SOX2 Mengatur Jalur CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 untuk Mengontrol Proliferasi dan Pembaruan Diri Sel Akar Kanker Serviks
Abstrak
Peran RNA non-koding panjang (lncRNA) dalam kanker serviks (KS) telah disajikan. Kami bertujuan untuk membahas efek zona menentukan seksual Y-box 2 (SOX2)/lncRNA transkrip terkait kanker usus besar-1 (CCAT1)/mikroRNA-185-3p (miR-185-3p)/proteksi forkhead box 3 (FOXP3) pada kemampuan proliferasi dan pembaruan diri sel akar KS. Ekspresi miR-185-3p, SOX2, CCAT1 dan FOXP3 diuji dalam jaringan dan sel KS. Hubungan antara ekspresi SOX2/CCAT1 dan fitur klinis patologis pasien KS diverifikasi. Investigasi kehilangan dan peningkatan fungsi dilakukan pada sel CD44+HeLa untuk membahas fungsi biologis dan kapasitas pembaruan diri. Terakhir, hubungan di antara SOX2, CCAT1, FOXP3 dan miR-185-3p diverifikasi. Ekspresi miR-185-3p menurun, sementara ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat dalam jaringan dan sel KS. Ekspresi SOX2 dan CCAT1 terkait dengan ukuran tumor, metastase nodul limfatik dan tahap federasi internasional ginekologi dan obstetri KS. Menurunkan SOX2 atau CCAT1 dan meningkatkan miR-185-3p menghasilkan inhibisi proliferasi, invasi, migrasi dan jumlah bola sel serta percepatan apoptosis sel CD44+HeLa. SOX2 dapat terikat pada CCAT1 yang mempengaruhi ekspresi miR-185-3p, dan FOXP3 ditargetkan oleh miR-185-3p.
Pendahuluan
Kanker serviks (KS) adalah penyebab kematian keempat utama pada wanita dengan estimasi 570.000 kasus dan 311.000 kematian di seluruh dunia pada 2018 [1]. Penyakit kompleks ini terlibat dengan berbagai faktor, termasuk efek genetik dan infeksi virus [2]. Dengan perkembangan pengujian gabungan papillomavirus manusia dan vaksinasi papillomavirus manusia, prosedur diagnosis dini untuk displasia serviks dan kanker menghasilkan penurunan insidensi, morbilitas dan mortalitas KS [3]. Untuk pasien KS dini, operasi disarankan, seperti operasi hemat fertilisitas, biopsi kon, trachelektomi radikal, disseksi nodul limfatik pelvis, radioterapi pelvis dan brakyterapi [4]. Karena metastase atau rekuren pada pasien KS lanjutan, prognose masih buruk [5]. Oleh karena itu, masih mendesak untuk mengidentifikasi penanda prognostik baru dan efektif serta strategi terapeutik untuk meningkatkan pengobatan KS.
Zona menentukan seksual Y-box 2 (SOX2) adalah anggota kritis dari keluarga faktor transkripsi SOX dan terutama muncul pada sel stem embrio dan dewasa serta juga diekspresikan pada sel stem tumor [6]. Terungkap bahwa SOX2 mengatur radiotahan dalam KS melalui jalur sinyal hedgehog [7]. Studi lain telah menunjukkan bahwa SOX2 krusial untuk mempertahankan subpopulasi sel stem kanker dalam baris sel KS [8]. RNA non-koding panjang (lncRNA) adalah kelas molekul RNA dengan panjang 200 nukleotida [9]. lncRNA transkrip terkait kanker usus besar-1 (CCAT1) terletak pada kromosom manusia 8q24.21 dan dianggap sebagai "titik panas" yang menghasilkan mutasi genetik dalam kanker usus besar [10]. Sebuah studi telah melaporkan bahwa CCAT1 mempercepat proliferasi dan invasi sel KS [11]. Menurut Jia et al., CCAT1 secara dramatis meningkatkan proliferasi, migrasi dan invasi sel KS [12]. Selain itu, studi lain telah mengungkapkan bahwa CCAT1 meningkatkan derajat malignant penyakit usus inflamasi melalui merusak halus usus dengan mengurangi mikroRNA-185-3p (miR-185-3p) [13]. miRNA dapat mengontrol ekspresi gen secara terbalik dengan mengurangi mRNA dan menekan terjemahan [14]. Eksperimen in vitro dalam studi sebelumnya telah mengungkapkan bahwa miR-185-3p mengatur radiotahan kanker rinofaring [15]. Studi lain telah menyiratkan bahwa miR-185 terlibat dalam resistensi sitaplatin kanker ovarium in vivo dan in vitro [16]. Proteksi forkhead box 3 (FOXP3) adalah faktor transkripsi yang termasuk dalam keluarga protein FOX, yang pertama kali ditemukan pada sel T regulasi (Treg) dan berperan vital dalam pemeliharaan dan proses sel Treg [17]. Sebuah studi melaporkan bahwa FOXP3 terkait dengan limfangiojenesis KS [18]. Studi lain mengungkapkan bahwa tingkat FOXP3 secara dramatis terkait dengan tahap federasi internasional ginekologi dan obstetri (tahap FIGO) dan ukuran tumor KS [19]. Dalam studi ini, kami oleh karena itu memeriksa efek axis SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 pada kemampuan proliferasi dan pembaruan diri sel stem KS.
