SOX2 Mengatur lncRNA CCAT1/MicroRNA-185-3p/FOXP3 Sumbu untuk Mempengaruhi Proliferasi dan Pembaruan Diri Sel Induk Kanker Serviks

Abstrak

Telah disajikan peran RNA non-coding panjang (lncRNAs) pada kanker serviks (CC). Kami bertujuan untuk membahas pengaruh wilayah penentu jenis kelamin Y-box 2 (SOX2)/lncRNA colon cancer-associated transcript-1 (CCAT1)/microRNA-185-3p (miR-185-3p)/forkhead box protein 3 (FOXP3 ) pada proliferasi dan kemampuan pembaruan diri sel induk CC. Ekspresi MiR-185-3p, SOX2, CCAT1 dan FOXP3 diuji dalam jaringan dan sel CC. Hubungan antara ekspresi SOX2/CCAT1 dan gambaran klinikopatologis pada pasien CC telah diverifikasi. Investigasi kehilangan dan keuntungan fungsi dilakukan di CD44⁺ Sel HeLa untuk membahas fungsi biologis dan kapasitas pembaruan diri. Akhirnya, hubungan antara SOX2, CCAT1, FOXP3 dan miR-185-3p diverifikasi. Ekspresi miR-185-3p menurun, sedangkan ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat pada jaringan dan sel CC. Ekspresi SOX2 dan CCAT1 dikaitkan dengan ukuran tumor, metastasis kelenjar getah bening dan federasi internasional ginekologi dan tahap kebidanan CC. Down-regulating SOX2 atau CCAT1 dan up-regulating miR-185-3p mengakibatkan penghambatan proliferasi, invasi, migrasi dan jumlah sel bola serta percepatan apoptosis CD44⁺ sel HeLa. SOX2 dapat mengikat CCAT1 yang memengaruhi ekspresi miR-185-3p, dan FOXP3 ditargetkan oleh miR-185-3p.

Pengantar

Kanker serviks (CC) merupakan penyebab kematian utama keempat pada wanita dengan perkiraan 570.000 kasus dan 311.000 kematian di seluruh dunia pada tahun 2018 [1]. Penyakit kompleks ini berpartisipasi dalam berbagai faktor, termasuk efek genetik dan infeksi virus [2]. Dengan perkembangan co-testing human papillomavirus dan vaksinasi human papillomavirus, prosedur diagnostik dini displasia serviks dan kanker menghasilkan pengurangan insiden, morbiditas dan mortalitas CC [3]. Untuk pasien CC awal, operasi dianjurkan, seperti operasi hemat kesuburan, biopsi kerucut, trakelektomi radikal, diseksi kelenjar getah bening panggul, radioterapi panggul dan brachytherapy [4]. Karena metastasis atau kekambuhan pada pasien CC lanjut, prognosisnya masih buruk [5]. Oleh karena itu, masih penting untuk mengidentifikasi penanda prognostik baru dan efektif serta strategi terapi untuk meningkatkan pengobatan CC.

Wilayah penentu jenis kelamin Y-box 2 (SOX2) adalah anggota penting dari keluarga faktor transkripsi SOX dan terutama dimanifestasikan dalam sel induk embrionik dan dewasa dan juga diekspresikan dalam sel induk tumor [6]. Telah terungkap bahwa SOX2 memodulasi radioresistensi di CC oleh jalur pensinyalan landak [7]. Studi lain telah menunjukkan bahwa SOX2 sangat penting untuk mempertahankan subpopulasi sel induk kanker dalam garis sel CC [8]. Long non-coding RNAs (lncRNAs) adalah kelas molekul RNA dengan panjang 200 nukleotida [9]. LncRNA colon cancer-associated transcript-1 (CCAT1) terletak pada kromosom manusia 8q24.21 dan dianggap sebagai “hot spot” yang menghasilkan mutasi genetik pada kanker usus besar [10]. Sebuah penelitian telah melaporkan bahwa CCAT1 mempercepat proliferasi sel dan invasi CC [11]. Menurut Jia et al., CCAT1 secara dramatis meningkatkan proliferasi, migrasi dan invasi sel CC [12]. Selain itu, penelitian lain telah mengungkapkan bahwa CCAT1 meningkatkan derajat keganasan penyakit radang usus melalui penghancuran penghalang usus dengan mengurangi microRNA-185-3p (miR-185-3p) [13]. MiRNA dapat mengontrol ekspresi gen secara terbalik melalui reduksi mRNA dan menekan translasi [14]. Eksperimen in vitro dalam penelitian sebelumnya telah mengungkapkan bahwa miR-185-3p memodulasi radioresistensi karsinoma nasofaring [15]. Studi lain telah mengimplikasikan bahwa miR-185 berpartisipasi dalam resistensi cisplatin kanker ovarium in vivo dan in vitro [16]. Forkhead box protein 3 (FOXP3) adalah faktor transkripsi milik keluarga protein FOX, yang pertama kali ditemukan dalam sel T regulator (Treg) dan berperan penting dalam pemeliharaan dan proses sel Treg [17]. Sebuah studi melaporkan bahwa FOXP3 terhubung dengan limfangiogenesis CC [18]. Studi lain mengungkapkan bahwa tingkat FOXP3 secara dramatis terkait dengan federasi internasional tahap ginekologi dan kebidanan (tahap FIGO) dan ukuran tumor CC [19]. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami menguji efek sumbu SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 pada proliferasi dan kemampuan pembaruan diri sel punca CC.

