Promosi Pertumbuhan Sel SH-SY5Y oleh Nanopartikel Emas Dimodifikasi dengan 6-Mercaptopurine dan Neuron-Penetrating Peptide
Abstrak
Banyak usaha telah dicurahkan untuk penemuan biomaterial yang efektif untuk regenerasi saraf. Di sini, kami melaporkan aplikasi baru nanopartikel emas (AuNPs) yang dimodifikasi dengan 6-mercaptopurine (6MP) dan peptida penembus neuron (RDP) sebagai agen neurofik untuk mendorong proliferasi dan pertumbuhan neurit sel neuroblastoma manusia (SH-SY5Y). Ketika sel-sel diperlakukan dengan konjugat 6MP-AuNPs-RDP, mereka menunjukkan aktivitas metabolisme yang lebih tinggi daripada kontrol. Selain itu, sel SH-SY5Y ditransplantasikan ke permukaan yang dilapisi dengan 6MP-AuNPs-RDP untuk memeriksa efek perkembangan neurit. Dapat disimpulkan bahwa 6MP-AuNPs-RDP melekat pada permukaan sel dan kemudian diinternalisasi ke dalam sel, menyebabkan peningkatan pertumbuhan neurit yang signifikan. Meskipun sel-sel yang dirawat 6MP-AuNPs-RDP dipulihkan dari penyimpanan beku, sel-sel masih mempertahankan pertumbuhan konstan, menunjukkan bahwa sel-sel memiliki toleransi yang sangat baik terhadap 6MP-AuNPs-RDP. Hasilnya menunjukkan bahwa 6MP-AuNPs-RDP memiliki potensi yang menjanjikan untuk dikembangkan sebagai bahan nano neurofik untuk pertumbuhan saraf.
Latar Belakang
Promosi proliferasi sel saraf dan pertumbuhan neurit penting dalam regenerasi saraf [1, 2], yang banyak upaya telah dilakukan untuk mengobati penyakit neurodegeneratif seperti penyakit Alzheimer (AD), penyakit Parkinson (PD), dan stroke [3 , 4]. Itu ditunjukkan dalam sejumlah penelitian bahwa sifat permukaan bahan dapat mempengaruhi morfologi sel, bahkan mengganggu/mempromosikan replikasi dan diferensiasi sel, yang sangat menjanjikan dalam pengobatan regeneratif dan mengembangkan strategi baru bahan nano dengan fungsi biologis aktif sebagai agen neurofik [5 , 6].
Di antara biomaterial yang ada, nanomaterial emas digunakan dalam berbagai aplikasi biologis termasuk penginderaan, pelabelan, pengiriman obat, dan pencitraan, karena kemudahan sintesis, kenyamanan untuk fungsionalisasi permukaan, toksisitas rendah, stabilisasi yang baik, dan biokompatibilitas [7, 8]. Misalnya, penelitian sebelumnya melaporkan bahwa nanorod emas yang terkait dengan paparan laser berdaya rendah merangsang peningkatan panjang neurit hingga 25 μm sel saraf NG108-15 dibandingkan dengan kontrol [9].
6-Mercaptopurine (6MP; Gbr. 1a), obat anti-inflamasi, telah digunakan untuk memfungsikan permukaan nanopartikel emas (AuNPs) untuk membentuk AuNP yang dimodifikasi 6MP (6MP-AuNPs) melalui ikatan Au-sulfur [10] . Dilaporkan bahwa 6MP-AuNPs digunakan untuk menganalisis secara kuantitatif konsentrasi 6MP dalam pelarut melalui mekanisme turn on-and-off [11]. Namun, tidak ada data yang menunjukkan efek 6MP-AuNPs pada sel.
Skema prosedur eksperimental. a Struktur 6-Mercaptopurine. b Prosedur percobaan. Partikel disintesis pada pH 9,0 dan tampak teragregasi pada pH 7,4. Ketika partikel ditambahkan ke dalam media sel SH-SY5Y, mereka diinternalisasi ke dalam sel dan merangsang pertumbuhan sel
Di sini, kami menggunakan garis sel saraf untuk menyelidiki interaksi 6MP-AuNPs dan sel, karena diketahui bahwa sel saraf sangat dipengaruhi oleh sifat substrat kultur. Di antara garis sel saraf, sel neuroblastoma manusia (SH-SY5Y) dianggap sebagai sistem model yang banyak digunakan karena sensitivitasnya yang tinggi terhadap stimulasi lingkungan dan pentingnya biomaterial fungsional dalam penelitian saraf. Selain itu, untuk meningkatkan efisiensi serapan sel saraf 6MP-AuNPs, peptida penargetan neuron (RDP) dikaitkan dengan permukaan partikel untuk membentuk konjugat 6MP-AuNPs-RDP. Hasilnya menunjukkan bahwa konjugat menunjukkan aktivitas neurofik yang jelas, tetapi bukan efek anti-proliferatif 6MP, yang mengarah ke peningkatan signifikan dalam proliferasi sel dan pertumbuhan neurit.
