Sintesis Hijau One-Step Efisien Nanopartikel Emas Multifungsi untuk Citra & Terapi Tumor Terpadu
Abstrak
Nanopartikel emas (GNPs) selalu digunakan sebagai vektor transportasi doksorubisin (DOX) untuk diagnosis dan terapi tumor; namun, proses sintesis vektor ini adalah menyiapkan GNPs melalui metode reduksi kimia terlebih dahulu, diikuti oleh konjugasi dengan DOX atau peptida spesifik, sehingga metode ini menghadapi beberapa masalah umum termasuk banyak langkah, biaya tinggi, memakan waktu, persiapan yang rumit, dan pengolahan pasca. Di sini, kami menyajikan strategi one-step untuk menyiapkan GNPs yang dikonjugasi DOX berdasarkan konstitusi kimia DOX untuk pertama kalinya. Selain itu, kami menyiapkan GNPs multifungsi (DRN-GNPs) dengan metode one-step dengan bantuan grup fungsional reduksi yang dimiliki oleh DOX, peptida RGD, dan peptida lokalisasi inti (NLS), yang hanya membutuhkan 30 menit. Hasil citra散乱 dan studi TEM sel menunjukkan bahwa DRN-GNPs dapat menargetkan inti sel Hela. Tingkat inhibisi tumor DRN-GNPs melalui injeksi tumor dan vena ekor tikus telanjang adalah 66,7% dan 57,7%, masing-masing, yang secara signifikan ditingkatkan dibandingkan grup kontrol. Sintesis one-step GNPs multifungsi tidak hanya menghemat waktu dan bahan, tetapi juga selaras dengan arah perkembangan kimia hijau, dan akan mendirikan dasar untuk aplikasi skala besar di masa depan yang dekat. Hasil kami menunjukkan bahwa strategi fabrikasi ini efisien, dan DRN-GNPs yang kami siapkan memiliki stabilitas koloidal yang baik dalam sistem fisiologis; mereka adalah agen kontras yang potensial dan vektor transportasi DOX yang efisien untuk diagnosis dan terapi kanker serviks.
Pendahuluan
Doksorubisin (DOX) adalah obat anticancer yang umum digunakan yang telah banyak digunakan dalam berbagai kemoterapi kanker, seperti tumor darah maligan [1], berbagai adenocarcinoma [2,3,4,5], sarkoma jaringan lunak [6], dan lain-lain. Namun, penggunaan DOX dalam jangka panjang dan dosis tinggi akan menyebabkan resistensi obat [7], mual [8], kerambut [9], dan toksisitas akut dan kronis [10], yang dapat menyebabkan gagal jantung kongestif [11]. Oleh karena itu, sangat penting untuk mengembangkan pembawa obat dengan biocompatibilitas yang baik dan kemampuan pemuatan obat yang tinggi. Dalam beberapa tahun terakhir, banyak nanomaterial, seperti titik kuantum [12, 13], kitosan [14, 15] nanomaterial silikon [16, 17], nanomaterial polimer [18,19,20], nanopartikel fluoresens [21,22,23,24], dan nanomaterial logam [25,26,27,28,29,30] telah dikembangkan sebagai vektor transportasi DOX untuk diagnosis dan terapi tumor. Nanomaterial emas telah banyak digunakan karena properti kimia dan optik unik, toksisitas rendah, biocompatibilitas yang baik, dan kemampuan kontrol modifikasi permukaan [31, 32] di antara nanomaterial ini. Sejauh ini, ada tiga pendekatan untuk konjugasi DOX ke GNPs. Yang pertama adalah mengonjugasi DOX ke permukaan GNPs dengan bantuan hidrazin [25], 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorida (EDC) [26], agen sensitif pH [27], sistem DCC/NHS [28]. Yang kedua adalah menginkubasi GNPs dengan DOX selama minimal 24 jam [29]. Yang ketiga adalah menggantikan sitrat yang dikonjugasi pada permukaan nanopartikel emas (GNPs) dengan DOX [30]. Meskipun GNPs yang dikonjugasi DOX ini telah digunakan dalam terapi tumor, aplikasinya masih terbatas karena kurangnya spesifisitas yang cukup. Terakhir, kelompok El-sayed [27] fungsionalisasi GNPs dengan DOX, peptida RGD, dan sinyal lokalisasi inti (NLS) peptida. Sorotan dari karyanya adalah bahwa GNPs masuk ke sel tumor melalui endositozan yang dimediasi reseptor oleh peptida RGD dan kemudian masuk ke inti dengan bantuan peptida NLS, yang membuat DOX secara efektif mengganggu sintesis DNA. Sayangnya, membutuhkan minimal 120 jam dengan menyatukan peptida atau obat lapis demi lapis pada GNPs, dan setiap proses membutuhkan minimal 24 jam. Demikian pula, semua metode yang disebutkan di atas menghadapi beberapa masalah umum seperti banyak langkah, biaya tinggi, persiapan yang rumit, dan pengolahan pasca. Oleh karena itu, diperlukan metode sederhana dan cepat untuk sintesis nanomaterial emas multifungsi.
