Nanopartikel Emas Modifikasi 6-Merkaptopurin dan Peptida Turunan Rabies Meningkatkan Proliferasi Sel Saraf SH-SY5Y dan Pertumbuhan Neuritis

Abstrak

Regenerasi saraf menuntut biomaterial yang dapat merangsang proliferasi neuron dan peraksonan. Di sini kami menyajikan platform neurofisik baru: nanoparticle emas (AuNPs) yang difungsikan dengan 6-merkaptopurin (6MP) dan peptida menembus neuron (RDP). Saat sel neuroblastoma SH-SY5Y diekspos kepada konjugat 6MP-AuNPs-RDP, aktivitas metabolik dan panjang neuritis meningkat secara signifikan dibandingkan kontrol. Pentingnya, sel yang pulih dari kriopreservasi mempertahankan keuntungan pertumbuhan ini, menunjukkan toleransi yang kuat terhadap nanomaterial. Temuan ini mendukung pengembangan 6MP-AuNPs-RDP sebagai nanomaterial neurofisik yang aman dan efektif.

Latar Belakang

Promosi yang efektif terhadap proliferasi neuron dan pertumbuhan neuritis adalah dasar strategi regeneratif untuk gangguan neurodegenereneratif seperti penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson, dan stroke (1–4). Kimia permukaan biomaterial dapat memodulasi morfologi sel, proliferasi, dan diferenciasi, menawarkan jalur yang promising menuju agen neurofisik (5,6). Nanopartikel emas (AuNPs) menjadi menarik dalam aplikasi biomedis karena sintesis yang mudah, kemampuan permukaan yang serbaguna, toksisitas rendah, dan kompatibilitas biologis (7,8). Pekerjaan sebelumnya menunjukkan bahwa nanorodi emas Combine dengan paparan laser daya rendah dapat memperpanjang neuritis sel NG108-15 hingga 25 µm (9).

6-Merkaptopurin (6MP) adalah obat antiinflamasi yang terikat AuNPs melalui ikatan Au–S, memungkinkan fungsionalisasi (10). Meskipun 6MP-AuNPs telah digunakan untuk deteksi obat kuantitatif (11), efek seluler mereka belum dieksplorasi. Oleh karena itu, kami menyelidiki 6MP-AuNPs dan peptida target neuron (RDP) dalam model neuroblastoma manusia SH-SY5Y, yang dipilih karena sensitivitas lingkungan yang tinggi dan relevansinya terhadap studi biomaterial saraf.

Metode / Eksperimen

Sintesis Konjugat 6MP-AuNPs-RDP

AuNPs 20 nm dilapisi sitrat disiapkan melalui reduksi Turkevich klasik dari HAuCl₄·3H₂O (0,01 %) dengan sitrat natrium (38,8 mM). 6MP (0,046 nM) dan AuNPs (0,33 mM) diinkubasi selama 5 jam pada suhu ruangan, lalu dikentrifuga pada 17.000 g selama 30 menit. Pelet dicuci tiga kali dengan air deionisasi. Untuk modifikasi RDP, peptida (0,023 nM) diinkubasi bersama dengan campuran AuNP/6MP dalam kondisi yang sama. Peptida terbalik terlabel FAM (FAM-SP) berfungsi sebagai kontrol. Partikel dicairkan kembali dalam 0,1 M NaOH (pH 9,0), difilter (0,22 µm), dan disimpan pada 4 °C.

Karakterisasi Partikel

Spektrum UV/Vis direkam dengan Shimadzu UV-2450. Distribusi ukuran dan potensi zeta diukur dengan Malvern Zetasizer Nano ZS setelah pengenceran. Mikroskopi elektron transmisi (TEM, Shimadzu) mengonfirmasi morfologi bola.

Kultur Sel

Sel SH-SY5Y dipertahankan dalam DMEM/F-12 (1:1) yang dilengkapi dengan 10 % FCS, 100 U/mL penicilin, dan 100 µg/mL streptomycin pada 37 °C, 5 % CO₂.

Uji Penyerapan Sel

Sel (5 × 10⁴ sel/lubang) diinkubasi dengan 0,25 µg/mL 6MP-AuNPs-RDP terlabel FAM atau 6MP-AuNPs-SP selama 2 jam. Mikroskopi fluorescensi (Olympus) dan spektrofluorometri (Hitachi) mengukur internalisasi.

Dampak pada Pertumbuhan Neuronal

Untuk proliferasi, sel ditanam pada 5 × 10⁵ sel/lubang dan diobati dengan 0–1,0 µg/mL 6MP-AuNPs-RDP selama 24 jam. Hitungan sel (hitungan sel otomatis Bio-Rad) dan aktivitas metabolik MTT (490 nm) dievaluasi. Panjang neuritis diukur setelah 3 hari perawatan harian 0,25 µg/mL menggunakan ImageJ. Piringan lapis permukaan (3,5 cm) juga disiapkan untuk mengevaluasi perpanjangan neuritis pada lapis nanopartikel.

