Terapi Kemo-Fototermal Baru pada Kanker Payudara Menggunakan Methotrexate-Loaded Folic Acid Conjugated Au@SiO2 Nanoparticles
Abstrak
Terapi laser tingkat rendah (LLLT) dikenal sebagai jenis fototerapi yang aman untuk menargetkan jaringan/sel tumor. Selain itu, menggunakan nanopartikel yang ditargetkan meningkatkan keberhasilan terapi kanker. Penelitian ini dirancang untuk menyelidiki efek gabungan dari emas berlapis silika yang mengandung folat (FA)/Methotrexate (MTX) (Au@SiO2 ) nanopartikel (NP) dan LLLT dalam memerangi kanker payudara.
NP disintesis dan dikarakterisasi menggunakan FTIR, TEM dan DLS-Zeta. NP memiliki morfologi bola dengan diameter rata-rata sekitar 25 nm dan muatan positif (+13.3 mV) sedangkan setelah konjugasi dengan FA dan MTX muatan bersihnya berkurang menjadi sekitar -19,7 mV.
Temuan kami dalam studi serapan sel dengan jelas menunjukkan peningkatan serapan seluler NP setelah FA dan MTX memuat NP di kedua lini sel kanker payudara terutama pada MDA-MB-231 karena ekspresi reseptor folat yang tinggi. Hasilnya menunjukkan bahwa LLLT memiliki efek proliferatif pada kedua lini sel kanker payudara tetapi dengan adanya nanopartikel target kanker payudara yang direkayasa, kemanjuran terapi kombinasi kemo-fototermal meningkat secara signifikan menggunakan uji MTT (p<0,05), pewarnaan DAPI, dan temuan siklus sel. Efek apoptosis tertinggi pada garis sel kanker payudara diamati pada sel yang terpapar kombinasi MTX-FA yang dimuat Au@SiO2 NP dan LLLT dibuktikan dengan pewarnaan DAPI dan siklus sel (dengan meningkatkan penangkapan sel di subG0/G1). Kombinasi kemoterapi dan LLLT meningkatkan potensi terapi kanker payudara dengan efek samping yang minimal.
Pengantar
Kanker payudara (BC), sebagai wanita yang paling sering, mempengaruhi kanker baru-baru ini telah dilaporkan dengan 1,7 juta kasus baru di seluruh dunia [1]. Karena etiologinya yang rumit dan respons yang buruk terhadap pengobatan, sering diketahui sebagai penyebab utama kematian terkait kanker pada wanita secara universal [2,3,4,5]. Sekitar 40.000 wanita di AS diprediksi meninggal karena SM pada tahun 2014 [2, 6, 7] “(www.cancer.org)”. Dengan 522.000 kematian secara keseluruhan, itu adalah penyebab kematian kelima akibat kanker dengan sekitar 800.000 kasus di negara berkembang dan frekuensi yang sama di negara maju [1]. Di negara-negara Asia usia permulaan terbesar adalah di antara orang dewasa 40 atau 50 tahun dibandingkan dengan negara-negara barat yang sering terjadi antara 60-70 tahun [8]. Faktor risiko utama BC adalah jenis kelamin perempuan, riwayat keluarga, usia, dan kecenderungan generatif yang bervariasi, seperti persalinan pertama pada usia lebih dari 30 tahun, menarche dini dan menopause kemudian, dan nuliparitas [9].
Tujuan utama dalam memerangi kanker adalah mengembangkan rencana terapi yang efektif dengan toksisitas rendah dan spesifisitas tinggi untuk menghilangkan tumor, terutama metastasis mereka, dan lebih lanjut pencegahan kekambuhan mereka. Tetapi pendekatan pengobatan kanker yang digunakan saat ini, seperti pembedahan, kemoterapi dan radioterapi menunjukkan berbagai efek samping [10,11,12] dan semuanya gagal mencapai tujuan ini [13, 14]
Beberapa dekade terakhir telah mengamati perjuangan besar dalam pengobatan kanker [15, 16]. Di antara pendekatan terapi populer saat ini, terapi termal telah berkembang sebagai metode pengobatan prospektif [17]. Baru-baru ini terapi fototermal (PTT), sebagai terapi kanker yang berpotensi efektif dan non-invasif, telah menarik perhatian yang signifikan [18, 19]. PTT berdasarkan struktur nano penyerap foto telah menjadi cara yang berbeda dengan metode umum [20, 21]. Pada PTT tipikal, yang menggunakan agen PTT untuk menghancurkan tumor dengan mendapatkan cukup hipertermia (42°C) di bawah penyinaran laser (near-infrared (NIR) cahaya dalam kisaran 700-1100 nm), telah dipelajari sebagai metode yang sangat tepat dan akurat. metode pengobatan kanker yang sangat invasif [22,23,24,25,26,27,28].
Sejumlah nanopartikel telah dipelajari secara luas sebagai agen kontras pencitraan, pembawa pengiriman obat, dan transformator modalitas energi seperti laser, gelombang radio, dan ultrasound, untuk fenomena termal yang bertanggung jawab atas efek terapeutik [29,30,31,32,33] ,34,35,36,37,38,39].
