Atomic Force Microscopy-Based Nanoscopy dari Chondrogenically Differentiated Human Adipose-Derived Stem Cells:Nanostructure and Integrin 1 Expression
Abstrak
Integrin 1 diketahui terlibat dalam diferensiasi, migrasi, proliferasi, perbaikan luka, perkembangan jaringan, dan organogenesis. Untuk menganalisis kemungkinan pengikatan antara integrin 1 ligan dan reseptor cluster of differential 29 (CD29), atomic force microscopy (AFM) digunakan untuk mendeteksi reseptor asli integrin 1-coupled pada permukaan sel punca turunan adiposa manusia (hADSc) . Probabilitas pengikatan interaksi ligan-reseptor integrin 1 diselidiki oleh ujung-ujung yang difungsikan integrin 1 pada hADSc selama diferensiasi kondrogenik awal pada tingkat kultur sel dua dimensi. Morfologi sel dan ultrastruktur hADSc diukur dengan AFM, yang menunjukkan bahwa sel gelendong panjang menjadi sel poligonal dengan penurunan rasio panjang/lebar dan peningkatan kekasaran selama induksi khondrogenik. Pengikatan integrin 1 ligan dan reseptor CD29 dideteksi oleh ujung yang difungsikan 1 untuk hADSc hidup. Sebanyak 1200 kurva dicatat pada 0, 6, dan 12 hari induksi kondrogenik. Gaya pecah rata-rata masing-masing adalah 61,8 ± 22.2 pN, 60 ± 20.2 pN, dan 67.2 ± 22.0 pN. Kejadian ruptur masing-masing adalah 19,58 ± 1,74%, 28,03 ± 2,05%, dan 33,4 ± 1,89%, yang menunjukkan bahwa kemungkinan pengikatan meningkat antara ligan integrin 1 dan reseptor pada permukaan hADSc selama induksi kondrogenik. Integrin 1 dan jalur pensinyalan -catenin/SOX berkorelasi selama diferensiasi khondrogenik. Hasil penyelidikan ini menyiratkan bahwa AFM menawarkan wawasan kinetik dan visual tentang perubahan dalam ikatan reseptor integrin 1 ligan-CD29 pada hADSc selama kondrogenesis. Perubahan morfologi seluler, ultrastruktur membran, dan kemungkinan pengikatan reseptor ligan-transmembran ditunjukkan sebagai penanda yang berguna untuk evaluasi proses diferensiasi kondrogenik.
Latar Belakang
Osteoarthritis (OA) adalah penyakit sendi degeneratif yang umum pada orang tua [1], dengan OA degeneratif yang ditandai dengan kerusakan progresif kartilago artikular. Tulang rawan sangat terorganisir tanpa pembuluh darah, saraf, atau jaringan limfatik [2]. Matriks ekstraseluler (ECM) terutama terdiri dari kolagen II dan glikoprotein, dan sangat penting untuk homeostasis tulang rawan. Karena tulang rawan bersifat avaskular, kapasitasnya untuk memperbarui diri terbatas. Meskipun pengobatan OA (baik bedah maupun non-bedah) dapat dengan cepat meredakan gejala pasien OA, terutama nyeri, namun tidak dapat mengembalikan struktur dan fungsi normal pada tulang rawan sendi [3]. Di masa depan, pengobatan kemungkinan akan mencakup rekayasa jaringan dengan sel punca dan perancah untuk memperbaiki cacat dan tulang rawan sendi degeneratif [4]. Sel punca mesenkim adalah sel stroma multipoten yang memiliki potensi osteogenik, adipogenik, kondrogenik, dan miogenik, tergantung pada kombinasi faktor pertumbuhan [5]. Analisis diferensiasi sel punca mesenkim menunjukkan Wnt/β-catenin, target mamalia rapamycin (mTOR), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), dan jalur lain memainkan peran penting dalam diferensiasi [6,7,8]. Namun, mekanisme yang mendasari di mana diferensiasi khondrogenik diinduksi masih sulit dipahami. Hal ini terutama berlaku untuk mekanisme dimana sinyal ekstraseluler mengaktifkan jalur sinyal intraseluler. Kami telah menemukan integrin 1 mengalami perubahan selama diferensiasi kondrogenik. Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa integrin 1 mungkin memainkan peran penting dalam diferensiasi khondrogenik sel punca yang diturunkan dari adiposa manusia (hADSc) karena keterlibatannya dalam berbagai jalur pensinyalan diferensiasi jaringan. Dalam penyelidikan ini, fokusnya adalah pada jalur pensinyalan Wnt/β-catenin.
