Eksosom yang berasal dari sel punca mesenkimal tali pusat manusia (hucMSCs) yang mengekspresikan microRNA telah disorot dalam penyakit manusia. Namun, mekanisme molekuler terperinci dari miR-18b-3p eksosom yang diturunkan dari hucMSCs pada preeklamsia (PE) masih diselidiki lebih lanjut. Kami bertujuan untuk menyelidiki pengaruh eksosom dan miR-18b-3p/leptin (LEP) pada terjadinya PE. Morfologi hucMSC dan hucMSC-eksosom (Exos) diidentifikasi. Eksosom terinfeksi dengan lentivirus berbeda yang mengekspresikan miR-18b-3p untuk mengeksplorasi peran miR-18b-3p dalam PE. Model tikus PE dibuat dengan injeksi intraperitoneal N -nitro-l-arginin metil ester. Ekspresi LEP dan miR-18b-3p diuji pada jaringan plasenta tikus PE. Juga, efek eksosom pada ekspresi LEP dan miR-18b-3p terdeteksi. Tekanan darah sistolik (SBP), proteinuria, faktor inflamasi, berat janin tikus dan plasenta dan apoptosis sel pada tikus PE terdeteksi. Akhirnya, hubungan antara miR-18b-3p dan LEP diverifikasi menggunakan uji gen reporter luciferase ganda dan uji pull-down RNA. Eksosom, memulihkan miR-18b-3p atau menghambat LEP mengurangi SBP dan proteinuria tikus PE serta meningkatkan berat janin tikus dan plasenta, menurunkan kadar serum faktor inflamasi serta menekan sel apoptosis tikus PE, memberikan efek supresi pada perkembangan PE. miR-18b-3p menurun dan LEP meningkat pada jaringan plasenta tikus PE. LEP adalah gen target langsung miR-18b-3p. Upregulasi miR-18b-3p atau pengobatan eksosom menekan ekspresi LEP dan mengurangi terjadinya PE, sementara downregulasi miR-18b-3p memiliki efek sebaliknya. LEP yang diatur ke bawah membalikkan efek pengurangan miR-18b-3p pada tikus PE. miR-18b-3p eksosom yang diturunkan dari HucMSCs menargetkan LEP untuk berpartisipasi dalam terjadinya dan pengembangan PE. Studi ini dapat memberikan dasar teoretis baru untuk mekanisme dan investigasi PE.
Preeklamsia (PE), ditandai dengan proteinuria dan hipertensi [1], merupakan penyebab utama mortalitas dan morbiditas janin dan ibu pada kehamilan manusia [2]. Etiologi dan patogenesis PE tidak jelas [3], yang telah dilaporkan terkait dengan invasi trofoblas abnormal yang mengakibatkan disfungsi endotel ibu, malperfusi plasenta kronis dan hipertensi dengan hasil yang merugikan [4]. Dengan pengecualian pengiriman janin dan plasenta, tidak ada terapi khusus untuk PE [5]. Oleh karena itu, sangat mendesak untuk mengeksplorasi target terapi untuk meningkatkan prognosis penyakit ini.
Tali pusat manusia (huc) adalah sumber sel punca mesenchymal (MSCs) yang cocok yang mengeluarkan berbagai faktor trofik dan sitokin serta menunjukkan kapasitas anti-inflamasi dan imunomodulator yang kuat [6]. Sebuah penelitian telah memverifikasi bahwa PE mempercepat ekspresi penanda neuroglial pada tali pusat MSC yang diturunkan dari jeli Wharton [7]. Efek protektif dari hucMSCs exosomes (Exos) pada morfologi plasenta dan angiogenesis pada tikus PE juga telah dilaporkan [8]. Eksosom adalah vesikel sekretorik kecil (50-100 nm) yang memediasi komunikasi antar sel dalam lingkungan mikro tumor melalui enkapsulasi dan transmisi faktor karsinogenik ke tempat yang jauh atau ke sel sekitarnya melalui sirkulasi [9]. Sebuah studi telah mengungkapkan kerusakan fungsi vaskular dan komplikasi yang disebabkan oleh transfer efektif sFlt-1 dan sEng ke dalam sel endotel pada pasien dengan PE melalui eksosom [10]. MicroRNAs (miRNAs) adalah RNA endogen, non-coding dengan panjang 18-25 nukleotida, dan mengatur ekspresi gen pada tingkat pasca-transkripsi [11]. Data dalam sebuah penelitian telah melaporkan bahwa ekspresi miR-18b mempengaruhi invasi sel, viabilitas dan migrasi sel trofoblas di PE [12]. Selanjutnya, Wu et al. telah mengusulkan bahwa miR-18b melemahkan proliferasi dalam sel endotel retina manusia yang diinduksi oleh glukosa tinggi, yang mungkin menawarkan wawasan baru untuk memahami mekanisme patogenesis retinopati diabetik [13]. Namun, peran miR-18b-3p eksosom yang diturunkan dari hucMSC dalam PE masih belum diketahui. Leptin (LEP) memiliki efek pleiotropik pada diferensiasi/proliferasi sel dan kekebalan keadaan fisiologis dan terutama muncul dari adiposit, selain jaringan lain, termasuk plasenta [14]. Sebuah penelitian telah memverifikasi bahwa metilasi promotor LEP abnormal terlibat dalam perkembangan PE [15]. Studi lain menunjukkan bahwa plasenta adalah situs utama ekspresi LEP pada kehamilan [16]. Namun demikian, hubungan pengikatan antara miR-18b-3p dan LEP masih sulit dipahami. Oleh karena itu, kami bertujuan untuk mengeksplorasi peran miR-18b-3p eksosom turunan hucMSC dalam PE dengan keterlibatan LEP, dan kami menyimpulkan bahwa miR-18b-3p eksosom turunan hucMSC dapat menghambat perkembangan PE melalui penargetan LEP.