Nanopartikel emas telah menarik perhatian besar selama dekade terakhir karena resonansi plasmon permukaan lokal yang tinggi (LSPR) dan konjugasi permukaan yang mudah dengan biomolekul [40]. Mereka telah mengungkapkan kapasitas konversi fototermal kinerja tinggi di area NIR [41,42,43] tanpa efek samping berbahaya dalam sistem biologis [44].
Meskipun nanopartikel emas telah diakui sebagai photo-synthesizer yang menjanjikan, tetapi karena stabilitas fototermalnya yang buruk pada iradiasi NIR berulang, nanopartikel emas secara bertahap kehilangan kemampuan konversi fototermalnya yang membatasi penggunaannya dalam praktik klinis. Selain itu, nanopartikel emas bukanlah pembawa obat yang baik karena kapasitas pemuatan obat yang buruk dan profil pelepasan obat yang terkontrol [45, 46]. Sebagai alternatif, nanopartikel silika mesopori (MSN) dikenal sebagai pembawa obat, DNA dan protein yang tepat karena kemampuan pemuatan obatnya yang lebih tinggi dan kurangnya kandungan toksik yang dihasilkan dari degradasinya. Mereka juga memiliki luas permukaan yang besar, ukuran yang dapat dikontrol, volume pori yang sangat tersedia, dan fitur permukaan yang diinginkan dapat diterapkan untuk modifikasi [47].
Nanopartikel setelah konjugasi ke agen kemoterapi dan ligan penargetan kanker dapat menghambat kerugian dari kemoterapi rutin, seperti pengiriman yang tidak spesifik, kelarutan air yang buruk, dan indeks terapeutik yang rendah [48, 49].
Agen yang menunjukkan sifat kemoterapi seperti doxorubicin, cyclophosphamide, methotrexate, fluorouracil, dan docetaxel digunakan sendiri atau dalam kombinasi sebagai perawatan inti utama, atau dibantu dengan perawatan lain seperti PTT. Sebagian besar pasien kanker mengalami efek samping obat kemoterapi karena distribusinya yang tidak tepat di tubuh pasien yang mempengaruhi semua organ. Obat ini merusak beberapa sel normal yang tumbuh cepat, misalnya sel darah, sel selaput lendir yang menutupi organ dalam, dan folikel rambut [50,51,52,53].
Methotrexate (MTX) telah menjadi obat yang paling sering digunakan untuk rheumatoid arthritis dan beberapa jenis tumor seperti kulit, paru-paru, kepala dan leher, dan payudara [54, 55]. Ini menghambat dihydrofolate reductase (DHFR), enzim yang berkontribusi pada produksi tetrahydrofolate dan produk sampingannya yang diperlukan untuk sintesis timidilat dan purin dan keduanya penting untuk pertumbuhan sel dan proliferasi sel. Oleh karena itu, memblokir metotreksat DHFR mencegah sintesis 4 makromolekul dasar DNA, RNA, timidilat, dan protein [56].
Sayangnya, seperti kebanyakan agen PTT konvensional, tantangan utama adalah untuk mencapai akumulasi selektif GNP di jaringan target setelah injeksi sistemik [57,58,59]. Terapi kanker yang ditargetkan memungkinkan pengiriman obat kemoterapi ke sel kanker tertentu sambil mengurangi paparan sel sehat normal. Hal ini mendorong kami untuk memberikan dosis obat yang lebih besar ke sel kanker dengan toksisitas sistemik yang lebih rendah. Nanopartikel yang ditargetkan ligan adalah penanda sel kanker yang diidentifikasi secara tepat, yang sangat terekspresi pada permukaan sel kanker [40].
Asam folat (folat atau vitamin B9) adalah bahan kunci untuk pertumbuhan dan metabolisme sel. Karena afinitas folat yang besar untuk protein reseptor folat, digunakan sebagai elemen untuk penargetan kanker. Reseptor folat, sebagai penanda tumor, diekspresikan secara berlebihan pada sel-sel ganas tertentu seperti kanker payudara, ovarium, paru-paru, ginjal, otak, dan usus besar [60]. Sistem penghantaran obat terkonjugasi folat meningkatkan penyerapan obat melalui endositosis [61].
Bahan dan Metode
Reagen dan bahan
Kami menggunakan air suling ganda (Perusahaan Ghazi, Tabriz, Iran) dan reagen kimia kelas analitik untuk percobaan kami. Sejumlah reagen dibeli dari Sigma-Aldrich Company termasuk:Tetraethyl orthosilicate (TEOS, 98%), (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane (MPTES, kemurnian 95%), asam folat dan rhodamin B. Sekelompok bahan dibeli dari Merck Co:Asam klorida (HCl, 37%), larutan Amoniak (25%), toluena Natrium hidroksida (NaOH, 98%), dan pelarut lebih lanjut. MTX dibeli dari Zahravi Farma Company, Tabriz, Iran.