Bahan dan Metode
Persetujuan Etika dan Persetujuan Partisipasi
Eksperimen yang melibatkan manusia dilaksanakan sesuai dengan prinsip yang dinyatakan dalam Deklarasi Helsinki. Studi ini disetujui oleh Dewan Review Institusional Rumah Sakit Pertama Universitas Jilin. Semua peserta menandai dokumen persetujuan informasi.
Subjek Studi
Dari Desember 2016 hingga Desember 2018, 39 kasus jaringan KS dan jaringan normal berdekatan yang sesuai dipanen dari pasien KS dan dipertahankan dalam nitrogen cair. Kriteria inklusi adalah sebagai berikut: (1) Pasien dikonfirmasi sebagai KS oleh patologi biopsi pada saluran serviks dan saluran serviks, sitologi smear serviks, tes iodin serviks, spekulum vagina dan reseksi vertebra serviks. (2) Pasien tidak menerima radioterapi dan kemoterapi 2 minggu sebelum operasi. Kriteria eksklusi adalah sebagai berikut: (1) pasien yang menjalani radioterapi atau kemoterapi apa pun, (2) pasien yang tidak setuju dengan pengumpulan sampel dan (3) pasien dengan gangguan sistem kekebalan tubuh.
Seleksi dan Kultur Sel
Baris sel KS (SiHa, HeLa, CaSki, HCC94 dan C33A) dan baris sel epitel serviks manusia yang diimmortal H8 dibeli dari Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Tiongkok). Sel KS SiHa, HeLa dan HCC94 dikultur dalam Medium Eagle Modifikasi Dulbecco (DMEM) glukosa tinggi yang mengandung 10% serum sapi janin (FBS), sementara CaSki, C33A dan H8 sel dalam medium RPMI-1640 yang mengandung 10% FBS (37℃ dan 5% CO2). Sel dilepas dan dialihkan setiap 2 hari.
Pengurutan Sel Stem KS (Sel HeLa CD44+)
Sel stem KS dipisahkan dari baris sel KS HeLa oleh kultur suspensi sel. Sel KS HeLa dikultur dalam Medium Dulbecco Modifikasi Iscove bebas serum (IMDM) dalam Petri dish ultra-efisi adhesi selama 21 hari dengan medium dipertukarkan semikuantitatif setiap 3–5 hari. Beberapa sel tersuspend menjadi bola, dan sel pembentuk bola HeLa (SFCs) diperoleh. Properti sel bola diidentifikasi dan dianalisis. Sel dilepas oleh tripsin dan disesuaikan menjadi 1 × 106 sel/mL. Sel ditambahi dengan antibodi CD44 dan diurutkan oleh sitometri aliran. Sel HeLa dengan CD44 positif adalah sel stem tumor HeLa, sementara dengan CD44 negatif adalah sel non-stem HeLa. Sel stem KS dikultur dalam DMEM/F12 dan ditambahi dengan 20 ng/mL faktor pertumbuhan fibroblast dasar (bFGF), 20 ng/mL faktor pertumbuhan epidemis (EGF) dan B27. Medium mengandung 1% penicilin dan streptomisin [20].
Perawatan Sel
Sel CD44+HeLa ditransfeksi dengan sh-SOX2, sh-SOX2 kontrol negatif (NC), sh-CCAT1, sh-CCAT1 NC, mimic miR-185-3p, mimic NC, sh-CCAT1 dan inhibitor miR-185-3p serta sh-CCAT1 dan inhibitor NC. Semua urutan oligonukleotida disuplai oleh GenePharma (Shanghai, Tiongkok). Sel dilepas oleh tripsin dan ditanam pada piring 6-lubang dengan 3 × 106 sel/lubang. Saat mencapai kepadatan 60%, sel diubah menjadi medium bebas serum dan diinkubasi selama 1 jam. Transfeksi dilakukan oleh reagen transfeksi Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, AS).
RNA dalam jaringan dan sel diekstraksi oleh Trizol (Invitrogen). RNA (1 μg) ditranskripsikan terbalik menjadi cDNA oleh kit RTase moloney murine leukemia virus (Invitrogen). cDNA ditambahkan ke sistem PCR real-time. Primer dirancang oleh Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Tiongkok) (Tabel 1). U6 adalah kontrol beban miR-185-3p, sementara gliseraldehida fosfat dehidrogenase (GAPDH) untuk SOX2, CCAT1 dan FOXP3. Hasil dianalisis dengan metode 2−ΔΔCt.