Bahan dan Metode

Persetujuan dan Persetujuan Etika untuk Berpartisipasi

Eksperimen yang melibatkan manusia dilaksanakan sesuai dengan prinsip-prinsip yang dinyatakan dalam Deklarasi Helsinki. Penelitian ini disetujui oleh Institutional Review Board dari Rumah Sakit Pertama Universitas Jilin. Semua peserta menandatangani dokumen persetujuan yang diinformasikan.

Mata Pelajaran

Dari Desember 2016 hingga Desember 2018, 39 kasus jaringan CC dan jaringan normal yang berdekatan diambil dari pasien CC dan diawetkan dalam nitrogen cair. Kriteria inklusi adalah sebagai berikut:(1) Pasien dikonfirmasi sebagai CC dengan patologi biopsi pada saluran transserviks dan serviks, sitologi apusan serviks, tes yodium serviks, spekulum vagina dan reseksi vertebra serviks. (2) Pasien tidak menerima radioterapi dan kemoterapi 2 minggu sebelum operasi. Kriteria eksklusi adalah sebagai berikut:(1) pasien yang menjalani radioterapi atau kemoterapi, (2) pasien tidak setuju dengan pengambilan sampel dan (3) pasien dengan gangguan sistem imun.

Seleksi dan Kultur Sel

Garis sel CC (SiHa, HeLa, CaSki, HCC94 dan C33A) dan garis sel epitel serviks manusia yang diabadikan H8 dibeli dari Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Sel CC SiHa, HeLa dan HCC94 dikultur dalam Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) glukosa tinggi yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS), sedangkan sel CaSki, C33A dan H8 dalam media Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 yang mengandung 10 % FBS (37℃ dan 5% CO₂ ). Sel dipisahkan dan disubkultur setiap 2 hari.

Penyortiran Sel Induk CC (CD44⁺ Sel HeLa)

Sel induk CC dipisahkan dari garis sel CC HeLa dengan kultur suspensi sel. Sel CC HeLa dikultur dengan Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) bebas serum dalam cawan Petri adhesi sangat rendah selama 21 hari dengan medium yang ditukar secara semikuantitatif setiap 3-5 hari. Beberapa sel ditangguhkan menjadi bola, dan sel pembentuk HeLa-bola (SFC) diperoleh. Properti sel bola diidentifikasi dan dianalisis. Sel dipisahkan oleh tripsin dan disesuaikan menjadi 1 × 10⁶ sel/mL. Sel ditambahkan dengan antibodi CD44 dan diurutkan berdasarkan flow cytometry. Sel HeLa dengan CD44 positif adalah sel punca tumor HeLa, sedangkan dengan CD44 negatif adalah sel non-induk HeLa. Sel punca CC dikultur dalam DMEM/F12 dan ditambahkan dengan 20 ng/mL faktor pertumbuhan fibroblas dasar (bFGF), 20 ng/mL faktor pertumbuhan epidermal (EGF) dan B27. Medium mengandung 1% penisilin dan streptomisin [20].

Perawatan Sel

CD44⁺ Sel-sel HeLa ditransfeksi dengan sh-SOX2, sh-SOX2 negative control (NC), sh-CCAT1, sh-CCAT1 NC, miR-185-3p meniru, meniru NC, sh-CCAT1 dan miR-185-3p inhibitor serta sh-CCAT1 dan inhibitor NC. Semua urutan oligonukleotida dipasok oleh GenePharma (Shanghai, Cina). Dilepas oleh tripsin, sel-sel diunggulkan dalam piring 6-sumur dengan 3 × 10⁶ sel / sumur. Ketika mencapai pertemuan 60%, sel diubah menjadi media bebas serum dan diinkubasi selama 1 jam. Transfeksi difasilitasi oleh reagen transfeksi Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA).

Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

RNA dalam jaringan dan sel diekstraksi dengan Trizol (Invitrogen). RNA (1 μg) dibalik menjadi cDNA oleh kit RTase virus moloney murine leukemia (Invitrogen). cDNA ditambahkan ke sistem PCR waktu nyata. Primer dirancang oleh Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) (Tabel 1). U6 adalah kontrol pemuatan miR-185-3p, sedangkan gliseraldehida fosfat dehidrogenase (GAPDH) dari SOX2, CCAT1 dan FOXP3. Hasilnya dianalisis dengan 2^−ΔΔCt metode.