Instrumentasi
Dalam studi ini, untuk menganalisis ukuran partikel dan morfologi, digunakan mikroskop elektron transmisi (TEM) (LEO 906, Jerman). Kami menyiapkan sekitar 100μL nanopartikel kami yang tersuspensi dalam larutan berair pada suhu kamar. Solusinya dipindahkan ke film karbon yang dilapisi pada kisi tembaga TEM dengan pengeringan beku berikutnya dan diamati pada 80KV. Penentuan ukuran partikel dilakukan dengan pengukuran DLS (dynamic light scattering) pada suhu 25 °C menggunakan Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, UK. Pengukuran potensial Zeta untuk NP yang disiapkan dilakukan dengan spektroskopi korelasi foton (Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, UK). Spektrofotometer sinar ganda UV–Vis (model PC UV-1601 SHIMADZU, Kyoto, Jepang) digunakan untuk pengukuran absorbansi dengan kuvet kuarsa 700μL yang memiliki panjang lintasan 10 mm. Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) dari spektrometer Bruker Tensor 27, Jerman digunakan untuk melakukan metode pelet KBr. Pengukuran pH dilakukan dengan pH meter Metrohm 713 (Herisau, Swiss). Pengaduk mekanik Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Jerman) digunakan untuk pengadukan. Efisiensi enkapsulasi FA dan MTX dihitung menggunakan sistem HPLC yang terdiri dari modul pemisahan Waters 2690 yang dilengkapi dengan detektor UV-vis Detektor Waters 2500 Pump 1000 (Waters, Milford, MA). Pemisahan kromatografi dilakukan pada suhu sekitar menggunakan kolom kromatografi Bondapak C18 m (250 mm 4,6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Irlandia).
Persiapan Au@SiO2 Nanopartikel
SiO2 NP disintesis berdasarkan metode sol-gel yang dilaporkan sebelumnya [62, 63]. Pada langkah selanjutnya nanopartikel berlapis silika yang difungsikan dengan tiol (TFSNPs) disiapkan sesuai dengan metode yang disebutkan dalam penelitian kami sebelumnya [64]. Nanopartikel Au diproduksi dengan metode reduksi sitrat (metode Turkevich) [65]. Akhirnya, permukaan TFSNPs ditutupi oleh AuNPs. Pada awalnya TFSNP didispersikan dalam air dengan bantuan bath sonicator selama setidaknya satu jam dan ditambahkan ke larutan AuNPs dan disonikasi selama 30 menit tambahan. Reaksi dilakukan pada kondisi gelap selama dua hari dengan pengadukan dinamis pada suhu 25 °C. Au@SiO2 nanopartikel dengan penampilan berwarna ungu dikumpulkan dengan sentrifugasi (10000 rpm, 10 menit) dan dikeringkan dalam oven vakum.
Pemuatan MTX dan FA
MTX serta FA dimuat ke Au@SiO2 nanocarrier sebagai berikut:MTX (10 mg) ditambahkan ke dalam 10 mL suspensi nanocarrier yang terdispersi dengan baik dalam PBS (5 mg/mL, pH 7,4) dan diaduk secara moderat pada suhu kamar selama satu hari dalam kondisi gelap. MTX memuat Au@SiO2 nanocarrier dikumpulkan dengan sentrifugasi. Supernatan dikumpulkan untuk pengukuran MTX yang diturunkan. Kemudian MTX memuat Au@SiO2 nanocarrier didispersikan dalam PBS (5 mg/mL, pH 7,4) dan FA (10mg) ditambahkan ke dalam larutan dan diaduk secara moderat pada suhu kamar selama satu hari dalam kondisi gelap. FA-MTX memuat Au@SiO2 nanocarrier dikumpulkan dengan sentrifugasi dan supernatan dipisahkan untuk perhitungan FA tak terikat pada langkah terakhir. FA-MTX memuat Au@SiO2 nanocarrier dibekukan-kering dan disimpan untuk percobaan berikutnya. Jumlah MTX dan FA yang tidak terikat dihitung menggunakan metode HPLC dengan protokol yang dilaporkan sebelumnya [66]. Asam folat dilarutkan dalam amonium hidroksida (10 % berat) dan diencerkan dengan fase gerak. Waktu retensi untuk MTX dan asam folat masing-masing adalah 10,5 dan 5,95 menit. Sampel rangkap tiga diterapkan. Efisiensi pemuatan obat (DLE) dihitung dengan rumus berikut:
Dua lini sel kanker payudara yang menarik dengan tingkat ekspresi permukaan yang dilaporkan reseptor folat (FR) [67] termasuk MCF-7 dan MDA-MB-231 dipilih dan dibeli dari Pasteur Cell Bank (Tehran, Iran) untuk penyelidikan sitotoksisitas. Garis sel yang dipilih ditumbuhkan dalam media lengkap yang mengandung RPMI1640 (Thermoscientific), 10% Fetal bovine serum (FBS), dan 1% Penstrep (Thermoscientific) dalam kondisi termal dan atmosfer 37°C, 5% CO2 , dan kelembapan 95%.