Analisis Western Blot
Total protein dalam sel dan jaringan diekstraksi. Konsentrasi protein ditentukan oleh kit asam bisionik asid (AmyJet Scientific, Wuhan, Hubei, Tiongkok). Protein dicampur dengan buffer loading dan direbus selama 5 menit, diikuti oleh mandi es dan sentrifugasi. Protein dirawat dengan elektroforesis gel poliakrilamida natrium dodecilsulfat 10% dan ditransfer ke membran. Membran diblokir dengan 5% susu skim selama 1 jam, diikuti dengan antibodi primer SOX2 (1: 1000, Jiangsu Rui sitan Co., Ltd., Jiangsu, Tiongkok), FOXP3 (1: 1000, Abcam Inc., Cambridge, MA, AS), GAPDH (1: 1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, AS) dan diikuti dengan antibodi sekunder yang dilabeli oleh peroksidase retisan, ditutupi dengan film pelindung dan diekspos. Imager Gel Doc EZ Bio-rad (Bio-rad, California, AS) digunakan untuk pengembangan. Citra protein dianalisis oleh perangkat lunak ImageJ2x.
Uji Kit Penghitung Sel (CCK)-8
Uji CCK-8 dilakukan dengan kit (Beyotime, Shanghai, Tiongkok). Sel (1 × 104) ditanam ke dalam piring 96-lubang dan diinkubasi. Setelah dikultur selama 0, 24, 48 dan 72 jam, sel ditambahi dengan larutan CCK-8 10 μL/lubang dan diinkubasi selama 1 jam. Nilai densitas optik ditentukan dengan pembaca mikropiring panjang gelombang penuh Multiskan Spectrum pada 450 nm. Enam lubang diambil untuk menghitung nilai rata-rata. Kurva pertumbuhan sel digambar dengan waktu sebagai ordinat dan kelayakan sel relatif sebagai ordinat. Nilai densitas optik mewakili proliferasi sel.
Sitometri Aliran
Sel (1 × 106) difusikan pada 1500 r/min, disuspendi dengan 200 μL buffer ikat, diinkubasi dengan 5 μL iodida propidium (PI) dan 5 μL Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) secara bergantian dan ditambahi dengan 400 μL buffer. Tingkat apoptosis sel diverifikasi oleh sitometer aliran (BD Biosciences, NJ, AS).
Uji Garis
Sel yang ditransfeksi dilepas dan disiapkan menjadi suspensi sel. Suspensi sel (1 × 106 sel/mL) ditanam ke dalam piring 6-lubang dan dikultur hingga kepadatan 80–90%. Garis lintang dan garis lurus pada piring 6-lubang dibuat secara merata dengan ujung pipet asetrik 10-μL sepanjang penggaris. Media asli diganti dengan medium lengkap, dan sel terus dikultur. Migrasi sel diamati di bawah mikroskop pada 0 jam dan 72 jam dan difoto di lokasi yang sama.
Uji Transwell
Sel yang ditransfeksi ditripsin, difusikan pada 1000 g dan dicuci dengan DMEM. Kamar Transwell yang sepenuhnya terhidrasi ditempatkan pada piring 24-lubang yang berisi DMEM-FBS 10% (600 mL/lubang). Suspensi sel (5 × 105 sel/mL, 200 μL) ditambahkan ke kamar atas Transwell (dilapisi dengan Matrigel 1: 8 sebesar 80 μL), sementara 500 μL DMEM-FBS 20% ke kamar bawah. Sel terus dikultur selama 24 jam, dikonfirmasi dengan 500 μL paraformaldehide (PFA) 4% dan diwarnai dengan larutan kristal violet 0,1%. Kemudian, sel pada permukaan dan tepi kamar atas dibersihkan dengan batu kapas. Lima bidang dipilih secara acak, dan sel dihitung di bawah mikroskop Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon, Jepang).
Uji Pembentukan Bola
Sel ditanam pada piring 6-lubang adsorpsi rendah yang berisi medium suspensi bebas serum dengan 200 sel/lubang. Setelah 2 minggu, tingkat pembentukan bola sel diamati di bawah mikroskop Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon), dan tingkat pembentukan bola dihitung sebagai jumlah bola rata-rata/jumlah sel yang ditanam × 100%.
Uji Imunopresipitasi Kromatin (ChIP)
Uji ChIP dilakukan dengan kit ChIP (Upstate, NY, AS). Antibodi SOX2 (1:1000, Re-stem Biotech, Jiangsu, Tiongkok) dan normal rabbit IgG (12–370, Millipore, AS) digunakan untuk mengimunpresipitasi kompleks protein–DNA yang terpaut silang. Sel CD44+HeLa dikonfirmasi dengan 1% PFA dan diinkubasi untuk menghasilkan silang protein–DNA. Kemudian, DNA dipotong menjadi fragmen kromatin 200–300 bp oleh ultrasonik. Kromatin DNA yang dipresipitasi dipulihkan dan dianalisis oleh RT-qPCR.
