Optimisasi Magnetofeksi Sel Osteoblast MG-63 dengan Medan Magnet Seragam dan Nanopartikel PEI-SPIO

Abstrak

Studi ini menunjukkan bahwa medan magnet seragam baru secara signifikan meningkatkan magnetofeksi sel osteoblast MG-63 menggunakan nanopartikel oksida besi superparamagnetik yang dimodifikasi PEI linear berat molekuler rendah (MW 20 kDa) (PEI-SPIO-NPs). PEI-SPIO-NPs menunjukkan ukuran, potensi zeta, kapasitas binding DNA plasmid (pDNA), dan kemampuan perlindungan DNA yang optimal, menjadikannya pengakar gen non-viral yang cocok. Di bawah medan seragam, kompleks PEI-SPIO-NP/pDNA dengan cepat dan merata menutupi permukaan sel, menghindari hotspot transaksi lokal dan gangguan membran yang dapat timbul dari pengelompokan pengakar bermuatan positif. Distribusi seragam ini meningkatkan cakupan efektif dari pengakar gen magnetik dan meningkatkan efisiensi transaksi. Medan seragam juga menyediakan lingkungan terkontrol untuk menyesuaikan rasio PEI-SPIO-NP:pDNA dan menyaring formulasi pengakar optimal. Akibatnya, pendekatan ini menawarkan strategi baru untuk pengiriman gen terapeutik yang ditargetkan ke jaringan osteosarcoma dan dapat diperluas ke model tumor lainnya.

Latar Belakang

Osteosarcoma tetap menjadi tumor tulang malignant paling umum pada anak-anak dan remaja, dan terapi saat ini menghasilkan manfaat waktu bertahan yang terbatas. Terapi gen telah muncul sebagai tambahan yang menjanjikan, namun sistem pengiriman non-viral yang efektif, aman, dan masih belum tersedia. Vektor viral konvensi, meski sangat efisien, mengangkat kekhawatiran keamanan termasuk imunogenitas dan mutagènesis insersi, mendorong penelitian menuju pengakar non-viral. Sayangnya, metode non-viral biasanya menunjukkan efisiensi transaksi yang rendah pada sel osteosarcoma.

Alat transaksi fisik—gene gun, ultrasound, elektroporasi—dapat meningkatkan pengiriman namun sering kali menyebabkan kerusakan seluler. Magnetofeksi, atau transaksi yang diassistensi magnet, menawarkan alternatif yang lebih lembut: nanopartikel magnetik (MNPs) ditarik ke sel target oleh medan eksternal, mengonsentrasikan kompleks gen di permukaan sel dan mempromosikan pengambilan. Sepuluh tahun terakhir, kemajuan seperti medan osilasi, magnet berputar, dan medan gradien dinamis telah meningkatkan efisiensi magnetofeksi, namun keseragaman medan magnet tetap menjadi faktor pembatas. Sebagian besar perangkat komersial menghasilkan medan heterogen, yang mengarah pada distribusi nanopartikel yang tidak merata, toksisitas lokal, dan hasil transaksi yang bervariasi.

Untuk mengatasi ini, grup kami bekerja sama dengan Fakultas Teknik Elektrik Universitas Chongqing untuk merancang generator medan magnet tipe Halbach yang menciptakan medan yang sangat seragam di area 50 mm × 50 mm (kekuatan medan 0,0739 T, keseragaman 1,3 × 10⁻³). Keseragaman ini lebih dari 100 kali lebih baik daripada papan magnet 96-lubang konvensional. Kami hipotesis bahwa medan tersebut akan memungkinkan distribusi merata kompleks PEI-SPIO-NP/pDNA dan meningkatkan magnetofeksi sel MG-63.

Metode

Bahan dan Reagen

SPIO-NPs, PEI linear (MW 20 kDa), EDC, NHS, DNA plasmid, dan semua reagen kultur sel diperoleh dari pemasok standar (Sigma-Aldrich, Invitrogen, dll.). Generator medan magnet tipe Halbach dibuat internal, dan papan magnet 96-lubang dibeli dari Chemicell. Semua kimia kelas analitik.

Sintesis PEI-SPIO-NPs

SPIO-NPs yang dimodifikasi karboksil (5 mg mL⁻¹) diaktifkan dengan EDC (0,1 g) dan NHS (0,5 g) pada pH 5 selama 4–6 jam, kemudian bereaksi dengan PEI (20 mg mL⁻¹) selama beberapa jam. Konjugat difosforasi (MWCO 20 kDa) selama 48 jam, dikeringkan dengan pendinginan, dan disimpan.

Pembentukan dan Karakterisasi Kompleks PEI-SPIO-NP/pDNA

PEI-SPIO-NPs dan DNA plasmid dicampur pada rasio N/P (NH₂/PO₄) yang berkisar dari 2,5 hingga 25. Kompleks dikarakterisasi oleh TEM, pencaran cahaya dinamis (DLS), potensi zeta, magnetometri sampel getaran (VSM), spektrometri emissi optik plasma terintegrasi (ICP-OES), dan mikroskopi gaya atom (AFM). Elektroforesis gel menilai binding pDNA dan perlindungan terhadap DNase I.

Pembangkitan Medan Magnet

Generator Halbach terdiri dari sembilan blok Nd-Fe-B 40 × 40 × 200 mm³ dan dua shim pasif. Keseragaman medan diukur dengan Gaussmeter; medan yang dihasilkan adalah 0,0739 T dengan variasi <0,13 % di seluruh bidang 50 mm × 50 mm.

Kultur Sel

Sel osteosarcoma MG-63 manusia dikultur dalam DMEM + 10 % FBS + antibiotik pada 37 °C, 5 % CO₂.

