positive correlation with the taken up amounts of DRN-GNPs by these two cell lines. The ratios of the cells incubated with PBS buffer and the MCF-7 cells were nearly 1.0, the brightness of cells was nearly close to the background. The ratio of Hela cells incubated with DRN-GNPs was 4.80, that means the synthesized DRN-GNPs could be specifically targeted and entered the tumor cells overexpressed the integrin α_v β₃ .

To confirm receptor-specific internalization of the DRN-GNPs, we investigated the cellular uptake of the DRN-GNPs by Hela and MCF-7 cells utilizing the TEM technique (see Fig. 5). There was a large amount of DRN-GNPs localized in the nucleus and cytoplasm regions of α_v β₃ -positive Hela cells (Fig. 5(A₁ - A₃ )). On the other hand, only a negligible amount of particles was found inside the cytoplasm regions of α_v β₃ -negative MCF-7 cells (Fig. 5(B₁ -B₂ )), they might be accumulated in the MCF-7 cells by means of the passive targeting EPR effect. We found that there were high contrast black continuous regions in the MCF-7 cells’ nucleus; they were uranyl acetate, which stained the nucleus, and they were different from the granular particles in the nucleus of Hela cells. The TEM images are consistent with the dark-field imaging results, indicating that the RGD and NLS peptides on the surface of GNPs facilitated the DRN-GNPs targeting Hela cells’ nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect contrast agent for tumor targeted imaging and diagnosis.

Cellular Therapeutic Efficacy Evaluation

To evaluate the therapeutic efficacy of DOX and DRN-GNPs at cell level, MTT assay was firstly carried out to study cell viability of Hela and MCF-7 cells under the treatment of these two samples for 24 h. DRN-GNPs demonstrated almost the same inhibition effect by killing nearly 70% of cells at the same DOX’s concentration (39.0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). In line with the MTT results, when the concentration of DRN-GNPs was 40 μg/mL, the number and state of the Hela and MCF-7 cells were relatively good, so the concentration of 35 μg/mL was the suitable concentration for imaging. We observed that when the DRN-GNPs’ concentration was high to 60 μg/mL (Fig. 6(C₃ )), the Hela cells became necrosis obviously. When the concentration of DRN-GNPs goes high to 100 μg/mL, salient reduction of the number cells can be observed and clear cellular morphological change as the characteristic of necrosis was observed. The same concentration of conjugated DOX still exhibited nearly the same anti-tumor efficacy compared with the free DOX. These results indicated that our synthesized DRN-GNPs could be used not only as a contrast agent but also as a good drug delivery system.

MTT assay was used to qualitatively display in vitro anti-tumor activity of DOX and DRN-GNPs on Hela (a ) and MCF-7 cells (b ) for 24 h (100%). The concentrations of C₀ -C₅ are 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL for DRN-GNPs; the corresponding DOX’s concentrations are 0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2, 39.0 μg/mL. Data are represented as means ± standard deviations of triplicate samples (n =3). Images of Hela cells incubated with different concentration of DRN-GNPs (c )

The result detected by the flow cytometry in Fig. 7 also demonstrates the anti-tumor efficacy of DRN-GNPs. Viability of Hela cells when exposed to DRN-GNPs of different concentrations was measured by flow cytometry based assays. Two modes of cell death, apoptosis and necrosis, were measured using Annexinv-FITC and propidium iodide (PI) dyes, respectively (Fig. 7). Similar to the results of MTT assay, the data showed that DRN-GNPs induced cell necrosis was dose-dependent. The proportion of necrotic cells was 8% without incubating with DRN-GNPs; when the concentration was high to 100 μg/mL, the proportion of necrotic cells was 23.84%; that means our synthesized DRN-GNPs could kill Hela cells efficiently. The difference between the results of MTT and flow cytometry can be explained that the difference of cell number and the methods.

Representative two-dimensional contour density plots to determine fractions of live, apoptotic, and necrotic cells, when exposed to DRN-GNPs at different concentrations (0–100 μg/mL) for 24 h, respectively. Cell necrosis and apoptosis were measured by using PI and Annexinv-FITC dyes

Therapy Evaluation of DRN-GNPs in Tumor-Bearing Mice

To further determine whether DRN-GNPs induced a combined therapeutic effect on tumor cells in vivo, we evaluated the anti-tumor effect of DRN-GNPs in tumor-bearing mice for long-term intravenously injection of drugs. The saline group and the drugs of free DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs intravenously injected groups were set as the control groups, in which the concentration of conjugated DOX was the same as that of the free DOX. We observed that the tumor sizes of DRN-GNPs-treated groups were obviously smaller than that of the saline, DOX, DN-GNPs, and DR-GNPs-treated groups (Fig. 8a). The tumor volume and body weight of the mice were monitored every 2 days. Significant variation of tumor volume and tumor weight among all of the treated groups is shown in Fig. 8d, f; the tumor volumes and tumor weight of DN-GNPs and DR-GNPs-treated groups were smaller than that of the free DOX-treated group, but still larger than that of the DRN-GNPs-treated groups because of the less targeted activity. That might be because DOX molecules are small, lack targeting, and they have a short half-life in vivo; therefore, they might be cleared out quickly. However, DRN-GNPs possess of strong stability in the blood system, long half-life, and highly targeted ability, so they can be targeted to the tumor site, and then play the anti-tumor effect of DOX. Between the DRN-GNPs intravenously injected and tumor-injected groups, the anti-tumor efficacy of the latter group is better than that of the former group because the drugs do not need a complex system of blood circulation into the focus. The tumor inhibition rate of DOX is less than 50%, and the rates of all of the DOX-conjugated GNPs are larger than 50%; they can be high to 66.7% and 57.7%, respectively. The HE stain results showed that there was a certain degree of damage for liver organs in the intravenous injected DRN-GNPs group (Fig. 9). Furthermore, the bio-toxicity of DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs on tumor-bearing mice were also assessed by histological analysis. As shown in Fig. 8b, tumor cell volume of saline group is comparatively larger than that of treatment groups, and tumor cells demonstrate with more mitotic figures. All the results showed that the tumor inhibition effect of DRN-GNPs was the best among the GNPs. Thus, our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect DOX delivery system for tumor therapy.

a Tumor images isolated from tumor-bearing mice after treatment of saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). b The histological images of tumors of the mice after treated with saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). c Body weight, tumor volume (d ), tumor inhabitation rate (e ), and tumor’s weight (f ) of tumor-bearing mice during 14 days treatment; data are represented as means ± standard deviations (n =6)

The histological images of the main organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of the mice after treated with saline, free DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection)