Pembuatan Mikrosfer rGO@Fe3O4 dengan Mudah untuk Terapi Kanker Kemoterapi-Fototermal Responsif NIR dan Target Magnetik
Abstrak
Grafena yang merespons cahaya inframerah dekat (NIR) telah menunjukkan efek menarik pada terapi ablasi fototermal kanker. Dalam penelitian ini, kami melaporkan pembuatan mikrosfer grafen berongga dengan hiasan Fe3O4 (rGO@Fe3O4) melalui metode spray drying dan coprecipitation yang sederhana untuk terapi kombinasi kemoterapi-fototermal yang responsif NIR dan target magnetik. Mikrosfer ini menunjukkan luas permukaan spesifik yang sangat tinggi (sekitar 120,7 m² g⁻¹) dan volume pori yang besar (sekitar 1,012 cm³ g⁻¹), yang memberikan keuntungan yang jelas untuk kapasitas muatan DOX yang tinggi (sekitar 18,43%). Efek fototermal yang dipicu NIR pada mikrosfer rGO@Fe3O4 merespons dengan cara on-off dan menginduksikan efesiensi konversi fototermal yang tinggi. Selain itu, Fe3O4 pada mikrosfer menunjukkan kemampuan targeting sel tumor yang luar biasa. Pengobatan kemoterapi-fototermal berbasis rGO@Fe3O4/DOX menunjukkan sitotoksisitas yang unggul terhadap sel Hela in vitro. Studi kami menunjukkan bahwa mikro-kapsul rGO@Fe3O4/DOX memiliki potensi besar dalam pengobatan kombinasi kemoterapi-fototermal kanker.
Pendahuluan
Kanker adalah salah satu penyakit paling ganas di dunia dan merupakan penyebab utama kematian manusia [1, 2]. Meskipun kemoterapi umum digunakan dalam pengobatan kanker klinis, beberapa masalah utama termasuk efesiensi terapi yang rendah dan efek samping yang luas serius membatasi penerapannya [3]. Sistem pengiriman obat (DDS) telah menunjukkan keuntungan besar dalam meningkatkan keterlarutan obat, biodistribusi, dan akumulasi tumor, yang diharapkan dapat secara signifikan meningkatkan efesiensi antitumor mereka [4]. Akhirnya, mikrosfer berongga yang digunakan sebagai sistem pengiriman obat telah mendapat perhatian yang meningkat karena luas permukaannya yang besar dan struktur pori yang melimpah [5,6,7,8], dan beberapa materi mikrosfer berongga telah dirancang dengan teknologi inovatif [9,10,11,12,13].
Oksida grafen (GO), jenis materi anorganik bebas logam baru, telah banyak diteliti dalam pengiriman obat karena fitur uniknya, seperti kompatibilitas biologis yang baik, biaya rendah, dan persiapan yang sederhana [14,15,16,17]. Secara khusus, oksida grafen dapat secara efektif mengubah cahaya menjadi panas ketika dipicu dengan sinar NIR [18,19,20], menjadi strategi yang menjanjikan untuk meningkatkan efek terapi fototermal kanker. Kelompok Chen telah melaporkan bahwa GO dapat mengirimi obat anticancer melalui interaksi non-kovalen seperti tumpukan π-π, ikatan hidrogen, dan adsorpsi elektrostatis [21]. Namun, lembar nanosheet oksida grafen 2D cenderung mengaglomerasi karena luas permukaan spesifik yang besar serta ikatan van der Waals antara lapisan grafen [17, 22], resulting in poor solubility in water and decreasing drug loading ability. Beberapa strategi telah dieksplorasi untuk mengatasi kekurangan ini. Kelompok Tsukruk telah mengembangkan kapsul berongga grafen menggunakan teknologi susunan lapis demi lapis [23], yang menunjukkan muatan obat yang sangat tinggi dibandingkan dengan materi GO lainnya. Hal ini dapat disumbangkan oleh luas permukaan spesifik dan volume pori yang besar dari kapsul berongga yang stabilized oleh GO. Namun, sedikit laporan yang merujuk pada studi GO dengan struktur pori terhubung tiga dimensi untuk pengiriman obat.
Meskipun banyak sistem pengiriman obat yang dilaporkan telah menunjukkan kemampuan muatan obat yang unggul dan perilaku pelepasan obat yang terkontrol, penelitian pralain dan penerapannya juga terbatas karena spesifisitas yang tidak mencukupi untuk menargetkan jaringan tumor [24]. Di antara berbagai sistem pengiriman obat target, Fe3O4, bahan target magnetik, banyak digunakan dalam terapi kanker karena respons magnetik yang tinggi, kualitas stabil, dan pencapaian yang mudah [25,26,27,28,29]. Kelompok Ni telah mengembangkan nanopartikel struktur inti-kulit Fe3O4@SiO2 dengan properti superparamagnetik untuk targeting magnetik tumor [30]. Selain itu, nanopartikel GO yang diancarkan Fe3O4 telah banyak diteliti dalam kombinasi pengiriman obat target magnetik dan terapi fototermal [31,32,33,34].
Dalam studi ini, kami melaporkan strategi canggah untuk mengembangkan platform DDS yang terdiri dari mikrosfer berongga rGO dengan hiasan oksida besi (rGO@Fe3O4) untuk terapi fototermal (PTT) yang dipicu NIR dan target magnetik. Seperti yang digambarkan dalam Skema 1, mikrosfer berongga rGO@Fe3O4 dipersiapkan melalui tiga langkah. Pertama, rGO-SiO2 disintesis dengan metode spray drying menggunakan SiO2 sebagai templat, dan kemudian mikrosfer berongga rGO diperoleh dengan menghilangkan SiO2 melalui pengasetan HF. Setelah itu, nanopartikel Fe3O4 diancarkan pada mikrosfer berongga rGO untuk membentuk mikrosfer rGO@Fe3O4. Dalam sistem ini, rGO berfungsi sebagai agen PTT yang dipicu NIR, dan Fe3O4 dapat memberikan properti targeting magnetik terhadap sel Hela. Mikrosfer terenkapsulasi Doxorubicin (DOX) (rGO@Fe3O4/DOX) berdasarkan adsorpsi pori dan tumpukan π-π, diharapkan menunjukkan kapasitas muatan obat yang ultra-tinggi dan perilaku pelepasan obat yang responsif pH, dan dapat secara signifikan meningkatkan efek anticancer untuk kombinasi fototermal-kemoterapi.
Ilustrasi skematis mikrosfer rGO@Fe3O4/DOX dan kombinasi fototermal-kemoterapi untuk inhibisi tumor
Bahan dan Metode
Bahan
Klorida besi heksahidrat (FeCl3·H2O), natrium hidroksida (NaOH), dan sulfat besi heptahidrat (FeSO4·7H2O) dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Sel Hela berasal dari Rumah Sakit Kanker Tianjin. Penyangga fosfat (PBS), hidroklorida Doxorubicin (DOX·HCl), medium minimum esensial Dulbecco (DMEM), 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), dan kit perhitungan sel-8 (CCK-8) dibeli dari Solarbio Science and Technology Co., Ltd. SiO2 (sekitar 300 nm) dibeli dari Shanghai Yuanjiang Chemical Company. Larutan deion air oksida grafen (2 mg/ml) adalah produk komersial dari Nanjing Xianfeng Company.
Persiapan Mikrosfer rGO@Fe3O4
Mikrosfer grafen berongga dipersiapkan melalui metode spray drying menggunakan SiO2 (300 nm) sebagai templat. Secara singkat, 100 mL larutan suspensi SiO2 (50 mg mL⁻¹) ditambahkan perlahan ke dalam 300 mL larutan air GO (2 mg mL⁻¹) di bawah pengadukan keras, larutan campuran kemudian di-keringkan spray pada 200 °C dalam unit spray dryer. Selanjutnya, produk disimpan pada 300 °C di bawah perlindungan Ar selama 2 jam dan rGO-SiO2 diperoleh. Untuk menghilangkan SiO2, rGO-SiO2 ditempatkan dalam larutan HF (10%) selama 48 jam pada 60 °C. Produk padat dicuci beberapa kali dan dikeringkan dalam oven kering vakum pada 60 °C selama 12 jam, rGO akhirnya diperoleh dengan rendemen 75%.
Nanopartikel rGO@Fe3O4 disiapkan melalui metode coprecipitation. Dalam proses typikal sintesis nanopartikel rGO@Fe3O4, 0,27 g FeCl3·H2O, 0,28 g FeSO4·7H2O, dan 0,1 g mikrosfer berongga rGO dilarutkan dalam 10 mL air deion dan diaduk selama 30 menit pada 50 °C. Kemudian, 60 mL NaOH (0,15 mol L⁻¹) ditambahkan perlahan di bawah pengadukan berkelanjutan pada 50 °C selama 12 jam. Produk akhirnya dipisahkan secara magnetik dan dicuci berulang kali dengan air deion dan etanol beberapa kali, diikuti dengan pengeringan pada 60 °C di bawah vakum selama 12 jam.
Karakterisasi Struktur
Ukuran dan morfologi sampel dianalisis menggunakan mikroskop elektron emis medan (FE-SEM, Hitachi, S-4800) dan mikroskop elektron transmisi (TEM, JEM2100F, JEOL). Komposisi produk dianalisis melalui sistem difraksi X (XRD, D8 Focus, radiasi Cu Ka, Bruker, Jerman) dengan laju pemindaian 12 °/min dalam rentang 10 hingga 80°. Selain itu, spektroskopi fotoelektron X (XPS) dilakukan pada spektrometer XPS (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, Amerika). FTIR (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) direkam dari 500 hingga 4000 cm⁻¹ dengan resolusi 4 cm⁻¹. Pengukuran magnetik dilakukan menggunakan magnetometer interferensi kuantum superkonduktor (SQUID, Quantum Design MPMS) pada suhu ruangan (300 K). Spektra Raman dikumpulkan menggunakan spektroskop Raman (Renishaw, inVia Reflex, Inggris) dengan laser panjang gelombang 532 nm. Kandungan rGO dievaluasi menggunakan analyzer termogravimetri (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600). Luas permukaan spesifik diukur menggunakan teknik Brunauer-Emmett-Teller (BET). Spektra UV-Vis direkam menggunakan analyzer asam nukleat/protein Beckman DU 800 (Beck-man Instruments, Inc., Rosemead, CA).
Pemuatan dan Pelepasan DOX
DOX, obat kemoterapi model doxorubicin, dienkapsulasi ke dalam inti rGO@Fe3O4 untuk mengevaluasi perilaku pemuatan dan pelepasan obat anticancer in vitro. rGO@Fe3O4/DOX disiapkan menurut referensi sebelumnya. Secara singkat, 10 mL (0,2 mg mL⁻¹) larutan air DOX ditambahkan ke dalam 10 mg larutan rGO@Fe3O4, campuran dihomogenkan ultrasonik untuk memastikan tidak ada endapan yang signifikan. Kemudian, campuran diseimbangkan pada pengocok bolak-balik (SK-O180-Pro) dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam. Setelah sentrifugas pada 6000 rpm selama 10 menit, DOX yang tidak dimuat dihilangkan, supernatant rGO@Fe3O4/DOX diukur melalui spektrofotometer UV-Vis untuk menentukan jumlah DOX yang dimuat. OD DOX direkam pada 490 nm, persamaan berikut digunakan untuk menghitung efisiensi pemuatan (LE) dan kapasitas pemuatan (LC) DOX:
LE = (jumlah total DOX - DOX bebas) / jumlah total DOX
LC = (jumlah total DOX - DOX bebas) / jumlah rGO@Fe3O4/DOX
Studi pelepasan in vitro DOX dilakukan dengan menempatkan rGO@Fe3O4/DOX (10 mg) dalam kantong dialisis (MWCO = 1000) dengan penyangga fosfat (PBS, 30 mL) pada pH 5,4, 6,5, atau 7,4, menempatkannya dalam bak air 37 °C dan mengocok pada 80 rpm. Pada interval yang ditentukan, 3 mL medium pelepasan dikumpulkan dan jumlah DOX yang dilepaskan dihitung dengan mengukur UV-Vis pada 480 nm.
Efek Fototermal yang Dipicu NIR pada Mikrosfer rGO@Fe3O4
Untuk memantau pengaruh dosis rGO@Fe3O4 pada efek fototermal yang dipicu NIR, larutan rGO@Fe3O4 dengan konsentrasi berbeda (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, dan 1 mg mL⁻¹) diiradiasi dengan laser NIR pada 2 W cm⁻² selama 5 menit, masing-masing. Selain itu, pengaruh energi NIR pada efek fototermal dievaluasi dengan mengiradiasi rGO@Fe3O4 (0,25 mg mL⁻¹) dengan daya berbeda (1 W cm⁻², 1,5 W cm⁻², 2 W cm⁻²) selama 5 menit. Suhu real-time diukur menggunakan kamera termal inframerah FLIR I5.
Serapan In Vitro
Sel Hela ditanam dalam piring konfokal 35 mm² dengan kepadatan 1 × 10⁵ sel/well. Setelah diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator (5% CO2, 37 °C), medium dihilangkan, dan medium segar yang berisi mikrosfer rGO@Fe3O4/DOX dan rGO@Fe3O4/DOX dengan magnet ditambahkan dan dikultivasi selama 5 jam lagi. Konsentrasi rGO@Fe3O4/DOX adalah 0,1 mg mL⁻¹. Sel kemudian dicuci tiga kali dengan PBS dingin (pH = 7,4) dan dikonfig dengan larutan paraformaldehida 4% selama 20 menit (CLSM, TCSSP5II, Leica, Ernst-Leitz-Strasse, Jerman).
Uji Kehidupan Sel
Sitotoksisitas mikrosfer ini dievaluasi dengan uji CCK-8 setelah perawatan NIR. Sel HeLa ditanam pada piring 96-lubang (5 × 10³ sel/well) dalam 100 μL medium dan dikultur dalam 5% CO2 pada 37 °C selama 24 jam. Untuk penilaian kompatibilitas biologis, rGO@Fe3O4 ditambahkan ke dalam well dengan rentang konsentrasi 0,01 hingga 0,2 mg mL⁻¹; untuk kelompok terapi fototermal tunggal, rGO@Fe3O4 ditambahkan dengan rentang konsentrasi 0,01 hingga 0,2 mg mL⁻¹, dan menerapkan sinar NIR selama 10 menit (2 W cm⁻², 808 nm); untuk kelompok kombinasi fototermal-kemoterapi, rGO@Fe3O4/DOX ditambahkan dengan rentang konsentrasi rGO@Fe3O4/DOX dari 0,01 hingga 0,2 mg mL⁻¹, dan penerapan sinar NIR selama 10 menit (2 W cm⁻², 808 nm). Sel kemudian diinkubasi selama 24 jam atau 48 jam. Setelah itu, sel dicuci dengan PBS dan diinkubasi dalam 100 μL medium DMEM yang berisi 10 μL larutan CCK-8 selama 40 menit lagi. Kehidupan sel terdeteksi menggunakan pembaca mikroliting pada panjang gelombang 450 nm. Semua eksperimen dilakukan dalam tiga kali pengulangan.
Hasil dan Pembahasan
Sintesis dan Karakterisasi Morfologi
Persiapan mikrosfer rGO@Fe3O4 dilakukan melalui tiga langkah. Pertama, mikrosfer rGO-SiO2 disintesis melalui spray drying menggunakan SiO2 sebagai templat. Morfologi mikrosfer rGO-SiO2 dikarakterisir melalui SEM dan TEM. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a, mikrosfer rGO-SiO2 dengan diameter 3 μm menunjukkan bentuk bola yang seragam dan terdiri dari banyak nanopartikel SiO2 yang padat (sekitar 300 nm). Data TEM dan diameter hidrodinamis yang diukur melalui pencaran cahaya dinamis juga mengonfirmasi hasilnya (Gambar 1d, g). Kemudian, mikrosfer berongga rGO diperoleh dengan menghilangkan SiO2 dari rGO-SiO2 melalui pemanasan pada 300 °C dan pengasetan HF. Pori yang jelas dengan ukuran pori sekitar 300 nm dapat diamati karena pelarutan SiO2 (Gambar 1b, e). Akhirnya, Fe3O4 dengan kemampuan targeting magnetik dihiasi pada rGO berpori melalui metode coprecipitation. Pengamatan SEM dan TEM mengilustrasikan bahwa penurunan yang signifikan ukuran pori setelah pemuatan Fe3O4 diperoleh (Gambar 1c, f), memberikan kelayakan pengiriman obat dan pelepasan obat yang terkontrol. Secara khusus, ukuran partikel dan distribusi ukuran hidrodinamis rGO-SiO2, rGO, rGO@Fe3O4 tidak menunjukkan perubahan yang terlihat selama perawatan ini (Gambar 1g, h, i).