Metode/Eksperimental
Sintesis Konjugat 6MP-AuNPs-RDP
AuNP berlapis sitrat dengan ukuran 20 nm disintesis dengan metode reduksi. Secara singkat, larutan HAuCl4 aqueous ·3H2 O (100 mL, 0,01%) dipanaskan dengan pengadukan kuat selama 30 menit, kemudian larutan natrium sitrat (10 mL, 38,8 mM) dengan cepat ditambahkan ke dalam HAuCl4 larutan. Campuran direfluks selama 30 menit lagi, hingga diperoleh larutan berwarna merah tua, dan didinginkan hingga suhu kamar secara alami.
6MP-AuNPs disiapkan dengan mencampurkan AuNPs (0,33 mM) dan larutan 6MP (konsentrasi akhir 0,046 nM) selama 5 jam pada suhu kamar menurut laporan sebelumnya [12]. Kemudian, campuran disentrifugasi pada 17.000g selama 30 mnt. Selanjutnya, supernatan dibuang, dan pelet (6MP-AuNPs) disuspensikan kembali dan dicuci dengan air deionisasi selama tiga kali.
Untuk mendapatkan 6MP-AuNP yang dimodifikasi RDP, RDP (FAM w/ CKSVRTWNEI IPSKGCLRVG GRCHPHVNGG GRRRRRRRRC; disintesis oleh Shanghai Ji'er Biotech. Co., China) dan 6MP, dengan konsentrasi akhir masing-masing 0,023 nM, secara bersamaan ditambahkan ke larutan AuNP (0,33 mM) selama 5 jam lalu disentrifugasi pada 17.000g selama 30 mnt. Sebagai kontrol, peptida perebutan berlabel FAM (FAM-SP; GRNECRIPRV GCVSRWRIGR KGRCHRLRPG GRVNRSHT GC) disintesis (Shanghai Ji'er Biotech. Co., China) dan 6MP-AuNPs-SP-FAM disiapkan secara paralel. Setelah itu, partikel supernatan dibuang, dan partikel dicuci masing-masing dengan air deionisasi. Solusi partikel masing-masing disesuaikan ke pH 9,0 dengan 0,1 M NaOH dan kemudian melewati filter spuit 0,22 m dan disimpan pada suhu 4 °C untuk digunakan.
Karakteristik Partikel
Spektrum serapan diukur pada suhu kamar dengan spektrofotometer UV/vis (UV-2450, Shimadzu Corp, Kyoto, Jepang) untuk mendeteksi penyerapan optik partikel. Ukuran partikel dan potensi zeta masing-masing partikel diukur dengan menggunakan alat hamburan cahaya dinamis (DLS) (Zetasizer Nano ZS; Malvern) setelah pengenceran dengan air deionisasi. Mikroskop elektron transmisi (TEM; Shimadzu) digunakan untuk mengamati struktur partikel.
Budaya Sel
Sel SH-SY5Y dikultur dalam medium Eagle's (DMEM) dan F-12 yang dimodifikasi Dulbecco dengan perbandingan 1:1. Media masing-masing dilengkapi dengan 10% serum janin (FCS), penisilin 100 unit/mL, dan streptomisin 100 μg/mL. Sel dipertahankan pada suhu 37 °C dengan 5% CO2 dalam inkubator yang dilembabkan (Thermo Fisher Scientific, USA). Semua reagen untuk kultur sel dibeli dari HyClone (AS).
Serapan Sel
Sel SH-SY5Y diunggulkan ke dalam pelat 24-sumur dengan kepadatan 5 × 10
4
sel / sumur. Ketika pertemuan sel mencapai 60%, 6MP-AuNPs-RDP berlabel FAM dan 6MP-AuNPs-SP konsentrasi akhir masing-masing ditambahkan ke media sel untuk inkubasi 2 jam. Kemudian, media sel dibuang dan diganti dengan media baru. Sel-sel diamati dan difoto dengan menggunakan mikroskop fluoresensi (Olympus, Jepang).
