Gint4.T-Modified DNA Tetrahedrons Loaded with Doxorubicin Menghambat Proliferasi Sel Glioma dengan Menargetkan PDGFRβ
Abstrak
Glioma adalah salah satu tumor otak intrinsik paling mematikan karena pertumbuhannya yang invasif. Efek pengobatan glioma buruk karena adanya penghalang darah-otak dan penghalang tumor darah dan penargetan obat yang tidak mencukupi. Tetrahedron DNA (TDN) menunjukkan potensi besar untuk pengiriman obat dan mungkin menjadi strategi terapi baru untuk glioma. Dalam penelitian ini, kami menggunakan TDN untuk memberikan doxorubicin (DOX) untuk terapi glioma. Gint4.T, sebuah aptamer yang dapat mengenali reseptor faktor pertumbuhan yang diturunkan dari platelet pada sel tumor, digunakan untuk memodifikasi TDN (Apt-TDN) untuk penghantaran obat yang ditargetkan. TDN dirakit sendiri dengan sintesis satu langkah, yang menunjukkan ukuran kecil (10 nm) dan muatan negatif. Uji serum janin sapi menunjukkan stabilitasnya sebagai pembawa obat. Apt-TDN dapat diambil secara efektif oleh sel U87MG. Dibandingkan dengan DOX dan DOX@TDN (TDN dimuat dengan DOX), DOX@Apt-TDN (Gint4.T-modified TDN sarat dengan DOX) menunjukkan tingkat apoptosis yang lebih awal, penghentian siklus sel yang lebih tinggi, dan sitotoksisitas yang lebih besar terhadap sel U87MG. Kesimpulannya, temuan kami menunjukkan bahwa DOX@Apt-TDN menyediakan terapi baru dengan aplikasi klinis yang menjanjikan untuk pasien glioma.
Pengantar
Glioma, tumor yang berasal dari neuroepithelium, adalah keganasan intrakranial yang paling umum. Hampir 1/3 dari semua tumor otak adalah glioma, dan sekitar 4/5 dari tumor otak ganas primer adalah glioma [1,2,3,4]. Saat ini, pengobatan yang paling efektif untuk glioma adalah reseksi bedah dan kemoradioterapi bersamaan pasca operasi, tetapi sayangnya, prognosis untuk pasien tetap buruk. Kemoterapi tradisional untuk glioma tidak menunjukkan hasil yang baik karena penargetan tumor yang buruk, komplikasi karena sawar darah-otak (BBB) dan sawar tumor darah (BTB), dan penargetan obat yang tidak mencukupi. BBB adalah faktor terpenting yang mencegah pengiriman hampir semua makromolekul (termasuk obat-obatan dan gen) ke parenkim otak dan fungsinya yang tepat. Obat yang tidak dapat melewati BBB harus diberikan dengan dosis yang cukup tinggi untuk mencapai konsentrasi pengobatan yang efektif di area yang diinginkan. Namun, kelebihan obat dapat menyebabkan efek samping sistemik yang parah dan akumulasi obat yang tidak diinginkan di jaringan yang tidak terpengaruh. Selain itu, obat anti-glioma konvensional yang ada memiliki kemampuan penargetan yang tidak memadai [3, 4]. Nanopartikel telah muncul sebagai alat pembawa obat yang paling menjanjikan. Karena keunggulan ukurannya, nanopartikel dapat melintasi BBB dan memberikan efek antitumor. Kafa dkk. [5] dirancang secara kimia multi-dinding karbon nanotube (f-MWNTs) menargetkan ANG dan dikonfirmasi kemampuan mereka untuk melintasi BBB melalui percobaan in vivo dan in vitro. Namun, nanomaterial ini dapat didistribusikan ke berbagai organ di seluruh tubuh atau bahkan masuk ke sistem saraf pusat (SSP), di mana mereka dapat menyebabkan neurotoksisitas [6].