Karakterisasi morfologi mikrosfer. Gambar SEM dari (a) rGO-SiO2, (b) rGO, (c) rGO@Fe3O4; gambar TEM dari (d) rGO-SiO2, (e) rGO, (f) rGO@Fe3O4; distribusi ukuran hidrodinamis sampel yang sesuai (g) rGO-SiO2, (h) rGO, (i) rGO@Fe3O4
Karakterisasi Struktur dan Komposisi
Untuk mengonfirmasi lebih lanjut pembuatan yang berhasil rGO@Fe3O4, SEM dengan EDS digunakan untuk menyelidiki struktur dan komposisi mikrosfer. Citra EDS rGO@Fe3O4 dikarakterisir melalui visualisasi elektron yang diserakkan tidak elastis dalam jendela kehilangan energi untuk unsur O, Fe, dan C, dan area warna yang berbeda mewakili lokasi yang kaya O, Fe, dan C dalam struktur nyata, masing-masing. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a dan b, Fe dan O tersebar luas dalam mikrosfer rGO@Fe3O4 dengan densitas muatan tinggi. Gambar 2d mengonfirmasi bahwa nanopartikel Fe3O4 tersebar seragam dalam rGO dengan diameter sekitar 18 nm, menghasilkan penurunan tajam ukuran pori dalam mikrosfer rGO@Fe3O4. Pola difraksi elektron area terpilih (SAED) lebih lanjut memverifikasi kehadiran Fe3O4 dalam rGO (Gambar 2e), resonansi karakteristik pada jarak muka 2,98 nm, 2,53 nm, 2,09 nm, 1,62 nm, dan 1,49 nm yang ditetapkan pada bidang 220, 311, 400, 511, dan 440 fase kubik terpusat muka Fe3O4, masing-masing. Puncak yang muncul pada 220, 311, 400, 511, dan 440 yang sesuai dengan Fe3O4 juga terdeteksi dalam spektra XRD, yang konsisten dengan hasil SAED (Gambar 2c). Namun, dilaporkan bahwa Fe3O4 dan γ-Fe2O3 tidak dapat dibedakan melalui pola XRD secara independen karena lokasi puncak karakteristik yang sama [35]. Hasil XPS menunjukkan puncak dominan pada 725,9/724,5 eV dan 714,1/711,0 eV, yang sesuai dengan Fe2p1/2 dan Fe 2p3/2 dari rGO@Fe3O4 (Gambar 2g, h), masing-masing, menunjukkan koeksistensi Fe3+ dan Fe2+ dalam Fe3O4 [36]. Analisis termogravimetri (TGA) dilakukan untuk memantau perilaku degradasi termal rGO dalam mikrosfer rGO@Fe3O4 dengan memanaskan sampel hingga 800 °C dan pendinginan hingga 100 °C dalam atmosfer udara (Gambar 2f). Kurva kehilangan massa menunjukkan dua daerah kehilangan massa yang berbeda termasuk daerah dehidrasi (40-300 °C) dan daerah devalatilisasi (300-800 °C) rGO dalam rGO@Fe3O4, konten karbon yang dihitung dari sampel adalah 25,6 wt%.
Karakterisasi struktur dan komposisi rGO@Fe3O4. (a, b) gambar pemetaan SEM dengan EDS mikrosfer rGO@Fe3O4: unsur C, Fe, dan O; (c) pola XRD mikrosfer rGO-SiO2, rGO, dan rGO@Fe3O4; (d, e) citra SAED mikrosfer rGO@Fe3O4; (f) kurva TG mikrosfer rGO@Fe3O4; (g, h) spektral XPS mikrosfer rGO@Fe3O4; (i) loop histerisis magnetik Fe3O4 dan mikrosfer rGO@Fe3O4 (inset atas menunjukkan nilai medan paksa (Hc) sampel, dan inset bawah menunjukkan suspensi mereka sebelum dan setelah pemisahan magnetik dengan magnet eksternal)
Properti magnetik mikrosfer rGO@Fe3O4 diselidiki menggunakan interferensi kuantum superkonduktor. Medan magnetik dilakukan dengan rentang pemindaian dari -20.000 hingga 20.000 Oe pada suhu ruangan. Gambar 2i menunjukkan nilai magnetisasi jenuh (Ms) dan medan paksa (Hc) Fe3O4 adalah 66,6 emu g⁻¹ dan 9,3 Oe. Setelah memuat Fe3O4 pada rGO, nilai Ms dan Hc mikrosfer rGO@Fe3O4 menurun menjadi 33,9 emu g⁻¹ dan 7,44 Oe. Penurunan yang signifikan dalam magnetisasi jenuh dapat disumbangkan oleh properti diamagnetik rGO dalam mikrosfer rGO@Fe3O4. Selain itu, kemampuan aglomerasi selektif mikrosfer rGO@Fe3O4 dilakukan secara intuitif melalui eksperimen pemisahan magnetik. Suspensi mikrosfer Fe3O4 dan rGO@Fe3O4 dimasukkan ke dalam vial dengan magnet eksternal selama 2 menit, suspensi dapat dikonsentrasi ke sisi magnet dan larutan air menjadi transparan. Ketika magnet diangkat, mikrosfer rGO@Fe3O4 terdistribusi seragam lagi setelah diayunkan perlahan, menunjukkan bahwa mikrosfer rGO@Fe3O4 memiliki kelebihan kemampuan disperdi air yang baik. Kemampuan disperdi air yang baik dan properti respons magnetik yang unggul membuka jalan untuk aplikasi targeting magnetik rGO@Fe3O4 sebagai pengirim obat dalam pengobatan kanker.