Dampak 6MP-AuNPs-RDP pada Pertumbuhan Neuronal
Sel SH-SY5Y diunggulkan ke dalam pelat 24-sumur dengan kepadatan 5 × 10
5
sel/sumur semalaman. Kemudian, RDP-6MP-AuNPs dengan konsentrasi yang berbeda (0, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 μg/mL) masing-masing ditambahkan ke dalam media untuk inkubasi 24 jam. Jumlah sel dihitung dengan menggunakan penghitung sel otomatis (Bio-Rad, USA).
Juga, aktivitas metabolisme sel diukur dengan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay menurut laporan sebelumnya [13]. Secara singkat, sel SH-SY5Y diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 5 × 10
4
sel/sumur dan diinkubasi dalam media yang mengandung 10% FBS selama semalam. Kemudian, partikel masing-masing ditambahkan ke dalam media selama 24 jam. Sel dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali, kemudian 100 L media segar dan 10 L MTT (5 mg/mL dalam buffer PBS) ditambahkan ke setiap sumur. Setelah inkubasi 4 jam, media dikeluarkan dan 200 L dimetil sulfoksida (DMSO) ditambahkan untuk melarutkan formazan yang dihasilkan. Absorbansi supernatan diukur pada 490 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (Bio-Rad, USA). Sel tanpa penambahan apa pun digunakan sebagai blanko, dan sel dengan hanya pelarut (0,1 M NaOH (pH 9,0) diatur ke pH 7,4 dengan HCl 0,1 M) sebagai kontrol. Aktivitas metabolisme sel relatif dihitung sebagai aktivitas metabolisme (%) =OD490 (sampel-kosong)/OD490 (kontrol-kosong). Setiap nilai dirata-ratakan dari empat eksperimen independen.
Untuk menentukan efek 6MP-AuNPs-RDP pada pertumbuhan neurit, sel SH-SY5Y ditransplantasikan ke pelat 6-sumur dan tumbuh hingga pertemuan 30%. Kemudian, sel diperlakukan dengan 6MP-AuNPs-RDP (0,25 μg/mL) sekali sehari selama 3 hari. Panjang neurit diamati di bawah mikroskop optik (Olympus, Jepang) dan dihitung dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ [14].
Proliferasi Sel pada Permukaan yang Dilapisi dengan 6MP-AuNPs-RDP
6MP-AuNPs-RDP dilapisi secara homogen ke bagian bawah cawan kultur berdiameter 3,5 cm, kemudian sel ditransplantasikan ke cawan berlapis partikel. Setelah inkubasi, sel-sel diamati di bawah mikroskop optik dan panjang neurit dihitung. Sel-sel dengan hanya pelarut digunakan sebagai kontrol. Setiap percobaan diulang empat kali secara independen, dan 200 neurit dirata-rata untuk perhitungan panjang neurit.
Analisis Statistik
Data dinyatakan sebagai mean ± SEM. Data dianalisis dengan program komputer dengan one-way analysis of variance (ANOVA), dilanjutkan dengan uji jarak berganda Dunnett, dengan software SPSS 13.0. Perbedaan dengan p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Tampilan dan Karakteristik Nanopartikel
Larutan AuNPs berair menunjukkan warna merah tua di bawah cahaya tampak (Gbr. 2a, 0 s). Setelah penambahan 6MP, warnanya berangsur-angsur menjadi gelap ketika 6MP dikonjugasikan ke AuNPs, dan akhirnya, endapan biru-hitam dari 6MP-AuNPs muncul setelah 5 jam reaksi. Pengendapan dapat diselesaikan dengan mengatur pH menjadi 9,0, dan pada saat itu, larutan berair 6MP-AuNPs menunjukkan warna mawar. Curah hujan akan terbentuk kembali ketika pH diatur ke pH 7,4.