DNA merupakan bahan yang ideal untuk konstruksi struktur nano karena perakitannya dapat dikontrol secara tepat oleh pasangan basa Watson-Crick [7]. Sampai saat ini, sejumlah struktur nano DNA dua dimensi (2D) dan tiga dimensi (3D) telah dirancang dan didemonstrasikan [8,9,10]. Struktur nano DNA tetrahedral (TDN) telah menarik perhatian yang signifikan karena biokompatibilitasnya, stabilitas, situs modifikasi fungsional yang melimpah, dan imunogenisitas yang rendah [11,12,13]. Turberfield dkk. mensintesis struktur nano DNA tetrahedral dengan hasil tinggi menggunakan metode sintesis satu langkah [14]. Walsh dkk. menemukan bahwa DNA tetrahedron yang mengandung probe asam nukleat dapat memasuki sel mamalia tanpa memerlukan reagen transfeksi [15]. Lee dkk. menunjukkan bahwa nanopartikel tetrahedral rakitan dapat digunakan untuk pengiriman siRNA yang ditargetkan in vivo [16]. TDN telah menunjukkan prospek aplikasi yang sangat baik dalam diagnostik molekuler, pengiriman molekuler, dan terapi obat yang ditargetkan. Mereka juga banyak digunakan dalam penelitian tumor di berbagai organ, seperti kanker payudara [17]. Demikian pula, TDN juga telah digunakan dalam studi penyakit sistem saraf. Tian dkk. [18] menggunakan DNA tetrahedron sebagai dasar dan memodifikasinya dengan angiopep-2 (ANG) untuk berhasil membangun nanoprobe ANG-TDN, yang dapat menargetkan protein terkait reseptor lipoprotein densitas rendah 1 (LRP-1) untuk pencitraan yang ditargetkan. Penelitian telah menunjukkan bahwa ANG-TDN dapat melewati BBB. Ma dkk. [19] menyarankan bahwa struktur nano DNA tetrahedral dapat memasuki sel induk saraf (NSC) tanpa memerlukan agen transfeksi, di mana mereka mempromosikan migrasi sel induk saraf, proliferasi, dan diferensiasi [20], dan memiliki potensi besar untuk perbaikan dan regenerasi jaringan saraf. . Oleh karena itu, kami menyelidiki kemungkinan penggunaan TDN dalam terapi glioma dan meningkatkan kemampuan penargetannya.
Reseptor faktor pertumbuhan yang diturunkan dari trombosit (PDGFRβ) adalah anggota penting dari keluarga protein kinase tirosin yang terlibat dalam proliferasi sel, migrasi, dan angiogenesis. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa PDGFβ adalah target yang menjanjikan untuk terapi antitumor karena perannya dalam angiogenesis [21, 22]. Aptamer adalah oligonukleotida DNA atau RNA untai tunggal pendek yang diproduksi oleh evolusi sistematis ligan dengan metode pengayaan eksponensial (SELEX). Aptamers mirip dengan antibodi, yang memiliki afinitas dan spesifisitas tinggi terhadap target mereka [23]. Karena sifatnya yang unik, aptamers memainkan peran penting dalam pengiriman target agen kemoterapi, siRNA, dan nanopartikel yang mengandung obat. Gint4.T, suatu aptamer RNA yang secara spesifik dapat mengikat PDGFRβ, juga merupakan antagonis spesifik PDGFRβ [24]. Monako dkk. [25] menyarankan bahwa aptamers Gint4.T dapat melewati sawar darah-otak (BBB) dan secara khusus mengenali PDGFRβ. Nanopartikel polimer terkonjugasi Gint4.T (PNPs) dapat dengan mudah diambil oleh sel glioblastoma (GBM). Dalam penelitian ini, kami melaporkan sistem sarat obat baru yang menggabungkan aptamer Gint4.T dan TDN. TDN (Apt-TDN) yang dimodifikasi Gint4.T yang dimuat dengan DOX (DOX@Apt-TDN) menunjukkan peningkatan serapan seluler spesifik dan sitotoksisitas terhadap sel U87MG.
Metode
Materi
Semua oligonukleotida DNA dan oligonukleotida 2'F-Py RNA dibeli dari Sangon Biotech (Shanghai, Cina), dan semua urutan oligonukleotida tercantum dalam Tabel 1. Larutan pewarna gel DNA GelRed dibeli dari Sangon Biotech. Baik serum janin sapi (FBS) dan medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) dibeli dari Thermo Fisher (New York, AS). Doxorubicin (DOX) dibeli dari Mengbio Technology (Chongqing, China). Sel U87MG dibeli dari Perpustakaan Sel Shanghai Life Academy of Sciences (Shanghai, Cina). DAPI dibeli dari Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, China).
