Nanopartikel Karbon Doped Cerium Sintesis Hijau untuk Terapi Antioksidan dengan Pengasupan Radikal Hidroksil Unggul

Abstrak

Kemajuan terbaru dalam nanomedisin menyoroti nanopartikel oksida cerium sebagai antioksidan yang kuat. Dalam studi ini, kami menyajikan metode sederhana dan ramah lingkungan yang menggunakan albumin serum sapi (BSA) untuk biomineralisasi nanopartikel karbonas doped cerium (Ce-doped CNPs). Partikel yang dihasilkan bersifat monodispers dengan diameter rata-rata 14,7 nm, dan menampilkan grup hidrofilik permukaan yang melimpah untuk memastikan dispersi jangka panjang dalam media berbasis air. Studi sitotoksitas in vitro (CCK-8) mengonfirmasi bahwa toksisitas sel tidak signifikan dalam rentang dosis yang luas. Saat ditantang dengan spesies oksigen reaktif yang diinduksi peroksida hidrogen, Ce-doped CNPs menunjukkan pengasupan radikal hidroksil yang luar biasa, melindungi sel otot halus vaskular dan sel tumor 7721 dari kerusakan oksidatif secara dosis-dependen. Temuan ini mendirikan Ce-doped CNPs sebagai pengasupan ROS yang menjanjikan dan bertoksisitas rendah untuk pengobatan penyakit yang terkait stres oksidatif.

Latar Belakang

Stres oksidatif, didefinisikan sebagai ketidakseimbangan antara produksi spesies oksigen reaktif (ROS) dan pertahanan antioksidan, menjadi dasar banyak penyakit kronis, termasuk aterosklerosis, kanker, dan neurodegenerasi. Radikal hidroksil (•OH) yang sangat reaktif sangat merusak, memicu peroksidan lipid, modifikasi protein, dan patau rantai DNA yang culminasi dalam kematian sel dan cedera jaringan. Strategi terapeutik yang mengurangi tingkat ROS, terutama •OH, sangat menarik dari segi klinis.

Nanopartikel oksida cerium (CeO₂ NPs) telah muncul sebagai nano-enzim yang kuat karena siklus redoks Ce³⁺/Ce⁴⁺ yang reversibel. Ini memungkinkan mereka meniru aktivitas dismutase superoksida (SOD) dan katalase (CAT), masing-masing menanggulangi •O₂⁻ dan H₂O₂. Namun, CeO₂ NPs konvensional sering memerlukan lapisan permukaan (misalnya PVP) untuk mencapai stabilitas air dan biokompatibilitas, yang dapat mengubah properti intrinsik mereka. Studi kami mengatasi keterbatasan ini dengan menyematkan ion cerium dalam kerangka karbonas yang berasal dari BSA, menghasilkan Ce-doped CNPs dengan hidrofilik intrinsik dan performa antioksidan yang kuat.

Bagian Eksperimen

Bahan dan Reagen

Albumin serum sapi (BSA), fluorescein diacetate (FDA), dan propidium iodide (PI) diperoleh dari Sigma (New York, NY, USA). Serum sapi fetal (FBS) dan Medium Minimum Esensial Dulbecco (DMEM) diperoleh dari Invitrogen China Limited (Shanghai). Nitrat cerium heksahidrat (Ce(NO₃)₃·6H₂O), metil violet (MV), sulfat ferrous heksahidrat (FeSO₄·7H₂O), dan H₂O₂ 30 % dibeli dari Aladdin Reagent Corporation (Shanghai) dan Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing). Semua kimia adalah grade analitik dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut; air deionisasi digunakan sepanjang proses.

Sintesis Nanopartikel Karbonas Doped Cerium

Ce-doped CNPs disiapkan melalui rute biomineralisasi yang diadaptasi dari sintesis berbasis BSA yang dilaporkan Wang et al. Singkatnya, 1,25 g BSA dilarutkan dalam 50 mL air deionisasi di bawah pengadukan berkelanjutan untuk membentuk larutan jernih. Larutan 300 mM Ce(NO₃)₃·6H₂O kemudian ditambahkan secara titik-titik sambil mempertahankan pengadukan yang intens. Secara bersamaan, NaOH 2,0 M diperkenalkan perlahan untuk meningkatkan pH menjadi 12. Campuran diaduk pada 55 °C selama 8 jam, menghasilkan suspensi coklat yang kemudian pendingin ke suhu ruangan. Produk difilter melalui membran PES 0,22 µm untuk mengeliminasi agregat besar, dialisis terhadap air (14 kDa MWCO) selama 3 hari, dan dikeringkan beku di bawah vakum. Bubuk yang dihasilkan disimpan untuk karakterisasi lebih lanjut.