Studi ini disetujui oleh Institutional Review Board of People's Hospital of Wuhan University. Semua peserta menandatangani dokumen informed consent. Semua hewan percobaan dihitung dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium oleh Komite Internasional Rumah Sakit Rakyat Universitas Wuhan.
Tali pusat janin yang dilahirkan oleh nifas sehat dikumpulkan dan dipotong-potong dan disaring dengan ayakan kemudian dicampur dengan larutan phosphate-buffered saline (PBS). Jaringan tali pusat disentrifugasi pada 1500 r/min selama 5 menit dengan radius sentrifugal 10 cm. Jaringan disuspensikan dengan medium Eagle modifikasi Dulbecco (DMEM)/F12 yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS) dan dipindahkan ke labu kultur. Cairan diganti setelah 4 hari dan kemudian diganti setiap 3 hari sekali. Sel disubkultur ketika pertemuan mencapai sekitar 90%. Pertumbuhan yang melekat dan morfologi hucMSC diamati di bawah mikroskop cahaya. Sel-sel diwarnai dengan larutan pewarnaan O merah minyak (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Cina) untuk mendeteksi diferensiasi osteogenik hucMSCs dan diwarnai dengan larutan pewarnaan alkaline phosphatase (ALP) (Beyotime) untuk mendeteksi diferensiasi adipogenik hucMSCs. Flow cytometer (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, USA) diadopsi untuk menguji CD73, CD166 (keduanya 1:10, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) dan CD105 (1:20, AbD Serotec, Oxford, Inggris).
HucMSC yang tumbuh dengan baik dikultur. Supernatan dikumpulkan dan disentrifugasi pada 28.500 r/min selama 1 jam dengan radius sentrifugasi 10 cm. Supernatan dibuang, dan sel difiksasi dengan glutaraldehid 2% dan asam osmik 1%, didehidrasi dengan etanol, direndam dalam propilen oksida, dikeringkan selama 2 jam, disematkan dengan Epon812 dan diiris. Irisan diwarnai dengan uranium dan timbal, masing-masing. Akhirnya, eksosom diamati di bawah mikroskop elektron. Detektor nanosight (Malvern Instruments, Malvern, UK) digunakan untuk mendeteksi pencitraan gerakan Brown dari nanopartikel eksosom dan ukurannya. Penanda permukaan hucMSC-Exos diidentifikasi dengan uji western blot, dan hasilnya menunjukkan bahwa hucMSC-Exos mengekspresikan CD9, CD81 dan CD63.
HucMSC terinfeksi lentivirus yang mengandung ekspresi rendah vektor miR-18b-3p dan ekspresi rendah kontrol negatif vektor (NC) miR-18b-3p (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Shanghai, Cina). Akhirnya, hucMSC-antagomir NC yang diekspresikan secara stabil dan antagomir hucMSC-miR-18b-3p diperoleh. Sel dikultur selama 48 jam, dan supernatan dikumpulkan dan disentrifugasi dengan ultrasentrifugasi untuk mendapatkan antagomir Exos-antagomir NC dan Exos-miR-18b-3p yang sesuai.
Tikus Wistar (berat 200–250 g, menua 8 w, terlepas dari jenis kelamin) dalam tingkat kesehatan-bersih dan kematangan seksual dipilih (Pusat Hewan Eksperimental Universitas Wuhan, Wuhan, Cina). Tikus diberi makan dalam sistem penghalang dengan suhu 18–28 °C, kelembaban relatif 40–70%, serta diet dan air yang cukup.
Model PE tikus dibuat dengan injeksi intraperitoneal 50 mg/kg nitric oxide synthetase inhibitor, N(G)-nitro-l-arginine methyl ester (L-NAME, Beyotime) dengan mengacu pada sebuah artikel [17]. Keberhasilan pembentukan model PE didasarkan pada peningkatan tekanan darah dengan 20 mmgHg dan lebih tinggi dari 115 mmHg serta peningkatan proteinuria.