Persiapan Struktur Nano DNA
Untuk merakit DNA tetrahedron (Tabel 1), 2 μL masing-masing oligonukleotida (S1, S2, S3, dan S4) ditambahkan ke 42 μL buffer TM (10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2 , pH =8). Larutan DNA kemudian dipanaskan hingga 95 °C selama 5 menit dan kemudian didinginkan hingga 4 °C selama 2 menit menggunakan mesin PCR Bio-Rad (California, USA) [26, 27]. Konsentrasi akhir TDN adalah 2 μM. TDN’ disiapkan dengan cara yang sama kecuali S1 diganti dengan S1’. Untuk mensintesis Apt-TDN, aptamer Gint4.T ditambahkan ke TDN pada rasio molar yang sama, dan campuran diinkubasi pada 37 °C selama 60 min. Sebelum sintesis, aptamer mengalami langkah denaturasi-renaturasi singkat (85 °C selama 5 menit, pendinginan cepat selama 2 menit dan selanjutnya memanas hingga 37 °C selama 10 menit) [25].
Elektroforesis Gel Agarosa
Gel agarosa (3%) dijalankan dalam 0,5 × buffer TEB pada 100 V selama 30 min. Suhu peralatan elektroforesis dipertahankan pada 0 °C dengan menempatkan peralatan dalam penangas es. Sebelum elektroforesis, GelRed ditambahkan ke gel agarosa untuk mewarnai untaian DNA. Setelah proses selesai, pemindai fluoresensi Bio-Rad (California, AS) digunakan untuk mengambil gambar gel.
Penghamburan Cahaya Dinamis
Malvern Zetasizer ZS90 (Malvern, UK) digunakan untuk mengukur ukuran hidrodinamik dan potensi zeta TDN. Sebanyak 1 mL TDN (100 nM) menjadi sasaran analisis hamburan cahaya dinamis (DLS).
Pencitraan Mikroskop Kekuatan Atom
TDN diencerkan menjadi 100 nM dengan buffer TM (buffer Tris-HCl yang mengandung MgCl2 ). Kemudian, 10 μL masing-masing sampel TDN ditambahkan ke mika yang baru dibelah dan diinkubasi selama 10 menit. Sampel kemudian dicitrakan pada instrumen mikroskop gaya atom (AFM) dalam mode AC (Agilent 5500, USA).
Pengukuran Kapasitas Pemuatan Obat dari TDN yang Disiapkan
Doksorubisin dilarutkan dalam air deionisasi untuk membuat larutan penyimpanan 500 μM. Doksorubisin pada konsentrasi yang berbeda (1 sampai 20 μM) dicampur dengan TDN (100 nM) atau Apt-TDN (100 nM) selama 6 jam pada suhu kamar (24–26 °C). Larutan campuran kemudian disentrifugasi pada 12.000×g selama 10 menit untuk mendapatkan TDN yang mengandung obat. Kemudian, 50 μL supernatan dibuang dan dicampur dengan PBS dengan perbandingan 1:1. Pembaca lempeng mikro Varioskan LUX (California, USA) digunakan untuk mengukur intensitas fluoresensi doksorubisin (λmantan =480 nm dan λem =590 nm) untuk menentukan jumlah doksorubisin dalam supernatan [28]. Konsentrasi doksorubisin yang dimuat dalam TDN dihitung dengan kurva standar dan intensitas fluoresensi. Kami juga mencampur doksorubisin dengan TDN untuk meningkatkan rasio molar.
Stabilitas Serum TDN In Vitro
TDN dicampur dengan medium lengkap dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, atau 24 jam. Solusi TDN dicampur dengan FBS pada rasio 1:1 dan diinkubasi pada 37 °C selama 1, 3, 5, atau 7 h. Setelah inkubasi, campuran dijalankan pada gel agarosa 3%.
Sitotoksisitas TDN In Vitro
Untuk menentukan sitotoksisitas TDN, sel U87MG pada konsentrasi 1 × 10
4
sel/sumur diunggulkan ke piring 96-sumur. Media kultur sel telah dihapus, dan media segar yang mengandung 0-500 nM TDN ditambahkan dan diinkubasi selama 24 h dan 48h setelah inkubasi semalam. Kemudian, 10 μL larutan CCK-8 ditambahkan ke masing-masing sumur, dan campuran diinkubasi selama 1 h. Absorbansi pada 450 nm kemudian diukur menggunakan pembaca lempeng mikro.
