Mikroskop Gaya Atom Mengungkap Dinamika Integrin β1 selama Kondrogenesis Sel Torsi Adiposit Manusia

Abstrak

Integrin β1 mengatur proses kunci seperti diferenciasi, migrasi, dan perbaikan jaringan. Menggunakan mikroskop gaya atom (AFM), kami mengukur interaksi antara ligan integrin β1 dan reseptor CD29 pada sel torsi adiposit manusia (hADSCs) selama diferenciasi kondrogenik awal. Pengamatan AFM menunjukkan transisi dari sel berbentuk fusiform panjang menjadi sel poligon dengan rasio panjang/lebar yang lebih rendah dan kekasaran permukaan yang meningkat. Lebih dari 1.200 kurva gaya-jarak yang dikumpulkan pada hari 0, 6, dan 12 mengungkapkan gaya pecahan yang naik (61,8 ± 22,2 pN → 67,2 ± 22,0 pN) dan probabilitas ikatan (19,6 % → 33,4 %). Data ini menunjukkan bahwa AFM dapat melacak keterlibatan integrin β1-CD29, ultrastruktur sel, dan morfologi sebagai penanda yang andal dari progresi kondrogenik.

Latar Belakang

Osteoarthritis (OA) mengikis cartilage artikular, jaringan yang avaskular dan memiliki kemampuan perbaikan sendiri yang terbatas. Rekayasa jaringan berbasis sel torsi menjanjikan untuk memulihkan fungsi cartilage, namun peristiwa sinyal yang tepat yang mengarahi kondrogenesis masih tidak jelas. Integrin, khususnya integrin β1 (CD29), memediasi interaksi sel-matriks dan mengaktifkan jalur seperti Wnt/β-katenin, PI3K, dan mTOR yang mengatur nasib sel torsi. Kami berfokus pada integrin β1 karena peran pentingnya dalam biologi cartilage dan interaksinya dengan berbagai sub-unit α.

AFM, dikombinasikan dengan spektroskopi gaya molekul tunggal (SMFS), menawarkan citra nanometer-resolusi dari sel hidup dan pengukuran langsung gaya ligan-reseptor. Dengan memfungsikan ujung AFM dengan antibodi integrin β1, kami menguji peristiwa ikatan pada hADSCs selama induksi kondrogenik, memberikan wawasan kinestik dan struktural yang tidak tersedia dengan uji konvensional.

Metode

Kultur Sel dan Reagen

hADSCs diisolasi dari lemak subkutan dari tiga donatur (rata-rata usia 20 tahun) di bawah protokol yang disetujui IRB. Sel diperluas dalam DMEM glukosa rendah yang dilengkapi dengan 10 % FBS yang dipanaskan inaktif, antibiotik, piruvat natrium, dan glutamin L, dan dipelihara pada 37 °C, 5 % CO₂.

Diferensiasi In Vitro

Untuk kondrogenesis, sel passage 4–8 ditanam pada 2 × 10⁵ sel per 10 mL dan dikultur dalam medium kondrogenik yang berisi 1 % FBS, ITS, 10 ng/mL TGF-β1, 100 ng/mL IGF-1, 10⁻⁷ M deksametason, dan 50 µg/mL asam askorbat. Pergantian medium dilakukan setiap 2 hari. Penyimpanan matriks kartilago dikonfirmasi oleh pewarnaan biru alkian dan biru toluidin.

Diferensiasi osteogenik dan adipogenik mengikuti protokol standar dengan deksametason, asam askorbat, fosfat gliserol beta, IBMX, hidrokortison, dan indometasin, yang dievaluasi oleh pewarnaan alizarin merah dan minyak merah O, masing-masing.

Sitometria Aliran

Sel dilabeli dengan antibodi terhadap CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD106, HLA-DR, dan CD105 dan dianalisis untuk mengonfirmasi fenotip mezenkim.

Imunoblotting dan Imunofluoresensi

Ekstrak protein diurai untuk β-katenin, integrin β1, kolagen II, GSK-3β, SOX, dan β-aktin. Imunofluoresensi memvisualisasikan distribusi integrin β1 dan organisasi F-aktin menggunakan Alexa Fluor 488 dan phalloidin-Alexa Fluor 573, masing-masing.

Fungsionalisasi Ujung AFM

Ujung silikon nitrid dibersihkan, disilanisasi dengan 1 % 3-APTES, dihubungkan silang dengan gluteraldehida, dan diinkubasi selama malam dengan 1 mg/mL antibodi anti-integrin β1 untuk menghasilkan probe yang difungsikan ligan.