Dalam makalah ini, kami menyajikan strategi one-step untuk menyiapkan GNPs yang dikonjugasi DOX berdasarkan konstitusi kimia DOX untuk pertama kalinya. Selain itu, kami menyajikan metode sintesis yang nyaman untuk menyiapkan vektor transportasi DOX multifungsi agar DOX bekerja lebih baik, yang dapat digunakan dalam diagnosis dan terapi tumor. Perbedaan utama karyamu kami dari yang lain adalah bahwa kami menggunakan DOX, peptida RGD, dan peptida NLS sebagai reagen reduksi dan reagen stabilisasi untuk memproduksi GNPs dan membuat ketiga substansi ini dikonjugasi pada permukaan GNPs untuk membentuk DRN-GNPs secara bersamaan. Karya kami sebelumnya [33,34,35] telah membuktikan bahwa RGD dan peptida lain dapat digunakan untuk mengurangi ion emas untuk memproduksi nanomaterial emas. Terminal N dari NLS dapat dimodifikasi dengan menggunakan urutan cistein cistein tirosin (CCY) untuk konstruksi CCYNLS, yang dapat mengurangi ion emas sambil tetap mempertahankan efek targeting NLS [36]. Kami juga menemukan bahwa DOX memiliki dua grup hidroksil fenolik dengan redusibilitas yang kuat dalam kondisi basis [37, 38], jadi ini mungkin mengurangi ion emas untuk membentuk GNPs juga. Sementara itu, efek antitumor DOX mungkin tidak terpengaruh karena ini menyisipkan diri ke dalam DNA oleh grup amino karbon 7 dan grup hidroksil karbon 9 [39]. Di samping itu, sulfur, oksigen, dan nitrogen pada peptida dan DOX dapat terikat dengan GNPs untuk menjaga stabilitas koloidal [33]. Hasil menunjukkan bahwa DRN-GNPs berhasil diproduksi dan bekerja baik dalam citra, diagnosis, dan terapi tumor (Skim 1). Sejauh yang kami ketahui, ini adalah laporan pertama untuk sintesis GNPs multifungsi yang dikonjugasi DOX, RGD, dan peptida NLS dengan metode one-step, dan aplikasinya dalam diagnosis dan terapi tumor.
Ilustrasi skematis sintesis DRN-GNPs, pengambilan oleh sel Hela dan diagnosis tumor DRN-GNPs
Bahan dan Metode
Bahan
HAuCl4 4H2O dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, peptida RGD siklus (urutan asam amino arginine-glycine-aspartate-tyrosine-glutamic acid (c(RGDyE))) dan natrium hidroksida sama dengan ref. [35]. Doksorubisin dibeli dari Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Peptida CCYNLS (urutan asam amino cistein-cistein-tirosin-prolin-prolin-lisin-lisin-lisin-arginin-lisin-valin, CCYPPKKKRKV) disuplai oleh China Peptides Co., Ltd (Shanghai, China). Baris sel Hela dan baris sel MCF-7 disediakan oleh Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. Serum sapi fetal (FBS) dan Dulbecco modified Eagle’s medium (DMEM) dibeli dari GibcoBRL Life Technologies. Kit Proliferasi dan Assay Sitorotoksisitas (MTT) dibeli dari Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.
Untuk persiapan DOX-GNPs, larutan DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) ditambahkan ke dalam larutan kloroaurat asam (0,86 mM, 1,0 mL) di bawah pengadukan magnetik, kemudian NaOH (2 M, 5 μL) ditambahkan untuk menyesuaikan pH. Untuk persiapan NLS-GNPs, larutan peptida CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) ditambahkan ke dalam larutan kloroaurat asam (3,44 mM, 1,0 mL) di bawah pengadukan magnetik, kemudian NaOH (2 M, 20 μL) ditambahkan untuk menyesuaikan pH. Untuk persiapan DR-GNPs, larutan DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) dan larutan peptida RGD (1,0 mM, 1,0 mL) ditambahkan ke dalam larutan kloroaurat asam (1,72 mM, 2,0 mL) di bawah pengadukan magnetik, kemudian NaOH (2 M, 15 μL) ditambahkan untuk menyesuaikan pH. Untuk persiapan DN-GNPs, larutan DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL) dan larutan peptida CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL) ditambahkan ke dalam larutan kloroaurat asam (1,72 mM, 2,0 mL) di bawah pengadukan magnetik, kemudian NaOH (2 M, 20 μL) ditambahkan untuk menyesuaikan pH. Untuk persiapan DRN-GNPs, larutan DOX (0,2 mg/mL, 1,0 mL), peptida CCYNLS (0,5 mM, 1,0 mL), dan peptida RGD (1,0 mM, 1,0 mL) ditambahkan ke dalam larutan kloroaurat asam (1,72 mM, 3,0 mL) di bawah pengadukan magnetik, kemudian NaOH (2 M, 35 μL) ditambahkan untuk menyesuaikan pH. Semua reaksi berlangsung selama 30 menit pada 100 °C dalam sistem reflu dan nilai pH adalah 10–12. Semua GNPs difilter dengan sentrifugasi pada 55.000 rpm selama 30 menit (Optima MAX-TL, Beckman Coulter). Setelah menyingkirkan supernatant, GNPs didisperdi ulang dalam air tisu murni.
Karakterisasi
Karakterisasi spektrum GNPs dilakukan menggunakan Spektrofotometer UV 3150 (Shimadzu, Jepang), spektrometro FTIR Nicolet Avatar model 330 (Thermo, Amerika), dan X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) ESCALab250 dengan kondisi analisis yang sama dengan ref. [35]. Gambar mikroskop transmisi elektron (TEM) GNPs diperoleh dari TEM (JEM-2100F, JEOL, Jepang) yang dioperasikan pada tegangan percepatan 200 kV.
Pengukuran DLS dan Potensial Zeta
Analyser Potensial Zeta Zeta PALS (Brookhaven Instrument Corporation) digunakan untuk mengukur dynamic light scatterings (DLS) DOX–GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs, dan DRN-GNPs, yang bekerja pada sudut 90° dengan laser solid-state (λ = 670 nm) pada suhu kamar. Ketika dilengkapi dengan elektroda AQ-827, analyser digunakan untuk mengukur potensial zeta GNPs.
Analisis ICP
Analisis kuantitatif Au dalam GNPs sama dengan ref. [35].
Stabilitas DR-GNPs, DN-GNPs, dan DRN-GNPs yang Dispersi dalam PBS, HCl, NaOH, dan Larutan NaCl
Kami mencampur 100 μL GNPs yang tersedot dan 500 μL larutan konsentrasi tinggi 0,2 M PBS, 0,5 M HCl, 0,5 M NaOH, dan 1,0 M NaCl, masing-masing. Dua belas jam kemudian, kami mengambil foto mereka dan menguji spektrum absorpsi UV mereka.
Budidaya Sel
Sel Hela dan MCF-7 dibudidayakan dalam inkubator (lembab dengan udara seimbang 5% CO2) pada 37 °C selama 24 jam. Media budidaya adalah DMEM dengan 10% FBS. Jumlah sel hidup dihitung dengan papan perhitungan sel.