Pencitraan Fluoresensi
Serapan seluler DOX dan TDN dipelajari dengan mikroskop fluoresensi (Olympus, Tokyo, Jepang). Sel-sel U87MG diunggulkan pada kaca penutup di piring 24-sumur dengan medium yang mengandung 10% serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas dan 1% penisilin dan streptomisin dan ditumbuhkan setidaknya selama 1 hari pada 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO 2 sampai sel mencapai setidaknya 75% pertemuan. Setelah inkubasi, media kultur dikeluarkan. Media lengkap yang mengandung 100 nM Cy3-TDN dan Cy3-Apt-TDN ditambahkan dan diinkubasi selama 3 h. TDN dan Apt-TDN diberi label dengan Cy3 untuk mendeteksi serapan nanopartikel antar sel. Untuk menilai penyerapan seluler DOX, DOX (DOX 2 μM), DOX@TDN (DOX 2 μM), dan DOX@Apt-TDN (DOX 2 μM) ditambahkan ke sel U87MG dan diinkubasi selama 3 h. Setelah 3 jam pengobatan, sel-sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 20 menit dalam gelap dan selanjutnya diwarnai dengan 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) selama 5 menit. Sel-sel dicuci dengan PBS tiga kali dan diamati di bawah mikroskop fluoresensi.
Flow Cytometry
Total 1 × 10
6
Sel U87MG ditanamkan ke dalam pelat 6-sumur. Setelah inkubasi semalam, media kultur dihilangkan, dan media yang dilengkapi dengan 100 nM Cy3-TDN, 100 nM Cy3-Apt-TDN, atau 100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 μM Apt gratis ditambahkan dan diinkubasi selama 3 jam. Kemudian, sel difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 20 menit, dan flow cytometry digunakan untuk menganalisis persentase sel Cy-3-positif.
Siklus Sel dan Apoptosis
Setelah perawatan dengan DOX, DOX@TDN, atau DOX@Apt-TDN selama 24 jam, 5 × 10
5
sel dikumpulkan dan difiksasi dalam 75% etanol dingin semalaman. Kemudian, sel diinkubasi dengan RNase dan propidium iodida selama 30 menit pada suhu 37 ° C dalam gelap. Siklus sel diselidiki dengan flow cytometry. Selain itu, setelah perlakuan yang berbeda, sel diwarnai dengan Annexin V-FITC/DAPI, dan apoptosis awal dieksplorasi.
Pengujian CCK-8
Untuk menentukan viabilitas sel, sel U87MG (5 × 10
3
) disemai ke piring 96-sumur dengan 100 μL medium dan dikultur semalaman pada 37 °C di bawah atmosfer yang mengandung 5% CO2 . Media kemudian dihilangkan, dan media segar yang mengandung DOX, DOX-TDN, atau DOX-Apt-TDN ditambahkan. Setelah 24 jam inkubasi, 10 L larutan CCK-8 ditambahkan, dan sel dikultur selama 1 jam lagi. Pembaca pelat mikro digunakan untuk mengukur absorbansi pada 450 nm.
Analisis Statistik
Semua percobaan dalam penelitian ini dilakukan dalam rangkap tiga, dan semua data disajikan sebagai nilai rata-rata dengan standar deviasinya (rata-rata ± SD). Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan program SPSS 24.0 (IBM, USA). Perbedaan signifikan ditentukan menggunakan t . Siswa tes, dengan P <0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok.
Hasil
Sintesis dan Karakterisasi TDN dan Apt-TDN
TDN dirakit sendiri dari empat oligonukleotida (Tabel 1) melalui sintesis satu langkah seperti yang dilaporkan sebelumnya [18, 29]. Aptamer penargetan tumor Gint4.T digunakan untuk memodifikasi TDN melalui pasangan basa Watson-Crick. Tetrahedron DNA berisi empat wajah, dengan setiap wajah dibentuk oleh satu oligonukleotida. Jadi, empat oligonukleotida berhibridisasi satu sama lain untuk membentuk DNA tetrahedron (Gbr. 1a). Analisis elektroforesis gel menunjukkan pita tunggal yang menonjol di jalur 4 dan 5, menunjukkan bahwa TDN dan Apt-TDN berhasil dibangun. Mobilitas Apt-TDN menurun dibandingkan dengan TDN, menunjukkan bahwa aptamer Gint4.T berhasil memodifikasi TDN.