Uji sitotoksisitas sel
Tes viabilitas sel dilakukan untuk mengukur proliferasi sel setelah perawatan NP yang berbeda tanpa iradiasi laser. Secara singkat:sel MCF-7 atau MDA-MB-231 dilapisi dalam 96 lempeng mikro dengan kepadatan sel 1,5×10
4
selama 24 jam, kemudian sel diperlakukan dengan MTX, Au@SiO2 dan FA-MTX memuat Au@SiO2 NP. Sel-sel tanpa pengobatan dianggap sebagai kontrol. Pada langkah berikutnya, pewarna tetrazolium MTT (Sigma) pada konsentrasi akhir 5 g/ml ditambahkan ke dalam sel dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 4 jam. Kemudian, larutan MTT dihilangkan dan kristal Furmazan yang mengendap dilarutkan dalam Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (BioIdea, Iran) di bawah pengocokan lembut selama 10 menit. Akhirnya, absorbansi diukur dalam 570 nm oleh pembaca ELISA. Kelangsungan hidup sel dinormalisasi untuk mengontrol sel dan latar belakang dihilangkan dengan pengurangan pengukuran kosong.
Terapi laser in vitro
Untuk Terapi Laser Tingkat Rendah (LLLT), laser NIR dengan panjang gelombang 810 nm (Laser dioda Mustang 2000, Rusia) dengan dosis daya keluaran 185 mW digunakan untuk penghancuran sel kanker. Mula-mula sel MCF-7 dan MDA-MB 231 dengan kepadatan sel 1,5×10
4
diperlakukan dengan Au@SiO2 dan FA-MTX memuat Au@SiO2 NP kemudian disinari dengan laser dengan dosis laser yang berbeda (30, 60, 75, 90 dan 105 J/cm
2
) dan waktu eksposur tetap (139 detik). Sel-sel yang hanya terpapar radiasi laser (tanpa NP) dan sel-sel tanpa NP dan perawatan laser dianggap sebagai kontrol positif dan negatif, masing-masing. Setelah 24 jam penyinaran laser, viabilitas sel diukur dengan metode uji MTT [64].
Uji serapan seluler nanopartikel
Pemeriksaan rinci internalisasi sel NP sangat penting untuk mengkonfirmasi efek spesifik dari nanocarrier yang dimodifikasi permukaan untuk setiap baris sel. Dalam penelitian ini, kami menggunakan flow cytometry sebagai mikroskop kuantitatif dan fluoresensi untuk pemeriksaan kualitatif pengambilan NP oleh garis sel MCF-7 dan MDA-MB-231.
Untuk suspensi NP, larutan rhodamin B (RhoD) dalam PBS ditambahkan bersamaan dengan pengadukan selama 24 jam pada suhu kamar dan ruangan gelap (mencegah pemutihan). Kemudian, NP yang dimuat RhoD dipisahkan oleh Amicon Filter dengan batas berat molekul nominal (NMWL) 30 kDa dan disentrifugasi selama 15 menit pada 5000 rpm dan dicuci dengan buffer PBS untuk menghilangkan RhoD yang tidak terikat. Sel-sel diunggulkan dalam piring dengan kepadatan 5×10
5
per sumur dan biarkan mencapai pertemuan. Sel-sel diperlakukan dengan NP yang dimuat Rhodamin B selama 30, 90 dan 180 menit, sel-sel yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol. Setelah itu, sel-sel di-tripsinisasi dan dicuci dengan PBS, dan kemudian fluoresensi diukur dengan analisis flow cytometric (BD Biosciences FCASCalibur flow cytometer; BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Serapan intraseluler dari NP atau NPD berlabel rhodamin B lebih lanjut dikonfirmasi oleh mikroskop fluoresensi. Sel MCF-7 dan MDA-MB-231 ditumbuhkan pada kaca penutup dan setelah 24 jam sel diperlakukan dengan Au@SiO2 gratis NP dan MTX-FA memuat Au@SiO2 NP. Setelah inkubasi selama 30, 90 dan 180 menit, sel-sel dicuci dengan PBS dan serapan nanocarrier berlabel rhodamin B diamati menggunakan mikroskop fluoresensi (mikroskop Olympus Bh2-FCA, Jepang).
Studi apoptosis dengan mikroskop Fluoresensi
Salah satu metode untuk studi kualitatif nuklir apoptosis adalah DAPI pewarna fluoresen yang mengikat DNA dan dapat dideteksi dengan mikroskopis yang sesuai. Kami menggunakan protokol seperti yang dilaporkan sebelumnya untuk pewarnaan DAPI [68], segera:sel MCF-7 atau MDA-MB-231 dilapisi dalam 6 wadah format sumur dengan kepadatan 5 ×10
5
dan biarkan mereka menempel dan tumbuh selama 24 jam. Setelah pengobatan dengan MTX, Au@SiO2 NP dan MTX-FA memuat Au@SiO2 NP dengan dan tanpa perawatan laser, sel-sel dicuci dengan PBS (Sigma) dan kemudian difiksasi dengan formaldehida 10% (Merck), selanjutnya:sel-sel ditembus dengan Triton X-100 (Sigma) selama 15 menit. Setelah pencucian yang tepat, sel-sel diwarnai dengan DAPI (sigma) selama 5 menit. Akhirnya, inti apoptosis (terfragmentasi atau berkerut) divisualisasikan oleh mikroskop Fluoresensi (Olympus). Sel-sel tanpa pengobatan dianggap sebagai kontrol negatif dan sel-sel hanya menerima penyinaran laser sebagai kontrol positif.