Assay Sitorotoksisitas DOX Bebas dan DRN-GNPs
Sel Hela dan MCF-7 dalam fase eksponensial ditambahkan ke lubang piring 96-lubang (sekitar 5 × 103 sel/lubang) dan diinkubasi selama 24 jam, masing-masing. Kemudian, DRN-GNPs dengan konsentrasi 0, 20, 40, 60, 80, dan 100 μg/mL (konsentrasi DOX yang sesuai adalah 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2, dan 39,0 μg/mL) diinkubasi dengan setiap lubang dan diinkubasi selama 24 jam pada 37 °C, masing-masing. Grup kontrol diatur dengan menambahkan hanya larutan buffer PBS, dan kelangsungannya diatur sebagai 100%. MTT (20 μL, 5 mg/mL) ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi pada 37 °C selama sekitar 4 jam. Kemudian, media budidaya dengan hati-hati dihisap, dan 150 μL dimetil sulfoksida ditambahkan ke setiap lubang selama 10 menit hingga kristal sepenuhnya larut. Pembaca mikropiring (Thermo Multiskan Mk3) digunakan untuk mengukur nilai OD setiap lubang pada 490 nm. Tiga lubang untuk setiap group disiapkan dan nilai yang dihitung dinyatakan sebagai rata-rata ± S.D.
Eksperimen Citometrika Aliran
Sel Hela dan MCF-7 dalam fase eksponensial ditambahkan ke setiap lubang dari dua piring 12-lubang (sekitar 5 × 104 sel/lubang) dan diinkubasi selama 24 jam, masing-masing. Kemudian, larutan DRN-GNPs ditambahkan ke setiap lubang (konsentrasi akhir dengan 0, 20, 40, 60, 80, dan 100 μg/mL) dan diinkubasi pada 37 °C selama 24 jam, masing-masing. Menghapus media budidaya dan menambahkan larutan Trypsin (mengandung EDTA) ke dalam lubang untuk mencerna sel. Kemudian, menghapus larutan Trypsin dari lubang, menambahkan media budidaya ke dalam lubang, dan memindahkan sel ke tabung sentrifugasi. Setelah sentrifugasi pada 1000 g selama 5 menit, supernatant dihilangkan dan sel di setiap tabung dikumpulkan dan dihitung dalam larutan PBS. Sekitar 5–10 × 104 sel diambil ke tabung sentrifugasi lain dan disentrifugasi pada 1000 g selama 5 menit lagi. Menghapus supernatant dan menambahkan 100 μL larutan buffer AnnexinV ke dalam tabung. Menambahkan 5 μL AnnexinV-FITC dan 5 μL iodida propidium ke dalam tabung dan mencampurnya dengan sel dengan lembut. Tabung diinkubasi pada suhu kamar (20–25 °C) selama 15 menit dalam kegelapan dan kemudian diuji dengan citometrika aliran (BD Accuri C6).
Studi Citra Scattering Lapangan Gelap dan Mikroskop Transmisi Elektron pada Budidaya Sel
Sel Hela dan MCF-7 diimplan pada slide budidaya sel 8-lubang sekitar 7 × 103 sel untuk setiap lubang, masing-masing. DRN-GNPs ditambahkan ke setiap lubang dengan konsentrasi akhir 35 μg/mL. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kami menghilangkan fisik dan GNPs yang terserap bebas dengan mencuci sel ini dengan larutan PBS tiga kali. Kemudian, kami menetapkan mereka dengan paraformaldehid 4% selama 20 menit, dilapisi dengan beberapa titik gliserol, dan menutup slide budidaya sel 8-lubang ini dengan selang kaca lainnya. Mikroskop lapangan gelap (Zeiss Imager Z1) digunakan untuk menilai sel pada perbesar × 200 dan mode refleksi. Waktu eksposur untuk gambar lapangan terang dan lapangan gelap pada tegangan 5 V adalah 1 ms dan 400 ms, masing-masing.
Untuk studi TEM, sel Hela dan MCF-7 diinkubasi dengan DRN-GNPs (35 μg/mL) selama 24 jam dalam botol budidaya sel, masing-masing. Setelah diinkubasi dan menyedot larutan campuran media dan DRN-GNPs, kami mencuci sel dengan larutan PBS tiga kali dan kemudian mencerna mereka dengan trypsin. Sel dipindahkan ke tabung sentrifugasi dengan volume kecil media DMEM. Sel disentrifugasi (1500 rpm) selama 10 menit, media DMEM dengan hati-hati dihisap, dan larutan glutaraldehid 3% (biasanya 40 kali volume bahan) ditambahkan dengan hati-hati ke dalam tabung untuk menetapkan sel di dasar tabung selama lebih dari 1 jam. Sel ditetapkan lebih lanjut dengan menambahkan tetroksida osmium 1% selama 1 jam, dikeringkan dengan etanol, dan kemudian ditanam dalam Spurr (Sigma-Aldrich Co., USA). Sel diambil dari tabung, dipotong menjadi potongan, diwarnai dengan asetat uranil air dan sitrat timbal, dan kemudian dipasang pada grid tembaga (300 mesh). Specimen diukur menggunakan mikroskop transmisi elektron FEI TECNAI-12 (tegangan kerja 120 kV).
Eksperimen Hewan
Subjek Hewan
Tikus telanjang Athymic betina dibeli dari Pusat Eksperimen Hewan Universitas Kedokteran Selatan (Guangzhou, China) untuk tes terapi tumor in vivo. Semua eksperimen hewan dilakukan sesuai dengan Aturan Pengelolaan Hewan dari Kementerian Kesehatan Republik Cina (Document NO. 55, 2001) dan pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari Universitas Farmasi Cina.