Uji Tarik RNA
Plasmida WT (tipe liar) dan MUT (tipe mutan) yang dilabeli biotin miR-185-3p (50 nM) ditransfeksi ke dalam sel CD44+HeLa, masing-masing. Sel diinkubasi dengan lisat sel spesifik (Ambion, Austin, Texas, AS) setelah 48 jam transfeksi. Lisat sel (50 mL) dikemas kembali. Lisat sisa diinkubasi dengan manik streptavidin M-280 (Sigma, St. Louis, MO, AS) yang telah dilapisi oleh RNase bebas dan tRNA ragi (Sigma). Diikuti dengan itu, sel dibersihkan dua kali dengan lisat dingin, tiga kali dengan buffer garam rendah dan sekali dengan buffer garam tinggi. Probe antagonist miR-185-3p diatur sebagai NC. Total RNA diekstraksi oleh Trizol, dan tingkat CCAT1 diuji oleh RT-qPCR.
Uji Gen Laporan Luciferase Dual
Situs ikut potensial E1 dan E2 SOX2 pada wilayah promotor CCAT1 diprediksi dan dianalisis oleh https://jaspar.genereg.net/. Urutan promotor CCAT1 yang berisi situs ikut SOX2 dan CCAT1 E1 disintesis, dan vektor CCAT1 3′UTR WT (E1-WT) dan CCAT1 3′UTR MUT (E1-MUT) dibentuk. Vektor dikloning ke dalam pmirGLO (Beyotime). Setelah itu, CCAT1-WT/pmirGLO atau CCAT1-MUT/pmirGLO ditransfeksi bersama dengan sh-SOX2 atau sh-SOX2 NC ke sel CD44+HeLa, masing-masing, selama 2 hari dan kemudian dilisis. Aktivitas luciferase diuji oleh sistem deteksi luciferase (Takara, Dalian, Tiongkok).
Situs web bioinformatika digunakan untuk memprediksi dan menganalisis situs ikut CCAT1 dan miR-185-3p. Situs ikut CCAT1 dan miR-185-3p diverifikasi oleh uji gen pelapor luciferase dual. CCAT1 3′UTR yang berisi situs ikut miR-185-3p disusun. CCAT1 3′UTR WT dan CCAT1 3′UTR MUT dibentuk dan ditransfeksi bersama dengan mimics NC dan mimics miR-185-3p ke sel CD44+HeLa selama 2 hari. Kemudian, sel dilisis dan aktivitas luciferase diuji oleh sistem deteksi luciferase (Takara). Metode yang sama diterapkan untuk memverifikasi hubungan target antara miR-185-3p dan FOXP3.
Analisis Statistik
Semua data dievaluasi oleh perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, AS). Data pengukuran dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar. Uji t diterapkan untuk perbedaan antara dua grup dan uji analisis variansi satu arah (ANOVA) diikuti dengan uji perbandingan berganda Tukey untuk perbedaan di antara grup. Variabel klasifikasi dievaluasi oleh uji Fisher eksak. Nilai p kurang dari 0,05 dianggap signifikan.
Hasil
Ekspresi miR-185-3p Menurun, Sementara Ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 Meningkat dalam Jaringan KS, dan Ekspresi SOX2 dan CCAT1 Terkait dengan Ukuran Tumor, Metastase Nodul Limfatik (LNM) dan Tahap FIGO
Saat mendeteksi peran axis SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 pada kemampuan proliferasi dan pembaruan diri sel stem KS, ekspresi miR-185-3p, SOX2, CCAT1 dan FOXP3 dalam jaringan KS dan jaringan normal berdekatan diuji oleh RT-qPCR dan analisis Western blot. Terungkap bahwa (Gambar 1a–c) ekspresi miR-185-3p berkurang, sementara ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat dalam jaringan KS.
Ekspresi miR-185-3p menurun, sementara ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat dalam jaringan KS. a Perbandingan ekspresi mRNA SOX2, CCAT1, miR-185-3p dan mRNA FOXP3 dalam jaringan KS dan jaringan normal berdekatan. b Pita protein ekspresi SOX2 dan FOXP3 dalam jaringan KS dan jaringan normal berdekatan. c Perbandingan ekspresi protein SOX2 dan FOXP3 dalam jaringan KS dan jaringan normal berdekatan. *p < 0,05 vs. jaringan normal berdekatan. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan perbandingan antara dua grup dievaluasi oleh uji t
Hubungan antara ekspresi SOX2/CCAT1 dan fitur klinis patologis KS dianalisis (Tabel 2). SOX2 dan CCAT1 yang diekspresikan berlebih dalam KS terkait dengan ukuran tumor, LNM dan tahap FIGO, yang menunjukkan bahwa ekspresi SOX2 dan CCAT1 lebih tinggi pada pasien dengan ukuran tumor yang lebih besar, LNM dan tahap FIGO yang lanjut pada pasien KS.