Investigasi gangguan siklus sel
Distribusi siklus sel MCF-7 dan MDA-MB-231 ditentukan dengan analisis flowcytometry. Dengan cara ini, sel diunggulkan dengan populasi awal 5 × 10
5
dan dibiarkan mencapai 80% pertemuan. Selanjutnya, sel diperlakukan dengan MTX, Au@SiO2 NP dan MTX-FA memuat Au@SiO2 NP dengan dan tanpa iradiasi laser dilakukan. Sel-sel tanpa perlakuan apapun dianggap sebagai kontrol negatif dan sel-sel hanya menerima iradiasi laser sebagai kontrol positif. Kemudian, sel dipanen dengan trypsinization diikuti dengan pencucian PBS yang tepat. Selanjutnya sel difiksasi dengan Etanol (Merck) selama 48 jam. Pada langkah berikutnya, sel-sel tetap dicuci, kemudian diperlakukan dengan Ribonuclease A (Cinaclone), dengan penambahan propidium iodida (PI) (Sigma) berikutnya pada gelap. Sinyal fluoresensi dideteksi oleh set FACS dari Beckton Dicinson Company.
Statistik penelitian
Eksperimen untuk setiap langkah telah dilakukan dalam tiga pengulangan dan hasilnya dilaporkan sebagai mean ±SD. ANOVA digunakan untuk perbandingan signifikansi antar kelompok. Perbedaan tersebut mencerminkan signifikansi dimana nilai probabilitas dihitung <0,05 oleh software SPSS.
Hasil dan diskusi
Karakterisasi NP yang disintesis
Au@SiO2 NP diproduksi dalam empat langkah:1-sintesis SiO2 nanopartikel, 2-penambahan penaut yang mengandung tiol ke NP SiO2, 3-sintesis nanopartikel emas, dan 4-penempelan nanopartikel emas ke permukaan kompleks penaut SiO2 (Gbr. 1). Sintesis Au@SiO2 . yang berhasil dikonfirmasi oleh FTIR (Gbr. 2a). Puncak Si–O–Si muncul sekitar 1088 cm
-1
. Puncak lebar pada 3000–3700 dan 803 cm
–1
dikreditkan ke peregangan dan out-of-pesawat lentur kelompok bebas-silanol O-H, masing-masing. Vibrasi ulur C–H alifatik menunjukkan puncak kuat pada 2950 cm
–1
. C–O ketiga gugus metoksi silan ditunjukkan dengan puncak pada 1191 cm
–1
.
Skema sintetis bertahap untuk persiapan folat dan metotreksat yang mengandung biokompatibel Au@SiO2 nanopartikel NP
a ) Spektrum FTIR Au@SiO2 nanopartikel, b ) distribusi ukuran FA-MTX terkonjugasi Au@SiO2 NP diukur dengan hamburan cahaya dinamis (DLS) c ) Potensi zeta Au@SiO2 dan FA-MTX terkonjugasi Au@SiO2 NP diukur dengan hamburan cahaya dinamis (DLS) pada pH=7.4 dan T=25 °C, d ) Kromatogram dari MTX dan FA yang dibongkar dipisahkan dari Au@SiO terkonjugasi FA-MTX2 NP diukur secara bersamaan dengan metode HPLC
Pengukuran hamburan cahaya dinamis (DLS) menunjukkan bahwa FA-MTX terkonjugasi Au@SiO2 Ukuran NP berada dalam kisaran nanometer (105±2,3 nm) dengan distribusi ukuran yang sempit (Gbr. 2b).
Potensi zeta merupakan parameter fisikokimia penting yang mempengaruhi stabilitas nanosuspensi. Nilai potensial zeta yang sangat positif atau negatif menyebabkan gaya tolak yang lebih besar. Di sisi lain, muatan partikel yang tinggi, baik positif maupun negatif, menyebabkan NP diserap oleh fagosit hati dan dibuang ke tubuh. Dalam kasus stabilisasi elektrostatik dan sterik gabungan, potensial zeta minimum ± 20 mV diinginkan [69,70,71]. Data potensial zeta dari NP dibandingkan sebelum dan sesudah memuat dengan MTX-FA pada pH=7.4 dan T=25 °C (Gbr. 2c). Potensi zeta yang diperoleh dari Au@SiO2 NP adalah +13,3 mV yang setelah pemuatan obat ganda menurun menjadi -19,7 mV yang berada dalam kisaran yang diinginkan. MTX dan FA memiliki muatan bersih negatif pada pH (7,4) di atas pka (3,8 dan 4,8, 3,5 dan 4,3), karena de-protonasi dua gugus asam karboksilat dalam strukturnya ([72], https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.). Oleh karena itu, setelah MTX dan FA memuat secara bersamaan pada Au@SiO2 NP, muatan bersihnya menjadi negatif.
