Meningkatkan Magnetofeksi Magnetic Polyethylenimine Nanopartikel menjadi MG-63 Osteoblas Menggunakan Medan Magnet Seragam Baru

Hasil dan Diskusi

Prinsip Magnetofection

Magnetofeksi didefinisikan sebagai vektor yang berasosiasi dengan nanopartikel superparamagnetik dan terakumulasi pada sel target dengan penerapan medan gradien magnet [15]. Gambar 1 menyajikan komponen dan morfologi kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA dan prinsip utama magnetofeksi. Akumulasi vektor yang lambat dan akibatnya konsentrasi vektor yang rendah dalam jaringan target telah diidentifikasi sebagai hambatan sederhana namun kuat untuk pengiriman gen yang efektif [28]. Mekanisme utama peningkatan khasiat magnetofeksi tampaknya adalah sedimentasi cepat dari dosis vektor penuh pada sel target, sehingga hingga 100% dari sel-sel ini akan memiliki partikel vektor yang terikat pada permukaannya dalam beberapa menit. Jadi, magnetofeksi adalah alat yang tepat untuk mengatasi penghalang kuat dari akumulasi vektor lambat dan, akibatnya, konsentrasi vektor rendah pada jaringan target. Kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA secara acak, dan terbatas dan memakan waktu dalam deposisinya dalam sel yang ditargetkan tanpa adanya medan magnet. Namun demikian, kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA dapat secara luas dan seragam menyentuh sel yang ditargetkan dalam waktu yang relatif singkat dengan adanya medan magnet, yang dapat meningkatkan kemungkinan serapan endositik di unit area sel, sehingga dapat meningkatkan tingkat pemanfaatan kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA dan meningkatkan efisiensi transfeksi.

Tinjauan magnetofeksi menggunakan kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA. Polyethyleneimine berlapis (LPEI) dan nanopartikel oksida besi superparamagnetik (SPIO-NPs) dikaitkan dengan reaksi kondensasi dehidrasi. Untuk tujuan ini, SPIO-NP dilapisi dengan LPEI, yaitu, LPEI terikat erat pada permukaan SPIO-NP dan mereka membentuk PEI-SPIO-NPs bersama-sama. Jika PEI-SPIO-NPs dicampur dengan pDNA telanjang, pDNA bermuatan negatif mengikat PEI-SPIO-NPs bermuatan positif melalui adsorpsi elektrostatik. Sel diinkubasi dengan kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA dengan adanya medan magnet yang menarik kompleks ke arah sel. Hasil dari magnetofection adalah bahwa pada dasarnya semua sel bersentuhan dengan vektor dan persentase sel yang tinggi ditransfeksi dengan cepat

Karakterisasi Kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA

Gambar 2a menunjukkan bahwa PEI-SPIO-NPs secara kasar berbentuk bola dan kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA tampak teragregasi, keduanya memiliki dispersibilitas yang baik, dan daya tarik antara muatan positif dan negatif membuat kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA dapat memperoleh ukuran kecil. Lingkaran histeresis kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA ditunjukkan pada Gambar. 2b. Persentase berat oksida besi dalam PEI-SPION-NPs yang diukur dengan spektrometer serapan atom adalah 20,33(± 2,87) %. Magnetisasi saturasi kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA adalah 21,5 (± 1,6) emu/g besi. Meskipun sifat magnetik berkurang dibandingkan dengan nanopartikel oksida besi superparamagnetik yang tidak dimodifikasi, kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA menunjukkan respons magnetik yang sangat baik, yang diperlukan untuk magnetofeksi efisiensi tinggi.