Ekspresi miR-185-3p Berkurang, Sementara Ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 Meningkat dalam Sel CD44+HeLa
Selanjutnya, ekspresi miR-185-3p, SOX2, CCAT1 dan FOXP3 dalam baris sel epitel serviks manusia yang diimmortal H8 dan baris sel KS SiHa, CasKi, HeLa, HCC94 dan C33A diuji. Disarankan bahwa (Gambar 2a–c) ekspresi miR-185-3p menurun, sementara SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat dalam baris sel KS. Di antaranya, SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam sel HeLa memiliki perbedaan ekspresi terbesar dari sel H8; dengan demikian, sel HeLa diurutkan dan diurutkan; sel HeLa-SFC diperoleh oleh kultur suspensi sel, dan ekspresi CD44 pada permukaan sel sebelum dan setelah diurutkan diidentifikasi oleh sitometri aliran. Hasilnya menekankan bahwa tingkat positif CD44 dalam sel HeLa-SFC secara signifikan lebih tinggi dari sebelum diurutkan, yang menunjukkan pengurutan sel stem KS yang berhasil (Gambar 2d). Sel stem yang diurutkan dinamakan sel CD44+HeLa. Kemudian, ekspresi miR-185-3p, SOX2, CCAT1 dan FOXP3 diuji dalam sel HeLa dan CD44+HeLa (Gambar 2e–g). Terungkap bahwa ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 di-up-regulasi dan miR-185-3p di-down-regulasi dalam sel CD44+HeLa.
Ekspresi miR-185-3p berkurang, sementara ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat dalam sel CD44+HeLa. a Perbandingan ekspresi mRNA SOX2, CCAT1, miR-185-3p dan mRNA FOXP3 dalam sel H8 dan baris sel KS. b Pita protein ekspresi SOX2 dan FOXP3 dalam sel H8 dan baris sel KS. c Perbandingan ekspresi protein SOX2 dan FOXP3 dalam sel H8 dan baris sel KS. d Deteksi tingkat ekspresi CD44 dalam sel HeLa sebelum dan setelah diurutkan oleh sitometri aliran. e Perbandingan ekspresi mRNA SOX2, CCAT1 dan miR-185-3p antara sel HeLa dan sel CD44+HeLa. f Pita protein ekspresi SOX2 dalam sel HeLa dan sel CD44+HeLa. g Perbandingan ekspresi protein SOX2 antara sel HeLa dan sel CD44+HeLa. ^p < 0,05 vs. sel H8. &p < 0,05 vs. sel HeLa. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, perbandingan antara dua grup dievaluasi oleh uji t, dan perbandingan di antara beberapa grup dievaluasi oleh uji ANOVA satu arah diikuti dengan uji pasca uji Tukey
Menurunkan SOX2 dan Menurunkan CCAT1 Menurunkan Proliferasi, Migrasi, Invasi dan Tingkat Pembentukan Bola serta Meningkatkan Apoptosis Sel CD44+HeLa
Selanjutnya, SOX2 dan CCAT1 dinonaktifkan dalam sel CD44+HeLa untuk menjelajahi efek mereka pada proliferasi dan pembaruan diri sel stem KS. Terdeteksi oleh uji CCK-8, sitometri aliran, uji garis, uji Transwell dan eksperimen pembentukan bola, proliferasi, migrasi, invasi dan tingkat pembentukan bola ditekan dan apoptosis sel CD44+HeLa dipromosikan oleh inhibisi SOX2 dan CCAT1 (Gambar 3a–i). Ini menunjukkan bahwa menonaktifkan SOX2 atau CCAT1 menghambat proliferasi dan pembaruan diri sel stem KS.
Menurunkan SOX2 dan menurunkan CCAT1 menurunkan proliferasi, migrasi, invasi dan tingkat pembentukan bola serta meningkatkan apoptosis sel CD44+HeLa. a Uji CCK-8 menguji kurva pertumbuhan sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. b Sitometri aliran mendeteksi apoptosis sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. c Perbandingan tingkat apoptosis sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. d Migrasi sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2 diuji oleh uji garis. e Perbandingan migrasi sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. f Deteksi kemampuan invasi sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2 oleh uji Transwell. g Perbandingan kemampuan invasi sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. h Eksperimen pembentukan bola menguji kapasitas pembaruan diri dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. i Perbandingan tingkat pembentukan bola dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. ap < 0,05 vs. kelompok sh-SOX2 NC. bp < 0,05 vs. kelompok sh-CCAT1 NC. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan perbandingan di antara beberapa grup dievaluasi oleh uji ANOVA satu arah diikuti dengan uji pasca uji Tukey
Pengurasan miR-185-3p Membalikkan Peran Penurunan CCAT1 dalam Sel CD44+HeLa
Kemudian, kami memeriksa apakah miR-185-3p terlibat dalam proses CCAT1 mengatur proliferasi dan pembaruan diri sel stem KS. Sel CD44+HeLa ditransfeksi dengan mimic miR-185-3p atau ditransfeksi bersama dengan sh-CCAT1 dan inhibitor miR-185-3p. Hasilnya menunjukkan bahwa up-regulasi miR-185-3p secara signifikan mengurangi proliferasi, migrasi, invasi dan tingkat pembentukan bola sambil meningkatkan tingkat apoptosis sel CD44+HeLa. Sel yang diobati dengan inhibitor miR-185-3p dapat membalikkan peran penurunan CCAT1 pada proliferasi, migrasi, invasi, apoptosis dan pembentukan bola sel CD44+HeLa (Gambar 4a–i).
