Gold Nanobiosensor Berdasarkan Resonansi Plasmon Permukaan Terlokalisasi Mampu Mendiagnosis Brucellosis Manusia, Memperkenalkan Metode yang Cepat dan Terjangkau

Metode

Kultur Bakteri dan Ekstraksi LPS

Strain halus B. melitensis dan B. aborsi dibudidayakan di Luria–Bertani [3] agar-agar. Pada langkah selanjutnya, bakteri dipanen dan LPS diekstraksi menggunakan metode air fenol panas yang dimodifikasi [25]. Untuk mengkonfirmasi kualitas LPS yang diekstraksi, elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) dengan pewarnaan perak nitrat diterapkan. Kuantifikasi LPS dilakukan menggunakan 1,9-dimetil metilen biru (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) menggunakan Salmonella typhimurium sebagai standar. Untuk menilai kontaminasi protein dan asam nukleat, digunakan metode Bradford dan absorbansi pada 260 nm.

Sintesis Nanopartikel Emas Bulat

Reduksi kimia garam emas (HAuCl₄ ) digunakan untuk mensintesis nanopartikel emas yang merupakan prosedur sintesis yang cepat, murah, dan hijau untuk nanopartikel Au pada suhu kamar [26]. Menurut metode yang dijelaskan, 15 mg natrium sitrat (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) dilarutkan dalam 50 ml air deionisasi suling dan disimpan dalam penangas es dan dicampur pada pengaduk magnet (150 RPM) . Pada saat yang sama, 600 l larutan garam emas (17,3 mM) ditambahkan. Selanjutnya, 1,2 ml larutan natrium borohidrida (20 mM) ditambahkan. Solusinya dicampur selama 2 jam dalam kondisi yang sama dan kemudian disimpan pada suhu 4 °C untuk aplikasi selanjutnya. Menurut penelitian sebelumnya, pada jenis sintesis ini, natrium sitrat secara bersamaan bertindak sebagai reduktor (mendorong reduksi AuIII menjadi Au0), capping agent (menstabilkan larutan koloid nanopartikel emas secara elektrostatis), dan mediator pH (memodifikasi reaktivitas Au spesies yang terlibat dalam reaksi). Dalam pengujian ini, produksi larutan berwarna merah dari larutan HAuCl4 berwarna kuning menunjukkan pembentukan emas dalam keadaan oksidasi nol.

Scanning electron microscopy (SEM) digunakan untuk mempelajari morfologi nanopartikel emas, dan Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK) digunakan untuk menilai distribusi ukuran. Hamburan cahaya dinamis (DLS), pada sudut hamburan 90º, digunakan sebagai prinsip dasar untuk mengukur ukuran partikel. Zetasizer Nano menggunakan laser dengan panjang gelombang 633 nm. Dengan teknik ini, penyebaran partikel yang disebabkan oleh gerak Brown diukur dan diubah menjadi distribusi ukuran dengan hubungan Stokes-Einstein [27]. Potensi zeta juga diterapkan untuk menentukan muatan permukaan listrik nanopartikel. Spektrum serapan nanopartikel direkam oleh spektrofotometer Cary 500 UVeviseNIR (ultra-violete-visible near infrared) (Varian, Australia).

Konstruksi Nanoprobe (Biosensor)

Karboksilasi Nanopartikel Emas

Nanopartikel emas dilapisi dengan penghubung asam tioglikolat untuk mempersiapkan permukaan GNP untuk memuat LPS. Singkatnya, 1 ml larutan TGA (1 mM) dicampur dengan 1 ml larutan nanopartikel emas dan disimpan pada suhu kamar selama 24 jam. Untuk isolasi nanopartikel emas berlapis, larutan disentrifugasi pada 12.000 g selama 15 menit. Setelah itu, dua langkah pencucian dengan air deionisasi destilasi ganda digunakan untuk menghilangkan kelebihan TGA. Akhirnya, spektrofotometri digunakan untuk menilai lapisan asam tioglikolat pada permukaan GNP.