Pengujian Western Blot

Protein total dalam sel dan jaringan diekstraksi. Konsentrasi protein ditentukan oleh kit asam bicinchoninic (AmyJet Scientific, Wuhan, Hubei, China). Protein dicampur dengan buffer pemuatan dan direbus selama 5 menit, diikuti dengan penangas es dan sentrifugasi. Protein diperlakukan dengan 10% natrium dodesil sulfat-poliakrilamida elektroforesis gel dan dipindahkan ke membran. Membran diblokir dengan susu skim 5% selama 1 jam, diperiksa dengan antibodi primer SOX2 (1:1000, Jiangsu Rui sitan Co., Ltd., Jiangsu, China), FOXP3 (1:1000, Abcam Inc., Cambridge, MA , USA), GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) dan diperiksa ulang dengan antibodi sekunder yang diberi label oleh horseradish peroxidase, ditutupi oleh film pengawet dan diekspos. Bio-rad Gel Doc EZ imager (Bio-rad, California, USA) diadopsi untuk pengembangan. Gambar protein dianalisis dengan perangkat lunak ImageJ2x.

Kit Penghitung Sel (CCK)-8 Assay

Uji CCK-8 diimplementasikan dengan kit (Beyotime, Shanghai, Cina). Sel (1 × 10⁴ ) diunggulkan ke piring 96-sumur dan diinkubasi. Dikultur selama 0, 24, 48 dan 72 jam, sel ditambahkan dengan 10 L/sumur larutan CCK-8 dan ditetaskan selama 1 jam. Nilai kerapatan optik ditentukan dengan pembaca pelat mikro panjang gelombang penuh Multiskan Spectrum pada 450 nm. Enam sumur diambil untuk menghitung nilai rata-rata. Kurva pertumbuhan sel diplot dengan waktu sebagai ordinat dan viabilitas sel relatif sebagai ordinat. Nilai kepadatan optik mewakili proliferasi sel.

Flow Cytometry

Sel (1 × 10⁶ ) disentrifugasi pada 1500 r/min, disuspensikan dengan 200 L binding buffer, diinkubasi dengan 5 L propidium iodide (PI) dan 5 L Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) secara bergantian dan ditambahkan dengan 400 L buffer. Tingkat apoptosis sel diverifikasi oleh flow cytometer (BD Biosciences, NJ, USA).

Uji Gores

Sel-sel yang ditransfusikan dipisahkan dan disiapkan ke dalam suspensi sel. Suspensi sel (1 × 10⁶ sel / mL) diunggulkan dalam piring 6-sumur dan dikultur hingga pertemuan 80-90%. Goresan melintang dan membujur pada pelat 6-sumur dibuat secara merata dengan ujung pipet aseptik 10 L di sepanjang penggaris. Media asli diganti dengan media lengkap, dan sel-sel terus dikultur. Migrasi sel diamati di bawah mikroskop pada 0 jam dan 72 jam dan difoto di tempat yang sama.

Pengujian Transwell

Sel-sel yang ditransfeksi di-tripsinisasi, disentrifugasi pada 1000 g dan dibilas dengan DMEM. Ruang Transwell yang terhidrasi penuh ditempatkan dalam pelat 24-sumur yang mengandung 10% FBS-DMEM (600 mL/sumur). Suspensi sel (5 × 10⁵ sel/mL, 200 L) ditambahkan ke ruang atas Transwell (dilapisi dengan 1:8 Matrigel 80 L), sedangkan 500 L 20% FBS-DMEM ke ruang bawah. Sel dikultur terus menerus selama 24 jam, difiksasi dengan 500 L paraformaldehyde (PFA) 4% dan diwarnai dengan larutan pewarna kristal violet 0,1%. Kemudian, sel-sel di permukaan dan tepi ruang atas dibersihkan dengan kapas. Lima bidang dipilih secara acak, dan sel dihitung di bawah mikroskop Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon, Jepang).

Pengujian Pembentuk Bola

Sel-sel diunggulkan dalam pelat 6-sumur adsorpsi rendah yang mengandung media suspensi bebas serum dengan 200 sel / sumur. Setelah 2 w, laju pembentukan bola sel diamati di bawah mikroskop Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon), dan laju pembentukan bola dihitung sebagai jumlah rata-rata bola/jumlah sel yang diunggulkan × 100%.