Analisis Efek Fototermal
Mengpertimbangkan penetrasi yang lebih dalam ke dalam jaringan dan kerusakan yang lebih sedikit pada jaringan di sekitarnya dari NIR, terapi fototermal responsif NIR sering digunakan untuk pengobatan tumor. Oleh karena itu, perilaku transformasi fototermal larutan air rGO@Fe3O4 pada konsentrasi dan densitas daya berbeda direkam di bawah iradiasi laser NIR pada 808 nm selama 5 menit. Gambar 3a, b menunjukkan bahwa kenaikan suhu rGO@Fe3O4 sangat tergantung pada konsentrasi dan densitas daya laser. Ketika konsentrasi mikrosfer mencapai 1 mg mL⁻¹, suhu meningkat dari 27,9 hingga 70,3 °C di bawah iradiasi laser NIR selama 5 menit pada 2 W cm⁻², sementara suhu untuk kelompok PBS hanya meningkat dari 31,7 hingga 36,2 °C. Efesiensi konversi fototermal yang tinggi rGO@Fe3O4 akan memiliki potensi besar untuk terapi fototermal tumor menurut laporan sebelumnya bahwa degenerasi protein dan kerusakan DNA dalam sel akan terjadi saat terpapar 50 °C selama 4 hingga 6 menit [21, 37]. Untuk menampilkan secara intuitif perilaku transformasi fototermal rGO@Fe3O4, termografi inframerah dilakukan dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar 4c. Larutan rGO@Fe3O4 dengan konsentrasi 1 mg mL⁻¹ dengan cepat meningkat menjadi 70,3 °C setelah iradiasi NIR selama 5 menit, sementara kelompok air tidak menunjukkan perubahan yang jelas, yang konsisten dengan hasil termometri. Selain itu, stabilitas fototermal rGO@Fe3O4 diteliti dengan melakukan prosedur laser on/off dengan laser 808 nm pada 2 W cm⁻² untuk enam siklus (Gambar 3d). Kenaikan suhu yang identik diperoleh, menunjukkan stabilitas fototermal NIR yang sempurna dari komposit rGO@Fe3O4. Hasil ini menunjukkan bahwa mikrosfer rGO@Fe3O4 memiliki janji yang besar sebagai agen fototermal untuk terapi fototermal dalam kanker.
Efek fototermal rGO@Fe3O4. a Perubahan suhu yang bergantung pada konsentrasi larutan rGO@Fe3O4 pada konsentrasi berbeda (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, dan 1 mg mL⁻¹) di bawah iradiasi 808 nm pada 2 W cm⁻² selama 5 menit. b Respons suhu yang bergantung pada daya larutan rGO@Fe3O4 0,25 mg mL⁻¹ di bawah iradiasi laser NIR 808 nm selama 5 menit (1 W cm⁻², 1,5 W cm⁻², 2 W cm⁻²). c Citra termal inframerah larutan rGO@Fe3O4 pada interval 0, 1, 2, 3, 4, dan 5 menit yang dipicu pada 808 nm (2 W cm⁻²). d Kenaikan suhu larutan rGO@Fe3O4 (0,25 mg mL⁻¹) selama 6 siklus laser on/off berturut-turut di bawah iradiasi 808 nm pada 2 W cm⁻²
Luas permukaan dan ukuran pori mikrosfer rGO@Fe3O4, perilaku pemuatan dan pelepasan DOX. a Isoterm adsorpsi-desorpsi nitrogen rGO@Fe3O4. b Distribusi ukuran pori rGO@Fe3O4. c Spektra FTIR rGO@Fe3O4 dan rGO@Fe3O4/DOX. d, e) citra SEM dan pemetaan N, Fe, dan O mikrosfer rGO@Fe3O4/DOX. f Kurva kinetika pelepasan obat yang diperoleh pada nilai pH berbeda mikrosfer rGO@Fe3O4. g Kurva kinetika pelepasan DOX responsif NIR
Pemuatan dan Pelepasan Obat