Pengukuran AFM

Sel diubah dengan 4 % paraformaldehida dan diimaging dalam PBS. Morfologi dan kekasaran permukaan (Ra, Rq) diukur dari >15 citra 10 µm² per titik waktu. SMFS dilakukan dalam mode pendekatan-retraksi pada 500 nm/s, mengumpulkan >400 kurva gaya per eksperimen (≈ 1.200 total per titik waktu). Peristiwa ikatan diidentifikasi oleh gaya pecahan >800 pN dan ambang gaya yang dikalibrasi pada 0,058 ± 0,006 N/m.

RT-qPCR

RNA diekstrak, ditranskripsi balik, dan dikuantifikasi untuk integrin β1 dan GAPDH menggunakan kimia SYBR Green. Ekspresi relatif dihitung dengan metode 2^–ΔΔCT.

Statistik

Eksperimen dilakukan dalam tiga kali ganda. Data disajikan sebagai rata-rata ± deviasi standar. Perbandingan menggunakan uji t atau ANOVA satu jalur dengan uji lanjutan Bonferroni; p < 0,05 dianggap signifikan.

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi hADSC

Sitometria aliran mengonfirmasi fenotip mezenkim (CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD34⁻, CD45⁻). Uji MTT menunjukkan proliferasi yang kuat di seluruh passage.

Perubahan Morfologi dan Ultrastruktur Selama Kondrogenesis

AFM mengungkapkan pergeseran morfologi yang jelas dari sel berbentuk fusiform menjadi poligon, dengan pengurangan yang signifikan pada rasio panjang/lebar pada hari 6 dan 12 (p < 0,01). Parameter kekasaran permukaan Ra dan Rq meningkat secara signifikan, yang menunjukkan heterogenitas membran yang ditingkatkan kemungkinan didorong oleh remodeling ECM.

Remodeling Sitoskeleton

Citra konfokal menunjukkan reorganisasi F-aktin dari array longitudinal menjadi pola radial yang terletak di periferi pada hari 12, yang mencerminkan remodeling sitoskeleton yang terkait dengan komitmen kondrogenik.

Dinamika Ikat Integrin β1–CD29

SMFS dengan ujung yang difungsikan integrin β1 menghasilkan gaya pecahan dan probabilitas ikatan yang meningkat seiring waktu (0 % → 33,4 % pada hari 12). Eksperimen pemblokiran dengan antibodi anti-integrin β1 bebas mengurangi kurva gaya sekitar 90 %, mengonfirmasi spesifikitas.

Ekspresi dan Sinyal Integrin β1

Western blot dan qRT-PCR menunjukkan pengregulasi naik integrin β1, kolagen II, dan komponen jalur β-katenin/SOX selama kondrogenesis. Tingkat β-katenin, SOX, dan GSK-3β yang meningkat menunjukkan bahwa integrin β1 mengaktifkan sinyal Wnt/β-katenin untuk mendorong sintesis matriks kartilago.

Implikasi dan Keterbatasan

AFM menyediakan pendekatan non-destruktif, satu sel untuk memantau dinamika integrin, morfologi, dan kekasaran membran sebagai indikator waktu nyata dari diferenciasi kondrogenik. Studi mendatang harus menyelidiki konformasi integrin dan mendefinisikan taut molekuler yang tepat antara integrin β1 dan sinyal β-katenin/SOX.

Kesimpulan

Kami telah mendirikan AFM sebagai alat yang kuat untuk melacak interaksi integrin β1–CD29 dan perubahan nanostruktural selama kondrogenesis hADSC. Teknik ini menyediakan wawasan kinestik dan struktural yang dapat menginformasikan strategi perbaikan kartilago berbasis sel torsi.

Singkatan

AFM

Mikroskop gaya atom

CD

Cluster of differentiation

DAPI

4′,6-diaminofluorescein-2-phenylindole

DMEM

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

ECM

Extracellular matrix

F-actin

Filamentous actin

FBS

Fetal bovine serum

hADSC

Human adipose-derived stem cell

IB

Immunoblotting

IBMX

3-isobutyl-1-methylxanthine

IGF-1

Insulin-like growth factor-1

ITS

Insulin-transferrin-selenium

mTOR

Mammalian target of rapamycin

OA

Osteoarthritis

PBS

Phosphate buffer saline

PI3K

Phosphoinositide 3-kinase

SD

Standard deviation

SMFS

Single-molecule force spectroscopy

TGF-β1

Transforming growth factor-β1