Tikus betina dan tikus jantan dikohabitasi secara acak pada 1:1, dan kedua tikus disimpan dalam kandang khusus individu pada pukul 5-6 sore. hari sebelumnya. Sperma pada sekret vagina tikus betina diamati dengan alat vaginal plug dan mikroskop keesokan harinya. Jika hasilnya positif pada saat yang sama, hari itu dicatat sebagai hari ke-0 kehamilan. Mulai tanggal 13 hari kehamilan, tikus dibagi menjadi 6 kelompok (10 tikus dalam setiap kelompok):kelompok normal (jumlah normal saline yang disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan), kelompok PE (NAMA L [50 mg/ kg per hari] disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan, dan 20 L saline normal disuntikkan ke plasenta pada hari ke-16 hingga hari ke-19 kehamilan), kelompok PE + miR-NC (L-NAME [50 mg /kg per hari] disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan, dan 20 L 4 nmol miR-NC disuntikkan ke plasenta pada hari ke-16 hingga hari ke-19 kehamilan), kelompok agomir PE + miR-18b-3p (N-NAMA [50 mg/kg per hari] disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan, dan 20 L agomir 4 nmol miR-18b-3p disuntikkan ke plasenta pada hari ke-16 hingga hari ke-19 kehamilan) , kelompok antagomir PE + miR-18b-3p (NAMA L [50 mg/kg per hari] disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan, dan 20 L antagomir 4 nmol miR-18b-3p disuntikkan ke P lacenta pada hari ke 16 hingga hari ke 19 kehamilan), PE + miR-18b-3p antagomir + kelompok kecil RNA (si)-LEP yang mengganggu (NAMA L [50 mg/kg per hari] disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke 13 hingga hari ke 20 kehamilan, dan 20 L 4 nmol miR-18b-3p antagomir dan si-LEP disuntikkan ke plasenta pada hari ke-16 hingga hari ke-19 kehamilan) dan kelompok PE + si-LEP (NAMA L [50 mg/kg per hari] disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan, dan 20 L 4 nmol si-LEP disuntikkan ke plasenta pada hari ke-16 hingga hari ke-19 kehamilan). Tikus diobati dengan eksosom dan eksosom yang membawa lentivirus. Tikus-tikus tersebut dibagi menjadi 5 kelompok (10 tikus dalam setiap kelompok):kelompok normal (jumlah normal saline yang disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan), kelompok PE (NAMA-L (50 mg/kg per hari). ) disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan, dan 20 L saline normal disuntikkan ke plasenta pada hari ke-16 hingga hari ke-19 kehamilan), kelompok PE + Exos (NAMA-L (50 mg/kg per hari) disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan, dan 20 L Exos (80 g eksosom disuspensikan dalam 20 L normal saline) disuntikkan ke plasenta pada hari ke-16 hingga hari ke-19 kehamilan), PE + Exos-antagomir NC kelompok (N-NAMA (50 mg/kg per hari) disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke 13 sampai hari ke 20 kehamilan, dan 20 L Exos-antagomir NC (80 g eksosom disuspensikan dalam 20 L salin normal) disuntikkan ke plasenta pada hari ke 16 hingga hari ke 19 kehamilan) dan kelompok antagomir PE + Exos-miR-18b-3p (N-NAMA (50 mg/kg per hari) disuntikkan secara intraperitoneal dari hari ke-13 hingga hari ke-20 kehamilan, dan 20 L Exos-miR-18b-3p antagomir (80 μg eksosom disuspensikan dalam 20 L salin normal) disuntikkan ke plasenta pada hari ke-16 hingga hari ke-19 kehamilan).
Tekanan darah tikus diukur dengan pengukuran tekanan darah arteri ekor tikus. SBP ekor-cuff dari semua tikus hamil diukur pada hari ke 10, 13, 16 dan 19 kehamilan menggunakan detektor tekanan arteri ekor tikus (Tensys (R) Medical Inc., San Diego, CA, USA). Tekanan diukur 3 kali dalam waktu singkat; kemudian, nilai rata-rata diambil sebagai tekanan darah.
Dalam hal diet gratis dan air, urin 24 jam tikus hamil dikumpulkan pada hari ke 10, 13, 16 dan 19 kehamilan, dan kandungan proteinnya terdeteksi di departemen nefrologi Rumah Sakit Rakyat Universitas Wuhan.