Sejumlah penelitian telah menunjukkan interaksi antara sel dan lingkungan ekstraseluler diatur oleh protein transmembran, khususnya, anggota keluarga integrin [9]. Integrin terdiri dari glikoprotein heterodimerik-transmembran dari rantai dan yang tidak terikat secara kovalen [10]. Secara teoritis, ada 64 integrin yang diketahui dan hanya 24 yang telah ditemukan. Integrin memainkan peran penting dalam adhesi sel-sel, adhesi sel ECM, pensinyalan sel, dan organisasi sitoskeleton aktin [11]. ECM memainkan peran penting dalam homeostasis jaringan, dan ECM mengatur integrin. Integrin memediasi banyak proses mendasar termasuk adhesi sel, migrasi, proliferasi, diferensiasi, kematian sel, perbaikan luka, perkembangan jaringan, dan organogenesis. Selama diferensiasi kondrogenik sel punca mesenkim, ekspresi integrin 1 terhubung ke jalur pensinyalan SOX dan ke kolagen II. Fokus penelitian ini adalah pada integrin 1 dimer karena merupakan dimer yang paling menonjol di antara heterodimer kartilago dan diketahui berinteraksi dengan banyak dimer yang berbeda [12]. Cluster of differential 29 (CD29) adalah subunit integrin 1 yang terkait dengan reseptor antigen yang sangat terlambat, diekspresikan pada hampir semua sel dan jenis jaringan.
Di sini, mikroskop kekuatan atom (AFM) digunakan untuk membantu kami mengukur perubahan selama diferensiasi kondrogenik hADSc. Sebagai jenis mikroskop pemindai pemindaian beresolusi sangat tinggi, AFM telah memberikan peluang baru untuk mendeteksi morfologi dan membran seluler untuk sel tunggal dalam cairan pada skala nano. Sementara itu, sistem spektroskopi gaya molekul tunggal (SMFS) yang dikombinasikan dengan mikroskop gaya atom (AFM) digunakan untuk mengukur ikatan ligan-reseptor pada sel hidup. Sistem SMFS lebih sensitif terhadap perubahan reseptor di membran sel, dan gambar kekuatan pengikatan divisualisasikan. Dalam karya ini, pengikatan ligan-reseptor integrin 1 diperiksa dengan ujung AFM yang difungsikan integrin 1. Menerapkan AFM, diferensiasi kondrogenik ditemukan untuk mengubah bentuk sel hADSc dan meningkatkan kekasaran seluler. Aplikasi ini menyediakan metode untuk menilai diferensiasi khondrogenik dengan pengukuran langsung interaksi ligan-reseptor integrin 1 dan perubahan ultrastruktur permukaan sel, meningkatkan penyelidikan permukaan sel dan penyaringan dengan cara yang divisualisasikan. Diferensiasi kondrogenik mengubah komposisi dan struktur membran, serta interaksi sitoskeletal intraseluler. Perubahan dalam morfologi seluler, ultrastruktur, dan pengikatan reseptor ligan-transmembran ini berfungsi sebagai penanda yang berguna untuk evaluasi mekanisme diferensiasi kondrogenik.
Metode
Kultur Sel dan Reagen
Untuk penyelidikan ini, sel diisolasi dari tiga pasien bedah (usia rata-rata 20 tahun) seperti yang dijelaskan sebelumnya [13]. Informed consent diperoleh dari semua pasien. Persetujuan etik untuk penelitian ini diperoleh dari Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Jinan (formulir tambahan). Sel dipertahankan dalam medium basal, yang termasuk Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Life Technologies, CA, USA) rendah glukosa yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas (FBS, Life Technologies, CA, USA), 100 unit/ ml penisilin (Life Technologies, CA, USA), 100 g/ml streptomisin (Life Technologies, CA, USA), 0,11 mg/ml natrium piruvat (Life Technologies, CA, USA), dan L-glutamine (Life Technologies, CA, AMERIKA SERIKAT). Sel dipertahankan pada suhu 37 °C dalam inkubator yang dilembabkan yang mengandung 5% CO2 dengan media diganti setiap 3 hari.
Diferensiasi In Vitro
Untuk induksi khondrogenik, hADSc bagian keempat hingga kedelapan diunggulkan pada kepadatan sel tinggi (2 × 105/10 ml) dan dikultur dalam media khondrogenik yang mengandung DMEM/F12 yang dilengkapi dengan 1% FBS, 1% Insulin-Transferrin-Selenium ( ITS) + supplement (Cyagen, Guangzhou, China), 10 ng/ml transforming growth factor-beta1 (TGF-β1) (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey, USA), 100 ng/ml faktor pertumbuhan seperti insulin-1 ( IGF-1) (Peprotech, Peprotech, Rocky Hill, New Jersey, AS), 10-7 M deksametason (Sigma, St. Louis, MO, AS), dan 50 μg/ml asam askorbat (Sigma, St. Louis, MO , AS). Media diganti setiap 2 hari dengan TGF-β1 dan IGF-1 yang baru ditambahkan. Kondrogenesis dinilai dengan pewarnaan biru alcian dan biru toluidin.