Teknik Karakterisasi

Mikroskopi transmisi elektron (TEM, JEOL JEM-2100) menyediakan data morfologi pada 200 kV. Distribusi ukuran partikel dihitung dengan ImageJ (NIH). Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR, Nicolet Nexus 470) dan spektroskopi fotoelektron X-ray (XPS, PHI 5000) mengidentifikasi grup fungsional permukaan dan status oksidasi. Difraksi X-ray (XRD, Rigaku D/MAX-2000) mengonfirmasi fase kristal. Spektra absorpsi UV-Vis (Shimadzu UV-2550) direkam untuk studi larutan.

Assay Fotometri UV-Vis untuk Pengasupan Radikal

Ce-doped CNPs (10 µM) dispersi dalam Tris-HCl 0,1 M (pH 5,0) dan di-sonikasi untuk meningkatkan keberlarutan. Campuran reaksi yang berisi 3,0 × 10⁻⁵ M MV, 0,15 mM FeSO₄·7H₂O, 1,0 M H₂O₂, dan suspensi Ce-doped CNP (0,17 mM) disiapkan dalam volume 10 mL. Setelah 5 menit pada suhu ruangan, absorbansi pada 582 nm diukur untuk mengkuantifikasi pemulihan MV, yang mencerminkan pengasupan radikal hidroksil.

Assay Kehidupan Sel (CCK-8)

Sel VSMC dan 7721 (1,5 × 10⁴ sel/well) diseed pada plates 96-well dan dibudidayakan hingga ~80 % konfluensi. Setelah 24 jam, media diganti dengan DMEM yang mengandung 0–400 µg/mL Ce-doped CNPs, dan sel dibudidayakan selama 24 jam. Reagen CCK-8 (10 µL/well) ditambahkan dan diinkubasi selama 4 jam. Absorbansi pada 490 nm dibaca pada microplate reader Synergy HT; kehidupan sel diekspresikan sebagai % dari kontrol tidak treated.

Model Stres Oksidatif yang Diinduksi Peroksida Hidrogen

Untuk menghasilkan cedera oksidatif, sel VSMC dan 7721 diekspose kepada H₂O₂ 30 % pada konsentrasi 50 µmol mL⁻¹ hingga 800 µmol mL⁻¹ selama 4 jam. Setelah perawatan, kehidupan sel dievaluasi dengan CCK-8 seperti yang dijelaskan di atas, memungkinkan penentuan LD₅₀ H₂O₂ (≈560 µM).

Assay Apoptosis dan Live-Dead

Sel yang pre-treated dengan Ce-doped CNPs (0–400 µg/mL) kemudian ditantang dengan H₂O₂ 560 µM selama 4 jam. Pewarnaan live-dead (Calcein-AM/PI) dilakukan pada sel 7721 yang dibudidayakan pada plates 6-well, dan citra fluoresensi ditangkap di bawah mikroskop konfokal.

Analisis Apoptosis dengan Citometri Alir

Setelah ekpos H₂O₂, sel 7721 dipanen, dicuci, dan diwarnai dengan Annexin V-FITC dan PI. Sampel dianalisis pada sitometer Beckman Coulter Epics XL MCL; persentase sel apoptosis awal (Annexin V⁺/PI⁻) dan akhir (Annexin V⁺/PI⁺) dihitung menggunakan FlowJo 7.6.2.

Analisis Statistik

Data mewakili mean ± SEM. Satu-way ANOVA diikuti dengan uji post-hoc Tukey diterapkan; p < 0,05 dianggap berarti secara statistik.

Hasil dan Diskusi

Sintesis dan Morfologi Nanopartikel

Strategi biomineralisasi menghasilkan Ce-doped CNPs yang sangat monodispers, seperti yang ditunjukkan oleh TEM (Gambar 1a). Partikel menampilkan morfologi poligonal, non-agregat dengan diameter rata-rata 14,7 ± 0,8 nm (Gambar 1b). Dispersi air tetap jernih selama beberapa hari, menunjukkan stabilitas koloidal yang luar biasa—keuntungan kunci untuk pengiriman biomedis.

a Citra TEM Ce-doped CNPs. b Distribusi ukuran.