Penilaian Sittotoksisitas

Uji CCK-8 mengukur viabilitas setelah paparan 24–96 jam terhadap PEI-SPIO-NP/pDNA, PEI-NP/pDNA, dan kontrol PolyMag-200 di bawah medan seragam atau tidak seragam.

Mikroskopi Konfokal

Kompleks berlabel RBITC diinkubasi dengan sel MG-63 di bawah medan seragam atau tidak seragam. Sel diwarnai dengan Hoechst 33342 dan LysoTracker Green; citra ditangkap pada Zeiss LSM 700.

Sitometri Aliran

Efisiensi transaksi diukur dengan sitometri aliran 48 jam setelah transaksi menggunakan plasmid yang mengekspresikan GFP.

Analisis Statistik

Data (n = 5) dianalisis dengan one-way ANOVA dan uji t Student; p < 0,05 menunjukkan signifikansi.

Hasil dan Pembicaraan

Prinsip Magnetofeksi

Magnetofeksi bergantung pada gradien magnet untuk menarik kompleks PEI-SPIO-NP/pDNA ke sel target, mencapai cakupan permukaan hampir lengkap dalam hitungan menit. Pengendapan cepat ini melewati hambatan difusi yang lambat yang khas dari transaksi non-magnetik.

Karakterisasi Kompleks PEI-SPIO-NP/pDNA

PEI-SPIO-NPs adalah bola ~10 nm; kompleks mengagregasi menjadi ~180–200 nm dengan potensi zeta positif (+11,9 mV pada N/P = 10). VSM menunjukkan magnetisasi jenuh 21,5 emu g⁻¹, cukup untuk manipulasi magnetik. Uji perpindahan gel mengonfirmasi kondensasi DNA lengkap pada N/P ≥ 5, dan uji perlindungan DNase menunjukkan perlindungan yang kuat pada N/P ≥ 5.

Keseragaman Medan Magnet dan Distribusi Nanopartikel

Di bawah medan Halbach, PEI-SPIO-NPs tersebar merata di seluruh papan, sedangkan papan magnet 96-lubang konvensional menghasilkan agregat yang menggumpal sepanjang garis magnet. Distribusi seragam meminimalkan kepadatan muatan lokal, mengurangi gangguan membran dan sittotoksisitas.

Sittotoksisitas

Hasil CCK-8 menunjukkan bahwa kompleks PEI-SPIO-NP/pDNA memiliki toksisitas lebih rendah dibandingkan kontrol PEI-NP/pDNA dan PolyMag-200/pDNA yang tidak dimagnetkan. Medan seragam lebih mengurangi toksisitas dibandingkan medan tidak seragam (p < 0,05). Nanopartikel yang mengandung pDNA menunjukkan toksisitas lebih rendah daripada partikel kosong, mungkin karena netralisasi muatan oleh plasmid bermuatan negatif.

Pengambilan Seluler

Citra konfokal menunjukkan kolokasi yang luas dari kompleks berlabel RBITC dengan LysoTracker pada 6 jam, diikuti oleh pelarian ke sitoplasma dan inti pada 12–24 jam. Pengambilan tertinggi di bawah medan seragam, berkaitan dengan efisiensi transaksi yang lebih besar.

Efisiensi Transaksi

Ekspresi GFP di bawah medan seragam mencapai 42,1 % (sitometri aliran), sekitar dua kali efisiensi medan tidak seragam (≈ 21 %). PEI-SPIO-NP/pDNA unggul dibandingkan PEI-NP/pDNA, dan meskipun PolyMag-200 mencapai transaksi tinggi, tetap sittotoksik. Data menunjukkan bahwa pengendapan cepat, cakupan seragam, dan pelarian endosom yang efisien secara kolektif mengajarkan magnetofeksi yang ditingkatkan.

Kesimpulan

Generator medan magnet tipe Halbach kami menghasilkan medan yang sangat seragam yang memungkinkan distribusi merata kompleks PEI-SPIO-NP/pDNA pada sel osteoblast MG-63. Konfigurasi ini mengurangi toksisitas lokal, meningkatkan cakupan permukaan sel, dan secara signifikan meningkatkan efisiensi magnetofeksi. Platform ini menawarkan pendekatan yang dapat dikontrol dan scalable untuk pengiriman gen yang ditargetkan ke osteosarcoma dan potensi tumor padat lainnya. Studi in vivo lebih lanjut diperlukan untuk memvalidasi efikasi terapeutik.

Singkatan

AFM

Mikroskopi gaya atom

CLSM

Mikroskopi laser scanning konfokal

DLS

Pencaran cahaya dinamis

DMEM

Medium Eagle modifikasi Dulbecco

EDC

1-Etil-3-[3-(dimetilamino)propil] karbodiimida

FBS

Serapi sapi fetus

GFP

Protein fluoresen hijau

ICP-OES

Spektrometri emissi optik plasma terintegrasi

MF

Medan magnet

MG-63

Baris sel osteosarcoma manusia

MRI

Resonansi magnetik

MWCO

Batas berat molekuler

NHS

N-hidroksi suksinimida

PBS

Larutan penyangga fosfat

pDNA

DNA plasmid

PEI

Polietilenimina

PEI-NPs

Nanopartikel polietilenimina

PEI-SPIO-NPs

Nanopartikel oksida besi superparamagnetik yang dimodifikasi polietilenimina

RBITC

Isosianat rodamin B

SPIO-NPs

Nanopartikel oksida besi superparamagnetik

TEM

Mikroskopi transmisi elektron

VSM

Magnetometer sampel getaran