Untuk menginduksi diferensiasi osteogenik dan adipogenik, sel-sel bagian keempat hingga kedelapan diperlakukan dengan media osteogenik dan adipogenik masing-masing selama 2 minggu. Media osteogenik terdiri dari DMEM yang dilengkapi dengan 10-7 M deksametason (Sigma, St. Louis, MO, USA), 50 μg/ml asam askorbat (Sigma, St. Louis, MO, USA), dan 10 mmol/l -gliserol fosfat (Sigma, St. Louis, MO, AS). Osteogenesis dinilai dengan pewarnaan alizarin red.
Media adipogenik terdiri dari DMEM yang dilengkapi dengan 0,5 mmol/l 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 μmol/l hidrokortison (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,1 mmol/l indometasin (Sigma, St. Louis, MO, USA). Diferensiasi adipogenik dievaluasi dengan pewarnaan Oil Red O.
Identifikasi Antigen Permukaan hADSc dengan Flow Cytometry
hADSC dicerna dengan tripsin dan kemudian dibilas dua kali dengan DMEM, sebelum disuspensi ulang pada kepadatan sel 2 × 10
7
sel/ml. Suspensi sel (50 μl; 1 × 10
6
sel) ditambahkan ke dalam tabung epoksi epoksida 1,5 ml kemudian diinkubasi dengan antibodi anti-CD34, anti-CD44, anti-CD45, anti-CD73, anti-CD90, anti-CD106, anti-HLA-DR, dan anti-CD105 untuk 20 menit pada 37 °C dalam gelap. Anti-CD34, anti-CD44, dan anti-CD45 diperoleh dari CST (Beverly, MA, USA); antibodi lain diperoleh dari Abcam (Cambridge, MA, USA). Kemudian, suspensi sel disentrifugasi pada × 500g selama 5 menit, diikuti dengan pembuangan supernatan dan suspensi kembali sel dalam 200 l Stain Buffer. Semua langkah diulang dua kali sebelum dianalisis dengan flow cytometry.
Analisis Imunoblotting (IB)
Sel dikumpulkan untuk imunoblotting seperti yang dijelaskan sebelumnya [14]. Antibodi utama yang digunakan adalah anti-β-catenin (ab32572), anti-integrin 1 (ab30394), dan anti-kolagen II (ab34712), yang diperoleh dari Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-β-aktin (8H10D10, 1:2000), anti-GSK-3β (27C10, 1:1000), dan anti-SOX (92G2, 1:1000) diperoleh dari Cell Signaling Technology (CST, Beverly, MA, AMERIKA SERIKAT). Antibodi terkonjugasi HRP sekunder (1:1000–1:3000) dibeli dari CST.
Imunofluoresensi
Untuk diferensiasi khondrogenik, sel dirawat selama 0, 6, dan 12 hari, dicerna, dan dibiakkan di atas kaca dalam pelat 24-sumur (Costar353047, Corning, New York, USA) selama 24 jam. Sel dicuci dua kali dengan larutan buffer fosfat (PBS) dingin, difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 15 menit pada suhu kamar. Setelah pemblokiran, sel diinkubasi dengan antibodi primer reaktif dengan integrin 1 selama 1 jam, diikuti dengan inkubasi selama 1 jam dalam gelap dengan IgG anti-tikus berlabel Alexa Fluor 488 (H + L) (CST #4408, MA, USA ), 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma, MO, USA). Untuk pewarnaan phalloidin, setelah pemblokiran, sel ditembus dengan 0,2% Triton X-100 selama 30 menit, kemudian sel diinkubasi dengan DAPI dan phalloidin-Alexa Flour 573 (Life technology, CA, USA) selama 1 jam. Setelah dicuci tiga kali, lokalisasi subseluler integrin 1 dan perubahan filamen aktin (F-aktin) dinilai selama diferensiasi tulang rawan dengan Laser Scan Confocal Microscope (ZEISS, LSM 700, Oberkochen, Jerman).
Persiapan Kiat AFM
Ujung Si3N4 (DNP-10, Bruker Corp) dengan konstanta pegas (0,06 N/m) dimodifikasi secara kimiawi oleh antibodi anti-CD29 sebagai berikut [15]. Ujung dibersihkan dengan aseton, sinar ultraviolet, dan larutan piranha (H2 JADI4 :H2 O2 = 3:1, v /v ) untuk waktu yang berbeda (5 mnt, 30 mnt, dan 10 mnt). Setelah pembilasan menyeluruh dengan air murni, ujung dibentuk dengan inkubasi dengan larutan 3-APTES 1% (Sigma, St. Louis, MO, USA) dalam etanol selama 30 menit. Ujungnya dicuci dengan air ultra murni tiga kali dan diperlakukan dengan larutan glutaraldehid 2,5% (Sigma, St. Louis, MO, USA) selama 1 jam. Glutaraldehida yang berlebihan dicuci tiga kali dengan air. Terakhir, ujung dimasukkan ke dalam larutan anti-integrin 1 (1 mg/ml) dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 °C. Probe yang dimodifikasi dicuci dengan PBS sebelum eksperimen.