Efektivitas Terapautik DOX Bebas dan Konjugatnya pada Tikus dengan Tumor
Singkatnya, 36 tikus telanjang (usia 5–6 minggu, berat 16–18 g) dibagi secara acak menjadi enam grup. Mereka diinjek subkutan dengan sel Hela (5 × 106 sel dalam PBS) ke dalam axila kanan. Lima hari kemudian, tikus dalam grup kontrol diinjek melalui vena ekor dengan larutan garam (0,154 mol/L, 0,2 mL). Tikus dalam grup DOX bebas, DR-GNPs, DN-GNPs, dan DRN-GNPs juga diinjek melalui vena ekor. Untuk membandingkan efektivitas antitumor DRN-GNPs antara injeksi intravenus dan injeksi tumor, kami menyiapkan grup untuk diinjek dengan jumlah yang sama dari DRN-GNPs pada situs tumor. Kelima grup ini mempertahankan dosis 0,3 mg/kg setara DOX bebas atau konjugasi pada setiap tikus. Setiap tikus mengalami injeksi vena ekor atau tumor sekali setiap hari. Berat badan dan volume tumor setiap tikus dipantau setiap hari selama 14 hari. Untuk menyelidiki lebih lanjut efek terapeutik DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, dan DRN-GNPs, tumor dari enam grup diangkat untuk analisis patologis setelah 14 hari perawatan. Tumor dan organ internal jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal tikus diisolasi dari tikus, diatasi dengan formalin netral-buffered 10%, dan ditanam dalam parafin. Jaringan tumor yang diiris diwarnai dengan Hematoxylin dan Eosin (H&E) dan diperiksa dengan mikroskop optik Olympus.
Hasil dan Diskusi
Sintesis dan Karakterisasi DOX-GNPs, NLS-GNPs, DN-GNPs, DR-GNPs, DRN-GNPs
Dalam sintesis DOX-GNPs, ketika larutan NaOH ditambahkan ke dalam larutan campuran DOX dan larutan kloroaurat asam, warna larutan segera berubah dari oranye menjadi ungu muda, kemudian menjadi merah anggur pada 100 °C dalam sistem reflu di bawah pengadukan magnetik dalam satu menit, yang menunjukkan terbentuknya DOX-GNPs. Hasilnya menunjukkan bahwa kemampuan reduksi DOX sangat kuat karena DOX memiliki dua grup hidroksil fenolik (karbon No. 6 dan No. 11) dengan redusibilitas yang kuat dalam kondisi basis. Reaksi berlanjut selama 30 menit sampai warna tidak berubah lagi.
Untuk menghindari kebingungan antara warna merah oranye DOX dan warna merah anggur GNPs, kami mengajukan bukti lebih lanjut dengan mengkarakterisasi spektrum absorpsi UV mereka (seperti ditunjukkan pada Gambar 1a). DOX memiliki puncak absorpsi karakteristik di sekitar 485 nm dan puncak pada 530 nm; namun, puncak pada 480 nm hilang dalam spektrum larutan produk dan puncak karakteristik pada 520 nm puncak absorpsi resonansi plasmon permukaan (SPR) GNPs muncul. Meski demikian, terbentuknya GNPs masih belum sepenuhnya ditentukan antara 520 nm GNPs dan 530 nm puncak DOX. Dengan mempertimbangkan bahwa GNPs akan tersedot dengan sentrifugasi kecepatan tinggi, dan molekul DOX tidak, kita dapat melihat endapan ungu di dasar tabung sentrifugasi pada produk (inset Gambar 1a(3-4)) dan DOX tidak memiliki keduanya (inset Gambar 1a (1-2)).
a Spektra absorpsi UV-Visible DOX dan DOX–GNPs yang disiapkan, inset dari (a) adalah gambar DOX (1, 2) dan DOX-GNPs (3, 4) sebelum (1, 3) dan setelah sentrifugasi (2, 4). b Gambar TEM DOX–GNPs. c Spektra FTIR DOX dan DOX–GNPs yang disiapkan. d Spektra XPS DOX–GNPs
DOX memiliki fluoresens merah di bawah iradiasi cahaya ultraviolet 365 nm; namun, fluoresens DOX hilang setelah sintesis GNPs. Ada dua kemungkinan; yang pertama adalah koefisien pengabsorpansi GNPs sangat kuat, mereka cenderung mematikan fluoresens molekul ketika mereka berada dekat dengan permukaan GNPs (< 5 nm) [40]. Jika jarak meningkat menjadi 20 nm atau lebih, medan plasmon nanopartikel terlalu jauh untuk mematikan sinyal fluoresens mereka [41]. Alasan lainnya adalah bahwa grup fluoresens DOX hancur setelah berperan sebagai agen reduksi. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1c, meskipun jumlah puncak absorpsi inframerah DOX-GNPs jauh lebih sedikit daripada DOX, banyak karakteristik DOX masih terpertahankan, seperti puncak absorpsi IR karakteristik pada 2910 cm−1 (C-H, getaran stretch) [42], 1631 cm−1 (getaran stretch karbonil) [43], 1114 cm−1 (C-O, C-N getaran stretch) [44], dan 867 cm−1 (N-H, C-H, getaran bengkok luar bidang) [45], masing-masing. Puncak representatif DOX tersebut juga ditampilkan dalam spektrum DOX-GNPs, yang menunjukkan bahwa DOX berhasil terikat pada DOX-GNPs. Menariknya, puncak pada 1214 cm−1 puncak karakteristik untuk getaran stretch C-O grup hidroksil fenolik [46] hilang dalam spektrum DOX-GNPs. Grup fenolik dapat mengurangi ion emas menjadi GNPs, dan kemudian transportasi ke grup karbonil. Kami spekulasi bahwa efek DOX tidak terpengaruh, karena ia menyisipkan diri ke dalam DNA oleh grup amino karbon 7 dan grup hidroksil karbon 9 [39].
Kami dapat mengamati bahwa ukuran partikel DOX-GNPs sekitar 6 nm dari hasil TEM (Gambar 1b). Rasio Au (I) yang dihitung adalah 31,93% dari spektrum XPS DOX-GNPs (Gambar 1d), yang cukup tinggi untuk mempertahankan stabilitas koloid. Namun, ketika endapan DOX-GNPs dispersi dalam larutan buffer PBS 0,2 M dengan sentrifugasi kecepatan tinggi setelah menghapus supernatant, warna larutan ini menjadi hitam ungu, dan terdapat floc insolubel yang terlihat. Ini menunjukkan bahwa stabilitas DOX-GNPs tidak terlalu baik dalam lingkungan konsentrasi garam tinggi. Ini dapat dijelaskan bahwa DOX hanya memiliki satu grup amino tetapi tidak memiliki grup sulfhydryl, yang tidak cukup bagi DOX untuk terhubung ke permukaan GNPs melalui ikatan Au-S dan Au-N. Jadi, lebih banyak upaya diperlukan jika DOX-GNPs digunakan sebagai agen kontras dan bahan antitumor untuk citra dan terapi tumor.