Tikus bunting dibius dengan natrium pentobarbital 3% pada hari ke-21 kebuntingan. Darah tepi tikus diawetkan, disentrifugasi untuk diambil serumnya dan disimpan dalam lemari es pada suhu – 20°C untuk standby. Kemudian janin tikus dan plasenta diambil dengan operasi caesar, selaput janin dan tali pusat yang terhubung dikeluarkan, dan tali pusat yang terhubung dengan janin tikus dipotong. Plasenta dan janin tikus ditempatkan pada kain kasa aseptik untuk mengeringkan darah dan cairan ketuban, masing-masing, dan kemudian diletakkan di timbangan analitik untuk menimbang beratnya. Satu bagian dari jaringan plasenta difiksasi dengan paraformaldehyde 4%, didehidrasi dengan etanol, dibersihkan dengan xilena, disematkan dengan parafin dan diiris terus menerus (5 m) untuk pewarnaan hematoxylin-eosin (HE) dan terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin pewarnaan nick end-labeling (TUNEL). Sisanya disimpan pada -80 °C untuk deteksi reverse transcription kuantitatif polymerase chain reaction (RT-qPCR), analisis Western blot, dan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Faktor nekrosis tumor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β dan kandungan IL-6 dalam serum diuji dengan ELISA. Konsentrasi TNF-α, IL-1β dan IL-6 ditentukan mengikuti instruksi kit (Sistem R&D, Minneapolis, MN, USA). Nilai densitas optik (OD) (490 nm) diuji oleh pembaca pelat mikro (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Kurva standar yang sesuai diperoleh dengan menggunakan nilai OD sebagai absis dan konsentrasi sampel standar yang sesuai sebagai ordinat. Konsentrasi TNF-α, IL-1β dan IL-6 dihitung dari kurva standar.
Sampel parafin dari jaringan plasenta dibersihkan dalam xilena, didehidrasi dengan alkohol gradien konvensional, diwarnai dengan hematoxylin, dibedakan dengan alkohol asam klorida 1% dan kembali menjadi biru dengan 1% air amonia. Kemudian jaringan diwarnai dengan larutan eosin 1%, didehidrasi (masing-masing 75%, 90%, 95% etanol, etil alkohol absolut) dan dibersihkan dengan xilena, dikeringkan, diblokir dan diamati di bawah mikroskop elektron.
Bagian tertanam parafin secara rutin dikeringkan dan didehidrasi sesuai dengan instruksi, dan kemudian, apoptosis dideteksi oleh TUNEL Kit (Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd., Jiangsu, China). 4,6-Diamino-2-phenylindole (Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) digunakan untuk mengamati sel TUNEL-positif menggunakan mikroskop fluoresensi (Nikon, Tokyo, Jepang) [18].
Jaringan plasenta ditimbang. Per 50–100 mg jaringan plasenta ditambahkan dengan 1 mL TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) dan benar-benar larut. Jaringan ditambahkan 200 L kloroform dan disentrifugasi pada 4 °C, 12.000 rpm untuk mengekstrak RNA total. Konsentrasi dan kemurnian RNA ditentukan dengan spektrofotometer asam nukleat protein DU-800 (Beckman). U6 dan -aktin digunakan sebagai kontrol pemuatan. Primer PCR dirancang dan diperparah oleh Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China). Urutan primer tercantum dalam Tabel 1. RNA dibalik menjadi cDNA berdasarkan instruksi RNA reverse transcription kit (Sangon). PCR diamplifikasi dan produk diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa. Data dihitung dengan 2 −ΔΔCt metode.
Protein total jaringan plasenta diekstraksi dengan buffer lisis sel uji radio-imunopresipitasi (Beyotime). HucMSC-Exo digunakan untuk buffer abstrak, yang disentrifugasi pada 14.000 rpm. Supernatan diawetkan untuk menguji ekspresi protein dari protein penanda eksosom (CD81, CD63 dan CD9) dalam serum. Konsentrasi protein ditentukan dengan kit asam bicinchoninic (Beyotime, P0010). Sampel dimuat sesuai dengan hasil kuantitatif protein, diperlakukan dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 10% dan dipindahkan ke membran. Membran diblokir dengan susu skim 5%, diperiksa dengan antibodi primer LEP, CD63, CD81, CD9 dan -aktin (4 mL, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA), diperiksa ulang dengan 4 mL antibodi sekunder kambing anti-kelinci IgG/horseradish peroksidase, terpapar dan dikembangkan. -Actin digunakan sebagai referensi internal. Nilai abu-abu dianalisis dengan perangkat lunak analisis grafik gel Image Lab.