Karakteristik kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA. a TEM kompleks PEI-SPIO-NPs dan PEI-SPIO-NPs/pDNA. b Loop histeresis kompleks SPIO-NP dan PEI-SPIO-NPs/pDNA. c Potensi zeta dan diameter hidrodinamik kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA pada berbagai rasio N/P. d Gambar skala abu-abu AFM dan struktur molekul kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA. Titik merah menunjukkan lokasi gugus kimia SPIO, titik hijau menunjukkan atom nitrogen, titik kuning menunjukkan atom karbon dan atom fosfor diwakili oleh lingkaran putih titik hitam. e (a) Distribusi ukuran kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA dan e (b) potensi zeta kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA yang diukur dengan instrumen hamburan cahaya dinamis Malvern Zetasizer. Hasil dinyatakan sebagai mean ± SD (n = 5)

Diameter hidrodinamik dan potensi zeta dianggap sebagai parameter pembawa gen yang sangat diperlukan. Gambar 2c menunjukkan bahwa diameter hidrodinamik kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA adalah 200 (± 21,7) nm dengan rasio N/P (NH₂ —grup di PEI / PO₄ —gugus dalam pDNA) sebesar 2,5, dan 175 (± 16,4) nm ketika rasio N/P adalah 5, menunjukkan bahwa perubahan ukuran yang cepat terjadi selama transisi potensial dari negatif ke positif. Setelah itu, gaya tolak menolak antara kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA meningkat dengan rasio N/P yang lebih tinggi, yang menunjukkan bahwa ukuran nanopartikel telah meningkat.

Kami menganalisis jenis ikatan kimia menurut susunan atom, dan selanjutnya berspekulasi tentang struktur molekul kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA. Struktur molekul kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA secara tidak langsung diungkapkan oleh mikroskop gaya atom (AFM, Gambar 2d), yang menunjukkan bahwa gugus karboksil dari nanopartikel oksida besi superparamagnetik digabungkan dengan amina primer PEI melalui ikatan amida. Selain itu, pDNA dibungkus dalam rantai molekul PEI melalui ikatan elektrostatik antara gugus fosfat dari rantai nukleotida dan gugus amina PEI, membentuk kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA. Dalam gambar skala abu-abu AFM, titik merah mewakili lokasi atom besi, titik hijau menunjukkan atom nitrogen, titik kuning menandakan atom karbon, dan atom fosfor diwakili oleh lingkaran putih dengan titik hitam.

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2e, potensi kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA dideteksi menggunakan instrumen hamburan cahaya dinamis. Pada pH =7, potensi nanopartikel oksida besi superparamagnetik (SPIO-NPs) adalah 6.6 (± 1.1) mV, yang menunjukkan adanya gugus karboksilat pada permukaannya. Potensi PEI-SPIO-NPs adalah + 18,2 (± 1,5) mV. Potensi PEI yang dimodifikasi dengan SPIO-NP diubah menjadi permukaan bermuatan positif, yang dapat digunakan sebagai pembawa gen yang digabungkan dengan pDNA bermuatan negatif. Kami mengevaluasi perubahan muatan permukaan kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA pada rasio N/P yang berbeda. Kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA menunjukkan muatan permukaan negatif bahkan pada rasio N/P rendah 2,5, yang secara bertahap diterjemahkan menjadi muatan permukaan positif saat rasio N/P meningkat menjadi 5. Peningkatan rasio N/P ini dalam kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA menghasilkan peningkatan muatan permukaan positif polipleks. Pada rasio N/P 10, potensi kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA (N/P = 10) adalah + 11,9 (± 1,2) mV, dan muatan permukaan mencapai dataran tinggi. Kompleks bermuatan positif datang dalam kontak dengan membran sel bermuatan negatif dan memungkinkan serapan seluler dari nanopartikel kompleks [29]. PEI-SPIO-NPs tidak hanya dapat digunakan sebagai pembawa gen pDNA bermuatan negatif tetapi juga berkontribusi pada tingkat magnetisme tertentu untuk pengiriman obat yang ditargetkan, dan menjadi agen kontras yang digunakan untuk pencitraan kontras magnetic resonance imaging (MRI) [30, 31] .

Persyaratan mendasar dari pembawa gen adalah bahwa pembawa transfeksi harus secara efisien membentuk kompleks yang stabil dengan asam nukleat. Untuk mengevaluasi kemampuan pengikatannya, volume yang sama dari larutan PEI-SPIO-NPs dan larutan pDNA dicampur pada rasio N/P yang berbeda dan divortex. Sebuah alikuot 10-μL campuran kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa (Gbr. 3a). Berbeda dengan pDNA telanjang, migrasi plasmid benar-benar diblokir pada rasio N/P 5, yang menunjukkan bahwa PEI-SPIO-NP sepenuhnya mengonsentrasikan pDNA [32].