Luas permukaan dan ukuran pori rGO@Fe3O4 dievaluasi melalui analisis BET dan BJH (Gambar 2a, b). Jenis kurva adsorpsi-desorpsi N2 adalah isoterm tipe IV, dan luas permukaan serta ukuran pori adalah 120,7 m² g⁻¹, 2-8 nm, dan 1,012 cm³ g⁻¹, masing-masing. Hasilnya menunjukkan bahwa rGO@Fe3O4 memiliki saluran mesoporos dan distribusi ukuran pori rata-rata, menunjukkan potensi besar untuk pemuatan obat antitumor. Kemudian, mikrosfer rGO@Fe3O4 dengan struktur pori digunakan untuk memuat obat kemoterapi model doxorubicin melalui campuran sederhana dan sonikasi ringan. Analisis ATR-FTIR lebih lanjut memverifikasi incorporasi stabil DOX dalam rGO@Fe3O4 karena resonansi karakteristik -COOH dan kelompok benzen DOX pada 1726 cm⁻¹ dan 1618 cm⁻¹ (Gambar 4c). Pengamatan mikroskop elektron pemindaian (SEM) menunjukkan bahwa sinyal baru unsur N yang ditetapkan pada DOX tersebar seragam dalam mikrosfer setelah pemuatan DOX (Gambar 4d, e). Selain itu, efisiensi pemuatan (LE) dan kapasitas pemuatan (LC) rGO@Fe3O4/DOX adalah 92,15% dan 18,43%, masing-masing. LC yang jauh lebih tinggi rGO@Fe3O4/DOX dibandingkan banyak pengirim obat dapat disumbangkan oleh luas permukaan dan ukuran pori yang sangat tinggi [19]. LE yang tinggi rGO@Fe3O4/DOX dapat disumbangkan oleh dua aspek, satu adalah rGO@Fe3O4 dapat berinteraksi dengan DOX melalui tumpukan π-π yang kuat antara ikatan π hibridisasi sp2 rGO@Fe3O4 dan bagian kinina DOX [21], dan yang lain mungkin adalah mereka dapat membentuk ikatan hidrogen antara asam karboksil (-COOH), hidroksil (-OH) rGO@Fe3O4 dan amina (-NH2), hidroksil (-OH) DOX. Kemudian, kami memantau perilaku pelepasan DOX dalam PBS pada pH 7,4, 6,5, dan 5,4, untuk meniru lingkungan ekstraseluler jaringan tumor dan jaringan normal. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4f, laju pelepasan DOX dipercepat ketika pH disesuaikan dari 7,4 menjadi 5,4, dan pelepasan berkelanjutan DOX pada pH 5,4 dapat mencapai 73% setelah perawatan 98 jam. Oleh karena itu, profil pelepasan kumulatif DOX dari rGO@Fe3O4 menunjukkan cara yang bergantung pada pH. Pelepasan yang dipercepat ini di dalam kondisi asam dapat disebabkan oleh protonisasi parsial kelompok hidroksil dan amina DOX, yang mengarah pada keterlarutan obat yang lebih tinggi dan penurunan ikatan hidrogen antara DOX dan grafen [38]. Selain itu, kami juga mempelajari perilaku pelepasan DOX responsif NIR in vitro. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4g, pelepasan DOX dipercepat oleh radiasi NIR dan laju pelepasan DOX mencapai 85%. Perilaku responsif pH dan NIR stimuli ini memainkan peran penting dalam pengiriman obat yang efektif menuju situs tumor.
Serapan Sel In Vitro
Untuk memverifikasi kemampuan targeting magnetik Fe3O4 dalam mikrosfer rGO@Fe3O4, eksperimen serapan sel dengan atau tanpa perawatan medan magnetik diselidiki secara kualitatif melalui mikroskop laser pemindaian konfokal (CLSM). Sel Hela diinkubasi dengan rGO@Fe3O4/DOX selama 4 jam dan inti sel Hela diwarnai dengan DAPI. Hasil pada Gambar 5 menunjukkan bahwa titik hitam yang sesuai dengan mikrosfer rGO@Fe3O4 dan sinyal fluoresensi merah yang jelas yang ditetapkan pada DOX diamati dalam kelompok rGO@Fe3O4 dengan perawatan medan magnetik. Sebaliknya, ada lebih sedikit titik hitam dan fluoresensi DOX yang lebih lemah dapat ditemukan ketika kelompok rGO@Fe3O4 tanpa pemuatan medan magnetik. Penjelasannya mungkin adalah bahwa titik hitam yang disumbangkan oleh rGO@Fe3O4 yang internalisasi ke dalam sel dapat dipromosikan oleh magnet. Hasilnya menunjukkan bahwa Fe3O4 dalam rGO@Fe3O4/DOX dapat secara spesifik menargetkan sel Hela secara efisien dan secara signifikan meningkatkan internalisasi sel mikrosfer, menunjukkan kemampuan targeting magnetik yang menguntungkan sistem pengiriman obat dalam terapi kanker.