Perangkat lunak prediksi online https://cm.jefferson.edu/ diadopsi untuk memprediksi hubungan target antara miR-18b-3p dan LEP serta situs pengikatan miR-18b-3p dan LEP 3′wilayah yang tidak diterjemahkan (UTR ). Urutan wilayah promotor LEP 3′UTR yang mengandung situs pengikatan miR-18b-3p disusun. Plasmid tipe liar (WT) LEP 3′UTR dan tipe mutan LEP 3′UTR (MUT) dibangun. Plasmid rekombinan diberi nama masing-masing sebagai LEP 3′UTR-WT dan LEP 3′UTR-MUT. Sel 293T yang dikultur ditransfeksi bersama dengan miR-18b-3p meniru dan LEP 3′UTR-WT, miR-18b-3p meniru dan LEP 3′UTR-MUT, meniru NC dan LEP 3′UTR-WT, meniru NC dan LEP 3′UTR-MUT selama 30 jam. Kemudian sel 293T dikumpulkan. Aktivitas kunang-kunang dan renilla luciferase dalam sel diukur dengan pengukuran pendaran sesuai dengan kit deteksi gen reporter luciferase ganda (Promega, Madison, WI, USA).
Probe RNA terbiotinilasi (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p dan Bio-miR-18b-3p-Mut) diinkubasi dengan lisat sel 293T dan diekstraksi menggunakan manik-manik magnetik yang terkonjugasi dengan antibiotik streptomisin. Eksperimen dilakukan berdasarkan instruksi kit pull-down RNA magnetik Pierce (Pierce, IL, USA). RNA dielusi dan dimurnikan menggunakan TRIzol (Pierce). Pengayaan LEP dalam kompleks RNA diukur menggunakan RT-qPCR seperti yang dijelaskan sebelumnya [19].
Semua data dijelaskan oleh perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Data pengukuran ditunjukkan sebagai mean ± standar deviasi. Data dilakukan oleh sampel independen t uji untuk perbandingan dua kelompok, sedangkan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti dengan uji post hoc Tukey. Kriteria signifikansi statistik ditetapkan pada p < 0,05.
Massa jaringan tali pusat diamati di bawah mikroskop terbalik. Terlihat bahwa sel merangkak keluar dari massa jaringan pada hari ke-3; sel menunjukkan bentuk gelendong dan benang serta tumbuh seperti koloni sekitar 5 hari. Ketika dikultur ke bagian 3, morfologi sel adalah fusiform panjang yang seragam dan mirip dengan morfologi fibroblas, dan susunannya teratur (Gbr. 1a). Setelah 2 w diferensiasi adipogenik hucMSC, tetesan lipid terbentuk di sitoplasma, dan tetesan lipid menunjukkan struktur Kranz di bawah mikroskop terbalik (Gbr. 1b), menunjukkan bahwa hucMSC yang diisolasi memiliki kemampuan diferensiasi adipogenik. Setelah 2 w diferensiasi osteogenik, sejumlah besar nodul kalsium coklat dapat dilihat di bawah mikroskop terbalik (Gbr. 1c), menunjukkan bahwa hucMSC yang dikulturkan memiliki kemampuan diferensiasi osteogenik. Flow cytometer diadopsi untuk menguji imunofenotipe sel, dan hasilnya mencakup bahwa sel mengekspresikan penanda permukaan CD73, CD105, dan CD166 MSC secara berlebihan (Gbr. 1d).
Morfologi dan identifikasi hucMSC dan hucMSC-Exos. a Morfologi hucMSC di bawah mikroskop terbalik, b hucMSC diuji dengan pewarnaan O merah minyak. c hucMSC diuji dengan pewarnaan ALP. d Flow cytometry digunakan untuk mendeteksi imunofenotipe. e Bentuk dan ukuran hucMSC-Exos diamati melalui TEM. f Deteksi distribusi ukuran partikel eksosom menggunakan analisis Nanosight. g Ekspresi protein CD9, CD81 dan CD63 di hucMSC-Exos dideteksi dengan uji western blot
Morfologi hucMSC-Exos diamati oleh TEM, dan hasilnya menunjukkan bahwa eksosom berbentuk bulat atau oval dengan kepadatan pusat rendah dan pewarnaan tebal di kedua sisi (Gbr. 1e). Analisis nanosight digunakan untuk menganalisis ukuran partikel eksosom, dan hasilnya menunjukkan bahwa ukuran partikel terutama didistribusikan antara 40 dan 100 nm, lebih terkonsentrasi sekitar 80 nm (Gbr. 1f). Uji Western blot mengungkapkan bahwa semua penanda permukaan CD81, CD63, dan CD9 diekspresikan dalam hucMSC-Exos (Gbr. 1g).