Optimasi Pelapisan Asam Tioglikolat pada Nanopartikel Emas

Pelapisan TGA dilakukan pada waktu yang berbeda, antara lain 12, 18, 24, 36, dan 48 jam untuk mengoptimalkan rasio pelapisan TGA pada nanopartikel emas. Selanjutnya, densitas optik diukur dan dibuat grafiknya untuk mendapatkan waktu inkubasi terbaik.

Penempelan Kovalen LPS ke Nanopartikel Emas Modifikasi TGA

Untuk merangsang perlekatan kovalen antara gugus karboksil TGA dan gugus amina LPS, gugus karboksil diaktifkan oleh EDC (pengikat silang nol paling populer untuk konjugasi biokimia) dan molekul N-hidroksisuksinimida (NHS). Nanopartikel emas yang terendapkan disuspensikan dalam larutan EDC/NHS 0,1 mM dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Pada langkah berikutnya, 2 ml fosfat buffer saline (PBS) yang mengandung 0,05% Tween-20 (PBST) (pH 7,4) ditambahkan. Setelah pusaran yang kuat, nanopartikel disentrifugasi pada 12.000 RPM selama 15 menit. Setelah sentrifugasi, larutan LPS ditambahkan setelah supernatan dihilangkan. Selanjutnya, campuran diinkubasi dalam penangas ultrasonik selama 10 menit diikuti dengan inkubasi 3 jam pada suhu kamar. Setelah itu, 2 ml PBST ditambahkan dan divorteks dengan kuat diikuti dengan sentrifugasi selama 15 menit pada 12.000 RPM, dan supernatannya dibuang. Akhirnya, nanoprobe kemudian disuspensikan kembali dalam 500 l PBS dan spektrum LSPR diukur dengan spektrofotometer. Setelah konfirmasi penempelan LPS ke nanopartikel emas, larutan disimpan pada suhu 4°C untuk studi lebih lanjut. Gambar 1 menunjukkan persamaan interaksi kimia sintesis nanopartikel emas yang dimodifikasi TGA dan lampiran LPS.

Interaksi kimia lampiran LPS ke nanopartikel emas. A molekul TGA, B Interaksi EDC + NHS, dan C Lampiran kovalen LPS ke nanopartikel emas yang dimodifikasi TGA. Nomor 1:nanopartikel; nomor 2:LPS

Mengoptimalkan Konsentrasi LPS

Untuk memaksimalkan pengikatan LPS ke gugus karboksil TGA teraktivasi, optimalisasi rasio nanopartikel LPS-ke-Au dilakukan dengan mengevaluasi pergeseran puncak spektrum LSPR sebagai fungsi konsentrasi LPS (100, 150, 200, 300, dan 560 µg /ml) dalam jumlah tertentu dari nanopartikel Au.

Deteksi Antibodi Anti-LPS oleh Nanoprobe

100 l sampel yang diencerkan (1:50 dalam PBS) dicampur dengan 200 l biosensor dan dicampur dengan pemipetan. Pada langkah berikutnya, biosensor disentrifugasi pada 12.000 g selama 15 menit setelah 30 menit inkubasi pada suhu kamar. Akhirnya, biosensor disuspensikan dalam 200 l PBS, dan absorbansi diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya. Untuk memvalidasi fungsi nanobiosensor, kontrol positif dan negatif juga disediakan dari kit ELISA yang tersedia secara komersial (Pishtazteb Zaman, Iran).

Pernyataan Etika

Penggunaan serum manusia telah disetujui oleh Komite Etik Fasa University of Medical Sciences Fasa, Iran (IR.FUMS.1396.324). Identitas pendonor serum diberi kode dan tidak diungkapkan kepada siapapun yang terlibat dalam penelitian ini. Selanjutnya, semua prosedur dilakukan di bawah pedoman etika mengikuti peraturan nasional. Selain itu, semua sampel berasal dari subjek yang telah menandatangani persetujuan tertulis.