Uji pengikatan pDNA dan uji perlindungan pDNA dari PEI-SPIO-NPs. a Elektroforesis gel agarosa dari kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA pada berbagai rasio N/P. b Analisis mobilitas elektroforesis PEI-SPIO-NPs/pDNA setelah pengobatan DNase-I. PEI-SPIO-NP pada berbagai rasio N/P dan pDNA (3 μg) diinkubasi pada 37 °C dalam 5% CO₂ lingkungan sub-lembab selama 30 mnt dengan DNase-I (4 U) dalam DNase/Mg ²⁺ buffer pencernaan yang terdiri dari 50 mM Tris-HCl (pH = 7.6) dan 10 mM MgCl₂ . DNase I kemudian diinaktivasi dengan menambahkan larutan EDTA (pH =8) hingga konsentrasi akhir menjadi 2,5 mM. Sampel kemudian diinkubasi selama 15 menit pada 65 °C, dan 10 μL 1 mg/mL natrium heparin ditambahkan untuk melepaskan pDNA dari PEI-SPIO-NPs/pDNA. Integritas pDNA dinilai dengan elektroforesis gel agarosa 1% (90 V, 30 mnt)

Fitur lain dari PEI-SPIO-NPs sebagai pembawa gen potensial adalah bahwa mereka dapat melindungi pDNA dari degradasi oleh nuklease, sehingga mendukung transfeksi. Gambar 3b menunjukkan bahwa pDNA telanjang didegradasi secara signifikan oleh DNase-I. Kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA pada rasio mol N/P < 5 benar-benar dicerna, sedangkan pDNA yang dilepaskan dari kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA (N/P = 5:1) tetap utuh. Hasil uji perlindungan DNase-I ini menunjukkan bahwa PEI-SPIO-NPs secara efektif melindungi pDNA dari pencernaan DNase-I, sehingga menyiratkan aplikasi potensialnya untuk terapi gen.

Seperti yang ditunjukkan di atas, ketika N/P <5, PEI-SPIO-NPs tidak dapat melindungi pDNA dari degradasi nuklease. Ukuran kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA meningkat ketika N/P>-10, yang tidak cocok untuk transportasi vektor [33, 34]. Ukuran kompleks PEI-SPIO-NPs/pDNA paling kecil dan menunjukkan stabilitas pada N/P = 5. Selain itu, potensi zeta PEI-SPIO-NPs tidak meningkat secara signifikan ketika N/P> 10. Oleh karena itu, untuk memastikan stabilitas PEI-SPIO-NPs/pDNA, rasio N/P 10 dipilih untuk eksperimen selanjutnya.

Pembangkitan Medan Magnet

Generator medan magnet Halbach yang baru (Gbr. 4a, b) dikembangkan oleh kelompok kami, bekerja sama dengan Fakultas Teknik Elektro Universitas Chongqing [20, 21]. Generator medan magnet baru terdiri dari sembilan modul magnet permanen berbentuk kubus identik dan dua lembar shimming pasif (Gbr. 4c), yang menghasilkan medan magnet yang sangat seragam di bidang horizontal.

Generator medan magnet dan keseragaman medan magnetnya dan PEI-SPIO-NP didistribusikan di medan magnet yang berbeda. a Pengukuran keseragaman medan magnet dengan Graussmeter. b Generator medan magnet seragam. c Gambar 3D susunan magnet generator medan magnet seragam (di mana setiap magnet memiliki ukuran 40 × 40 × 200 mm ³ ). d Generator medan magnet 96 sumur. e Keseragaman medan magnet generator medan magnet 96 sumur. f Keseragaman medan magnet generator medan magnet seragam. g Distribusi PEI-SPIO-NPs di medan magnet 96-sumur. h Distribusi PEI-SPIO-NPs dalam medan magnet yang seragam. saya Distribusi bidang XOY medan magnet seragam (50 mm × 50 mm) dan j Distribusi 3D medan magnet seragam