Pengujian Imunopresipitasi Kromatin (ChIP)

Uji ChIP dioperasikan dengan kit ChIP (Upstate, NY, USA). SOX2 (1:1000, Re-stem Biotech, Jiangsu, China) dan antibodi IgG kelinci normal (12-370, Millipore, USA) digunakan untuk imunopresipitasi kompleks protein-DNA terkait-silang. CD44⁺ Sel HeLa difiksasi dengan 1% PFA dan diinkubasi untuk menghasilkan ikatan silang DNA-protein. Kemudian, DNA dipotong menjadi fragmen kromatin 200–300 bp dengan ultrasonik. DNA kromatin yang diendapkan ditemukan dan dianalisis dengan RT-qPCR.

Uji Tarik-Down RNA

Plasmid tipe liar (WT) dan tipe mutan (MUT) berlabel biotin (50 nM) ditransfusikan ke CD44⁺ sel HeLa, masing-masing. Sel ditetaskan dengan lisat sel tertentu (Ambion, Austin, Texas, USA) setelah 48 jam transfeksi. Sel lisat (50 mL) di-subpackage. Lysate residual ditetaskan dengan manik-manik streptavidin M-280 (Sigma, St. Louis, MO, USA) yang telah dilapisi sebelumnya dengan RNase bebas RNase dan ragi (Sigma). Selanjutnya, sel dibersihkan dua kali dengan lisat dingin, tiga kali dengan buffer garam rendah dan sekali dengan buffer garam tinggi. Sebuah probe miR-185-3p antagonis didirikan sebagai NC. Total RNA diekstraksi dengan Trizol, dan level CCAT1 diuji dengan RT-qPCR.

Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda

Situs pengikatan potensial E1 dan E2 dari SOX2 pada wilayah promotor CCAT1 diprediksi oleh https://jaspar.genereg.net/. Urutan promotor CCAT1 yang mengandung situs pengikatan SOX2 dan CCAT1 E1 disintesis, dan vektor CCAT1 3′UTR WT (E1-WT) dan CCAT1 3′UTR MUT (E1-MUT) dibentuk. Vektor dikloning ke pmirGLO (Beyotime). Setelah itu, CCAT1-WT/pmirGLO atau CCAT1-MUT/pmirGLO ditransfeksi bersama dengan sh-SOX2 atau sh-SOX2 NC ke CD44⁺ Sel HeLa, masing-masing, selama 2 hari dan kemudian dilisiskan. Aktivitas luciferase diuji dengan sistem deteksi luciferase (Takara, Dalian, China).

Situs web bioinformatika digunakan untuk memprediksi dan menganalisis situs pengikatan CCAT1 dan miR-185-3p. Situs pengikatan CCAT1 dan miR-185-3p diverifikasi oleh uji gen reporter luciferase ganda. CCAT1 3′UTR yang mengandung situs pengikatan miR-185-3p disusun. CCAT1 3′UTR WT dan CCAT1 3′UTR MUT dibuat dan ditransfeksi bersama dengan mimik NC dan miR-185-3p ke CD44⁺ sel HeLa selama 2 hari. Kemudian, sel-sel dilisiskan dan aktivitas luciferase diuji dengan sistem deteksi luciferase (Takara). Metode yang sama diterapkan untuk memverifikasi hubungan penargetan antara miR-185-3p dan FOXP3.

Analisis Statistik

Semua data dievaluasi dengan perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Data pengukuran ditunjukkan sebagai mean ± standar deviasi. Uji t diterapkan untuk perbedaan antara dua kelompok dan analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti oleh uji perbandingan ganda Tukey untuk perbedaan antar kelompok. Variabel klasifikasi dinilai dengan uji eksak Fisher. p nilai kurang dari 0,05 dianggap signifikan.

Hasil

ekspresi miR-185-3p Menurun, Sementara Ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 Meningkat di Jaringan CC, dan Ekspresi SOX2 dan CCAT1 Terkait dengan Ukuran Tumor, Kelenjar Getah Bening Metastasis (LNM) dan Tahap FIGO

Ketika mendeteksi peran sumbu SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 pada proliferasi dan kemampuan pembaruan diri sel induk CC, ekspresi miR-185-3p, SOX2, CCAT1 dan FOXP3 dalam jaringan CC dan jaringan normal yang berdekatan ditemukan diuji dengan RT-qPCR dan uji western blot. Dimanifestasikan bahwa (Gbr. 1a–c) ekspresi miR-185-3p berkurang, sementara ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat di jaringan CC.