Kami menyintesis DRN-GNPs dengan DOX, peptida RGD, dan peptida NLS sebagai agen reduksi dan stabilisasi. Peptida RGD dapat secara spesifik menargetkan beberapa sel tumor yang overexpressed integrin αvβ3, dan peptida NLS dapat secara spesifik menargetkan inti. Gambar 2a menunjukkan spektrum UV-Vis DOX-GNPs, NLS-GNPs, DRN-GNPs yang dibuat; karakteristik puncak absorpsi plasmon permukaan mereka adalah 520–530 nm [33]. Seseorang juga dapat melihat dari inset bahwa GNPs menunjukkan warna merah anggur terang. Gambar TEM (Berkas tambahan 1: Gambar S1) menunjukkan bahwa ukuran partikel NLS-GNPs dan DRN-GNPs adalah sekitar 10 nm dan 5 nm, dan GNPs tersebar merata, tidak ada aglomerasi yang jelas.
a Spektra absorpsi UV-Visible dan gambar foto DOX–GNPs (a), NLS-GNPs (b), dan DRN-GNPs (c). b Spektra absorpsi UV-Visible dasar DOX, peptida RGD, peptida NLS, dan supernatant DRN-GNPs. c Spektra FTIR peptida NLS, NLS-GNPs, dan DRN-GNPs. Jarak antara spektrum GNPs dan spektrum peptida NLS diperbesar untuk kontras yang jelas
Untuk memvalidasi sintesis NLS-GNPs dan DRN-GNPs, kami mengkarakterisasi spektrum FTIR peptida NLS dan GNPs pada Gambar 2c. Beberapa puncak FTIR peptida NLS ditemukan dalam spektrum NLS-GNPs dan DRN-GNPs, seperti puncak absorpsi getaran stretch C-H (2840–2972 cm−1) [47], puncak absorpsi getaran stretch C=O (1630–1700 cm−1) [48], dan puncak getaran bengkok dalam bidang =C-H (1300–1475 cm−1) [49]; ini menunjukkan bahwa peptida CCYNLS berhasil dikonjugasi pada permukaan GNPs. Kami juga menemukan bahwa puncak getaran kerangka benzen terminal tirosin dalam peptida NLS pada 1529 cm−1 dan puncak getaran stretch C-O hidroksil fenolik pada 1193 cm−1 [49] hilang dalam spektrum inframerah NLS-GNPs dan DRN-GNPs, yang berarti kerangka benzen terminal tirosin diubah menjadi struktur kuinon setelah berperan sebagai agen reduksi.
Kami menyentrifugasi DRN-GNPs dengan kecepatan tinggi, mengumpulkan supernatantnya, yang hampir tidak berwarna, dan kemudian menguji apakah masih ada reaksi yang tersisa melalui spektrum UV-Vis pada Gambar 2b. Puncak absorpsi UV peptida RGD dan NLS berasal dari sisa tirosin, puncak absorpsi berada pada 275 nm. Namun, grup hidroksil fenolik menjadi ion oksigen negatif dalam kondisi basis, yang meningkatkan densitas elektron cincin benzen, puncak bergeser merah menjadi 292 nm. Kami tidak melihat puncak karakteristik dalam spektrum UV-Vis supernatant DRN-GNPs, yang berarti kedua peptida terlibat dalam reaksi. DOX memiliki tiga puncak absorpsi dalam rentang 450–600 nm, tetapi supernatant DRN-GNPs tidak memiliki puncak tersebut. Selain itu, tidak ada DOX yang ditemukan dalam supernatant DRN-GNPs karena warnanya cokelat muda tetapi warna DOX dalam kondisi basis adalah ungu transparan muda. Dapat disimpulkan bahwa ketiga bahan hampir bereaksi sepenuhnya. Demikian pula, DR-GNPs dan DN-GNPs juga dijelaskan dengan cara ini, lihat Berkas tambahan 1: Gambar S2.
Kami menggunakan spektroskopi XPS untuk memeriksa valensi Au untuk NLS-GNPs dan DRN-GNPs. Seperti ditunjukkan pada Gambar 3a, b, dua puncak dengan energi ikatan sekitar 83,6 eV dan 87,0 eV konsisten dengan emisi fotoelektron Au 4f7/2 dan 4f 5/2 [33]. Posisi energi ikatan Au 4f7/2 keduanya hampir 84,0 eV. Untuk NLS-GNPs, ini dapat diuraikan menjadi Au (0) (83,5 eV) dan Au (I) (84,1 eV), rasio area puncaknya masing-masing 57% dan 43%. Demikian pula, untuk DRN-GNPs, ini dapat diuraikan menjadi Au (0) (83,6 eV) dan Au (I) (84,4 eV), rasio area puncaknya masing-masing 62% dan 38%, sehingga mereka memiliki proporsi Au (I) yang lebih tinggi. Muatan dapat membentuk kompleks Au (I)-S, yang membantu mempertahankan stabilitas koloidal GNPs. Menariknya, kami mengidentifikasi tiga jenis S dalam spektrum XPS NLS-GNPs, DN-GNPs, dan DRN-GNPs dalam Berkas tambahan 1: Gambar S3. Kurva biru dan hitam mewakili status oksidasi sulfur, kurva ungu mewakili ikatan S-H, dan kurva hijau mewakili ikatan Au-S. Pembentukan ikatan Au-S menunjukkan bahwa peptida NLS berhasil dikonjugasi pada permukaan ketiga GNPs ini.
Spektra XPS Au 4f dari (a) NLS-GNPs, (b) DRN-GNPs. Energi ikatan Au 4f7/2 dari spektrum asli (hitam) dan hasil fitting (merah) dapat diuraikan menjadi dua komponen, Au(0)-kurva biru dan Au(I)-kurva ungu. Spektra absorpsi UV-Visible dan gambar DRN-GNPs yang dispersi dalam PBS, NaCl, NaOH, dan HCl, masing-masing (c).
