Nanobiosensor LSPR Cepat dan Biaya Rendah untuk Diagnosa Brucellosis yang Akurat

Abstrak

Brucellosis tetap menjadi zoonosis bakteri paling umum di dunia. Diagnostik konvensional—kultura, serologi, dan PCR—menderita waktu putar yang panjang, sensivitas terbatas, atau reaktivitas silang. Di sini kami menyajikan nanobiosensor resonansi plasmon permukaan lokal (LSPR) nanopartikel emas yang mengatasi kekurangan ini. Lipopolisakarida halus (LPS) dari Brucella melitensis dan Brucella abortus diimmobilisasi kovalen pada nanopartikel emas 10 nm. Pengikatan anti-Brucella antibody pasien menghasilkan red-shift yang dapat diukur dalam puncak LSPR, memungkinkan diskriminasi kuantitatif antara serum terinfeksi dan tidak terinfeksi. Dalam studi buta 40 sampel klinis (20 positif kultural, 20 negatif kultural), sensor mencapai sensivitas 85 %, spesifisitas 100 %, nilai prediksi positif 100 %, dan nilai prediksi negatif 86 %—setara dengan atau melebihi uji serologi standar. Uji memerlukan hanya 30 menit, menggunakan reagen yang murah, dan dapat diterapkan untuk perawatan di titik layanan.

Pendahuluan

Spesies Brucella adalah kokobasili Gram-negatif yang pertumbuhannya lambat yang menginfeksi berbagai hewan domestik dan liar. Dari 12 spesies yang diakui, B. melitensis, B. abortus, B. suis, dan B. canis adalah patogen manusia utama, dengan B. melitensis sebagai yang paling virulent. Brucellosis manusia menunjukkan gejala nonspecific seperti flu, sehingga konfirmasi laboratorium esensial. Kultura tradisional, meskipun standar emas, membutuhkan 5–7 hari dan carries risiko biosafety. Uji serologi menderita reaktivitas silang dan tidak dapat membedakan infeksi aktif dari infeksi lampau. Amplifikasi asam nukleat menawarkan kecepatan tetapi mungkin tetap positif setelah penyembuhan. Jadi, alat diagnostik yang cepat, akurat, dan terjangkau dengan segera diperlukan.

Resonansi plasmon permukaan lokal (LSPR) mengeksploitasi osilasi kolektif elektron konduksi dalam nanopartikel logam, menghasilkan puncak serapan tajam yang bergeser saat ikatan biomolekul. Nanopartikel emas (AuNPs) dengan ukuran sekitar 10 nm menawarkan rasio permukaan-volume yang tinggi dan properti optik yang stabil, menjadikannya transduktor LSPR ideal. Dengan mengikat antigen LPS ke AuNPs, sensor LSPR dapat mendeteksi anti-Brucella antibody dengan sensivitas dan spesifisitas tinggi dalam bacaan warna sederhana.

Metode

Kultura Bakteri dan Ekstraksi LPS

Strain halus Brucella melitensis dan Brucella abortus ditanam pada agar Luria–Bertani. LPS diekstrak melalui metode fenol panas, difilter oleh SDS-PAGE pewarnaan perak, dan dikuantifikasi dengan 1,9-dimetil metilen biru terhadap standar Salmonella typhimurium. Kontaminasi protein dicekal oleh uji Bradford dan konten asam nukleat <0,2 % dari massa LPS.

Sintesis Nanopartikel Emas

AuNPs diproduksi oleh reduksi Turkevich dari HAuCl₄ dengan sitrat natrium, diikuti oleh penambahan borohidrat natrium pada suhu kamar. Koloid yang dihasilkan menunjukkan puncak plasmon 530 nm dan diameter rata-rata 10 nm, dikonfirmasi oleh SEM dan pencaharan cahaya dinamis (DLS). Potensi zeta −28 mV menunjukkan stabilitas koloid yang baik.

Persiapan Nanopros

AuNPs difungsionalkan dengan asam tionglikolat (TGA) untuk grup karboksil permukaan. Inkubasi TGA optimal 24 jam, setelahnya 300 µg/ml LPS diikatkan kovalen melalui kimia EDC/NHS. Pros akhir mempertahankan puncak absorbansi 530 nm yang kuat.

Deteksi Antibodi

Sampel serum diencerkan 1:50 dalam PBS dan dicampur 1:2 (100 µl serum + 200 µl pros). Setelah 30 menit inkubasi, campuran difusgas dan absorbansi supernatant diukur. Red-shifts ≥4,38 nm, yang didefinisikan sebagai ambang batas (mean + 2 SD dari kontrol negatif), dianggap positif.