Ekspresi miR-185-3p menurun, sedangkan ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat pada jaringan CC. a Perbandingan ekspresi mRNA SOX2, CCAT1, miR-185-3p dan FOXP3 di CC dan jaringan normal yang berdekatan. b Pita protein ekspresi protein SOX2 dan FOXP3 di CC dan jaringan normal yang berdekatan. c Perbandingan ekspresi protein SOX2 dan FOXP3 di CC dan jaringan normal yang berdekatan. *p < 0,05 vs. jaringan normal yang berdekatan. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara dua kelompok dinilai dengan uji t

Hubungan antara ekspresi SOX2/CCAT1 dan gambaran klinikopatologis CC dianalisis (Tabel 2). SOX2 dan CCAT1 yang diekspresikan secara berlebihan dalam CC dihubungkan dengan ukuran tumor, stadium LNM dan FIGO, menunjukkan bahwa ekspresi SOX2 dan CCAT1 lebih tinggi pada pasien dengan ukuran tumor yang lebih besar, LNM, dan stadium FIGO lanjut dari pasien CC.

ekspresi miR-185-3p Berkurang, Sementara Ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 Meningkatkan CD44⁺ Sel HeLa

Selanjutnya, ekspresi miR-185-3p, SOX2, CCAT1 dan FOXP3 dalam sel epitel serviks manusia yang diabadikan garis sel H8 dan CC SiHa, CasKi, HeLa, HCC94 dan C33A diuji. Disarankan bahwa (Gbr. 2a-c) ekspresi miR-185-3p terdegradasi, sementara SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat pada garis sel CC. Di antara mereka, SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam sel HeLa memiliki perbedaan ekspresi terbesar dari sel H8; dengan demikian, sel-sel HeLa disaring dan disortir; HeLa-SFC diperoleh dengan kultur suspensi sel, dan ekspresi CD44 di permukaan sel sebelum dan sesudah penyortiran diidentifikasi dengan flow cytometry. Hasilnya menekankan bahwa tingkat positif CD44 dalam HeLa-SFCs secara nyata lebih tinggi daripada sebelum penyortiran, menunjukkan keberhasilan penyortiran sel induk CC (Gbr. 2d). Sel induk yang diurutkan diberi nama CD44⁺ sel HeLa. Kemudian, ekspresi miR-185-3p, SOX2, CCAT1 dan FOXP3 diuji dalam HeLa dan CD44⁺ Sel HeLa (Gbr. 2e–g). Dimanifestasikan bahwa ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 diatur ke atas dan miR-185-3p diatur ke bawah dalam CD44⁺ sel HeLa.

ekspresi miR-185-3p berkurang, sementara ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 meningkat dalam CD44⁺ sel HeLa. a Perbandingan ekspresi mRNA SOX2, CCAT1, miR-185-3p dan FOXP3 dalam garis sel H8 dan CC. b Pita protein ekspresi protein SOX2 dan FOXP3 dalam garis sel H8 dan CC. c Perbandingan ekspresi protein SOX2 dan FOXP3 dalam garis sel H8 dan CC. d Deteksi laju ekspresi CD44 dalam sel HeLa sebelum dan sesudah diurutkan berdasarkan flow cytometry. e Perbandingan ekspresi SOX2 mRNA, CCAT1 dan miR-185-3p antara sel HeLa dan CD44⁺ sel HeLa. f Pita protein ekspresi protein SOX2 dalam sel HeLa dan CD44⁺ sel HeLa. g Perbandingan ekspresi protein SOX2 antara sel HeLa dan CD44⁺ sel HeLa. ^p < 0,05 vs. sel H8. ^& p < 0,05 vs. sel HeLa. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, perbandingan antara dua kelompok dinilai dengan uji t, dan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey

Down-Regulating SOX2 dan Down-Regulating CCAT1 Menurunkan Tingkat Proliferasi, Migrasi, Invasi dan Pembentukan Sphere dan Meningkatkan Apoptosis CD44⁺ Sel HeLa

Selanjutnya, SOX2 dan CCAT1 dibungkam dalam CD44⁺ Sel HeLa untuk mengeksplorasi efeknya pada proliferasi dan pembaruan diri sel induk CC. Dideteksi dengan uji CCK-8, flow cytometry, uji awal, uji Transwell dan eksperimen pembentukan bola, proliferasi, migrasi, invasi, dan laju pembentukan bola ditekan dan apoptosis CD44⁺ Sel HeLa dipromosikan oleh penghambatan SOX2 dan CCAT1 (Gbr. 3a-i). Itu menunjukkan bahwa membungkam SOX2 atau CCAT1 menghambat proliferasi dan pembaruan diri sel induk CC.