Evaluasi target magnetik mikrosfer rGO@Fe3O4-DOX. Citra CLSM sel HeLa yang diinkubasi dengan rGO@Fe3O4/DOX dengan dan tanpa magnet (inset menunjukkan citra pada perbesar tinggi)
Analisis Sitotoksisitas In Vitro
Kompatibilitas biologis rGO@Fe3O4 dievaluasi menggunakan uji CCK-8 terhadap sel Hela. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6a, setelah diinkubasi dengan rGO@Fe3O4 pada rentang konsentrasi yang berbeda yang luas, kehidupan sel juga lebih dari 90% bahkan pada konsentrasi tinggi hingga 200 μg mL⁻¹, hasilnya menunjukkan bahwa rGO@Fe3O4 menunjukkan kompatibilitas biologis yang tinggi dan dapat berfungsi sebagai platform pengiriman obat yang efisien. Efesiensi terapi fototermal rGO@Fe3O4 lebih lanjut diselidiki setelah diinkubasi dengan sel Hela selama 24 jam dan 48 jam di bawah iradiasi cahaya NIR (laser NIR 808 nm, 10 menit). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6b, fototoksisitas jelas bergantung pada dosis pada stimulasi NIR, dan kehidupan sel menurun dari 90,37 menjadi 35,52% pada 24 jam, dan dari 93,77 menjadi 31,75% pada 48 jam, yang mengindikasikan bahwa rGO@Fe3O4 memiliki fototoksisitas yang unggul dan memiliki janji yang besar dalam terapi fototermal. Untuk mengestimasi efesiensi terapi sinergis fototermal-kemoterapi, sitotoksisitas rGO@Fe3O4/DOX terhadap sel Hela dengan dan tanpa iradiasi NIR diteliti. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6c, d, kehidupan sel menunjukkan cara yang bergantung pada konsentrasi dan terkontrol waktu. Sekitar 65% dan 80% sel Hela dibunuh oleh rGO@Fe3O4/DOX tanpa iradiasi NIR dan DOX pada 24 jam, penurunan kemampuan pembunuh tumor rGO@Fe3O4/DOX dibandingkan DOX bebas mungkin disebabkan oleh perilaku pelepasan DOX yang tertunda dari mikrosfer rGO@Fe3O4/DOX. Setelah iradiasi laser NIR (laser NIR 808 nm, 10 menit), rGO@Fe3O4/DOX dengan kelompok laser membunuh lebih dari 86% sel pada dosis DOX yang setara (30 μg mL⁻¹). Hasil serupa dapat diamati setelah perawatan sel yang sama selama 48 jam, penurunan kehidupan sel DOX, rGO@Fe3O4/DOX, rGO@Fe3O4/DOX dengan iradiasi NIR adalah 80%, 76%, dan 90%, masing-masing, menunjukkan efek sinergis dari kombinasi terapi fototermal dan kemoterapi.
Kompatibilitas biologis dan efesiensi terapi fototermal tunggal atau kombinasi fototermal-kemoterapi. a Kehidupan sel sel Hela yang dikultur dengan rGO@Fe3O4 selama 24 jam dan 48 jam. b Kehidupan sel sel Hela yang dikultur dengan atau tanpa iradiasi NIR pada konsentrasi berbeda rGO@Fe3O4 selama 24 jam dan 48 jam. (c, d) Kehidupan sel sel Hela yang dikultur dengan DOX bebas, mikrosfer rGO@Fe3O4/DOX selama 24 jam dan 48 jam dengan dan tanpa iradiasi NIR (808 nm, 2 W cm⁻²) (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001)
Kesimpulan
Ringkasnya, kami mengeksplorasi strategi yang sederhana untuk membangun platform pengiriman obat berbasis rGO rGO@Fe3O4/DOX untuk terapi kombinasi fototermal-kemoterima. Mikrosfer rGO@Fe3O4/DOX menunjukkan efek PTT yang dipicu NIR yang unggul dan stabilitas fototermal NIR yang sempurna. Fe3O4 pada mikrosfer memastikan kemampuan targeting sel tumor yang luar biasa. DOX dapat dienkapsulasi ke dalam rGO@Fe3O4 dengan kapasitas muatan obat yang ultra-tinggi dan perilaku pelepasan obat yang responsif pH dapat dicapai secara bersamaan. Selain itu, efesiensi antitumor yang ditingkatkan dicapai ketika kombinasi kemoterapi dan terapi fototermal. Oleh karena itu, platform pengiriman obat multifungsi ini dapat menjadi calon yang menjanjikan untuk targeting tumor dan terapi kanker kombinasi di masa depan.
Ketersediaan Data dan Bahan
Data dan analisis dalam karya ini tersedia dari penulis correspondensi atas permintaan yang wajar.