Mengevaluasi Fungsi Metode yang Dirancang

Empat puluh sampel yang berisi 20 kasus (positif benar) dan 20 kontrol (negatif benar) disediakan untuk mengevaluasi fungsionalitas metode yang dirancang. Untuk alasan ini, kinerja metode yang dirancang dalam penelitian ini dibandingkan dengan hasil kultur. Selanjutnya, kit komersial yang tersedia (Pishtaz Teb, Tehran, Iran) digunakan untuk menilai tingkat serum antibodi IgM dan IgG. Persiapan sampel dan evaluasi antibodi dilakukan sesuai dengan protokol pabrikan (Spesifikasi:99,85%, Sensitivitas:99,4%). Selain itu, uji aglutinasi tabung standar dilakukan pada semua sampel serum untuk membandingkan dan memvalidasi kinerja metode berbasis LSPR. Untuk mengevaluasi kinerja metode yang dirancang, hasil yang diperoleh dari metode berbasis LSPR dibandingkan dengan pengujian konvensional tersebut dengan menghitung sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif, dan nilai prediksi negatif berdasarkan rumus umum sebagai berikut:

Analisis Statistik

Studi ini dianalisis sebagai eksperimen kinerja diagnostik klasik dengan mengevaluasi persetujuan dari tes yang diusulkan, LSPR-nanosensor, dan tes standar referensi, kultur, dan beberapa tes konvensional termasuk ELISA dan SAT untuk menentukan kemampuannya dalam mengidentifikasi kondisi target. . Nilai cutoff dihitung dengan rata-rata serum kontrol (negatif benar) ditambah nilai deviasi standar dua kali (2SD). Uji Kolmogorov–Smirnov dilakukan untuk mengetahui normalitas dan mengevaluasi distribusi data. Berdasarkan hasil normalitas, yang mengungkapkan distribusi parametrik, uji ANOVA digunakan untuk membandingkan kelompok. Semua analisis statistik dilakukan menggunakan GraphPad Prism for windows versi 8 dan SPSS for windows versi 9.

Hasil

Analisis Ekstraksi Lipopolisakarida

SDS-PAGE menunjukkan bahwa hasil ekstraksi LPS adalah sekitar 1 persen dari berat basah bakteri yang digunakan. Selain itu, konsentrasi asam nukleat adalah ≤ 0,2% dari konsentrasi LPS. Yang terpenting, metode Bradford menunjukkan tidak adanya kontaminasi protein.

Karakterisasi Nanopartikel Emas

Distribusi ukuran nanopartikel menentukan kualitas biosensor. Menurut penelitian sebelumnya, nanopartikel harus memiliki ukuran tertentu. Dalam hal ini, ukuran nanopartikel yang tepat menghasilkan stabilitas koloid yang sesuai, rasio permukaan-ke-volume yang tinggi, dan pergerakan cepat untuk laju pengikatan yang tinggi menghasilkan afinitas tinggi, sensitivitas tinggi, dan selektivitas tinggi dalam interaksi dengan target biologis. Selanjutnya, nanopartikel harus sebesar mungkin untuk memungkinkan adanya berbagai ligan pada permukaan partikel dan mendapatkan interaksi multivalen juga [29,30,31]. Sebagai Gu et al. melaporkan, komparabilitas ukuran nanopartikel dengan ukuran target biologis sangat penting dalam interaksi protein [32]. Berdasarkan ukuran antibodi anti-Brucella yaitu 2–5 nm [33], penelitian ini menyiapkan nanopartikel emas dengan ukuran rata-rata 10 nm dan dilakukan penentuan distribusi ukuran nanopartikel dengan instrumen Zetasizer NanoZS90, yang menggunakan laser dengan panjang gelombang 633-nm. Teknik ini memanfaatkan persamaan Stokes–Einstein yang dapat mengubah difusi partikel yang disebabkan oleh gerak Brown menjadi distribusi ukuran. Menurut Gambar. 2, GNP terdistribusi secara merata pada skala 10 nm. Nilai potensial Zeta mengungkapkan detail tentang muatan permukaan dan stabilitas GNP. Partikel bermuatan negatif, dan potensial zeta mereka kira-kira 28 mV. Selanjutnya, Tabel 1 menunjukkan panjang gelombang absorbansi maksimum GNPs. Panjang gelombang visual dan ultraviolet diukur dengan spektrofotometer, dan absorbansi maksimum adalah 530 nm. Kami menggunakan metode Turkevich untuk menghasilkan nanopartikel emas. Kelebihan dari metode ini adalah produksi nanopartikel emas meliputi proses produksi yang mudah dan murah, kemampuan mengontrol ukuran nanopartikel, dan stabilitas koloid yang tepat [34].