a Sintesis DNA tetrahedron dan Gint4.T-TDN. Jalur 1:S1; jalur 2:S1+S2; jalur 3:S1+S2+S3; jalur 4:S1+S2+S3+S4 (TDN); jalur 5:TDN dicampur dengan Apt-tail (Gint4.T); Apt-TDN. Jalur 1 tidak terlihat karena pewarna asam nukleat tidak dapat menodai DNA untai tunggal dengan benar. b Gambar AFM menunjukkan bahwa ketinggian TDN dan Apt-TDN adalah ~ 2 nm. c Penentuan ukuran partikel dan potensi zeta dari TDN dan Apt-TDN dengan hamburan cahaya dinamis (DLS). Ukuran partikel rata-rata dari TDN dan Apt-TDN masing-masing adalah 10,10 nm (A) dan 13,54 nm (B). Potensi zeta rata-rata dari TDN dan Apt-TDN masing-masing adalah 5,69 mV (C) dan 7,3 mV (D).
Ukuran TDN dan Apt-TDN ditentukan oleh DLS dan AFM. TDN dan Apt-TDN menunjukkan ukuran partikel 10,1 nm dan 13,5 nm, masing-masing, mencerminkan penambahan ligan Gint4.T (Gbr. 1c (A), (B)). Karena diameter hidrodinamik termasuk molekul air, partikel lebih besar dari ukuran teoritisnya. Ketinggian TDN dan Apt-TDN yang ditentukan oleh gambar AFM adalah ~ 2 nm (Gbr. 1b), menunjukkan bahwa modifikasi aptamer tidak mengubah struktur 3D. Potensi zeta rata-rata dari TDN dan Apt-TDN adalah 5.69 mV (C) dan 7.3 mV (D), masing-masing (Gbr. 1c (C) (D)). Berdasarkan parameter ini, kami menyimpulkan bahwa TDN dan Apt-TDN telah berhasil dirakit.
Stabilitas dan Sitotoksisitas TDN In Vitro
Analisis elektroforesis gel menunjukkan bahwa TDN tetap utuh ketika diinkubasi dalam medium lengkap selama 24 jam pada 37°C (Gbr. 2a (A)). Selanjutnya, ketika konsentrasi serum janin sapi ditingkatkan menjadi 50%, TDN tetap stabil setidaknya selama 7 jam (Gbr. 2a (B)), yang konsisten dengan laporan sebelumnya [18, 26]. Untuk menentukan sitotoksisitas struktur nano, uji CCK-8 digunakan untuk menilai viabilitas sel sel U87MG setelah pengobatan dengan TDN pada sejumlah konsentrasi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2b, tidak ada sitotoksisitas signifikan yang diamati pada sel U87MG yang diobati dengan TDN pada 0-500 nM selama 24 h dan 48h. Oleh karena itu, nanopartikel DNA dapat digunakan sebagai pembawa yang stabil dan biosafe untuk pengiriman obat.
a Elektroforesis gel menunjukkan bahwa TDN tetap stabil selama 24 jam dalam medium lengkap pada 37°C (A); TDN tetap stabil selama 7 jam ketika konsentrasi serum janin sapi ditingkatkan menjadi 50% (B). b Sel U87MG dikultur bersama dengan TDN pada konsentrasi yang berbeda (10–500 nM) selama 24 h dan 48h. Uji CCK-8 menunjukkan bahwa aktivitas sel U87MG tidak terpengaruh, yang menunjukkan keamanan hayati TDN
Kapasitas Pemuatan Obat dari TDN dan Apt-TDN
Doksorubisin adalah obat kemoterapi spektrum luas yang dapat berinterkalasi menjadi untai ganda DNA. Kami menghitung kurva doksorubisin standar (Gbr. 3a) dan kemudian menyelidiki interkalasi doksorubisin ke dalam TDN. Jumlah interkalasi doxorubicin dalam TDN dan Apt-TDN secara bertahap meningkat dengan meningkatnya konsentrasi doxorubicin. Ketika konsentrasi doxorubicin adalah 14 μM, jumlah interkalasi doxorubicin di TDN dan Apt-TDN memuncak pada 5,5 μM dan 6,0 μM, masing-masing, dan kemudian mendatar (Gbr. 3b), menunjukkan bahwa untaian DNA terisi penuh. Sementara itu, kami mencampur doksorubisin dengan TDN untuk meningkatkan rasio molar. Spektrum fluoresensi doksorubisin dipindai untuk dianalisis. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 3c, spektrum fluoresensi doksorubisin dipadamkan dengan doksorubisin pada rasio molar 0,05. Berdasarkan temuan ini, kami menyimpulkan bahwa sekitar 55 molekul doksorubisin terkandung dalam satu TDN, sementara 60 molekul terkandung dalam satu Apt-TDN.