Pengukuran AFM
AFM (Bioscope Catalyst, Bruker, USA) digunakan untuk menyelidiki morfologi hADSc dan perubahan ultrastruktural selama diferensiasi khondrogenik. Konstanta gaya yang tepat dari ujung AFM diukur dalam PBS. Untuk menilai morfologi dan ultrastruktur, sel dicuci dengan PBS beberapa kali. Kemudian, larutan paraformaldehyde 4% ditambahkan ke dalam 3,5 cm
2
hidangan budaya selama 15 menit. Setelah sel dicuci dengan PBS, sel disimpan dalam PBS pada suhu 4°C sampai digunakan. Konstanta pegas dari tip berkisar antara 4,2 hingga 5,8 N/m dalam mode kontak. Gambar morfologi dan ultrastruktural hADSc diambil di PBS pada suhu kamar oleh AFM. Gambar ultrastruktur yang mengelilingi inti hADSc diperoleh dalam mode kontak. Perangkat lunak analisis nanoscope digunakan untuk mengevaluasi ultrastruktur permukaan sel untuk lebih dari 15 gambar 10 × 10 μm yang berbeda untuk setidaknya 15 sel berbeda dalam kelompok (hari ke 0, 6, 12). Kekuatan pengikatan antara ujung AFM yang dimodifikasi integrin 1 dan reseptor CD29 dari hADSc hidup dianalisis selama periode khondrogenik yang berbeda (0, 6, dan 12 hari). Kekuatan pengikatan diukur dalam mode pendekatan-tarik sistem AFM (Bioscope Catalyst, Bruker, USA). Untuk mempelajari peristiwa pemisahan sel hidup integrin 1, ujung yang dimodifikasi antibodi integrin 1 digunakan pada kecepatan pendekatan-tarik 500 nm/s. Konstanta gaya ujung yang difungsikan adalah 0,058 ± 0,006 N/m. Kekuatan ambang batas pada sel adalah 800 pN. Antibodi anti-integrin 1 (100 g/ml) ditambahkan ke sel selama 30 menit sebelum eksperimen pengukuran kekuatan. Pemblokiran integrin 1 dan probe telanjang juga digunakan sebagai kontrol untuk mendeteksi gaya pecah yang tidak spesifik antara ujung dan sel yang dimodifikasi antibodi integrin 1. Untuk kuantifikasi probabilitas pengikatan reseptor ligan 1 integrin, kurva gaya interaksi spesifik diukur dengan probe yang difungsikan dengan antibodi integrin 1. Lebih dari 400 kurva gaya diukur dalam satu percobaan dengan hasil yang dirangkum dari setidaknya tiga percobaan independen. Dengan demikian, sekitar 1200 kurva gaya-jarak asli di setiap percobaan perbandingan diperoleh dari 30-40 sel yang berbeda menggunakan perangkat lunak analisis Nanoscope instrumen. Dengan rata-rata nilai gaya untuk setidaknya tiga percobaan independen, efek induksi kondrogenik pada gaya interaksi antara ligan integrin 1 dan reseptor CD29 pada permukaan sel telah ditentukan.
Transkripsi Terbalik dan PCR Real-time
TRIzol® Plus RNA Purification Kits (Life Technologies, CA, USA) digunakan, dan 1 μg RNA ditranskripsi balik ke cDNA menggunakan High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Invitrogen) sesuai dengan protokol pabrikan dengan sedikit modifikasi. Integrin 1 dan GAPDH dikuantifikasi menggunakan qRT-PCR dengan primer spesifik gen:5′-TGGAGGAAATGGTGTTTGC-3′ (integrin 1-sense) dan 5′-CGTTGCTGGCTTCACAAGTA-3′ (integrin 1-antisense); 5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′ (GAPDH-sense) dan 5′-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT-3′ (GAPDH-antisense). Untuk PCR waktu nyata, Langkah Satu PCR Waktu Nyata (Biosistem Terapan) dilakukan menggunakan Fast SYBR@GREEN Master Mix (Life Technologies, CA, USA). Ekspresi gen target dinormalisasi ke GAPDH sebagai standar internal dan dihitung menggunakan metode 2-ΔΔCT komparatif. Setiap pengujian dilakukan dalam rangkap tiga.