Struktur nanopartikel emas di bawah SEM. Distribusi yang sama dari nanopartikel emas tercermin dengan baik pada gambar

Karakterisasi Nano-bio-Probe

Seperti disebutkan di atas, penelitian ini menggunakan molekul TGA untuk menghubungkan nanopartikel emas dengan LPS yang menghasilkan sedikit penurunan 4,55% pada puncak LSPR pada 530 nm. Selain itu, penelitian ini melakukan beberapa kali inkubasi untuk menentukan kepatuhan TGA maksimum pada nanopartikel emas. Berdasarkan hasil yang ditunjukkan pada Gambar 3, inkubasi TGA 24 jam dengan GNP menghasilkan lapisan TGA maksimum pada permukaan nanopartikel emas.

Mengoptimalkan pelapisan asam tioglikolat pada nanopartikel emas. Seperti yang ditunjukkan gambar, tidak ada perubahan signifikan dalam absorbansi setelah 24 jam inkubasi meskipun perpanjangan waktu yang berdekatan. Oleh karena itu, 24 jam dipilih sebagai waktu yang dioptimalkan untuk pelapisan asam tioglikolat pada GNP. Y -sumbu menunjukkan intensitas absorbansi pada 530 nm (absorbansi maksimum nanopartikel). Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Data disajikan sebagai mean ± SEM. a.u.:Satuan absorbansi

Mengenai penentuan konsentrasi optimal LPS, penelitian ini menyelidiki konsentrasi termasuk 100, 150, 200, 300, dan 560 ug/ml. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, karena konsentrasi meningkat, absorbansi menurun. Menurut hasil, penelitian ini memilih konsentrasi LPS 300 ug/ml untuk melapisi permukaan GNP yang dimodifikasi TGA, karena tidak ada penurunan signifikan dalam intensitas puncak penyerapan dengan meningkatkan konsentrasi LPS.

Mengoptimalkan konsentrasi LPS. Ketika konsentrasi LPS meningkat, absorbansi menurun secara signifikan. Namun, pada peningkatan konsentrasi LPS lebih dari 300 mg/ml, tidak ada penurunan yang signifikan dalam absorbansi LSPR. Oleh karena itu, konsentrasi tersebut dipilih sebagai konsentrasi yang dioptimalkan. Y -sumbu menunjukkan intensitas absorbansi pada 530 nm (absorbansi maksimum nanopartikel). Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Data disajikan sebagai mean ± SEM. a.u.:Satuan absorbansi

Penilaian Fungsi Nano-bio-Probe

Karena teknik LSPR merupakan metode optik yang sensitif terhadap permukaan, maka teknik ini dapat mendeteksi interaksi antara antibodi anti-LPS dan antigen pada permukaan nanopartikel emas melalui citra perubahan puncak absorpsi LSPR yang disebabkan oleh interaksi elektrostatik antara antibodi dan antigen. Untuk memastikan fungsi biosensor yang benar, penelitian ini menyiapkan kontrol positif yang terdiri dari antibodi LPS anti-Brucella dengan titer 1:80 dan kontrol negatif, dan merekam spektrum LSPR biosensor setelah inkubasi dengan kontrol. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, inkubasi dengan kontrol negatif tidak mempengaruhi absorbansi LSPR. Namun, inkubasi dengan kontrol positif menyebabkan pergeseran absorbansi maksimum LSPR yang sebelumnya dikenal sebagai pergeseran merah. Oleh karena itu, pengikatan antibodi anti-Brucella ke antigen LPS membatasi timbulnya cahaya pada permukaan nanoprobe.