Proses reaksi dan karakteristik nanopartikel. a Proses reaksi untuk menyiapkan 6MP-AuNPs. Setelah 6MP ditambahkan ke dalam larutan AuNP, warna larutan berubah dan pengendapan secara bertahap terbentuk dalam 5 jam. b Presipitasi 6MP-AuNPs-RDP dilarutkan ketika pH diatur menjadi 9,0 dengan 0,1 M NaOH. c DLS pengukuran distribusi ukuran partikel. d Potensi zeta dari AuNPs, 6MP-AuNPs, dan 6MP-AuNPs-RDP. e Struktur partikel di bawah TEM
6MP-AuNPs-RDP dibuat dengan mengkonjugasikan AuNPs dengan kelompok tiol 6MP atau RDP pada pH 9,0. Larutan encer 6MP-AuNPs-RDP menunjukkan warna mawar yang sama dengan larutan 6MP-AuNP (Gbr. 2b). Ketika pH larutan 6MP-AuNPs-RDP diatur menjadi 7,4, partikel mengendap di dasar larutan.
Ukuran dan potensi zeta dari larutan 6MP-AuNPs dan 6MP-AuNPs-RDP (pH 9.0) masing-masing diperiksa oleh DLS (Gbr. 2c). Data menunjukkan bahwa ukuran rata-rata 6MP-AuNPs-RDP sedikit lebih besar daripada 6MP-AuNPs (24,6 vs 20,5 nm), sedangkan potensi zeta yang pertama secara signifikan lebih tinggi daripada yang terakhir (− 25,8 vs 37,2 mV), menunjukkan bahwa RDP kationik meningkatkan potensi permukaan partikel. Gambar TEM menunjukkan bahwa kedua nanopartikel ini berbentuk bulat (Gbr. 2d).
Serapan Sel dari Nanopartikel
Ketika larutan partikel diatur ke pH 7,4 dan ditambahkan ke dalam media sel, partikel mulai beragregasi dan secara bertahap tenggelam ke dasar sumur. Namun, 30 menit kemudian, plak kosong yang jelas muncul di sekitar sel, dan celah sel yang diberi perlakuan 6MP-AuNPs-RDP memiliki agregasi partikel yang lebih sedikit daripada 6MP-AuNPs (Gbr. 3a). Selain itu, lebih banyak nanopartikel yang diamati di dalam sel yang diobati dengan 6MP-AuNPs-RDP dibandingkan dengan sel yang diobati dengan 6MP-AuNPs.
Serapan sel dari nanopartikel. a Solusi 6MP-AuNPs dan 6MP-AuNPs-RDP masing-masing 0,25 g/mL disesuaikan dengan pH 7,4 dan ditambahkan ke dalam media sel selama inkubasi 30 menit. Partikel diinternalisasi ke dalam sel SH-SY5Y atau diendapkan di dasar sumur. b Diagram skematik AuNP yang dimodifikasi peptida 6MP dan berlabel fluoresensi. Setelah sel SH-SY5Y diinkubasi dengan partikel selama 2 jam, gambar diambil (c ) dan intensitas fluoresensi (d ) diukur. Data disajikan sebagai mean ± SEM. Nilai rata-rata untuk empat percobaan independen.
**p < 0.01 dibandingkan dengan sel yang diberi perlakuan 6MP-AuNPs-SP
Untuk mengidentifikasi lebih lanjut bahwa partikel dapat memasuki sel saraf, peptida berlabel fluoresensi dikonjugasikan dengan partikel (Gbr. 3b). Setelah 2 jam menginkubasi sel dengan nanopartikel ini, fluoresensi yang kuat diamati pada sel yang dirawat 6MP-AuNPs-RDP, sementara fluoresensi hijau yang relatif lemah terlihat pada sel yang dirawat 6MP-AuNPs-SP. (Gbr. 3c). Hasil pengukuran intensitas fluoresensi dengan Spektrometer Fluoresensi (Hitachi Ltd. Co. Tokyo, Jepang) menunjukkan bahwa sel yang diberi perlakuan 6MP-AuNPs-RDP memiliki intensitas fluoresensi yang jauh lebih tinggi daripada sel yang diberi perlakuan 6MP-AuNPs-SP (Gbr. 3d ), menunjukkan bahwa RDP, sejenis peptida penembus sel (CPP), dapat meningkatkan efisiensi serapan seluler partikel.