Etika

Semua serum dikumpulkan dengan persetujuan yang diinformasi dan persetujuan IRB (IR.FUMS.1396.324). Identitas peserta dikodekan.

Validasi

Empat puluh serum (20 positif kultural, 20 negatif kultural) diuji. Hasil dibandingkan dengan kultural, uji aglutinasi tabung standar (SAT), dan kit komersial ELISA untuk IgM/IgG. Sensivitas, spesifisitas, PPV, dan NPV dihitung menurut rumus standar.

Analisis Statistik

Normalitas data dinilai oleh Kolmogorov–Smirnov; ANOVA membandingkan grup. Analisis dilakukan dengan GraphPad Prism 8 dan SPSS 9.

Hasil

Ekstraksi LPS

SDS-PAGE mengonfirmasi hasil ~1 % (bobot basah) dengan kontaminasi protein dan asam nukleat yang tidak signifikan.

Karakterisasi AuNP

Gambar SEM menunjukkan bola 10 nm yang seragam. DLS menunjukkan distribusi ukuran sempit (10 ± 2 nm). Potensi zeta −28 mV. Puncak UV–Vis pada 530 nm mengonfirmasi sintesis yang berhasil.

Optimasi Pros

Lapisan TGA 24 jam menghasilkan fungsionalisasi maksimum tanpa geser spektral. Pemuatan LPS memeklar pada 300 µg/ml, di luarnya tidak ada perubahan absorbansi yang lebih lanjut.

Konsep Bukti

Inkubasi dengan kontrol anti-Brucella positif menghasilkan red-shift yang jelas, sedangkan kontrol negatif tidak.

Penentuan Ambang Batas

Mean red-shift dalam negatif adalah 1,70 nm; positif rata-rata 6,08 nm. Ambang batas 4,38 nm menghasilkan 5 % false positive dan 0 % false negative dalam set validasi.

Kinerja Diagnostik

Dibandingkan dengan kultural, uji LSPR menunjukkan sensivitas 85 %, spesifisitas 100 %, PPV 100 %, dan NPV 86 %. SAT mencapai sensivitas 90 %, spesifisitas 100 %; ELISA IgM/IgG memiliki PPV lebih rendah (90 % dan 81 % masing-masing).

Pembahasan

Brucellosis menyebabkan sekitar 500.000 kasus manusia baru setiap tahun. Nanobiosensor LSPR menawarkan alternatif yang cepat (≤30 menit), murah (<$1 per tes), dan sangat spesifik terhadap metode konvensional. Dengan mendeteksi anti-LPS antibody melalui geser spektral yang dapat diukur, uji ini menghindari kulturan yang memakan waktu dan masalah reaktivitas silang serologi. Meski memberikan tingkat antibody kualitatif bukan kuantitatif, PPV dan NPV yang tinggi membuatnya cocok untuk skrining dan konfirmasi di daerah endemic.

Keterbatasan meliputi persistensi antibody setelah penyembuhan, yang dapat menghasilkan hasil positif pada pasien yang sudah sembuh, dan kebutuhan akan spektrofotometer untuk pengukuran geser yang akurat. Pekerjaan mendatang akan menjelajahi pembaca portabel, handheld untuk memungkinkan penerapan di titik layanan yang sebenarnya.

Kesimpulan

Biosensor LSPR nanopartikel emas 10 nm menunjukkan deteksi yang cepat, akurat, dan hemat biaya anti-Brucella antibody. Spesifisitas yang tinggi dan sensivitas yang setara dengan serologi standar, dikombinasikan dengan persyaratan peralatan minimal, menjadikannya alat yang menjanjikan untuk mendiagnosis brucellosis, terutama di setting dengan sumber terbatas.

Ketersediaan data dan bahan

Data tersedia dari penulis yang bertanggung jawab atas permintaan yang wajar.

Singkatan

LPS

Lipopolisakarida

GNPs

Nanopartikel emas

DLS

Pencaharan cahaya dinamis

LSPR

Resonansi plasmon permukaan lokal

SAT

Uji aglutinasi tabung standar

ELISA

Uji imunosorben terhubung enzim

PPV

Nilai prediksi positif

NPV

Nilai prediksi negatif

PSPR

Resonansi plasmon permukaan yang merambat

SDS‑PAGE

Elektroforesis gel akrilamida natrium dodeksil sulfat

SEM

Mikroskopi elektron pemindai

TGA

Asam tionglikolat

NHS

N-hidroxisuksinimida

EDC

N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilkarbodimidida hidroklorida

PBS

Penyangga fosfat