Selanjutnya, puncak N 1s, C 1s, dan O 1s dari spektrum XPS menunjukkan bahwa peptida dan DOX terlekat pada GNPs (Berkas tambahan 1: Gambar S4).
Spektra XRD (Berkas tambahan 1: Gambar S5) menunjukkan bahwa struktur kristal GNPs ini adalah struktur kristal kubik face-centered, karena semua spektrum XRD mereka mengandung empat puncak pada 38,2°, 44,5°, 64,7°, dan 77,8° yang sesuai dengan bidang (111), (200), (220), dan (311) [33].
Stabilitas DRN-GNPs
Data DLS (dynamic light scattering) dan potensial zeta dari lima GNPs ini ditampilkan dalam Tabel 1; ukuran hidrodinamik mereka lebih besar dari yang dikarakterisir oleh TEM, yang dapat disebabkan oleh sejumlah molekul terhidrasi di sekitar inti GNPs yang larut air. Potensial zeta mereka negatif karena grup karboksil yang dikonjugasi pada permukaan GNPs. Larutan GNPs menunjukkan stabilitas koloidal yang baik ketika nilai absolut potensial zeta lebih besar dari 30 mV; semakin besar nilai absolutnya, semakin baik stabilitasnya. Seseorang dapat melihat bahwa mereka semua memiliki stabilitas koloidal yang baik dari Tabel 1. Dalam perbandingan, nilai potensial zeta NLS-GNPs adalah yang tertinggi, yang mungkin karena permukaannya penuh dengan peptida NLS yang dapat membentuk ikatan Au-S yang kuat melalui grup sulfhydryl. Nilai absolut potensial zeta DOX-GNPs mendekati 30 mV; ini konsisten dengan yang disebutkan sebelumnya bahwa DOX-GNPs tidak sangat stabil ketika dispersi dalam larutan buffer PBS. Data spektrum ditampilkan dalam Berkas tambahan 1: Gambar S6.
Perubahan pita resonansi plasmon permukaan (SPR) karakteristik GNPs dapat digunakan untuk menentukan agregasi GNPs dengan memanfaatkan spektrometri UV-Vis [49]. Kami mengukur spektrum UV-Vis mereka dan mengambil foto DRN-GNPs (Gambar 3c) ketika mereka dispersi dalam larutan garam tinggi (1 M NaCl dan 0,2 M PBS), asam kuat (0,5 M HCl), dan basa kuat (0,5 M NaOH). Tidak ada perubahan warna larutan maupun pergeseran spektrum UV-vis yang diamati di bawah berbagai kondisi keras kecuali dalam larutan HCl, di mana warnanya berubah menjadi ungu sedikit dan puncak absorpsi ultraviolet bergeser merah sekitar 20 nm, yang berarti GNPs agak mengagregasi dalam kondisi asam kuat. Alasannya mungkin karena stabilitas koloidal GNPs yang bermuatan negatif terpengaruh dalam kondisi asam kuat, tetapi tidak terpengaruh dalam lingkungan larutan buffer PBS netral dan basa. Kami dapat menyimpulkan bahwa DRN-GNPs sangat stabil dalam kondisi garam tinggi dan basa, yang menunjukkan bahwa DRN-GNPs yang disintesis kami diharapkan dapat digunakan untuk citra sel in vitro dan terapi antitumor in vivo.
Citra Scattering Lapangan Gelap Plasmonik Sel Tumor dan Studi Mikroskop Transmisi Elektron Sel
Untuk citra targeting spesifik sel tumor dengan DRN-GNPs, kami memilih sel Hela sebagai grup uji dan sel MCF-7 sebagai grup kontrol. Alasannya adalah sel Hela overexpressed integrin αvβ3 [50] tetapi sel MCF-7 tidak, jadi tidak ada ikatan spesifik RGD; ini adalah grup kontrol yang baik [51]. Pengambilan DRN-GNPs oleh kedua baris sel ini setelah diinkubasi selama 24 jam dengan konsentrasi akhir 35 μg/mL dinilai dengan mikroskop fluoresens tegak dalam mode lapangan gelap. Sel yang diperlakukan tanpa GNPs tidak menunjukkan pencahayaan scattering plasmonik (Gambar 4 A-sel Hela, 5C-sel MCF-7). Gambar sel Hela yang diperlakukan dengan DRN-GNPs menunjukkan bahwa sinyal scattering dari GNPs sangat terlokalisasi pada inti (Gambar 4b dan 5e). Namun, kami hampir tidak dapat melihat cahaya scattering dari sel MCF-7 setelah mereka diinkubasi dengan DRN-GNPs, meskipun sejumlah kecil GNPs mungkin telah masuk ke sel tumor melalui efek permeabilitas dan retensi pasif (EPR effect) sel tumor (Gambar 4d dan 5f), efek permeabilitas dan retensi (EPR) adalah fenomena unik tumor padat yang terkait dengan perbedaan anatomi dan patofisiologinya dari jaringan normal. Misalnya, angiogenesi mengarah pada densitas vaskular yang tinggi dalam tumor padat, celah besar ada antara sel endotel dalam pembuluh darah tumor, dan jaringan tumor menunjukkan ekstraversasi dan retensi selektif obat makromolekuler [52]. Jadi mereka mungkin tidak terdeteksi dengan jelas dalam kondisi eksperimental yang sama. Hasilnya menunjukkan bahwa endositozan sel Hela melalui endositozan yang dimediasi reseptor dipromosi oleh peptida RGD pada permukaan GNPs. Peptida NLS juga dapat mempertahankan aktivitasnya untuk secara spesifik menargetkan inti. Jadi DRN-GNPs yang disintesis kami dapat menjadi agen kontras yang sangat potensial untuk citra targeting tumor.