Analisis Statistik
Semua percobaan dilakukan setidaknya tiga kali, dengan data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbandingan antara dua kelompok dilakukan oleh t tes. Perbedaan yang signifikan antara rata-rata kelompok ditentukan dengan analisis ANOVA satu arah, diikuti oleh uji T2 Bonferroni dan Tamhane (varians yang sama tidak diasumsikan). Nilai p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil dan Diskusi
Penilaian hADSc
Sel punca mesenkim adalah sel stroma multipoten yang memiliki potensi osteogenik, adipogenik, kondrogenik, dan miogenik. Ada dua cara utama untuk mengidentifikasi hADSc, penanda CD permukaan sel dan kapasitas untuk membedakan [16]. Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S1 dan File tambahan 2:Gambar S2, sel turunannya adalah hADSc. Kemudian, proliferasi sel dari bagian 3 hADSc ditentukan dengan uji MTT (File tambahan 3:Gambar S3).
Induksi Morfologi dan Perubahan Ultrastruktur Permukaan selama hADSc Chondrogenesis
AFM selalu digunakan untuk mendeteksi morfologi sel dan ultrastruktur pada skala nano [17]. Bentuk sel berhubungan dengan fungsi sel khusus dan organisasi jaringan. Dalam beberapa penelitian kanker, AFM dapat digunakan sebagai teknik pencitraan tinggi untuk menganalisis perubahan morfologi untuk evaluasi efek obat. Selanjutnya, bentuk sel punca mesenkim berubah selama induksi kondrogenik [18]. Sementara perubahan bentuk sel tampaknya diperlukan untuk diferensiasi, sedikit yang diketahui tentang apakah morfologi sel mempengaruhi tahap perkembangan awal diferensiasi sel punca mesenkim. Oleh karena itu, perubahan morfologi dan ultrastruktur membran selama kondrogenesis hADSc dievaluasi oleh AFM, karena perubahan ini penting [19] dan dapat secara langsung mempengaruhi fungsi sel [20]. Morfologi permukaan dan struktur ultrafine hADSc diselidiki selama diferensiasi khondrogenik untuk periode waktu yang berbeda (Gbr. 1 dan Gbr. 2). Morfologi dan ultrastruktur permukaan jelas berbeda pada setiap kelompok pembanding. Pada hari ke-0, sel memiliki bentuk gelendong memanjang dengan permukaan yang relatif halus. Arsitektur membran sel homogen. Setelah induksi khondrogenik, pada hari ke 6 dan 12, terlihat perubahan morfologi sel yang signifikan. Sebagian besar sel secara bertahap menyusut menjadi bentuk poligonal (Gbr. 1a) dengan penurunan rata-rata rasio panjang/lebar sel selama diferensiasi kondrogenik (Gbr. 1b). Sejumlah penelitian menunjukkan perubahan morfologi sel konsisten dengan sitoskeleton sel [21]. Kami juga menemukan perubahan sitoskeleton selama diferensiasi khondrogenik, yang dijelaskan dalam hasil terakhir.
Karakteristik morfologi hADSc selama kondrogenesis. a Gambar morfologi seluruh hADSc diperoleh pada diferensiasi khondrogenik 0, 6, dan 12 hari. Gambar dianalisis dengan Model Gambar Kesalahan Tinggi dan Kekuatan Puncak dengan Nanoscope. b Rata-rata rasio panjang/lebar sel diukur setelah perlakuan diferensiasi khondrogenik pada 0, 6, dan 12 hari. *p < 0,05, **p < 0.01
Karakteristik ultrastruktur membran hADSc selama diferensiasi kondrogenik. a Perubahan ultrastruktur membran sel dinilai setelah diferensiasi khondrogenik selama 0, 6, dan 12 hari. b Parameter kekasaran permukaan Ra dan Rq sel diukur selama induksi kondrogenik hADSc selama 0, 6, dan 12 hari
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, ultrastruktur membran sel juga berubah; partikel menjadi besar dan heterogen. Studi sebelumnya menunjukkan Ra dan Rq adalah pembuat nilai kekasaran untuk mengevaluasi perubahan membran sel yang diperlakukan berbeda [22]. Rq adalah tentang kekasaran akar rata-rata kuadrat, \( \mathrm{Rq}=\sqrt{\frac{\sum_{t-1}^N{\left( Zn-\overline{Z}\right)}^2 }{N-1}} \); \( \mathrm{Rq}=\sqrt{\frac{\sum_{\mathrm{t}-1}^{\mathrm{N}}{\left(\mathrm{Zn}-\overline{\mathrm{Z }}\right)}^2}{\mathrm{N}-1}}; \) Ra adalah tentang kekasaran rata-rata, \( \mathrm{Ra}=\frac{1}{N}{\sum}_{ t-1}^N1\mid Zi-\overline{Z}\mid \). Untuk mendapatkan kekasaran, ukuran pindaian adalah 10 μm × 10 μm. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2b, baik Ra dan Rq dari dua area berbeda meningkat selama kondrogenesis hADSc. Nilai Ra dan Rq sel pada hari ke 0 rendah, menunjukkan permukaan yang halus (Gbr. 2b). Nilai untuk Ra dan Rq secara bersamaan meningkat dengan diferensiasi kondrogenik, menunjukkan heterogenitas yang lebih besar dan lebih kasar pada permukaan sel (Gbr. 2a). Berdasarkan perubahan yang diamati, diferensiasi kondrogenik menghasilkan morfologi sel dan perubahan rasio tinggi/lebar sel (Gbr. 1a, b). Ada penelitian yang menunjukkan bahwa ECM dapat mengatur adhesi sel dengan mengatur integrin [11]. Oleh karena itu, peningkatan nilai kekasaran menyarankan perubahan ECM dan ultrastruktur membran sel selama kondrogenesis. Data ini menunjukkan diferensiasi kondrogenik untuk mempengaruhi morfologi sel, ECM, dan struktur membran sel.