a Kurva standar konsentrasi DOX dalam buffer PBS; ex =480 nm dan em =590 nm. Besarnya DOX yang dibawa oleh TDN dan Apt-TDN. b DOX diselingi ke dalam DNA untai ganda dari TDN dan Apt-TDN. Ketika konsentrasi DOX mencapai 14 μM dan konsentrasi DOX interkalasi dalam TDN dan Apt-TDN mencapai puncaknya masing-masing pada 5,5 μM dan 6,0 μM, satu tetrahedron DNA dapat membawa 55 molekul Dox, sedangkan satu tetrahedron DNA termodifikasi aptamer membawa 60 DOX molekul. c Spektrum fluoresensi DOX di supernatan. Doksorubisin dicampur dengan TDN pada rasio molar yang meningkat (0, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, dan 0,05 dari atas ke bawah). Ketika rasio molar 1:20, fluoresensi padam
Serapan Seluler yang Ditargetkan dari Apt-TDN
DNA adalah makromolekul bermuatan negatif, yang membuat masuknya ke dalam membran sel bermuatan negatif menjadi sulit. Biasanya, molekul DNA individu harus mengakses sel dengan bantuan reagen transfeksi. Di sini, kami memberi label TDN dan Apt-TDN dengan Cy3 untuk memantau penyerapan nanopartikel intraseluler. Setelah inkubasi dengan sel U87MG selama 3 jam, sinyal fluoresensi Cy3 merah muncul di sitoplasma seluler, menunjukkan bahwa TDN mengikat sitomembran dan dibawa ke dalam sel tanpa bantuan agen transfeksi (Gbr. 4a). Apt-TDN menunjukkan fluoresensi merah yang lebih tinggi, yang menunjukkan bahwa kehadiran aptamer Gint4.T secara signifikan meningkatkan serapan DNA tetrahedron oleh sel U87MG. Namun, ketika aptamer gratis ditambahkan, fluoresensi Cy3 menurun ke tingkat yang diamati untuk TDN saja. Karena penghambatan kompetitif oleh aptamer gratis, kami menyimpulkan bahwa aptamer pada TDN tidak dapat memfasilitasi penyerapan TDN. Berdasarkan penghambatan kompetitif ini, kami membuktikan bahwa Apt-TDN dapat menargetkan sel U87MG. Flow cytometry selanjutnya membuktikan bahwa persentase sel U87MG Cy3-positif lebih tinggi pada kelompok Apt-TDN daripada pada kelompok TDN. Free Apt menurunkan persentase sel U87MG Cy3-positif dalam kelompok Apt-TDN (Gbr. 4b).
a Serapan sel U87MG dari TDN dan Apt-TDN (TDN-Gint4.T). TDN memasuki sel U87MG secara langsung tanpa agen transfeksi, dan penyerapan Apt-TDN (terkait dengan aptamer Gint4.T) meningkat secara signifikan dan dihambat secara kompetitif oleh Apt bebas (Gint4.T), menunjukkan bahwa aptamer Gint4.T memainkan peran peran penting dalam penargetan seluler. Bilah skala mewakili 50 μm. b Kurva flow cytometry menunjukkan serapan intraseluler dari TDN, Apt-TDN, dan Apt-TDN+Apt setelah inkubasi selama 3 h
Serapan Seluler dari DOX@TDN dan DOX@Apt-TDN
Kami menggunakan spektrum fluoresensi karakteristik doksorubisin untuk menilai efisiensi penyerapan obat. Setelah 3 jam pengobatan, doksorubisin intraseluler dicitrakan dengan mikroskop fluoresensi (Gbr. 5a). Doksorubisin bebas dapat masuk ke dalam sel U87MG dan terletak di dalam nukleus. Dengan penambahan DOX@TDN, fluoresensinya lebih tinggi daripada doksorubisin bebas. Hasil ini menunjukkan bahwa nanopartikel DNA meningkatkan serapan seluler doxorubicin. Ketika DOX@Apt-TDN ditambahkan, sinyal merah dalam nukleus bahkan lebih tinggi daripada sel yang telah ditambahkan DOX@TDN. Analisis semi-kuantitatif dari serapan DOX intraseluler lebih lanjut menegaskan bahwa Apt-TDN memfasilitasi peningkatan lebih dari dua kali lipat dalam serapan DOX intraseluler dibandingkan dengan untuk obat tunggal. Kami menyimpulkan bahwa ini karena pengikatan spesifik Gin4.T ke reseptor, yang diikuti lebih banyak nanopartikel yang dapat masuk ke dalam sel. Setelah pencernaan di lisosom, doksorubisin dapat dilepaskan ke dalam sitoplasma dan berfungsi lebih lanjut di dalam nukleus.