miR-185-3p yang diekspresikan berlebih menekan proliferasi, migrasi, invasi dan tingkat pembentukan bola serta meningkatkan apoptosis sel CD44+HeLa. a Uji CCK-8 menguji kurva pertumbuhan sel dalam sel yang diobati dengan mimic miR-185-3p. b Sitometri aliran mendeteksi apoptosis sel dalam sel yang diobati dengan mimic miR-185-3p. c Perbandingan tingkat apoptosis sel dalam sel yang diobati dengan mimic miR-185-3p. d Migrasi sel dalam sel yang diobati dengan mimic miR-185-3p diuji oleh uji garis. e Perbandingan migrasi sel dalam sel yang diobati dengan mimic miR-185-3p. f Deteksi kemampuan invasi sel yang diobati dengan mimic miR-185-3p oleh uji Transwell. g Perbandingan kemampuan invasi sel yang diobati dengan mimic miR-185-3p. h Eksperimen pembentukan bola menguji kapasitas pembaruan diri dalam sel yang diobati dengan mimic miR-185-3p. i Perbandingan tingkat pembentukan bola dalam sel yang diobati dengan mimic miR-185-3p. a p < 0,05 vs. kelompok sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. kelompok sh-CCAT1 NC. c p < 0,05 vs. kelompok mimic NC. d p < 0,05 vs. kelompok sh-CCAT1 + inhibitor NC. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan perbandingan di antara beberapa grup dievaluasi oleh uji ANOVA satu arah diikuti dengan uji pasca uji Tukey
SOX2 yang Diekspresikan Rendah dan CCAT1 yang Diekspresikan Rendah Menurunkan Ekspresi FOXP3 dan Meningkatkan Ekspresi miR-185-3p dalam Sel CD44+HeLa
Selanjutnya, kami memeriksa ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam sel CD44+HeLa setelah transfeksi sh-SOX2, sh-CCAT1, mimic miR-185-3p dan co-transfeksi sh-CCAT1 dan inhibitor miR-185-3p. Ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 berkurang, sementara ekspresi miR-185-3p meningkat dalam sel yang diobati dengan sh-SOX2. Ekspresi CCAT1 dan FOXP3 berkurang, dan ekspresi miR-185-3p ditingkatkan dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1. Ekspresi miR-185-3p meningkat, dan ekspresi FOXP3 menurun dalam sel yang diperkenalkan dengan mimic miR-185-3p. Ekspresi FOXP3 meningkat, dan ekspresi miR-185-3p berkurang dalam sel yang ditransfeksi secara berturut-turut dengan sh-CCAT1 dan inhibitor miR-185-3p (Gambar 5a–d).
SOX2 yang diekspresikan rendah dan CCAT1 yang diekspresikan rendah menurunkan ekspresi FOXP3 dan meningkatkan ekspresi miR-185-3p dalam sel CD44+HeLa. a Ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam kelompok sh-SOX2 NC dan sh-SOX2. b Ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam kelompok sh-CCAT1 NC dan sh-CCAT1. c Ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam kelompok mimic NC dan mimic miR-185-3p. d Ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam kelompok sh-CCAT1 + inhibitor NC dan sh-CCAT1 + inhibitor miR-185-3p. a p < 0,05 vs. kelompok sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. kelompok sh-CCAT1 NC. c p < 0,05 vs. kelompok mimic NC. d p < 0,05 vs. kelompok sh-CCAT1 + inhibitor NC. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan perbandingan di antara beberapa grup dievaluasi oleh uji ANOVA satu arah diikuti dengan uji pasca uji Tukey
SOX2 Terikat pada CCAT1 yang Mempengaruhi Ekspresi miR-185-3p, dan FOXP3 adalah Gen Target miR-185-3p
Situs ikut potensial faktor transkripsi wilayah promotor CCAT1 diprediksi dan dianalisis oleh situs web https://jaspar.genereg.net/, dan menunjukkan bahwa SOX2 dan CCAT1 memiliki situs ikut potensial dalam wilayah promotor CCAT1 (Gambar 6a). ChIP-qPCR melaporkan bahwa (Gambar 6b): Berdasarkan kelompok IgG, lebih banyak fragmen promotor CCAT1 yang dikaya dalam kelompok SOX2 pada situs ikut E1, yang membuktikan bahwa SOX2 terikat pada promotor CCAT1 pada situs E1 dan SOX2 terlibat dalam regulasi CCAT1. Uji gen pelapor luciferase dual menunjukkan bahwa (Gambar 6c): Aktivitas luciferase ditekan dalam sel yang ditransfeksi bersama dengan sh-SOX2 dan E1-WT, yang menunjukkan bahwa SOX2 dapat terikat pada CCAT1.