Puncak nanoprobe LSPR dengan adanya kontrol positif dan negatif. Kontrol disediakan dari kit ELISA yang tersedia secara komersial

Menentukan Nilai Batas

Untuk tujuan ini, penelitian ini memperoleh 40 serum dari subjek benar positif dan negatif berdasarkan kultur dan pengamatan klinis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, rata-rata pergeseran merah dalam sampel negatif sejati (kontrol) adalah 1,70 nm yang secara signifikan berbeda dari pasien positif sejati (P nilai < 0,001). Selanjutnya, hasil menunjukkan bahwa pergeseran merah 4,38 nm harus digunakan sebagai nilai batas. Menariknya, hanya 5% dari kontrol yang memiliki pergeseran merah di atas nilai batas, dan pergeseran merah pada semua pasien berada di atas nilai batas yang menunjukkan bahwa kinerja metode dapat diterima dan penentuan nilai batas dapat diandalkan.

Pergeseran merah puncak LSPR dalam serum pasien sejati dan subjek kontrol. Setelah interaksi antara antibodi, yang disajikan dalam serum individu yang terinfeksi, terjadi pergeseran merah yang berbeda secara signifikan jika dibandingkan dengan kontrol. Selanjutnya, gambar tersebut menunjukkan nilai SD dan 2SD yang berharga untuk definisi titik batas. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga untuk setiap sampel. P nilai < 0,05 dianggap signifikan

Validasi Fungsi Biosensor

Pada langkah sebelumnya, penelitian ini memperkenalkan metode cepat dan murah untuk mengidentifikasi antibodi anti-Brucella dalam sampel. Namun, memverifikasi fungsionalitas metode baru diperlukan. Untuk tujuan ini, penelitian ini melakukan serangkaian sub-penelitian termasuk uji aglutinasi tabung standar, kadar anti-IgG, dan anti-IgM dalam serum sampel negatif dan positif berdasarkan hasil kultur. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, sensitivitas metode saat ini kurang dari SAT saja. Yang penting, spesifisitas metode berbasis LSPR menunjukkan hasil yang paling dapat diterima yaitu 100%. Serupa dengan spesifisitas, nilai prediksi positif dari metode saat ini lebih tinggi dari tes konvensional lainnya (100%). Pada akhirnya, NPV metode berbasis SAT, IgG, IgM dan LSPR masing-masing adalah 90%, 90%, 81%, dan 86%.

Diskusi

Brucellosis mungkin dianggap sebagai infeksi manusia pertama setelah domestikasi sapi, domba, dan kambing [35]. Brucellosis adalah zoonosis bakteri paling umum di dunia dengan 500.000 kasus manusia baru dari penyakit yang didiagnosis secara global setiap tahun [9, 36]. Gejala brucellosis manusia tidak patognomonik karena infeksi dapat mempengaruhi organ tubuh manapun [37]. Meskipun temuan laboratorium masih merupakan faktor yang dapat diandalkan dalam deteksi penyakit, strategi saat ini termasuk kultur, serologi, dan tes amplifikasi asam nukleat telah menunjukkan kelemahan yang serius [9, 38,39,40]. Oleh karena itu, penelitian ini mencoba memperkenalkan metode diagnostik baru berdasarkan LSPR untuk menghilangkan keterbatasan.

Dalam beberapa tahun terakhir, resonansi plasmon permukaan lokal telah digunakan sebagai dasar untuk pengembangan biosensor. Keuntungan dari penelitian saat ini tentang nanopartikel emas dan kemajuan dalam nanoteknologi telah dianggap sebagai faktor utama untuk meningkatkan kinerja diagnostik. Warna unik dan sifat optik GNP, karena efek plasmonik dan dapat disesuaikan, adalah dua karakteristik yang menonjol dan menguntungkan dari partikel ini dibandingkan dengan partikel lain [12, 41].