Perubahan Sitoskeletal selama Induksi Kondrogenik hADSc
Selama diferensiasi sel punca, morfologi sel dan perubahan struktur membran terkait dengan sitoskeleton sel, yang diikuti dengan perkembangan karakteristik seluler spesifik garis keturunan [21]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, sinyal fluoresensi merah dan biru masing-masing menunjukkan F-aktin dan DAPI. Sitoskeleton sel sangat berubah selama induksi kondrogenik pada Gambar. 3a. Di satu sisi, mikrofilamen sitoskeleton berjalan di sepanjang sumbu sel panjang pada kelompok hari 0, sedangkan mikrofilamen sitoskeleton menyebar dalam susunan radial ketika hADSc diperlakukan dengan diferensiasi kondrogenik selama 12 hari. Di sisi lain, distribusi mikrofilamen sel homogen pada kelompok hari ke-0 tetapi mikrofilamen terutama didistribusikan di pinggiran hADSc yang diobati dengan diferensiasi khondrogenik selama 12 hari.
Organisasi sitoskeleton dan lokasi integrin 1 pada hADSc yang membedakan secara kondrogenik. a Perubahan sitoskeleton terdeteksi selama kondrogenesis hADSc dengan mikroskop confocal. b Lokasi integrin 1 diukur selama diferensiasi kondrogenik dengan mikroskop confocal. Sitoskeleton dan nukleus masing-masing diwarnai dengan F-aktin dan DAPI. Sinyal fluoresensi merah dan biru masing-masing menunjukkan F-aktin dan DAPI
Diferensiasi Kondrogenik Mengubah Probabilitas Pengikatan Integrin 1 menjadi Reseptor pada hADSc
AFM juga merupakan alat yang berguna untuk mempelajari gaya pengikatan antara ligan dan reseptornya, membuat transduksi sinyal membran-reseptor pada permukaan sel menjadi jelas [23]. Dengan AFM, perubahan antara integrin 1 dan reseptornya diukur secara visual, sederhana, dan spesifik. Interaksi reseptor ligan 1 integrin pada sel hidup merupakan salah satu cara untuk mengeksplorasi proses pengikatan pada membran sel. Prosedur untuk fungsionalisasi ujung AFM adalah penggabungan integrin 1 ke ujung AFM dengan menghubungkan APTES dan glutaraldehid. Tip ini digunakan untuk mendeteksi pengikatan integrin 1 ke reseptor CD29 pada permukaan sel (Gbr. 4a). Spektroskopi kekuatan molekul tunggal (SMFS) digunakan untuk menilai distribusi kekuatan pemisahan sel hidup anti-integrin 1 dalam wilayah lokal dari hADSc hidup individu (Gbr. 4b). Kurva gaya representatif ditunjukkan pada Gbr. 4c, d, yang menggambarkan kurva molekul tunggal (Gbr. 4c) dan dua pasang kurva puncak pecah (Gbr. 4d). Eksperimen pemblokiran dan eksperimen tip AFM telanjang dilakukan untuk memverifikasi kekhususan kurva gaya yang diperoleh. Tip AFM telanjang tidak mendeteksi puncak gaya tertentu (Gbr. 4e). Eksperimen AFM telanjang menunjukkan bahwa probabilitas pengikatan non-spesifik dari interaksi ligan-reseptor integrin 1 pada permukaan hADSc kurang dari 1%. Untuk percobaan pemblokiran, antibodi anti-integrin 1 diinkubasi dengan sel selama 30 menit dan kemudian kurva gaya direkam menggunakan ujung yang difungsikan integrin 1. Antibodi pemblokiran mengurangi kurva gaya sebesar 90% (Gbr. 4f). Tidak ada perbedaan dalam kemungkinan pengikatan reseptor ligan 1 integrin pada permukaan sel di antara ketiga kelompok setelah pengobatan antibodi anti-integrin 1 (Gbr. 4g). Hasil ini menunjukkan bahwa ujung AFM yang dimodifikasi antibodi sangat berguna untuk mendeteksi gaya tersebut, dan bahwa ujung AFM yang difungsikan integrin 1 bersifat spesifik.