SOX2 dapat terikat pada CCAT1 yang mempengaruhi ekspresi miR-185-3p, dan FOXP3 adalah gen target miR-185-3p. a Prediksi situs ikut dalam wilayah promotor SOX2 dan CCAT1 oleh situs bioinformatika. b Eksperimen ChIP-qPCR memverifikasi hubungan ikut antara SOX2 dan CCAT1. c Situs ikut SOX2 dan CCAT1 diverifikasi oleh uji gen pelapor luciferase dual. d Prediksi situs ikut dalam CCAT1 dan miR-185-3p oleh situs bioinformatika. e Verifikasi ikut antara CCAT1 dan miR-185-3p oleh uji gen pelapor luciferase dual. f Hubungan ikut antara CCAT1 dan miR-185-3p dalam sel diverifikasi oleh uji tarik RNA. g Prediksi hubungan target antara miR-185-3p dan FOXP3 oleh situs web bioinformatika. h Identifikasi hubungan target antara miR-185-3p dan FOXP3 oleh uji gen pelapor luciferase dual. Data pengukuran digambarkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan perbandingan antara dua grup dievaluasi oleh uji t
Situs web Jefferson memprediksi bahwa CCAT1 dapat terikat pada miR-185-3p (Gambar 6d). Uji gen pelapor luciferase dual melaporkan bahwa (Gambar 6e) aktivitas luciferase menurun dalam sel yang diperkenalkan dengan mimic miR-185-3p dan CCAT1-WT, yang menyiratkan bahwa miR-185-3p dapat terikat pada CCAT1. Uji tarik RNA digunakan untuk memverifikasi apakah CCAT1 dapat terikat dengan miR-185-3p. Hasilnya menunjukkan bahwa (Gambar 6f) tingkat kaya CCAT1 dalam sel yang diobati dengan Bio-miR-185-3p-WT meningkat secara signifikan, sementara tingkat kaya CCAT1 dalam sel yang diobati dengan Bio-miR-185-3p-MUT tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan. Hasil ini menunjukkan bahwa CCAT1 dapat mengadopsi miR-185-3p, sehingga mempengaruhi ekspresi miR-185-3p.
Hubungan target antara miR-185-3p dan FOXP3 diprediksi oleh situs web Jefferson (Gambar 6g). Uji gen pelapor luciferase dual memverifikasi bahwa (Gambar 6h) aktivitas luciferase relatif sel secara dramatis menurun setelah FOXP3-WT dan mimic miR-185-3p ditransfeksi bersama ke sel CD44+HeLa, sementara FOXP3-MUT ditransfeksi bersama dengan mimic miR-185-3p tidak mempengaruhi aktivitas luciferase relatif sel, yang menyiratkan bahwa miR-185-3p menargetkan FOXP3.
Diskusi
KS adalah malignancy keempat yang sering terjadi pada wanita di seluruh dunia, diikuti oleh kanker payudara, usus besar dan paru-paru [3]. Terlapor bahwa sel KS dengan ekspresi SOX2 positif menunjukkan karakteristik sel stem kanker [21]. Sebuah studi telah melaporkan bahwa CCAT1 adalah lncRNA onkogen penting yang terkait dengan KS dan memainkan peran memfasilitasi pertumbuhan dan invasi sel KS [11]. Studi lain mengungkapkan bahwa miR-185-3p dapat memprediksi radiotahan kanker rinofaring dan mengatur pertumbuhan serta apoptosis sel kanker [22]. Terlapor bahwa autoantibody sirkulasi terhadap FOXP3 mencerminkan progresi kontinu lesi serviks dan mungkin menjadi biomarker potensial untuk prognose dini KS [23]. Studi saat ini dirancang untuk mengeksplorasi bagaimana axis SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 mempengaruhi kemampuan proliferasi dan pembaruan diri sel stem KS.