Efek Nanopartikel pada Pertumbuhan Neuronal
Untuk memeriksa apakah partikel memiliki efek pada pertumbuhan saraf, baik uji MTT dan penghitungan sel digunakan untuk mengukur aktivitas dan jumlah metabolisme sel setelah sel inkubasi dengan partikel selama 24 jam. Hasilnya menunjukkan bahwa RDP saja tidak mempengaruhi pertumbuhan sel, sementara 6MP-AuNPs-RDP dan 6MP-AuNPs pada konsentrasi masing-masing di atas 0,125 dan 0,5 g/mL, meningkatkan aktivitas metabolisme sel dan jumlah sel dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 3d). 4a, b). Selain itu, sel yang diobati dengan 6MP-AuNPs-RDP menunjukkan aktivitas metabolisme yang lebih tinggi daripada sel yang diobati dengan 6MP-AuNPs, yang mungkin terkait dengan efisiensi penetrasi sel yang lebih tinggi dari 6MP-AuNPs-RDP daripada 6MP-AuNPs.
Partikel meningkatkan aktivitas metabolisme sel (a ) dan angka (b ), dan konsentrasi 6MP-AuNPs dan 6MP-AuNPs-RDP bervariasi dari 0 hingga 1,0 μg/mL Data disajikan sebagai mean ± SEM. Sel-sel dengan hanya pelarut {0,1 M NaOH (pH 9,0) disesuaikan dengan pH 7,4 dengan 0,1 M HCl} digunakan sebagai kontrol. Nilai rata-rata untuk empat percobaan independen.
*p < 0.05,
**p < 0.01 dibandingkan dengan sel yang diobati dengan RDP,
#p < 0.05, dan
##p < 0.01 dibandingkan dengan sel yang diobati dengan 6MP-AuNPs
Efek Nanopartikel pada Panjang Neurit
Selain partikel dapat meningkatkan aktivitas metabolisme sel, dampak partikel terhadap panjang neurit juga diamati pada konsentrasi partikel yang tinggi (1 μg/mL). Gambar (Gbr. 5a) menunjukkan bahwa nanopartikel agregat menetap di dasar sumur, dan area plak kosong yang lebih besar muncul di sekitar sel yang diberi perlakuan 6MP-AuNPs-RDP.
Nanopartikel mendorong pertumbuhan neurit. Gambar (a ) dan panjang neurit (b ) setelah sel masing-masing diperlakukan dengan RDP, 6MP-AuNPs, dan 6MP-AuNPs-RDP selama 24 jam. Sel-sel dengan hanya pelarut digunakan sebagai kontrol. Nilai rata-rata untuk 200 neurit.
*p < 0.05 dan
**p < 0.01 dibandingkan dengan kontrol
Setelah inkubasi 24 jam, hasil menunjukkan bahwa sel yang diberi perlakuan partikel memiliki neurit yang lebih panjang dibandingkan sel kontrol, sedangkan sel yang diberi perlakuan RDP dan kontrol tidak memiliki perbedaan yang signifikan. Selain itu, neuritis sel yang diobati dengan 6MP-AuNPs-RDP jauh lebih lama daripada sel yang diobati dengan 6MP-AuNPs (Gbr. 5b).
Dari hasil Gambar 5, 6MP membunuh semua sel SH-SY5Y karena sitotoksisitasnya; jadi, kami tidak menggunakan 6MP untuk melapisi pelat. Juga, seperti yang ditunjukkan oleh Gambar. 3, 4, dan 5, jumlah 6MP-AuNPs yang relatif kecil memasuki sel, dan panjang neurit serta jumlah sel jelas lebih rendah dari 6MP-AuNPs-RDP. Oleh karena itu, 6MP-AuNPs-RDP dipilih untuk penelitian lebih lanjut guna menguji pengaruhnya terhadap pertumbuhan sel.
Proliferasi Sel dan Pertumbuhan Neurit Setelah Pemberian 6MP-AuNPs-RDP Berulang
Untuk mengidentifikasi lebih lanjut hasil 6MP-AuNPs-RDP pada proliferasi sel dan pertumbuhan neurit, 6MP-AuNPs-RDP ditambahkan ke dalam media sel selama tiga kali pada hari 1, 2, dan 3 setelah kultur sel dalam pelat 6-sumur (hari 0). Hasilnya menunjukkan bahwa panjang neurit dari sel yang diberi perlakuan partikel menjadi jelas lebih panjang daripada kontrol (Gbr. 6a, b), dan aktivitas metabolisme sel meningkat ketika sel diperlakukan dengan partikel (Gbr. 6c).