Isi baris dicantumkan sebagai berikut: “PBS buffer” mewakili sel yang diinkubasi dengan larutan PBS, “DRN-GNPs” mewakili sel yang diinkubasi dengan DRN-GNPs. Subskrip dari “1” mewakili gambar lapangan terang sel, “2” mewakili gambar lapangan gelap sel, dan “3” mewakili gambar tumpang tindih (lapangan terang dan lapangan gelap) sel. Semua skala bar adalah 20 μm. Gambar E adalah wilayah kecil yang dipilih dari B3 dalam Gambar 4, gambar F adalah wilayah kecil yang dipilih dari D3 dalam Gambar 4, skala bar adalah 10 μm
Gambar TEM DRN-GNPs yang diinkubasi dalam sel Hela dan MCF-7 selama 24 jam. A1, A2, dan A3 sesuai dengan sel HeLa sementara B1 dan B2 untuk sel MCF-7
Tabel 2 menunjukkan nilai rasio antara keabuan rata-rata densitometri sel dan latar belakang dalam gambar yang sama, yang memiliki korelasi positif dengan jumlah DRN-GNPs yang diambil oleh kedua baris sel ini. Rasio sel yang diinkubasi dengan larutan PBS dan sel MCF-7 hampir 1,0, kecerahan sel hampir sama dengan latar belakang. Rasio sel Hela yang diinkubasi dengan DRN-GNPs adalah 4,80, yang berarti DRN-GNPs yang disintesis kami dapat secara spesifik ditargetkan dan masuk ke sel tumor yang overexpressed integrin αvβ3.
Untuk mengonfirmasi internalisasi spesifik reseptor DRN-GNPs, kami menyelidiki pengambilan seluler DRN-GNPs oleh sel Hela dan MCF-7 menggunakan teknik TEM (lihat Gambar 5). Terdapat sejumlah besar DRN-GNPs yang terlokalisasi pada wilayah inti dan sitoroplasma sel Hela positif αvβ3 (Gambar 5(A1- A3)). Di sisi lain, hanya sejumlah kecil partikel yang ditemukan di dalam wilayah sitoroplasma sel MCF-7 negatif αvβ3 (Gambar 5(B1-B2), mereka mungkin terakumulasi di sel MCF-7 melalui cara targeting pasif efek EPR. Kami menemukan bahwa ada wilayah berkelanjutan hitam kontras tinggi pada inti sel MCF-7; mereka adalah asetat uranil yang mewarnai inti, dan mereka berbeda dari partikel granuler pada inti sel Hela. Gambar TEM konsisten dengan hasil citra lapangan gelap, menunjukkan bahwa peptida RGD dan NLS pada permukaan GNPs memfasilitasi DRN-GNPs targeting inti sel Hela. Jadi DRN-GNPs yang disintesis kami dapat digunakan sebagai agen kontras yang sempurna untuk citra dan diagnosis targeting tumor.
Evaluasi Efektivitas Terapautik Seluler
Untuk mengevaluasi efektivitas terapeutik DOX dan DRN-GNPs pada tingkat sel, uji MTT pertama kali dilakukan untuk mempelajari kelangsungan sel Hela dan MCF-7 di bawah perawatan kedua sampel ini selama 24 jam. DRN-GNPs menunjukkan efek inhibi yang hampir sama dengan membunuh hampir 70% sel pada konsentrasi DOX yang sama (39,0 μg/mL, Gambar 6(A, B)). Sesuai dengan hasil MTT, ketika konsentrasi DRN-GNPs adalah 40 μg/mL, jumlah dan kondisi sel Hela dan MCF-7 relatif baik, jadi konsentrasi 35 μg/mL adalah konsentrasi yang sesuai untuk citra. Kami mengamati bahwa ketika konsentrasi DRN-GNPs tinggi hingga 60 μg/mL (Gambar 6(C3)), sel Hela menjadi nekrosis yang jelas. Ketika konsentrasi DRN-GNPs tinggi hingga 100 μg/mL, penurunan signifikan dalam jumlah sel dapat diamati dan perubahan morfologi sel yang jelas sebagai karakteristik nekrosis diamati. Konsentrasi yang sama dari DOX konjugasi masih menunjukkan efek antitumor yang hampir sama dengan DOX bebas. Hasil ini menunjukkan bahwa DRN-GNPs yang disintesis kami dapat digunakan tidak hanya sebagai agen kontras tetapi juga sebagai sistem pengiriman obat yang baik.
Uji MTT digunakan untuk menampilkan secara kualitatif aktivitas antitumor in vitro DOX dan DRN-GNPs pada sel Hela (a) dan sel MCF-7 (b) selama 24 jam (100%). Konsentrasi C0-C5 adalah 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL untuk DRN-GNPs; konsentrasi DOX yang sesuai adalah 0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2, dan 39,0 μg/mL. Data direpresentasikan sebagai rata-rata ± standar deviasi dari sampel triplikata (n = 3). Gambar sel Hela yang diinkubasi dengan berbagai konsentrasi DRN-GNPs (c)
Hasil yang terdeteksi oleh citometrika aliran pada Gambar 7 juga menunjukkan efektivitas antitumor DRN-GNPs. Kelangsungan sel Hela saat diekspose dengan DRN-GNPs pada berbagai konsentrasi diukur dengan uji berbasis citometrika aliran. Dua mode kematian sel, apoptosis dan nekrosis, diukur menggunakan catdye Annexinv-FITC dan iodida propidium (PI), masing-masing (Gambar 7). Mirip dengan hasil uji MTT, data menunjukkan bahwa DRN-GNPs menyebabkan nekrosis sel bergantung pada dosis. Proporsi sel nekrotik adalah 8% tanpa diinkubasi dengan DRN-GNPs; ketika konsentrasi tinggi hingga 100 μg/mL, proporsi sel nekrotik adalah 23,84%; yang berarti DRN-GNPs yang disintesis kami dapat membunuh sel Hela secara efisien. Perbedaan antara hasil uji MTT dan citometrika aliran dapat dijelaskan oleh perbedaan jumlah sel dan metode.