Analisis TEM memberikan ukuran partikel individu yang pasti. Au nanopartikel terlihat sebagai bola gelap yang tersebar pada NP SiO2 sebagai lapisan lapisan abu-abu. Gambar TEM mengkonfirmasi bahwa NP Au@SiO2 telah disintesis dengan bentuk bola homogen di mana ukuran rata-rata partikel sekitar 25nm (Gbr. 3).
Gambar TEM dari Au@SiO2 nanopartikel
Pemuatan obat
Di sini, folat memediasi peningkatan serapan GNP pada jenis sel kanker tertentu yang mengekspresikan reseptor folat secara berlebihan melalui endositosis yang dimediasi reseptor untuk mengatasi rendahnya kemanjuran internalisasi GNP, oleh karena itu reseptor folat dikenal sebagai penanda tumor dan penggunaan folat semakin meningkat untuk tumor. penargetan [67, 73].
Setelah konjugasi molekul MTX dan FA menjadi Au@SiO2 NP, potensi zeta berubah dari +13.3 menjadi -19.7 mV. Perkiraan nilai pKa dari dua gugus asam karboksilat MTX adalah 3,8, 4,8 dan FA adalah 3,5 dan 4,3 [72], https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Oleh karena itu, karena deprotonasi dua gugus asam karboksilat MTX dan FA pada pH 7,4 yang berada di atas pka mereka, muatan bersih menjadi negatif dan menunjukkan keberhasilan konjugasi MTX dan FA pada Au@SiO2 NP. De Ying Tian et al menunjukkan bahwa pemuatan MTX pada nanopartikel Au dengan diameter 18 dan 30 mm masing-masing adalah 15 ± 0,4% dan 10 ± 1,0% [74]. Dalam penelitian ini FA dan MTX dimuat dalam NP Au@SiO2 dengan efisiensi enkapsulasi masing-masing 22,6 dan 77,5%. Kromatogram puncak penilaian MTX dan FA simultan telah ditunjukkan pada Gambar. 2d.
Serapan sel
Karena agen fototermal intraseluler dapat meningkatkan efisiensi terapi kanker fototermal [75], diyakini bahwa internalisasi sel bahan fototermal diperlukan. In vitro uji serapan seluler dilakukan dengan menggunakan sel kanker payudara manusia MDA-MB-231, yang diketahui mengekspresi reseptor folat secara berlebihan [40]. Untuk mempelajari peran FA sebagai agen penargetan dan efisiensi pelapisan permukaan pada penyerapan Au@SiO2 NP oleh sel target, sel MCF-7 dan MDA-MB-231 diperlakukan dengan NP Au@SiO2 dan NP Au@SiO2 yang dimuat MTX-FA. Hasil rata-rata intensitas floresen dari serapan sel ditunjukkan pada Gambar 4. Hasil menunjukkan bahwa serapan NP Au@SiO2 di MCF-7 dan MDA-MB-231 meningkat seiring waktu kultur sel untuk semua sampel (Gambar 4 dan 5 ). Juga, setelah dekorasi permukaan NP Au@SiO2 dengan MTX dan FA, serapan sel meningkat secara signifikan pada MCF-7 dan MDA-MB-231 sebagai sel yang mengekspresikan reseptor folat. Penyerapan NP Au@SiO2 yang dimuat MTX-FA ke dalam sel MDA-MB-231 lebih besar daripada MCF-7. Karena sel-sel MDA-MB-231 mengekspresikan tingkat reseptor folat permukaan yang lebih tinggi sehingga porsi NP yang ditargetkan reseptor folat yang tinggi dimasukkan melalui mekanisme endositosis yang dimediasi reseptor yang menghasilkan serapan seluler yang lebih tinggi. Dalam penelitian lain, peningkatan internalisasi sel dari NP terkonjugasi folat terjadi hanya pada sel kanker yang mengekspresikan aHFR secara berlebihan dan tidak pada sel sehat yang memiliki ekspresi permukaan sel yang lebih sedikit dari aHFR [40]. Konjugasi NP Au@SiO2 dengan FA dapat memfasilitasi penyerapan sel NP dan metotreksat, yang mengarah pada peningkatan toksisitas terhadap sel MDA-MB-231 [76].