a Serapan seluler DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN. Dimodifikasi dengan aptamer Gint4.T, Apt-TDN dapat mengirimkan lebih banyak doksorubisin ke sel U87MG daripada TDN. Selain itu, TDN dapat membawa lebih banyak obat ke sel daripada obat itu sendiri. Bilah skala menunjukkan 50 μm. b Analisis semi-kuantitatif intensitas fluoresensi doksorubisin dengan pengobatan PBS, DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN (dibandingkan dengan blanko:*p <0,05, **p <0,01)
Sitotoksisitas DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN
Untuk studi sitotoksisitas, tiga kelompok sel U87MG diperlakukan dengan konsentrasi doksorubisin yang berbeda (Gbr. 6a). IC50 nilai untuk doxorubicin adalah 13,39 μM untuk pengobatan DOX, 7,826 μM untuk pengobatan DOX@TDN, dan 4,205 μM untuk pengobatan DOX@Apt-TDN. Di antara tiga perawatan, DOX@Apt-TDN menunjukkan sitotoksisitas tertinggi pada 24 h, yang menunjukkan spesifisitas Apt-TDN untuk sel U87MG. Setelah 24 jam, sel-sel dalam kelompok DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN dikumpulkan dan digunakan untuk mengeksplorasi apoptosis awal. Data kami menunjukkan bahwa tingkat apoptosis awal lebih tinggi pada kelompok DOX@Apt-TDN dibandingkan pada dua kelompok lainnya (Gbr. 6b). Selain itu, proporsi sel pada fase G0/G1 meningkat pada kelompok DOX-Apt-TDN dibandingkan dengan kelompok DOX dan DOX-TDN (p <0,01), dan rasio sel pada fase S menurun pada kelompok DOX-Apt-TDN (p <0,01) (Gbr. 6c). Persentase sel pada fase G2 tidak diubah (data tidak ditampilkan).
a Sitotoksisitas DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN pada berbagai konsentrasi. Tingkat penghambatan sel U87MG meningkat secara signifikan dengan meningkatnya konsentrasi DOX, tetapi kelompok DOX@TDN dan DOX@Apt-TDN menunjukkan peningkatan sitotoksisitas yang signifikan dibandingkan dengan kelompok DOX. Tingkat penghambatan sel kelompok DOX@Apt-TDN juga secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok DOX@TDN (dibandingkan dengan DOX, **p 0,05; dibandingkan dengan DOX, ***p <0,01; dibandingkan dengan DOX@Apt-TDN,
#p <0,05). b Apoptosis sel U87MG setelah inkubasi dengan PBS, DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN selama 24 h. c Histogram aliran sitometri dari siklus sel U87MG setelah inkubasi dengan PBS, DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN selama 24 jam (dibandingkan dengan kontrol, **p 0,05; dibandingkan dengan kontrol, ***p <0,01; dibandingkan dengan DOX@Apt-TDN,
#p <0,01)
Diskusi
Baik melalui percobaan in vitro atau in vivo, stabilitas obat dan pembawanya harus ditentukan. Setelah perakitan TDN, stabilitasnya pertama kali ditentukan secara in vitro. Penelitian ini menunjukkan bahwa struktur 3D nanopartikel DNA dapat meningkatkan stabilitasnya dalam serum dengan menghambat pengikatan enzim. Keamanan biologis dari struktur nano yang relevan adalah persyaratan paling penting untuk penerapannya. Tidak ada sitotoksisitas signifikan yang diamati pada sel U87MG yang dikultur bersama dengan berbagai konsentrasi TDN selama 24 jam atau 48 jam. Tak satu pun dari sekuens DNA yang digunakan dalam penelitian ini mengkodekan informasi genetik apa pun, dan tidak ada efek samping yang dilaporkan dalam uji sitotoksisitas. Oleh karena itu, TDN dapat berfungsi sebagai pembawa obat yang aman dan stabil.