Pengukuran gaya AFM dengan ujung AFM yang difungsikan integrin 1 pada hADSc yang hidup. a Representasi skematis dari strategi yang digunakan untuk imobilisasi integrin 1 ke ujung AFM. b Representasi skema dari gaya molekul tunggal yang diukur antara ujung AFM yang difungsikan integrin 1 dan hADSc yang hidup. c, d Kurva gaya representatif diperoleh dengan tip AFM termodifikasi integrin 1 pada hADSc, dan e setelah sistem diblokir dengan larutan antibodi monoklonal integrin 1. f Probabilitas pengikatan ujung integrin 1 yang difungsikan pada hADSc sebelum dan sesudah diblokir oleh antibodi integrin 1 pada hari ke 0. g Probabilitas pengikatan tip yang difungsikan CD29 pada hADSc setelah diblokir oleh antibodi integrin 1 pada 0, 6, dan 12 hari. ***p < 0.001, n.s.. tidak ada perbedaan yang signifikan
Gaya ikat (rupture force) merupakan gaya interaksi antara ligan dengan reseptornya [24]. Perubahan morfologi dan ultrastruktur permukaan membran plasma terkait dengan banyak proses biologi seluler, seperti diferensiasi, apoptosis, dan migrasi sel. Selama diferensiasi, perubahan sitoskeleton dianggap terkait dengan perubahan integrin, terutama integrin 1. Integrin 1 (CD29) sangat penting dalam adhesi sel ke ECM dan adhesi sel-sel. Itu juga dapat berinteraksi dengan protein intraseluler, merangsang molekul pensinyalan yang terkait dengan sitoskeleton aktin [25]. Dalam penelitian ini, perubahan morfologi sel dan sitoskeletal diamati selama kondrogenesis hADSc dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) dan AFM. Selama diferensiasi kondrogenik, perubahan sitoskeleton, morfologi, dan ultrastruktur permukaan mungkin merupakan indikator keadaan sel yang baru dan dapat diandalkan. Integrin 1, reseptor CD29, didistribusikan di atas permukaan sel seperti yang dinilai oleh imunofluoresensi (Gbr. 3b). Kekuatan pengikatan dan stabilitas kompleks reseptor ligan integrin 1 selama kondrogenesis hADSc dievaluasi pada diferensiasi 0, 6, dan 12 hari. Total 1200 kurva dicatat untuk setiap hari, dengan gaya pecah rata-rata masing-masing 61,8 ± 22.2 pN, 60 ± 20.2 pN, dan 67.2 ± 22.0 pN (Gbr. 5a–c). Distribusi besaran gaya dianalisis sebagai gaya rata-rata + SD (Gbr. 5d). Tidak ada perbedaan yang signifikan rata-rata gaya antara hari 0 dan 6. Terdapat perbedaan rata-rata gaya antara hari 0 dan 12. Besarnya gaya ikat meningkat pada hari ke-12. Sedangkan kejadian pecah pada hari ke-0, 6, dan 12 masing-masing adalah 19,58 ± 1,74%, 28,03 ± 2,05%, dan 33,4 ± 1,89% (Gbr. 5e). Peningkatan kemungkinan pengikatan juga menunjukkan bahwa integrin 1 (CD29) memainkan peran penting dalam diferensiasi khondrogenik dan dapat memberikan informasi untuk diferensiasi khondrogenik, melalui jalur pensinyalan. Oleh karena itu, peningkatan integrin 1 nanodomains selama diferensiasi khondrogenik secara mendasar dapat mempengaruhi kekuatan pengikatan reseptor ligan CD29 pada hADSc yang hidup. Perubahan morfologi dan ultrastruktur permukaan membran plasma disertai perubahan struktur protein integrin 1, konformasi, kekuatan ikat, dan stabilitas kompleks reseptor ligan integrin 1 pada sel. Singkatnya, integrin 1 memainkan peran penting dalam diferensiasi kondrogenik hADSc.