Uji serapan sel kuantitatif dari rhodamin B berlabel Au@SiO2 nanopartikel (NP) atau rhodamin B berlabel MTX-FA dimuat Au@SiO2 nanopartikel (NPD) di MCF-7 (a ) dan MDA-MB-231(b ) garis sel untuk durasi paparan 0,5 jam, 1,5 jam dan 3 jam diperoleh dengan flow cytometry. Sel-sel yang tidak diobati dari kedua garis sel digunakan sebagai kontrol negatif. c Perbandingan intensitas fluoresen rata-rata dari rhodamin B berlabel Au@SiO2 nanopartikel (NP) atau rhodamin B berlabel MTX-FA dimuat Au@SiO2 nanopartikel (NPD) untuk durasi paparan 0,5 jam, 1,5 jam dan 3 jam diperoleh dengan flow cytometry
A Uji serapan sel kualitatif menggunakan Rhodamin B berlabel Au@SiO2 nanopartikel (NP) di MCF7 dengan durasi paparan 30 (a ), 90 (b ) dan 180 (c ) min atau rhodamin B berlabel MTX-FA dimuat Au@SiO2 nanopartikel (NPD) dengan durasi paparan 30 (d ), 90 (e ) dan 180 (f ) menit dan (B ) Uji serapan sel kualitatif menggunakan Rhodamin B berlabel Au@SiO2 nanopartikel (NP) dalam MDA-MB-231 dengan durasi paparan 30 (a ), 90 (b ) dan 180 (c ) min atau rhodamin B berlabel MTX-FA dimuat Au@SiO2 nanopartikel (NPD) dengan durasi paparan 30 (d ), 90 (e ) dan 180 (f ) menit ditangkap oleh mikroskop florescent
Uji sitotoksisitas
Studi sitotoksisitas seluler in vitro dari MTX gratis, Au@SiO kosong2 NP dan MTX-FA terkonjugasi Au@SiO2 NP, dievaluasi dengan uji MTT selama 24, 48, dan 72 jam (Gbr. 6). Hasil uji MTT menunjukkan bahwa Au@SiO2 NP tidak memiliki efek sitotoksik pada garis sel MCF-7 dan MDA-MB-231. Selanjutnya, untuk membandingkan efek sitotoksisitas dari MTX bebas dan MTX-FA terkonjugasi Au@SiO2 NP, konsentrasi MTX yang sama (25, 50, 100 dan 200μg/mL) digunakan untuk semua waktu perawatan. Hasil sitotoksisitas sel menunjukkan bahwa MTX atau MTX-FA bebas terkonjugasi Au@SiO2 NP menunjukkan tingkat kematian sekitar 10-25% di kedua garis sel setelah 24 jam pengobatan. Studi sebelumnya melaporkan efek proliferatif nanopartikel emas pada garis sel yang berbeda seperti sel murine osteoblas MC3T3-E1 dan sel induk ligamen periodontal manusia dalam kondisi in vitro. Hasil kami sejalan dengan penelitian ini dan Gambar 6a dan b menunjukkan efek proliferasi NP Au@SiO2 bebas. Oleh karena itu efek sitotoksik yang sama dari MTX dan FA-MTX yang memuat nanopartikel Au@SiO2 (NPD) mungkin disebabkan oleh fenomena ini [77, 78].
a MCF-7 dan (b ) Laju penghambatan pertumbuhan sel MDA-MB-231 setelah perlakuan dengan konsentrasi NP, MTX dan FA-MTX yang berbeda dimuat Au@SiO2 nanopartikel (NPD) setelah waktu pemaparan 24, 48 dan 72 jam
Iradiasi laser
Dalam penelitian ini, viabilitas sel MCF-7 dan MDA-MB 231 sel diperlakukan dengan Au@SiO2 NP dan MTX-FA memuat Au@SiO2 NP setelah penyinaran laser dengan dosis dalam kisaran 30-105 J/cm
2
diselidiki dengan uji MTT. Tingkat kematian sel MCF-7 dan MDA-MB-231 yang diobati dengan MTX-FA yang dimuat Au@SiO2 NP (konsentrasi MTX adalah 100 g/mL) setelah LLLT dengan dosis 75 J/cm
2
adalah sekitar 39 dan 45,5%, masing-masing. Sedangkan pada kondisi yang sama sel diperlakukan dengan Au@SiO2 NP setelah penyinaran laser atau laser saja tidak menunjukkan kematian sel yang jelas. Juga dengan meningkatkan dosis laser menjadi 105 J/cm
2
tingkat kematian kedua garis sel meningkat menjadi 60-75%, sedangkan kedua sel yang diobati dengan Au@SiO2 NP + laser atau laser saja pada dosis iradiasi yang sama tidak menunjukkan efek sitotoksik. Nilai IC50 untuk sel MCF-7 dan MDA-MB-231 setelah terapi kombinasi dengan MTX-FA yang dimuat Au@SiO2 NP (dosis MTX 100 g/mL) dan LLLT diperoleh pada dosis 90 dan 75 J/cm
2
, masing-masing. Di sisi lain tingkat kematian MTX dan MTX-FA memuat Au@SiO2 NP tanpa iradiasi laser pada dosis MTX 100 g/mL (dosis yang dipilih untuk studi terapi laser) adalah antara 15-25% di kedua lini sel. These results indicated that the combination of MTX-FA loaded Au@SiO2 NPs and laser therapy showed a synergistic effect in both cell lines and significantly decreased the cell viability (p <0.001) compared to cells received only laser irradiation. These results indicated that NPs treatment, especially with targeting strategy can improved the efficacy of laser therapy in breast cancer cell destruction (Fig. 7).