Hasil SBP dan proteinuria 24 jam menunjukkan bahwa:tidak ada perbedaan bermakna SBP dan proteinuria 24 jam pada 6 kelompok sebelum pemberian (hari ke 10 kehamilan). SBP dan proteinuria 24 jam pada hari ke 19 kehamilan tidak menunjukkan perbedaan yang jelas pada tikus normal. Pada tikus PE atau tikus PE yang diobati dengan miR-NC, miR-18b-3p agomir, miR-18b-3p antagomir, miR-18b-3p antagomir + si-LEP, si-NC atau si-LEP, SBP dan 24-jam proteinuria mulai meningkat pada hari ke-13 kehamilan. Tidak ada perbedaan yang jelas dari SBP dan proteinuria 24 jam pada hari ke-16 dan hari ke-19 kehamilan pada tikus PE yang diobati dengan miR-18b-3p agomir dan si-LEP. Tikus PE mengalami peningkatan SBP dan proteinuria 24 jam pada hari ke-19 kehamilan; peningkatan ini dikurangi dengan elevasi miR-18b-3p tetapi lebih ditingkatkan dengan inhibisi miR-18b-3p; Pengurangan LEP membatalkan peran penurunan regulasi miR-18b-3p dalam SBP dan proteinuria 24 jam pada hari ke-19 kehamilan pada tikus PE (Gbr. 2a, b).
Memulihkan miR-18b-3p mengurangi karakteristik patologis tikus PE. a Hasil SBP pada tikus. b Hasil proteinuria 24 jam pada tikus. c Perubahan berat badan janin tikus. d Perubahan berat plasenta pada tikus. e Perubahan faktor inflamasi dalam serum dideteksi menggunakan ELISA. n = 10, *p <0,05 versus kelompok normal. ^p < 0,05 versus kelompok PE + miR-NC. @ p < 0,05 versus kelompok antagonis PE + miR-18b-3p. & p < 0,05 versus kelompok PE + si-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji Tukey
Berat janin tikus dan plasenta berkurang pada tikus PE; miR-18b-3p upregulated atau downregulated LEP meningkat, sementara miR-18b-3p downregulated menurunkan berat janin tikus dan plasenta pada tikus PE; Pembungkaman LEP membalikkan efek penghambatan miR-18b-3p pada berat janin tikus dan plasenta pada tikus PE (Gbr. 2c, d).
Faktor inflamasi dalam serum tikus PE terdeteksi. Ditemukan bahwa kandungan TNF-α, IL-1β dan IL-6 meningkat pada tikus PE; elevasi miR-18b-3p atau penghambatan LEP ditekan, sementara pengurangan miR-18b-3p mempromosikan konten TNF-α, IL-1β dan IL-6; efek penghambatan miR-18b-3p pada konten TNF-α, IL-1β dan IL-6 dibatalkan oleh penipisan LEP (Gbr. 2e).
Pada tikus normal, vili plasenta kaya akan pembuluh darah dan memiliki struktur yang jelas, sinsitiotrofoblas merupakan trofoblas utama pada vili plasenta, dan jumlah sitotrofoblas lebih sedikit. Pada tikus PE atau tikus PE yang diberi miR-NC, miR-18b-3p antagomir, si-NC atau miR-18b-3p antagomir + si-LEP, jumlah vili plasenta menurun, strukturnya kabur dan berhenti berkembang, beberapa vili dilakukan nekrosis fibrinoid, dan jumlah nodul sinsitiotrofoblas pada vili plasenta meningkat, dan sebagian besar vili belum matur. Jumlah trofosit berkurang, dan perubahan patologis berkurang pada tikus PE yang diobati dengan miR-18b-3p agomir dan si-LEP (Gbr. 3a).
MiR-18b-3p yang diekspresikan secara berlebihan memperbaiki perubahan patologis dan menekan sel-sel apoptosis jaringan plasenta pada tikus PE. a Pewarnaan HE digunakan untuk menguji gambaran patologis jaringan plasenta. b Pewarnaan TUNEL dilakukan untuk mengetahui sel-sel apoptosis jaringan plasenta pada tikus PE. c Tingkat apoptosis sel dideteksi dengan pewarnaan TUNEL. n = 10, *p <0,05 versus kelompok normal. ^p < 0,05 versus kelompok miR-NC. @ p < 0,05 versus kelompok antagonis miR-18b-3p. & p < 0,05 versus kelompok si-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji Tukey
Pewarnaan TUNEL menunjukkan bahwa sejumlah kecil sel apoptosis dapat dilihat. Tikus PE telah meningkatkan sel apoptosis, yang dikurangi dengan peningkatan miR-18b-3p dan pembungkaman LEP, dan selanjutnya ditingkatkan dengan penghambatan miR-18b-3p; Pembungkaman LEP juga membalikkan efek penghambatan miR-18b-3p pada jumlah sel apoptosis pada tikus PE (Gbr. 3b, c).
Secara bersama-sama, tikus dengan miR-18b-3p yang diregulasi atau LEP yang dihambat mengalami penurunan derajat perkembangan PE dalam histologi, dan LEP yang dibungkam dapat menghilangkan efek terapeutik dari miR-18b-3p yang dihambat.
Berdasarkan hasil di atas, downregulasi LEP membalikkan efek terapeutik dari downregulasi miR-18b-3p pada tikus PE dalam patologi dan histologi; dengan demikian, kami berhipotesis bahwa miR-18b-3p mungkin terkait dengan LEP.