Down-regulating SOX2 dan down-regulating CCAT1 menurunkan tingkat proliferasi, migrasi, invasi dan pembentukan bola dan meningkatkan apoptosis CD44⁺ sel HeLa. a Uji CCK-8 menguji kurva pertumbuhan sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. b Flow cytometry mendeteksi apoptosis sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. c Perbandingan tingkat apoptosis sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. d Migrasi sel dalam sel yang dirawat dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2 diuji dengan uji awal. e Perbandingan migrasi sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. f Deteksi kemampuan invasi sel dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2 dengan uji Transwell. g Perbandingan kemampuan invasi sel yang diobati dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. h Eksperimen pembentuk bola menguji kapasitas pembaruan diri dalam sel yang diberi sh-CCAT1 atau sh-SOX2. saya Perbandingan laju pembentukan bola dalam sel yang diperlakukan dengan sh-CCAT1 atau sh-SOX2. a p < 0,05 vs kelompok sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. kelompok NC sh-CCAT1. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey

MiR-185-3p Depleted Membalikkan Peran Down-Regulation CCAT1 di CD44⁺ Sel HeLa

Kemudian, kami memeriksa apakah miR-185-3p terlibat dalam proses CCAT1 yang mengatur proliferasi dan pembaruan diri sel punca CC. CD44⁺ HeLa ditransfeksi dengan miR-185-3p mimik atau ditransfeksi bersama dengan sh-CCAT1 dan inhibitor miR-185-3p. Hasilnya menunjukkan bahwa up-regulation miR-185-3p terutama mengurangi tingkat proliferasi, migrasi, invasi dan pembentukan bola sementara meningkatkan tingkat apoptosis CD44⁺ sel HeLa. Sel yang diobati dengan inhibitor miR-185-3p dapat membalikkan peran CCAT1 yang diatur ke bawah dalam proliferasi, migrasi, invasi, apoptosis, dan pembentukan bidang sel CD44⁺ Sel HeLa (Gbr. 4a–i).

MiR-185-3p yang diekspresikan secara berlebihan menekan laju proliferasi, migrasi, invasi, dan pembentukan bola serta meningkatkan apoptosis CD44⁺ sel HeLa. a Uji CCK-8 menguji kurva pertumbuhan sel dalam sel yang diperlakukan dengan miR-185-3p mimik. b Flow cytometry mendeteksi apoptosis sel dalam sel yang diobati dengan miR-185-3p mimik. c Perbandingan tingkat apoptosis sel dalam sel yang diobati dengan miR-185-3p mimik. d Migrasi sel dalam sel yang diperlakukan dengan miR-185-3p mimik diuji dengan uji gores. e Perbandingan migrasi sel dalam sel yang diobati dengan miR-185-3p mimik. f Deteksi kemampuan invasi sel yang diobati dengan miR-185-3p mimik dengan uji Transwell. g Perbandingan kemampuan invasi sel yang diobati dengan miR-185-3p mimik. h Eksperimen pembentukan bola menguji kapasitas pembaruan diri dalam sel yang diperlakukan dengan miR-185-3p mimik. saya Perbandingan laju pembentukan bola dalam sel yang diperlakukan dengan miR-185-3p mimik. sebuah p < 0,05 vs kelompok sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. kelompok NC sh-CCAT1. c p < 0,05 vs. kelompok meniru NC. d p < 0.05 vs kelompok NC sh-CCAT1 + inhibitor. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey

SOX2 yang Diekspresikan Rendah dan CCAT1 yang Diekspresikan Rendah Menurunkan Ekspresi FOXP3 dan Meningkatkan Ekspresi miR-185-3p di CD44⁺ Sel HeLa

Setelah itu, kami memeriksa ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam CD44⁺ Sel HeLa setelah transfeksi sh-SOX2, sh-CCAT1, miR-185-3p meniru dan co-transfeksi inhibitor sh-CCAT1 dan miR-185-3p. Ekspresi SOX2, CCAT1 dan FOXP3 berkurang, sementara ekspresi miR-185-3p meningkat dalam sel yang diobati dengan sh-SOX2. Ekspresi CCAT1 dan FOXP3 berkurang, dan ekspresi miR-185-3p ditingkatkan dalam sel yang diobati dengan sh-CCAT1. ekspresi miR-185-3p meningkat, dan ekspresi FOXP3 menurun dalam sel yang diperkenalkan dengan miR-185-3p mimik. Ekspresi FOXP3 meningkat, dan ekspresi miR-185-3p berkurang dalam sel yang secara berturut-turut ditransfeksi dengan inhibitor sh-CCAT1 dan miR-185-3p (Gbr. 5a–d).

SOX2 yang diekspresikan rendah dan CCAT1 yang diekspresikan dengan rendah menurunkan ekspresi FOXP3 dan meningkatkan ekspresi miR-185-3p di CD44⁺ sel HeLa. a Ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam grup sh-SOX2 NC dan sh-SOX2. b Ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam grup sh-CCAT1 NC dan sh-CCAT1. c Ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam kelompok mimik NC dan miR-185-3p mimik. d Ekspresi SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 dalam kelompok sh-CCAT1 + inhibitor NC dan sh-CCAT1 + miR-185-3p inhibitor. sebuah p < 0,05 vs kelompok sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. kelompok NC sh-CCAT1. c p < 0,05 vs. kelompok NC peniru. d p < 0.05 vs kelompok NC sh-CCAT1 + inhibitor. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey

SOX2 Mengikat ke CCAT1 Yang Mempengaruhi Ekspresi miR-185-3p, dan FOXP3 adalah Gen Target miR-185-3p

Situs pengikatan potensial dari faktor transkripsi wilayah promotor CCAT1 didasarkan dan dianalisis oleh situs web https://jaspar.genereg.net/, dan itu menunjukkan bahwa SOX2 dan CCAT1 memiliki situs pengikatan potensial di wilayah promotor CCAT1 (Gbr. 6a). ChIP-qPCR melaporkan bahwa (Gbr. 6b):Berbeda dengan kelompok IgG, lebih banyak fragmen promotor CCAT1 diperkaya dalam grup SOX2 di situs pengikatan E1, yang membuktikan bahwa SOX2 terikat pada promotor CCAT1 di situs E1 dan SOX2 terikat pada promotor CCAT1 di situs E1 terlibat dalam regulasi CCAT1. Uji gen reporter luciferase ganda menunjukkan bahwa (Gbr. 6c):Aktivitas luciferase ditekan dalam sel yang ditransfeksi bersama dengan sh-SOX2 dan E1-WT, yang menunjukkan bahwa SOX2 dapat berikatan dengan CCAT1.

SOX2 dapat mengikat CCAT1 yang mempengaruhi ekspresi miR-185-3p, dan FOXP3 adalah gen target miR-185-3p. a Prediksi situs pengikatan di daerah promotor SOX2 dan CCAT1 oleh situs bioinformatika. b Eksperimen ChIP-qPCR memverifikasi hubungan pengikatan antara SOX2 dan CCAT1. c Situs pengikatan SOX2 dan CCAT1 diverifikasi oleh uji gen reporter luciferase ganda. d Prediksi situs pengikatan di CCAT1 dan miR-185-3p oleh situs bioinformatika. e Verifikasi pengikatan CCAT1 dan miR-185-3p dengan uji gen reporter luciferase ganda. f Hubungan pengikatan antara CCAT1 dan miR-185-3p dalam sel yang diverifikasi oleh uji pull-down RNA. g Prediksi hubungan penargetan antara miR-185-3p dan FOXP3 oleh situs web bioinformatika. h Identifikasi hubungan penargetan antara miR-185-3p dan FOXP3 dengan uji gen reporter luciferase ganda. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara dua kelompok dinilai dengan uji t

Situs web Jefferson memperkirakan bahwa CCAT1 dapat mengikat miR-185-3p (Gbr. 6d). Uji gen reporter luciferase ganda melaporkan bahwa (Gbr. 6e) aktivitas luciferase menurun dalam sel yang diperkenalkan dengan miR-185-3p mimik dan CCAT1-WT, menunjukkan bahwa miR-185-3p dapat berikatan dengan CCAT1. Uji pull-down RNA digunakan untuk memverifikasi apakah CCAT1 dapat mengikat dengan miR-185-3p. Hasilnya menunjukkan bahwa (Gbr. 6f) tingkat pengayaan CCAT1 dalam sel yang diobati dengan Bio-miR-185-3p-WT meningkat tajam, sedangkan tingkat pengayaan CCAT1 dalam sel yang diobati dengan Bio-miR-185-3p-MUT menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan. Hasil ini menunjukkan bahwa CCAT1 dapat mengadsorpsi miR-185-3p, sehingga memengaruhi ekspresi miR-185-3p.

Hubungan target antara miR-185-3p dan FOXP3 diprediksi oleh situs web Jefferson (Gbr. 6g). Uji gen reporter luciferase ganda memverifikasi bahwa (Gbr. 6h) aktivitas luciferase relatif sel berkurang secara dramatis setelah FOXP3-WT dan miR-185-3p ditransfusikan bersama ke CD44⁺ Sel HeLa, sementara FOXP3-MUT ditransfeksi bersama dengan miR-185-3p mimik tidak memengaruhi aktivitas luciferase relatif sel, menunjukkan bahwa miR-185-3p menargetkan FOXP3.

Diskusi

CC adalah keganasan keempat yang sering terjadi pada wanita di dunia, diikuti oleh kanker payudara, usus besar dan paru-paru [3]. Telah dilaporkan bahwa sel CC dengan ekspresi SOX2 positif menunjukkan karakteristik sel induk kanker [21]. Sebuah penelitian telah melaporkan bahwa CCAT1 adalah lncRNA onkogenik penting yang terkait dengan CC dan memberikan peran memfasilitasi dalam pertumbuhan dan invasi sel CC [11]. Studi lain mengungkapkan miR-185-3p dapat memprediksi radiosensitivitas karsinoma nasofaring dan mengatur pertumbuhan dan apoptosis sel kanker [22]. Telah dilaporkan bahwa autoantibodi yang bersirkulasi terhadap FOXP3 mencerminkan kemajuan berkelanjutan dari lesi serviks dan mungkin menjadi biomarker potensial untuk prognosis awal CC [23]. Studi saat ini dirancang untuk mengeksplorasi bagaimana sumbu SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 memengaruhi proliferasi dan kemampuan pembaruan diri sel punca CC.