A comparison of cell growth inhibition rates exposed to different laser powers (30, 60, 75, 90 and 105 J/cm
2
) for treatment groups of laser alone, laser + Au@SiO2 nanoparticles and laser + MTX-FA loaded Au@SiO2 nanoparticles directed for two cell line MCF-7 (a ) and MDA-MB-231(b ) with subsequent checking after 24h
Apoptosis study by DAPI
The apoptosis were studied in MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treatment with Au@ SiO2 NPs; MTX-FA loaded Au@ SiO2 NPs with or without laser to know if laser treatment could enhance the efficacy of chemotherapy. Our results summarized in Fig. 8 indicated that normal MCF-7 and MDA-MB-231 cells without any treatment set as control as well as cells treated with laser alone or free Au@SiO2 NPs without laser irradiation had typical nuclei, lacking any apoptosis. However, MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with free MTX, Au@ SiO2 NPs with laser irradiation and MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs without laser irradiation showed partial apoptotic nuclei (Fig. 8). The cells treated with MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs in combination with laser irradiation (810 nm, 75 J/cm
2
, 139 sec) showed a major drop in MCF-7 and MDA-MB-231 cell population. Therefore, laser irradiation efficacy was enhanced after MTX/FA loaded Au@SiO2 NPs uptake on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Hence, the novel developed MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs has the capability of augmenting the photothermal effects by highly fragmented cell nuclei, a radical rise in cell loss and complete damage of cells.
Apoptosis assay using DAPI staining for MCF-7 or MDA-MB-231 cells, images captured using an inverted microscope. The untreated cells as the negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm
2
) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO2 nanoparticles (NP (c ), cells treated with laser (75 J/cm
2
) and Au@SiO2 nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h )
Cell cycle
Cell cycle distributions after treatment with MTX, Au@SiO2 NPs and MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs either in combination with LLLT (75 J/cm
2
) or without laser irradiation was studied in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells using flowcytometry and PI staining of DNA. Our study indicated that in MDA-MB-231 or MCF-7 cells, the percentage of non-treated cells (control group) were actively in phase S (Fig. 9a, b). Using 75 J/cm
2
laser treatments reduced the percentage of cells in S-phase in a non-significant manner. On the other hand the cells irradiated with LLLT without NP and drug treatment showed the significant increase in Go/G1 cell population indicated the safety of LLLT alone. Also NPs treatment did not disturb the cell cycle in both cell lines. Treatment of cells with free MTX in the absence or presence of laser irradiation showed some disturbances in cell cycles, including reduction of cells in S-phase. Using NPD alone reduced the cells in S-phase. And interestingly using MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs (NPD) enhanced the cell percentage in sub Go/G1 as a sign of apoptosis [72]. Also the percentage of the MDA-MB-231 cells present in sub Go/G1 (around 18%) were significantly higher than MCF-7 cells (12%) in MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs (NPD) treatment group due to the higher uptake of NPs in MDA-MB-231 cells.
Cell cycle distributions investigated for MCF-7 (A ) or MDA-MB-231 (B ) cells. The untreated cells as negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm
2
) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO2 nanoparticles (NP) (c ), cells treated with laser (75 J/cm
2
) and Au@SiO2 nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h ), C ) Quantitative results of cell cycle arrest and its distribution
Ramos et al , showed that in tumor cells, LLLT increases the percentage of cells in S and G2 /M phases, also they detected a reduction in proliferation and enhancing in senescence [79]. The cell cycle study after LLLT (15 J/cm2) showed a G1 arrest, which is in line with growth stopover in irradiated TK6 cells [80]. Another group reported that PTT is primarily disturbing cells in the S phase and increasing the cell population and arrest in the G2/M phase [81]. As a result, PTT can induce radio-sensitization of the cells via disturbing cell cycle [82]. Their results are in accordance with our study, which showed cell cycle disturbance and reduction of cells in S-phase. Our study also showed the increase in population of apoptotic cells (sub Go/G1) after combination chemo-photothermal therapy. Therefore, applying a combination of LLLT and MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs (NPD) as breast cancer targeted nanoparticles could enhance the breast cancer therapy efficacy.
Conclusions
In this study MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs was designed for target breast cancer therapy in combination with LLLT as noninvasive, FDA approved laser therapy. MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs with spherical morphology and mean diameter of 25nm and surface charge of -19.7 was obtained. This size and surface charge is in a suitable range to increase the bio-distribution of NPs. The successful targeted strategy of this novel developed NPs was approved with a higher cellular uptake percentage of MDA-MB-231 compared to MCF-7 as two breast cancer cell lines with different folate receptor expression. The MTT assay, DAPI staining and cell cycle study's results indicated that the combination of chemo-photothermal therapy showed synergistic effect and the cytotoxicity and apoptosis effect on both breast cancer cell lines especially on MDA-MB-231 cells was increased significantly(p <0.001). Since the Au@SiO2 nanoparticles or LLLT showed no cytotoxic effects, it can be concluded that our therapeutic design has synergistic effects on targeted site. The findings of this study could be useful for designing future cancer therapy programs using bio-chemotherapy combined with low level lasers.