Plot kontur densitas dua dimensi representatif untuk menentukan fraksi sel hidup, apoptosis, dan nekrotik, saat diekspose dengan DRN-GNPs pada berbagai konsentrasi (0–100 μg/mL) selama 24 jam, masing-masing. Nekrosis dan apoptosis sel diukur menggunakan catdye PI dan Annexinv-FITC
Evaluasi Terapi DRN-GNPs pada Tikus dengan Tumor
Untuk menentukan lebih lanjut apakah DRN-GNPs menghasilkan efek terapi gabungan pada sel tumor in vivo, kami mengevaluasi efek antitumor DRN-GNPs pada tikus dengan tumor untuk injeksi obat intravenus jangka panjang. Grup garam dan grup bebas DOX, DR-GNPs, dan DN-GNPs yang diinjek intravenus diatur sebagai grup kontrol, di mana konsentrasi DOX konjugasi sama dengan DOX bebas. Kami mengamati bahwa ukuran tumor dari grup yang diobati DRN-GNPs jelas lebih kecil dibandingkan grup garam, DOX, DN-GNPs, dan DR-GNPs yang diobati (Gambar 8a). Volume tumor dan berat badan tikus dipantau setiap 2 hari. Variasi yang signifikan dari volume tumor dan berat tumor di antara semua grup yang diobati ditunjukkan pada Gambar 8d, f; volume tumor dan berat tumor dari grup DN-GNPs dan DR-GNPs yang diobati lebih kecil dibandingkan grup DOX bebas yang diobati, tetapi masih lebih besar dibandingkan grup DRN-GNPs yang diobati karena aktivitas targeting yang kurang. Ini mungkin karena molekul DOX kecil, kurang targeting, dan memiliki setengah hayat yang pendek in vivo; sehingga mereka mungkin dibersihkan dengan cepat. Namun, DRN-GNPs memiliki stabilitas yang kuat dalam sistem darah, setengah hayat panjang, dan kemampuan targeting yang tinggi, sehingga mereka dapat ditargetkan ke situs tumor, dan kemudian memainkan efek antitumor DOX. Di antara grup DRN-GNPs yang diinjek intravenus dan grup injeksi tumor, efektivitas antitumor dari grup terakhir lebih baik dari pada grup pertama karena obat tidak memerlukan sistem sirkulasi darah yang kompleks ke fokus. Tingkat inhibisi tumor DOX kurang dari 50%, dan tingkat dari semua GNPs yang dikonjugasi DOX lebih dari 50%; mereka dapat tinggi hingga 66,7% dan 57,7%, masing-masing. Hasil warna HE menunjukkan bahwa terdapat tingkat kerusakan tertentu pada organ hati pada grup DRN-GNPs yang diinjek intravenus (Gambar 9). Selain itu, bio-toksisitas DOX, DR-GNPs, dan DN-GNPs pada tikus dengan tumor juga dievaluasi oleh analisis histologis. Seperti ditunjukkan pada Gambar 8b, volume sel tumor dari grup garam relatif lebih besar dibandingkan grup perawatan, dan sel tumor menunjukkan lebih banyak figur mitotik. Semua hasil menunjukkan bahwa efek inhibi tumor DRN-GNPs adalah yang terbaik di antara GNPs. Jadi, DRN-GNPs yang disintesis kami dapat digunakan sebagai sistem pengiriman DOX yang sempurna untuk terapi tumor.
a Gambar tumor yang diisolasi dari tikus dengan tumor setelah perawatan dengan garam, DOX bebas, DN-GNPs, DR-GNPs, dan DRN-GNPs (injeksi tumor dan injeksi intravenus). b Gambar histologis tumor tikus setelah diobati dengan garam, DOX bebas, DN-GNPs, DR-GNPs, dan DRN-GNPs (injeksi tumor dan injeksi intravenus). c Berat badan, volume tumor (d), tingkat inhibisi tumor (e), dan berat tumor (f) dari tikus dengan tumor selama 14 hari perawatan; data direpresentasikan sebagai rata-rata ± standar deviasi (n = 6)
Gambar histologis organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal) tikus setelah diobati dengan garam, DOX bebas, DR-GNPs, DN-GNPs, dan DRN-GNPs (injeksi tumor dan injeksi intravenus)
Kesimpulan
Dalam studi ini, kami berhasil mengembangkan metode one-step untuk menyiapkan DRN-GNPs multifungsi dalam waktu sekitar setengah jam. GNPs juga telah berhasil diterapkan pada citra targeting tumor dan terapi tumor baik in vitro maupun in vivo. Keberhasilan ini menunjukkan bahwa mungkin untuk memanfaatkan sepenuhnya kemampuan reduksi dan stabilisasi dari DOX, peptida RGD, dan peptida CCYNLS, yang akan membuat proses sintesis GNPs sederhana dan efisien. Lebih penting lagi, DRN-GNPs one-step yang disintesis masih memiliki stabilitas koloidal yang baik dalam sistem fisiologis, dan peptida yang dikonjugasi pada permukaan tetap mempertahankan kemampuan targeting dan DOX masih memiliki kemampuan antitumor-nya. Sejauh yang kami ketahui, ini adalah laporan pertama untuk sintesis GNPs multifungsi yang dikonjugasi DOX, RGD dan peptida CCYNLS dengan metode one-step, dan aplikasinya dalam citra, diagnosis, dan terapi tumor. Strategi ini selaras dengan arah perkembangan kimia hijau, dan akan mendirikan dasar untuk aplikasi skala besar di masa depan yang dekat. Kami harapkan laporan kami akan memberikan cara baru untuk sintesis one-step nanomaterial multifungsi yang digunakan untuk citra dan terapi tumor.
Ketersediaan Data dan Bahan
Semua data disajikan dalam naskah utama atau dalam berkas pendukung tambahan.
Singkatan
CCYNLS peptides:
Urutan asam amino adalah cistein-cistein-tirosin-prolin-prolin-lisin-lisin-lisin-arginin-lisin-valin
Cyclic RGD peptides:
Urutan asam amino adalah arginine-glycine-aspartate-tyrosine-glutamic acid
“PBS buffer” mewakili sel yang diinkubasi dengan larutan PBS, “DRN-GNPs” mewakili sel yang diinkubasi dengan DRN-GNPs. Subskrip dari “1” mewakili gambar lapangan terang sel, “2” mewakili gambar lapangan gelap sel, dan “3” mewakili gambar tumpang tindih (lapangan terang dan lapangan gelap) sel. Semua skala bar adalah 20 μm. Gambar E adalah wilayah kecil yang dipilih dari B3 dalam Gambar 4, gambar F adalah wilayah kecil yang dipilih dari D3 dalam Gambar 4, skala bar adalah 10 μm