Berdasarkan temuan kami, ekspresi SOX2 dan CCAT1 meningkat pada jaringan dan sel CC yang terkait dengan ukuran tumor, LNM, dan FIGO lanjut. Terbukti secara fungsional, down-regulating SOX2 dan CCAT1 menurunkan proliferasi, migrasi, invasi dan jumlah sel bola dan meningkatkan apoptosis sel induk CC. Mirip dengan penelitian kami, tren ekspresi SOX2 meningkat di CC [24, 25]. Selain itu, ekspresi SOX2 juga diregulasi dalam sel CC yang berasal dari sel induk kanker [26]. Overexpressed SOX2 was suggested to link with clinicopathological characteristics of patients with several types of cancer, not limited to CC. For example, it was suggested that up-regulated SOX2 shows in cervical squamous cell carcinoma patients staged in FIGO I-II [27]. Moreover, SOX2 expression is linked to LNM in oral squamous cell carcinoma [28]. When it comes to the molecular function of SOX2 for cancer progression, there is an observational work presenting that down-regulated SOX-2 suppresses cell migration and invasion of cervical squamous cell carcinoma [29]. Meanwhile, another research has offered a proof that up-regulated SOX2 enhances CC cell clonogenicity, proliferation and tumorigenicity in vitro and in vivo than control cells [30].

Concerning to the regulatory relation between SOX2 and CCAT1, an existed study has presented that silencing SOX2 markedly reduces CCAT1 mRNA level [31]. As to the role of CCAT1 in cancers, a study has showed that CCAT1 expression is markedly elevated in CC tissues versus in the adjacent normal tissues [11, 12]. Of note, CCAT1 overexpression in CC is positively related to the tumor size [12]. In terms of the role of CCAT1 in cancer cell activity, there is a research highlighting that overexpressed CCAT1 accelerates CC cell proliferation, colony formation and invasion [11]. Interestingly, a previous research has demonstrated that the cell viability, invasive and migratory abilities are declined via knocking down CCAT1 [12]. Anyway, the functional effect of SOX2 and CCAT1 in other cancers was similar to that in CC.

Afterward, our research revealed that CCAT1 could bind to miR-185-3p, the down-regulated CCAT1 in CC and overexpressing miR-185-3p suppressed the proliferation and self-renewal abilities of CC stem cells. It is reported that CCAT1 and miR-185-3p are negatively correlated [13]. Furthermore, a result reported that a reduction is seen in miR-185-3p expression in radioresistant nasopharyngeal carcinoma cases [22]. Regarding to the suppressive function of miR-185-3p in cancer cell aggressiveness, a study has revealed that up-regulation of miR-185-3p suppresses the invasive and metastatic properties of nasopharyngeal carcinoma cells [32]. Furthermore, Zou et al. have suggested that restored miR-185 represses breast cancer cell growth and invasion [33]. There is a article finding that up-regulation of miR-185 declines the proliferation, invasion and colony formation capacities of non-small cell lung cancer cells in vitro [34]. It is presented that in vitro cell proliferation, invasion and migration as well as in vivo tumor growth are suppressed via miR-185-overexpressing in non-small cell lung cancer cells [35]. From those studies, the anti-tumor role of miR-185-3p in the present study was consistent with previous researches.

To proceed, we unveiled that miR-185-3p targeted FOXP3, the overexpressed gene in CC to regulate CC stem cell activities. In fact, FOXP3, the regulator of SOX2 cancer stem-like cell marker in colon cancer [36], has been investigated in CC, showing an up-regulation in CC cells [19] [37]. It was evidenced that elevating FOXP3 promotes the formation of tumor spheres and stimulates the stemness of non-small cell lung cancer cells [38].

Conclusion

Collectively, we explored for the first time that SOX2 transcription could activate CCAT1, thereby inhibiting miR-185-3p and regulating FOXP3 to promote the proliferation and self-renewal of CC stem cells, which is a potential avenue to treat CC. Additionally, however, limitations in this present study still exist in the relatively small trial size in the designed experiment. Thus, clinical researches might be further carried out to detect the efficacy for the treatment of CC.

Ketersediaan data dan materi

Tidak berlaku.

Menghambat MicroRNA-301 Menahan Angiogenesis dan Pertumbuhan Sel pada Karsinoma Sel Skuamosa Kerongkongan dengan Meningkatkan PTEN Aplikasi multifungsi Zn–Fe–Mn ditambah oksida nanokomposit berbantuan PVA

bahan nano