Berdasarkan temuan kami, ekspresi SOX2 dan CCAT1 meningkat dalam jaringan dan sel KS yang terkait dengan ukuran tumor, LNM dan tahap FIGO yang lanjut. Secara fungsional terbukti, menurunkan SOX2 dan CCAT1 menurunkan proliferasi, migrasi, invasi dan jumlah bola sel serta meningkatkan apoptosis sel stem KS. Mirip dengan studi kami, ekspresi SOX2 cenderung meningkat dalam KS [24, 25]. Selain itu, ekspresi SOX2 juga di-up-regulasi dalam sel KS yang berasal dari sel stem kanker [26]. SOX2 yang diekspresikan berlebih disarankan terkait dengan karakteristik klinis patologis pasien dengan beberapa jenis kanker, tidak terbatas pada KS. Misalnya, disarankan bahwa SOX2 yang di-up-regulasi muncul pada pasien kanker sel seksium serviks dengan tahap FIGO I-II [27]. Selain itu, ekspresi SOX2 terkait dengan LNM dalam kanker sel seksium oral [28]. Ketika mengenai fungsi molekular SOX2 untuk progresi kanker, ada karya observatif yang menunjukkan bahwa SOX-2 yang di-down-regulasi menekan migrasi dan invasi kanker sel seksium serviks [29]. Sementara itu, penelitian lain telah memberikan bukti bahwa SOX2 yang di-up-regulasi meningkatkan klonogenitas, proliferasi dan tumorigenisitas sel KS in vitro dan in vivo dibandingkan dengan sel kontrol [30].
Sehubungan dengan hubungan regulasi antara SOX2 dan CCAT1, studi yang ada telah menyajikan bahwa menonaktifkan SOX2 secara signifikan mengurangi tingkat mRNA CCAT1 [31]. Sehubungan dengan peran CCAT1 dalam kanker, studi telah menunjukkan bahwa ekspresi CCAT1 secara signifikan meningkat dalam jaringan KS dibandingkan dengan jaringan normal berdekatan [11, 12]. Perlu diperhatikan bahwa ekspresi berlebih CCAT1 dalam KS berkorelasi positif dengan ukuran tumor [12]. Dalam hal peran CCAT1 dalam aktivitas sel kanker, ada penelitian yang menyoroti bahwa ekspresi berlebih CCAT1 mempercepat proliferasi, pembentukan koloni dan invasi sel KS [11]. Menariknya, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa kemampuan kelayakan sel, invasi dan migrasi menurun melalui penekanan CCAT1 [12]. Bagaimanapun, efek fungsional SOX2 dan CCAT1 dalam kanker lain mirip dengan dalam KS.
Selanjutnya, penelitian kami mengungkapkan bahwa CCAT1 dapat terikat pada miR-185-3p, penurunan CCAT1 dalam KS dan ekspresi berlebih miR-185-3p menekan kemampuan proliferasi dan pembaruan diri sel stem KS. Terlapor bahwa CCAT1 dan miR-185-3p berkorelasi negatif [13]. Selain itu, hasil melaporkan bahwa terdapat penurunan dalam ekspresi miR-185-3p pada kasus kanker rinofaring radiotahan [22]. Sehubungan dengan fungsi menekan miR-185-3p dalam agresivitas sel kanker, studi telah mengungkapkan bahwa up-regulasi miR-185-3p menekan properti invasi dan metastase sel kanker rinofaring [32]. Selain itu, Zou et al. telah menyarankan bahwa pemulihan miR-185 menekan pertumbuhan dan invasi sel kanker payudara [33]. Ada artikel yang menemukan bahwa up-regulasi miR-185 menurunkan kapasitas proliferasi, invasi dan pembentukan koloni sel kanker paru non-sel kecil in vitro [34]. Disajikan bahwa proliferasi, invasi dan migrasi sel in vitro serta pertumbuhan tumor in vivo ditekan melalui ekspresi berlebih miR-185-3p dalam sel kanker paru non-sel kecil [35]. Dari studi-studi ini, peran antitumor miR-185-3p dalam studi saat ini konsisten dengan penelitian sebelumnya.
Untuk melanjutkan, kami mengungkapkan bahwa miR-185-3p menargetkan FOXP3, gen yang diekspresikan berlebih dalam KS untuk mengatur aktivitas sel stem KS. Faktanya, FOXP3, regulator penanda sel stem kanker mirip SOX2 dalam kanker usus besar [36], telah diselidiki dalam KS, menunjukkan up-regulasi dalam sel KS [19] [37]. Terbukti bahwa elevasi FOXP3 mempromosikan pembentukan bola tumor dan merangsang stemness sel kanker paru non-sel kecil [38].
Kesimpulan
Secara kolektif, kami mengeksplorasi untuk pertama kalinya bahwa transkripsi SOX2 dapat mengaktifkan CCAT1, sehingga menghambat miR-185-3p dan mengatur FOXP3 untuk mempromosikan proliferasi dan pembaruan diri sel stem KS, yang merupakan jalan potensial untuk mengobati KS. Selain itu, keterbatasan dalam studi saat ini masih ada dalam ukuran coba yang relatif kecil dalam eksperimen yang dirancang. Dengan demikian, penelitian klinis mungkin perlu dilakukan lebih lanjut untuk mendeteksi efektivitas pengobatan KS.