Dalam penelitian ini, pergeseran merah pada puncak LSPR digunakan sebagai indikator interaksi antara antigen LPS dan antibodi anti-Brucella. Dengan kata lain, dibandingkan dengan sampel kontrol, adanya antibodi dalam serum sampel kasus menyebabkan pergeseran merah yang signifikan dari puncak penyerapan LSPR yang dapat diasumsikan sebagai indikator brucellosis. Meskipun ada perbedaan yang signifikan dalam pergeseran merah antara sampel kontrol dan sampel kasus, perbedaan ini tidak dapat mengukur konsentrasi antibodi dalam serum, yang dapat dianggap sebagai salah satu keterbatasan serius dari metode ini. Namun, kita harus ingat bahwa beberapa metode umum, seperti strategi terkait ELISA, biasanya dianggap sebagai titik batas [42, 43].

Yang penting, penelitian ini memvalidasi kinerja teknik berbasis LSPR dengan membandingkan hasil yang diperoleh dengan metode lain saat ini dengan mengevaluasi berbagai parameter. Parameter pertama yang dianalisis adalah sensitivitas yang menentukan kemungkinan tes brucellosis positif pada pasien [44]. Seperti Yagupsky dkk. telah dibahas [9], sensitivitas kultur darah, yang dianggap sebagai standar emas saat ini, berkurang terutama pada penyakit kronis dan infeksi fokal. Selain itu, metode ini juga menghadapi keterbatasan serius lainnya, seperti masalah keamanan laboratorium, pertumbuhan bakteri yang lambat, dan hasil positif yang merupakan bukti penyakit yang tak terbantahkan [45, 46]. Teknik berbasis LSPR ini menunjukkan hasil yang andal dan kompetitif dibandingkan dengan metode konvensional dalam sensitivitas seperti kultur, SAT, dan kit yang bergantung pada ELISA. Pada saat yang sama, spesifisitas, yaitu kemungkinan tes negatif jika pasien tidak terinfeksi, dievaluasi [45, 47]. As results showed, compared to the other diagnostic strategy, the designed LSPR-based technique had the most significant outcome in terms of specificity. It is an important characteristic of this method because the previous studies had questioned the validity and specificity of serodiagnostic methods of human brucellosis since asymptomatic and self-limiting episodes of this infection occur in zoonosis endemicity areas [48,49,50]. However, like antibody-related methods, the current method resists the possible long-term persistence of anti-Brucella antibodies within the serum, even after complete recovery from brucellosis.

Similar to previous studies, positive predictive value was defined as the ratio of the true positive results to the sum of all positive results [51]. Similarly, the NPV was described as the ratio of the true negative results to the sum of all negative results [51]. Compared to conventional diagnostic strategies, the current designed method represented the most wonderful PPV outcomes, demonstrating its ability to distinguish between infected and non-infected individuals. In addition, the evaluation of the NPV results revealed the promising potential of the LSPR-based method to exclude non-patients from real patients.

Kesimpulan

This study introduced a rapid, simple, low cost, reliable, and economical method for diagnosing brucellosis. Although there are some minor limitations, including the qualitative outcomes and the possibility of being positive in recovered individuals, the advantages discussed show that it has good capabilities compared to the current laboratory-based diagnostic procedures.

Ketersediaan data dan materi

The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Singkatan

LPS:

Lipopolysaccharides

GNPs:

Gold nanoparticles

DLS:

Dynamic light scattering

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

SAT:

Standard tube agglutination test

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

PPV:

Positive predictive value

NPV:

Negative predictive value

PSPR:

Propagating surface plasmon resonance

SDS-PAGE:

Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis

SEM:

Scanning electron microscopy

TGA:

Thioglycolic acid

NHS:

N-hydroxysuccinimide

EDC:

N -(3-dimethylaminopropyl)-N ′-ethylcarbodiimide hydrochloride

PBS:

Phosphate buffer saline

Emisi Multiwarna dari Struktur Nanopiramid Kuasikristal Fotonik Berbasis Ultraviolet GaN dengan Sumur Kuantum Ganda Semipolar InxGa1−xN/GaN Analisis Aktin dan Organisasi Adhesi Fokus dalam Sel U2OS pada Struktur Nano Polimer