Struktur magnet yang dioptimalkan dapat menghasilkan medan magnet yang terdistribusi secara merata dalam arah horizontal area 50 mm × 50 mm di bidang YOZ. Gradien didistribusikan dalam arah vertikal dengan gradien 2 mT/mm. Medan magnet terdistribusi secara merata di area XOY 50 mm × 50 mm dengan keseragaman 1,3 × 10 ⁻³ dan medan magnet sebesar 0,0739 T, kuat magnet bidang koronal dan bidang sagital tempat pelat kultur sel ditempatkan masing-masing sebesar 0,0632 T dan 0,07 T. Perbedaan keseragaman masing-masing sumur pada pelat magnet kultur sel 96 sumur adalah kira-kira 80% (Gbr. 4d, e). Namun, perbedaan keseragaman masing-masing sumur di medan magnet novel Halbach lebih kecil dari 2‰, sehingga perbedaan keseragaman antara kedua medan magnet adalah> 100 kali lipat (Gbr. 4f). Dalam hal ini, kami menetapkan pelat magnet kultur sel 96-sumur sebagai medan magnet yang tidak seragam, dan medan magnet Halbach yang baru adalah medan magnet yang relatif seragam, yang digunakan sebagai alat eksperimental untuk penelitian selanjutnya.

Distribusi PEI-SPIO-NPs dipengaruhi secara signifikan oleh medan magnet. PEI-SPIO-NPs tenggelam secara bertahap karena gravitasi dan didistribusikan secara acak tanpa adanya medan magnet. Setelah penerapan medan magnet, PEI-SPIO-NPs dengan cepat tenggelam ke dasar pelat. Selanjutnya, distribusi juga dapat berubah secara signifikan dalam medan magnet yang berbeda. Dalam medan magnet non-seragam konvensional (pelat magnet kultur sel 96 sumur), PEI-SPIO-NP dikumpulkan menjadi massa atau pita dan didistribusikan bersama dengan garis gaya magnet (Gbr. 4g). Namun, PEI-SPIO-NP terdistribusi secara seragam dalam medan magnet seragam yang diinduksi oleh generator medan magnet baru (Gbr. 4h). Seperti dapat dilihat dari distribusi bidang XOY dan distribusi 3D medan magnet (Gbr. 4i, j), area merah pada gambar adalah medan magnet yang relatif seragam, dengan keseragaman sekitar dua per seribu (Z = 10 mm), dan dapat dilihat bahwa gradien medan magnet di wilayah target adalah sekitar 1,3 t/m (130 G/cm). The magnetic field generated in the designated area could obtain a good flat property in the horizontal direction by adjusting the arrangement of the magnet module and changing the magnetization direction of the magnet module.

Assessment of In Vitro Cytotoxicity

We used CCK-8 kits to evaluate the effects of magnetization, magnetic field, and pDNA on the cytotoxicity of nanoparticles. Figure 5a shows that with the prolongation of culture time, the absorbance values increased in all the groups except for the PolyMag-200/pDNA groups. The absorbance values of PEI-SPIO-NPs/pDNA group were higher than that of PEI-NPs/pDNA group and PolyMag-200/pDNA group (P  < 0.05) and lower than that of the control group (P  > 0.05), suggesting that the cytotoxicity of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes is lower than unmagnetized PEI-NPs/pDNA complexes and PolyMag-200/pDNA complexes. Figure 5b shows the negative effects on the absorbance values caused by the uniform and non-uniform magnetic fields. The negative effect caused by the uniform magnetic field was smaller than that caused by the non-uniform magnetic field (P < 0,05). As shown in Fig. 5c, the absorbance values of nanoparticles without pDNA is significantly lower than that of nanoparticles with pDNA (P  < 0.05), which meant nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts.