Skema desain Ce-doped CNP.

Kimia Permukaan dan Status Oksidasi

Analisis XPS mengonfirmasi koeksistensi Ce³⁺ (≈15,99 %) dan Ce⁴⁺, yang mendasari sifat redox-aktif partikel (Gambar 2b). Spektra C 1s (Gambar 2c) mengungkapkan puncak pada 285,0, 287,8, dan 288,9 eV, yang sesuai dengan grup C–C, C=O, dan C–O, sementara spektra O 1s (Gambar 2d) menampilkan puncak pada 530,5 dan 531,8 eV, yang mengindikasikan ikatan Ce–O dan hidroksil permukaan. Spektra FT-IR (Gambar 3A) menampilkan gerangan O–H lebar pada 3400 cm⁻¹ dan puncak terkait nitrat pada 1510 dan 1450 cm⁻¹, mengonfirmasi kehadiran grup fungsional hidrofilik dan penyertaan ion cerium yang berhasil.

a Spektra survei XPS. b Spektra Ce 3d. c Spektra C 1s. d Spektra O 1s.

Spektra FT-IR BSA dan Ce-doped CNPs (a). Pola XRD (b). Absorpsi UV-Vis Ce-doped CNPs (c). Absorbansi MV setelah berbagai perawatan (d). a MV saja. b MV + H₂O₂ + Ce-doped CNPs. c MV + FeSO₄ + H₂O₂. d MV + FeSO₄ + H₂O₂ + Ce-doped CNPs setelah 5 menit.

Pola XRD (Gambar 3B) mengungkapkan puncak karakteristik jaringan hibrid karbon-cerium, dengan puncak karbon di sekitar 24,4° dan refleksi ceria pada 30,3°, 35,23°, dan 43,2°, mengonfirmasi integrasi Ce ke dalam kerangka karbon yang berhasil.

Sitotoksitas In Vitro

Assay CCK-8 menunjukkan bahwa Ce-doped CNPs tidak mengganggu kehidupan sel pada konsentrasi hingga 400 µg/mL (Gambar 4a). Bahkan pada dosis tertinggi, kehidupan sel tetap di atas 90 %, menekankan biokompatibilitas yang luar biasa partikel.

a Kehidupan sel setelah ekpos Ce-doped CNP. b Kehidupan VSMC di bawah H₂O₂ 560 µM (CCK-8). c Kehidupan sel 7721 di bawah stres oksidatif yang sama.

Efektivitas Antioksidan

H₂O₂ 560 µM diidentifikasi sebagai LD₅₀ untuk sel VSMC dan 7721. Pre-treatment dengan Ce-doped CNPs secara signifikan meningkatkan kelangsungan hidup secara dosis-dependen, dengan 400 µg/mL memulihkan kehidupan sel ke sekitar 88 % (Gambar 4c). Pewarnaan live-dead (Gambar 5) menunjukkan penurunan yang jelas sel merah (PI-positif) seiring peningkatan Ce-doped CNPs, mengonfirmasi perlindungan terhadap apoptosis oksidatif. Citometri alir (Gambar 6) mengukur apoptosis: H₂O₂ saja menginduksi apoptosis akhir sebesar 46,4 %, yang turun menjadi 24,2, 20,0, 15,1, dan 11,2 % dengan 50, 100, 200, dan 400 µg/mL Ce-doped CNPs, masing-masing.

Pewarnaan live-dead sel 7721 setelah ekpos H₂O₂ dan perawatan Ce-doped CNP (skala bar = 50 µm).

Profil citometri alir sel 7721: apoptosis awal (Annexin V⁺/PI⁻) dan akhir (Annexin V⁺/PI⁺) di bawah berbagai perawatan.

Kesimpulan

Kami telah mengembangkan sintesis satu tahap hijau dari nanopartikel karbonas doped cerium yang sangat dispersibel, biokompatibel, dan menunjukkan pengasupan radikal hidroksil yang kuat. Partikel mempertahankan siklus redoks Ce³⁺/Ce⁴⁺ intrinsik, memungkinkan mereka meniru aktivitas SOD dan CAT dan melindungi sel vaskular dan tumor dari cedera oksidatif yang diinduksi H₂O₂. Efektivitas antioksidan dosis-dependen dan sitotoksitas minimal memosisikan Ce-doped CNPs sebagai kandidat menarik untuk pencegahan dan pengobatan patologi yang terkait stres oksidatif.