Uji western blot dan RT-qPCR mengungkapkan bahwa tikus PE mengalami penurunan miR-18b-3p dan peningkatan level ekspresi LEP; pengobatan miR-18b-3p agomir meningkatkan regulasi miR-18b-3p dan menurunkan regulasi LEP pada tikus PE, sedangkan pengobatan antagomir miR-18b-3p meningkatkan ekspresi LEP; Pembungkaman LEP membalikkan efek promotif pengurangan miR-18b-3p pada ekspresi LEP pada tikus PE (Gbr. 4a–c).
miR-18b-3p diturunkan regulasi dan LEP diregulasi dalam jaringan plasenta tikus PE. a Ekspresi miR-18b-3p dan LEP mRNA dalam jaringan plasenta dideteksi menggunakan RT-qPCR. b Pita protein LEP di jaringan plasenta. c Uji western blot dilakukan untuk mendeteksi ekspresi protein LEP pada jaringan plasenta. d Ekspresi miR-18b-3p dan LEP mRNA dalam jaringan plasenta setelah perawatan eksosom terdeteksi menggunakan RT-qPCR. e Pita protein LEP dalam jaringan plasenta setelah perawatan eksosom. f Uji western blot dilakukan untuk mendeteksi ekspresi protein LEP setelah pengobatan eksosom. g Situs pengikatan miR-18b-3p dan LEP didasarkan pada perangkat lunak online. h Hubungan target antara miR-18b-3p dan LEP diverifikasi oleh uji gen reporter luciferase ganda. saya hubungan penargetan antara miR-18b-3p dan LEP diverifikasi oleh uji tarik-turun RNA. n = 10, *p <0,05 versus kelompok normal. ^p < 0,05 versus kelompok miR-NC. @ p < 0,05 versus kelompok antagonis miR-18b-3p. & p < 0,05 versus kelompok si-NC. # p < 0,05 versus kelompok PE. $ p < 0,05 versus kelompok PE + Exos-antagomir NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji Tukey
Uji western blot dan RT-qPCR digunakan untuk mengeksplorasi peran eksosom pada tikus PE. Hasil menunjukkan bahwa eksosom meningkatkan regulasi miR-18b-3p dan menurunkan regulasi LEP pada tikus PE, menunjukkan efek supresi eksosom pada pengembangan PE. Selain itu, eksosom yang membawa miR-18b-3p antagomir menginduksi penurunan regulasi miR-18b-3p dan peningkatan regulasi LEP pada tikus PE (Gbr. 4d–f).
Hubungan target antara miR-18b-3p dan LEP diperkirakan oleh perangkat lunak prediksi online bioinformatika https://cm.jefferson.edu/ (Gbr. 4g). Uji gen reporter luciferase ganda menunjukkan bahwa miR-18b-3p mimik mengurangi aktivitas luciferase dari LEP 3′UTR-WT, sementara tidak memberikan dampak pada LEP 3′UTR-MUT (Gbr. 4h). Lebih lanjut, uji pull-down RNA mengungkapkan bahwa pengayaan LEP ditingkatkan oleh miR-18b-3p terbiotinilasi WT (Gbr. 4i). Temuan ini menunjukkan bahwa LEP adalah gen target miR-18b-3p.
Hasil SBP dan 24 jam menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara SBP dan proteinuria 24 jam pada 5 kelompok sebelum pemberian (hari ke 10 kehamilan). SBP and 24-h proteinuria in day 19 of gestation showed no distinct difference in normal rats. In PE rats, SBP and 24-h proteinuria began to raise at day 13 of gestation. There was no distinct difference of SBP and 24-h proteinuria in day 16 and day 19 of gestation in PE rats treated with hucMSC-Exos and hucMSC-Exos transmitting antagomir NC. SBP and 24-h proteinuria heightened in day 19 of gestation in the PE rats, while the increase was reduced by injection of hucMSC-Exos. Inhibiting miR-18b-3p reversed the effect of hucMSC-Exos on SBP and 24-h proteinuria in day 19 of gestation in PE rats (Fig. 5a, b).
hucMSC-Exos attenuate pathological characteristics of PE rats. a Results of SBP in rats after exosome treatment. b Results of 24-h proteinuria in rats after exosome treatment. c Weight changes of fetal rats after exosome treatment. d Changes of placental weight in rats after exosome treatment. e Changes of inflammation factors after exosome treatment in serum were determined using ELISA. n = 10, *p < 0.05 versus the normal group. # p < 0.05 versus the PE group. $ p < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s test
The weight of fetal rat and placenta was measured, and we found that the PE rats had decreased weight of fetal rat and placenta; miR-18b-3p downregulation abolished the role of hucMSC-Exos in the weight of fetal rat and placenta in PE rats (Fig. 5c, d).