Comparison of cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes, and different nanoparticles with pDNA and without pDNA on MG-63 osteoblasts. Cytotoxicity is detected by the CCK-8 test kit, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm, which reflects the cell viability, and the high viability is indicative of the low cytotoxicity. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P < 0,05, **P < 0,01). a The cytotoxicity effects of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes on MG-63 osteoblasts. b The cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field on MG-63 osteoblasts and c the cytotoxicity effects of different nanoparticles with pDNA and without pDNA

Although PEI is an efficient transfection reagent, its cytotoxicity is strongly and positively correlated with its transfection efficiency and the mechanism of cytotoxicity caused by PEI is not very clear [35]. The present study found that during transfection, PEI increases the permeability of the cell membrane and damages the integrity of the mitochondrial and nuclear membranes [36, 37]. Sonawane et al. [38] reported that PEI25K promotes the release of mitochondrial protons and inhibits the electron transport chain in a dose- and time-dependent manner, indicating that PEI induces cell apoptosis. Another study showed that PEI induces cell autophagy, which is closely related to cytotoxicity [39]. The cytotoxicity of magnetized PEI decreased, and this might be attributable to the surface carboxyl groups of superparamagnetic iron oxide nanoparticles, which are negatively charged, thus partly neutralizing the positive charge of the PEIs and decreasing the chances of incurring irreversible damage. The non-uniform magnetic field induced PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes to gather into masses or bands, and be distributed along with the lines of magnetic force (Fig. 4b), thereby causing severe damage to parts of the cell membrane and even cell death due to the excessively high number of positive charges [40]. In contrast, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes were uniformly distributed across the uniform magnetic field, thereby decreasing the accumulation of positive charges and reducing the cytotoxicity.

Nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts than nanoparticles without pDNA; this may be attributed to the negatively charged pDNA partially neutralize the surface positive potential of the cationic nanoparticles at the beginning of magnetofection progress. Moghimi SM et al. concluded that PEI-induced cellular toxicity could been defined as a two-stage process, with the first stage taking place within 30 min of PEI uptake [41]. Stage-one toxicity has been defined as necrosis that is based on compromise of cell membrane integrity mediated by PEI binding to negatively charged plasma membrane proteoglycans, with highly cationic NPs being extremely cytotoxic [42]. After internalized by MG-63 osteoblast, different nanoparticles exhibits similar cytotoxic mechanisms, internalization leads to proton buffering, osmotic pressure, and eventual lysis of lysosomal membranes, releasing hydrolytic enzymes and other lysosomal constituents into the cytoplasm [43].

Cellular Uptake of PEI-SPIO-NPs/pDNA Complexes

To better understand the intracellular distribution of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes or PEI-NPs/pDNA complexes and the relationship between intracellular uptake of complexes and transfection efficiency, a laser scanning confocal microscope was used to trace the magnetized RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes and non-magnetized RBITC-PEI-NPs/pDNA complexes during transfection of MG-63 cells. LysoTracker Green D26 is a specific marker for lysosomes, and Hoechst 33342 specifically stains nuclei. Overlapping green and red fluorescence, which yields yellow fluorescence, represents colocalization and indicates entrapment of polyplexes in lysosome.

Figure 6 shows that extensive co-localization was observed at 6 h post-transfection, which indicates that most of the complexes were entrapped in endosomes. The RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed a higher frequency of co-localization than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group (arrow). At 12 h post-transfection, most of the red fluorescence had already translocated from the green fluorescence of lysosomes to the surrounding blue fluorescence of nuclei, and some green fluorescence of gene expression was visible in the cytoplasm, which indicated that most complexes escaped the endosomes via the proton sponge effect [44, 45] (arrow). The fluorescent signals of the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group were more distinct than those of the RBITC-SPIO-PEI-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group. It was interesting that the cytoplasm emitted green fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, which indicated expression of GFP, thereby illustrating the proton sponge effect that facilitates gene expression. At 12 h post-transfection, some nuclei emitted red fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, indicating that complexes had been transported into nuclei, which may be attributable to the mechanical effect of magnetofection (arrow). At 24 h post-transfection, the green fluorescence in the cytoplasm showed maximal levels, the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed more intense green fluorescence than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field and the PBITC-PEI-NPs group (arrow). The affiliated magnetic field enabled the magnetic nanoparticles to attach rapidly to the cell membrane and accelerate intracellular uptake of magnetic nanoparticles. By contrast, up to 100% of these cells will have vector particles bound to their surfaces within a few minutes in the presence of the novel uniform magnetic field; more vectors adherence leads to a greater probability of cellular uptake, and transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [46].