Analisis Statistik

Data (n = 4) dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM dan dianalisis dengan satu jalur ANOVA dengan uji Dunnett (SPSS 13.0). p < 0,05 menunjukkan signifikansi.

Hasil

Penampilan Nanopartikel dan Sifat Fisikokimia

AuNPs menunjukkan warna merah; setelah penambahan 6MP, larutan menjadi gelap, membentuk endapan biru-hitam setelah 5 jam. Penggumpalan pada pH 9,0 menghasilkan larutan merah mawar, yang mengendapkan kembali pada pH 7,4. DLS mengungkapkan diameter rata-rata 20,5 nm untuk 6MP-AuNPs dan 24,6 nm untuk 6MP-AuNPs-RDP; potensi zeta adalah −37,2 mV dan −25,8 mV, masing-masing (Gambar 2c,d). TEM mengonfirmasi morfologi bola.

Penyerapan Sel yang Ditingkatkan melalui RDP

Pada pH 7,4, 6MP-AuNPs-RDP mengendapkan lebih sedikit dan menampilkan plak periseluler yang menonjol, sedangkan 6MP-AuNPs membentuk endapan yang luas (Gambar 3a). Citra fluorescensi menunjukkan sinyal intracellular yang kuat untuk 6MP-AuNPs-RDP dibandingkan sinyal lemah untuk 6MP-AuNPs-SP (Gambar 3b-d), yang menunjukkan bahwa RDP secara signifikan meningkatkan internalisasi nanopartikel.

Promosi Proliferasi dan Aktivitas Metabolik

Kedua 6MP-AuNPs dan 6MP-AuNPs-RDP meningkatkan jumlah sel dan absorbansi MTT secara bergantung pada dosis; efeknya lebih kuat untuk partikel yang dikonjugasi RDP (Gambar 4a,b). RDP sendirian tidak mengubah pertumbuhan.

Peningkatan Pertumbuhan Neuritis

Setelah paparan 24 jam terhadap 1,0 µg/mL partikel, sel yang diobati dengan 6MP-AuNPs-RDP menunjukkan neuritis yang signifikan lebih lama dibandingkan kontrol dan 6MP-AuNPs (Gambar 5a,b). RDP sendirian tidak ada efek. Ketika diterapkan sebagai lapisan permukaan, 6MP-AuNPs-RDP mempercepat perpanjangan neuritis dan memfasilitasi internalisasi seluruh sitoplasma dan inti (Gambar 6d,e).

Efek Kriopreservasi

Sel yang diobati sebelumnya dengan 1,0 µg/mL 6MP-AuNPs-RDP mempertahankan proliferasi dan panjang neuritis yang ditingkatkan setelah dilebur, menunjukkan toleransi yang kuat terhadap penyimpanan kriogenik (Gambar 7a-c).

Pembahasan

Data mengonfirmasi bahwa 6MP-AuNPs-RDP menggabungkan kompatibilitas biologis nanostruktur emas dengan kemampuan penyerapan neuron RDP dan sifat promosi pertumbuhan dari purin yang terpapar pada 6MP. Perilaku asam-basa konjugat (pI ≈ 7,8) selaras dengan pH fisiologis, mengurangi pengendapan dalam media sel. RDP kemungkinan besar memediasi endositosis melalui reseptor GABA atau asetilkolin nikotinik, selaras dengan studi sebelumnya tentang nanopartikel yang difungsikan peptida (15–19). Grup purin yang terpapar pada permukaan nanopartikel dapat mengaktifkan jalur MAPK/ERK dan PI3K/Akt, pengatur kunci dari diferenciasi neuronal dan pertumbuhan neuritis (21–23). Pentingnya, sel SH-SY5Y mengolah paparan berulang dan kriopreservasi, menekankan profil keamanan platform ini.

Kesimpulan

Nanopartikel emas yang difungsikan dengan 6-merkaptopurin dan peptida turunan rabies RDP merupakan nanomaterial neurofisik yang kuat yang mempromosikan proliferasi neuron dan perpanjangan neuritis sambil mempertahankan kompatibilitas biologis. Temuan ini mendukung pengembangan lebih lanjut 6MP-AuNPs-RDP untuk strategi terapeutik dalam regenerasi saraf.

Singkatan

6MP

6-Merkaptopurin

AD

Penyakit Alzheimer

AuNPs

Nanopartikel Emas

DLS

Pencaran Cahaya Dinamis

DMEM

Medium Dulbecco yang Dimodifikasi Eagle

DMSO

Dimetil Sulfoksida

FCS

Serum Sapi Keningar

MTT

3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida

PD

Penyakit Parkinson

RDP

Peptida Turunan Virus Rabies

TEM

Mikroskopi Elektron Transmisi