Efisiensi penargetan dari struktur nano yang dimodifikasi aptamer sangat penting untuk pengiriman obat selektif ke sel kanker. Tidak seperti antibodi, aptamer secara kimiawi stabil, murah, dan dapat diproduksi secara massal. Lebih jauh, tidak seperti bahan lain, aptamers dapat dengan mudah mengikat DNA tetrahedron menggunakan prinsip komplementer basa. Dengan demikian, kombinasi aptamers dan DNA tetrahedron meletakkan dasar untuk pengiriman obat yang ditargetkan dan perawatan generasi berikutnya. Hasil kami menunjukkan bahwa TDN dapat memasuki sel tanpa agen transfeksi, yang serupa dengan hasil Walsh et al. dan Ma dkk. [15, 19]. Dibandingkan dengan TDN, penyerapan Apt-TDN oleh sel U87MG meningkat secara signifikan. Setelah penambahan aptamer gratis, peningkatan ini menghilang. Hasil ini menunjukkan bahwa Gint4.T adalah antagonis spesifik PDGFRβ [25]. Studi kami menunjukkan bahwa aptamer Gint4.T dapat menargetkan sel U87MG karena ekspresi PDGGRβ yang tinggi pada permukaan sel glioma. Camorani dkk. [24] juga menunjukkan bahwa aptamer Gint4.T dapat menargetkan sel tumor dengan secara khusus berinteraksi dengan domain ekstraseluler PDGFRβ. Keuntungan dari penargetan aptamer Gint4.T telah ditunjukkan sampai batas tertentu melalui studi in vitro, tetapi pengujian in vivo lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi temuan ini. Studi ini juga mengkonfirmasi bahwa DOX@Apt-TDN lebih sitotoksik daripada DOX atau DOX@TDN, yang kemungkinan berasal dari dua faktor. Pertama, aptamer Gint4.T secara spesifik dapat mengikat domain ekstraseluler PDGFR, memblokir proliferasi sel tumor dan menghambat pertumbuhan sel tumor [24]. Hal ini sesuai dengan hasil percobaan kami. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, siklus sel U87MG berubah setelah pengobatan dengan DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN meningkat secara signifikan pada sel tumor fase G0/G1, menurun pada sel fase S, dan memblokir sel tumor di G0 /G1, menunjukkan bahwa mereka dapat menghambat siklus sel sel U87MG dan menghambat proliferasinya. Dibandingkan dengan kelompok DOX dan DOX@TDN, kelompok DOX@Apt-TDN memiliki kemampuan yang jauh lebih kuat untuk menghambat proliferasi sel U87MG. Selain itu, Gint4.T secara khusus mengikat sel tumor dan meningkatkan penargetan sel dari kompleks DOX@Apt-TDN. Dengan demikian, kita dapat meningkatkan efisiensi penargetan obat dan mengurangi dosis pemberian obat antitumor sistemik untuk mencegah efek samping sistemiknya.
Kesimpulan
Modifikasi dengan Gint4.T meningkatkan spesifisitas dan efisiensi TDN dalam pengobatan glioma dengan menargetkan PDGFRβ yang diekspresikan dalam jumlah besar pada sel glioma. Selain itu, ketika dimuat dengan Apt-TDN, itu dapat secara signifikan meningkatkan efek anti-glioma DOX. Oleh karena itu, DOX@Apt-TDN dapat berfungsi sebagai strategi terapi yang menjanjikan terhadap glioma untuk pasien. Kekurangan penelitian ini adalah hanya diverifikasi secara in vitro. Dalam studi selanjutnya, kami akan mengeksplorasi lebih lanjut pada model hewan.
Ketersediaan Data dan Materi
Data yang relevan disertakan dalam artikel.
Singkatan
BBB:
Penghalang darah-otak
BTB:
Penghalang tumor darah
TDN:
Struktur nano DNA tetrahedral/DNA tetrahedron
DOX:
Doksorubisin
PDGFRβ:
Reseptor faktor pertumbuhan yang diturunkan dari trombosit
Apt-TDN:
TDN yang dimodifikasi Gint4.T
DOX@ TDN:
TDN dimuat dengan DOX
DOX@Apt-TDN:
TDN yang dimodifikasi Gint4.T dimuat dengan DOX
SSP:
Sistem saraf pusat
ANG:
Angiopep-2
LRP-1:
Low-density lipoprotein receptor-related protein 1