Intracellular tracking of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes in the presence of uniform magnetic field (uniform MF) or non-uniform magnetic field (non-uniform MF) and PEI-NPs/pDNA complexes without magnetic field (No MF) at 6, 12, and 24 h post-transfection to MG-63 osteoblasts. Confocal images were obtained from three channels and overlaid:red indicates RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes (excitation:554 nm; emission:576 nm), green represents lysosomes stained with Lysotracker-DND26 and the homogeneous green in the cytoplasm implies GFP expression (excitation:443 nm; emission:505 nm), blue signifies the nuclei stained by the Hochest 33342. (excitation:359 nm; emission:461 nm)

In Vitro Transfection

Because PEI-SPIO-NPs are endowed with promising attributes such as pDNA condensation ability and high cell viability, we next used it as a gene carrier to determine the role of novel uniform and non-uniform magnetic fields on transfection efficiency. To evaluate the effectiveness of magnetofection, we selected the MG-63 osteosarcoma cell line as target cells and used GFP-pDNA as the reporter gene.

GFP expression was observed by inverted fluorescence microscopy at 24 h post-transfection. Figure 7a shows that the PEI-SPIO-NPs/pDNA group yielded significantly higher transfection efficiencies than the PEI-NPs/pDNA group in the presence of the uniform or non-uniform magnetic field, which is obvious in the uniform magnetic field group (P  < 0.05), the transfection efficiency of the uniform magnetic field group was 42.1%, which is roughly two times higher than that of the non-uniform magnetic field group. Although PolyMag-200/pDNA showed high transfection efficiency and has been confirmed to transfect most adherent cell lines, it is also highly cytotoxic. The cells were collected for flow cytometry at 48 h post-transfection (Fig. 7b), and the statistical analysis results were in agreement with the findings from fluorescence microscopy (Fig. 7c).

MG-63 osteoblasts transfected with PEI-SPIO-NPs/pDNA or PEI-NPs/pDNA under the condition of no magnetic field, non-uniform magnetic field, or uniform magnetic field. GFP-pDNA was used for reporter gene in combination with PEI-NPs or PEI-SPIO-NPs (N/P = 10), and the cells were exposed to the non-uniform or uniform magnetic fields for 20 min. At 24-h post-transfection, cell images were captured under an inverted fluorescent microscope. PolyMag-200 comprise commercial magnetic transfection reagents that were used as positive control, naked pDNA was used as the negative control. a At × 40 magnification in an inverted fluorescent microscope. b Transfection efficiency was calculated by flow cytometer and c statistical analysis of the transfection efficiency of PEI-SPIO-NPs/pDNA group, PolyMag-200/pDNA group and PEI-NPs/pDNA group. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P < 0,05, **P  < 0.01)

The mechanism underlying the increase in transfection efficiency by magnetofection is currently unclear. Previous studies have demonstrated that magnetofection does not involve magnetic nanoparticles being pulled directly into the cells by the magnetic field, magnetic nanoparticles enter cells via endocytosis and remain intact upon cellular uptake [47]. The observed significant increase in transfection efficiency may be due to the synergistic effect of accelerated sedimentation and fast internalization [48, 49]. The number of magnetic complexes that enter each cell apparently influences pDNA content. Although genes must still escape endosomes before transcription, transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [50], branched PEIs showed a higher uptake rate. However, once inside the cell, lysosomal escape becomes the key to transfection, especially with higher N/P ratios, and linear PEIs showed higher rates of lysosomal escape [51,52,53]. Because of the magnetic force, PEI-SPIO-NPs can quickly come in close contact with cell membranes, which to some extent, increases the uptake capability of complexes. Once the complexes are inside the cell, PEIs provide a structural advantage and facilitate timely release of pDNA, which is eventually expressed by the cells.