Nanopartikel menginduksi proliferasi sel dan pertumbuhan neurit. a gambar sel pada hari 1, 2, 3, dan 4. b Panjang neurit dari sel yang dirawat 6MP-AuNPs-RDP dan kontrolnya. Nilai rata-rata untuk 200 neurit.
**p < 0,01 dibandingkan dengan kontrol. c Aktivitas metabolisme sel yang dirawat 6MP-AuNPs-RDP. Sel menerima pengobatan tiga kali sehari selama 3 hari. Pertama kali, 6MP-AuNPs-RDP ditambahkan ke dalam media sel setelah sel dikultur selama 24 jam dari transplantasi sel. Setiap konsentrasi partikel adalah 0,25 μg/mL. d Gambar pertumbuhan neurit sel pada pelapisan permukaan dengan 6MP-AuNPs-RDP. 6MP-AuNPs-RDP dilapisi di bagian bawah cawan kultur berdiameter 3,5 cm, dan kemudian, sel-sel ditransplantasikan pada cawan. e Panjang neurit diukur pada 0 ~ 3 hari. Sel-sel dengan hanya pelarut digunakan sebagai kontrol. Nilai rata-rata untuk 200 neurit.
**p < 0.01 dibandingkan dengan kontrol,
*p < 0.05,
**p < 0,01 dibandingkan dengan sel hari 1. Panah biru menunjuk ke neurit yang representatif
Untuk menguji pengaruh 6MP-AuNPs-RDP pada pertumbuhan neurit ketika partikel digunakan sebagai bahan pelapis permukaan, bagian bawah cawan kultur dilapisi dengan 6MP-AuNPs-RDP, dan kemudian, sel-sel ditransplatasi pada pelapis. Gambar menunjukkan bahwa partikel dengan cepat menempel pada membran sel (Gbr. 6d), kemudian partikel diinternalisasi dan didistribusikan di seluruh sel, termasuk sitoplasma, membran nukleus, dan nukleus sel. Hasilnya juga menunjukkan bahwa sel yang diberi perlakuan partikel memiliki neurit yang lebih panjang secara signifikan daripada kontrol (Gbr. 6e).
Pengaruh Nanopartikel pada Pertumbuhan Sel Setelah Penyimpanan Beku
Untuk memeriksa toleransi sel terhadap partikel dan mengidentifikasi apakah sel mempertahankan kapasitas proliferasi setelah keadaan pertumbuhan terpisah, sel yang diberi perlakuan 6MP-AuNPs-RDP dibekukan dan disimpan selama beberapa hari ketika mereka mencapai fase pertumbuhan eksponensial. Kemudian, sel-sel diambil kembali dan dikultur pada pelat 24-sumur (Gbr. 7a). Hasilnya menunjukkan bahwa jumlah sel yang diberi perlakuan partikel meningkat secara signifikan dan neurit menjadi lebih panjang daripada kontrol (Gbr. 7b, c), menunjukkan bahwa pertumbuhan sel yang diberi perlakuan partikel tidak dapat dipengaruhi oleh proses pembekuan dan pemulihan .
Nanopartikel meningkatkan panjang neurit dan jumlah sel setelah penyimpanan beku. (a ) Sel diperlakukan dengan 6MP-AuNPs-RDP (1,0 μg/mL) sebelum penyimpanan, dan sel dipulihkan dan dilanjutkan kultur selama 3 hari. Panjang neurit (b ) dan nomor sel (c ) dari sel yang diobati dengan 6MP-AuNPs-RDP meningkat secara signifikan setelah penyimpanan. Sel-sel dengan hanya pelarut digunakan sebagai kontrol. Data disajikan sebagai mean ± SEM.
**p < 0,01 dibandingkan dengan kontrol. Panah biru menunjuk ke perwakilan neurit
Diskusi
AuNPs telah menunjukkan aplikasi potensial yang besar di berbagai bidang kimia, fisika, material, biologi, kedokteran, dan bidang interdisipliner terkait. Untuk menstabilkan struktur AuNPs, ligan yang paling sering dimodifikasi tiol digunakan sebagai agen penstabil yang dapat mengikat permukaan AuNPs dengan pembentukan ikatan Au-S. Dalam penelitian tersebut, kelompok tiol 6MP dan RDP terkonjugasi dengan permukaan AuNPs, dan struktur partikelnya stabil dan dapat digunakan untuk penelitian lebih lanjut.