Kekuatan pengikatan dan probabilitas pengikatan diukur pada permukaan hADSc hidup dengan ujung AFM yang difungsikan integrin 1. a–c Histogram kekuatan pengikatan reseptor antibodi integrin 1 yang diperoleh selama diferensiasi kondrogenik hADSc selama 0, 6 dan 12 hari. d Kekuatan pengikatan untuk integrin 1-reseptor diperoleh pada 0, 6, dan 12 hari diferensiasi kondrogenik hADSc. e Probabilitas pengikatan reseptor integrin 1 terdeteksi selama diferensiasi kondrogenik hADSc selama 0, 6, dan 12 hari. *p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001, n.s. tidak ada perbedaan yang signifikan
Upregulasi Integrin 1 selama Diferensiasi Kondrogenik hADSc
Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa anggota keluarga integrin memainkan peran penting dalam diferensiasi sel. Lebih lanjut, integrin dapat mengatur interaksi antara lingkungan ekstraseluler dan sel, mengontrol jalur transduksi sinyal melalui protein yang terhubung [26]. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa probabilitas pengikatan dapat dipengaruhi oleh kepadatan dan konformasi protein transmembran (reseptor) pada permukaan sel [27]. Konformasi integrin dapat berupa headpiece tertutup yang memiliki afinitas rendah terhadap ligan, atau headpiece terbuka yang memiliki afinitas tinggi terhadap ligan [28, 29]. Ekspresi integrin 1 meningkat pada tingkat transkripsi dan translasi dengan peningkatan ekspresi kolagen II, karakteristik kondrosit (Gbr. 6a, b). Dengan demikian, ekspresi integrin 1 yang diregulasi ke atas konsisten dengan peningkatan kemungkinan pengikatan tanpa memperhatikan konformasi.
The role of integrin β1 and β-catenin/SOX pathway in regulating hADSc chondrogenic differentiation. a Protein integrin β1 was up-regulated during chondrogenesis of hADSc as assessed by western blotting. Cartilage differentiation up-regulated collagen II expression at different days. b The mRNA of integrin β1 was up-regulated during chondrogenic differentiation of hADSc. c Measurement of proteins associated with the β-catenin/SOX pathway during chondrogenic differentiation of hADSc for 0, 6, and 12 days. *p < 0,05, **p < 0.01
The Role of Integrin β1 in Chondrogenic Differentiation Regulated by the β-catenin/SOX Signaling Pathway
Previous studies have shown Wnt/β-catenin, PI3K, and mTOR signaling pathways to be related to integrin β1 [30,31,32]. Each is important in mesenchymal stem cell differentiation. Likewise, studies have demonstrated SOX and collagen II to be regulated by integrin β1 during chondrogenesis of hADSc. SOX is a hallmark component of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Hence, we hypothesized that chondrogenic differentiation was regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1. SOX, GSK-3β, β-catenin, and integrin β1 were all increased during chondrogenesis of hADSc (Fig. 6c), with integrin β1 inducing cell signaling. These data demonstrate chondrogenic differentiation to be regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1.
Prospective and Limitations
In this work, changes in cellular morphology, the structure of the membrane, and the binding probability of integrin β1 ligand–receptors were demonstrated to be useful image markers to evaluate the chondrogenic differentiation process. This is a new method for evaluation of morphology, membrane ultrastructure, and changes in transmembrane proteins during chondrogenic differentiation. There are limitations to this study. Although increased binding probability was related to the high expression of integrin β1, the conformation of integrin β1 during chondrogenesis was not investigated. Further work is necessary to determine the conformation of integrin β1 during chondrogenic differentiation. Integrin β1 was demonstrated to participate in the β-catenin/SOX signaling pathway during chondrogenesis of hADSc. However, the relationship between integrin β1 and β-catenin/SOX signaling pathway is still not fully established. Further work is necessary to identify the exact role of integrin β1 in this pathway.
Kesimpulan
In the present work, a novel method (AFM) was employed to evaluate chondrogenic induction in hADSc. Cell surface ultrastructural changes were assessed by AFM imaging. AFM was used to investigate the binding force and binding probability between integrin β1 ligand and its receptors on the surface of hADSc by integrin β1-functionalized AFM tips. Based on AFM data, during chondrogenesis, cell morphology was changed from an elongated spindle shape to a polygonal shape with increased cell roughness. By use of integrin β1-functionalized AFM tips, the binding probability and force magnitude of integrin β1 ligand–receptor on the surface of hADSc were found to increase during chondrogenic induction. By immunoblot, integrin β1 was demonstrated to participate in the β-catenin/SOX signaling pathway, which regulated the chondrogenesis of hADSc. Taken together, these results and the established methodology contribute to a better understanding of cell morphology and roughness. Further, the data provide thermodynamic and kinetic insight into the integrin β1 ligand-binding process, at the single-molecule level. This AFM method will be useful for investigation of signaling pathways in living hADSc during chondrogenesis. Changes in the cellular nanostructure, as well as structure of the membrane, and the binding probability of transmembrane proteins are useful markers to evaluate chondrogenic differentiation mechanisms. This AFM method can be used to understand the mechanism of mesenchymal stem cell differentiation in tissue engineering and will be useful for an enhanced understanding of mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation.