Seperti yang dapat dilihat dari hasil, partikel memiliki sifat asam-basa yang jelas, yang terkait dengan disosiasi gugus N(9)-H dari molekul 6MP yang terjadi pada kisaran pH 10,4 ~ 11,2 dalam larutan, dan agregasi terjadi ketika nilai pH larutan 6MP-AuNP di bawah 6. Protonasi N9 dari molekul 6MP menetralkan 6MP-AuNPs dengan nilai pH lebih rendah dari 6, dan kemudian, interaksi antar molekul (interaksi susunan basa) menjadi sangat kuat dan terkompensasi tolakan elektrostatik. Setelah modifikasi RDP, partikel menunjukkan perilaku asam-basa yang lebih kompleks karena pI tiol-RDP sekitar 11,5 selain sifat asam-basa dari 6MP-AuNPs. Dari titrasi didapatkan nilai pI 6MP-AuNPs-RDP sebesar 7,8 mendekati kondisi fisiologis (pH 7,4). Dengan demikian, 6MP-AuNPs-RDP dan 6MP-AuNPs dapat mengendap dari media sel.
Dalam penelitian ini, kami mengidentifikasi bahwa RDP meningkatkan penyerapan sel 6MP-AuNPs, yang konsisten dengan penelitian sebelumnya. Telah diketahui secara umum bahwa RDP merupakan peptida panjang yang terdiri dari 39 asam amino yang berasal dari glikoprotein virus rabies yang memiliki kemampuan untuk mengangkut makromolekul asing ke dalam sel saraf [15, 16]. Dalam penelitian kami sebelumnya, efisiensi serapan sel nanocluster emas meningkat secara signifikan ketika nanocluster dikonjugasikan dengan RDP [17]. Mekanisme penetrasi RDP ke dalam sel mungkin berhubungan dengan reseptor -aminobutyric acid (GABA) membran sel saraf atau endositosis yang dimediasi reseptor asetilkolin nikotinat [18, 19].
Studi ini juga menyarankan efek sebaliknya dari 6MP-AuNPs-RDP relatif terhadap 6MP bahwa 6MP-AuNPs-RDP mempromosikan proliferasi sel dan pertumbuhan neurit, menunjukkan aktivitas neurofik yang jelas. Mekanisme perbedaan khas 6MP-AuNPs-RDP dan 6MP ini mungkin terkait dengan struktur kimia 6MP (turunan purin dari gugus tiol C6) [20]. Pada permukaan 6MP-AuNPs-RDP, kelompok tiol 6MP terlibat dalam ikatan dengan AuNPs dan dengan demikian diblokir. Oleh karena itu, kelompok purin terpapar pada permukaan partikel. Telah diterima dengan baik bahwa purin memainkan peran penting dalam mendorong pertumbuhan neuron (seperti diferensiasi sel, pembentukan dan ekstensi neurit, sinaptogenesis) melalui jalur pensinyalan purinergik intraseluler [21, 22], termasuk protein kinase yang diaktifkan mitogen/protein yang diatur sinyal ekstraseluler kinase (MAPK/ERK) dan phosphatidylinositol 3-kinase/serine-treonin kinase Akt (PI3K/Akt) jalur (jalur yang sama diinduksi oleh neurotropin dan sitokin) [23]. Oleh karena itu, purin dari 6MP-AuNPs-RDP mungkin berkontribusi terhadap efek proliferasi sel dan pertumbuhan neurit.
Harus ditunjukkan bahwa sel SH-SY5Y menunjukkan toleransi yang sangat baik terhadap 6MP-AuNPs-RDP. Ketika sel-sel yang diperlakukan partikel menerima administrasi partikel berulang atau pemulihan dari penyimpanan beku, bahkan ketika sel-sel tumbuh di permukaan yang dilapisi dengan partikel, mereka masih mempertahankan aktivitas proliferasi, menunjukkan bahwa 6MP-AuNPs-RDP harus memiliki potensi untuk aplikasi.
Kesimpulan
Di sini, kami menyarankan bahwa AuNP yang dimodifikasi dengan 6MP dan RDP dapat secara efektif meningkatkan proliferasi sel dan pertumbuhan neurit. Karena biokompatibilitas dan biosafety nanopartikel yang sangat baik, mereka adalah biomaterial yang menjanjikan yang dapat digunakan sebagai nanomaterial neurofik untuk pertumbuhan neuron.