Inflammatory factors in serum were detected using ELISA. TNF-α, IL-1β and IL-6 contents remarkably increased in PE rats. Exosomes treatment decreased TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum of PE rats, which were enhanced by injection of exosomes inhibiting miR-18b-3p (Fig. 5e).
In normal rats, the placental villus was abundant in blood vessels with a clear structure, syncytiotrophoblasts were the main trophoblast in placental villi, and there were fewer cytotrophoblasts. In the PE rats and PE rats treated with hucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir, the number of placental villi reduced, the structure was blurred and atrophied, some villi were presented fibrinoid necrosis, and the number of syncytiotrophoblast nodules in placental villi enhanced, and most of the villi were immature. The pathological change was improved in the PE rats treated with hucMSC-Exos or hucMSC-Exos-antagomir NC versus the PE rats and PE rats treated with hucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir (Fig. 6a).
Exosomes alleviate pathological change and decrease apoptotic cells of placenta tissues in PE rats. a HE staining was utilized to test pathological features of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. b TUNEL staining was implemented to determine apoptotic cells of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. c Cell apoptosis rate was detected by TUNEL staining. n = 10, *p < 0.05 versus the normal group. # p < 0.05 versus the PE group. $ p < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s test
TUNEL staining indicated that in normal rats, a small number of apoptotic cells could be seen. PE rats had enhanced apoptotic cells, and reduced miR-18b-3p reversed the impacts of hucMSC-Exos on the number of apoptotic cells in placenta tissues from PE rats (Fig. 6b, c).
PE is a multisystem pregnancy disorder characterized by proteinuria and either high blood pressure or other adverse conditions and is linked to a wide range of maternal endothelial dysfunction [20]. It was reported that hucMSC-Exo improved the morphology of placental tissue in PE rats through suppressing cell apoptosis and facilitating angiogenesis in placental tissue in a dose-dependent manner [8]. A study has reported that miR-18b expression affected cell migration, viability and invasion in PE [12]. Moreover, it was verified increased maternal LEP concentration and hypomethylation of the LEP in placenta in early onset PE [21]. The current study was designed to explore the effect of exosomes and miR-18b-3p targeted LEP on the occurrence of PE. The findings in this study revealed that hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p inhibited PE progression by reducing LEP.
Based on our findings, miR-18b-3p reduced and LEP elevated in placenta tissues of PE rats. Similar to our study, the mRNA expression of miR-18b was markedly suppressed in PE placental tissues relative to that in normal placental tissues [12]. In addition, a study revealed that miR-18b content was dramatically reduced in malignant melanoma tissues in comparison with their matched adjacent non-tumor tissues [22]. Another study has verified that placental LEP expression was raised in preterm PE compared with controls [23]. Moreover, a study showed that LEP expression was obviously heightened in preeclamptic placentas [15]. This literature provided a theoretical basis for us to explore the abnormal expression of miR-18b-3p and LEP in PE. Moreover, it was predicted using a bioinformatic software that LEP was targeted by miR-18b-3p, and this targeting relationship was further confirmed with dual-luciferase reporter gene assay in our research. A study reported that LEP is a target for all three miRNAs (miR-1301, miR-223 and miR-224) in early-onset PE [16]. Another study has displayed that LEP decreased miR-93 expression in osteoarthritis and rheumatoid arthritis [24]. However, the binding between miR-18b-3p and LEP in human diseases, especially in PE, remains scarcely studied, which is the novelty of this study. Furthermore, a result emerging from our study reported that exosomes increased miR-18b-3p and decreased LEP in placenta tissues of PE. It was formerly documented that the expression of miR-18b-5p was notably raised in colorectal cancer plasma exosomes [25], while the relationship between hucMSC-Exos and miR-18b-3p/LEP in PE needs further study.
Additionally, the finding from our investigation showed that restored miR-18b-3p reduced SBP and 24-h proteinuria of PE rats, increased the weight of placenta, declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum and placenta tissues as well as suppressed cell apoptosis. These data indicated that miR-18b-3p elevation contributes to alleviating the symptoms and pathological changes in PE. It was demonstrated that stable upregulation of miR-18b produced effective tumor inhibitor activity, such as inhibiting melanoma cell viability, inducing apoptosis and reducing tumor growth in vivo [26]. Another result in our study was that hucMSC-Exos reduced SBP and 24-h proteinuria of PE rats, increased the weight of placenta, declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum and placenta tissues as well as suppressed cell apoptosis. The findings of the current study revealed that exosomes treated PE rat models presented an increase of the number and quality of fetuses, the quality of placenta, but cell apoptosis was significantly reduced [8]. Interestingly, a previous research has demonstrated that the addition of fetal bovine exosomes declined contents of macrophage TNF-α and IL-6 [27]. A study has revealed that purified exosomes suppressed production of IL-1β in lipopolysaccharide/nigericin-stimulated macrophages [28]. Furthermore, Nong et al. have suggested that inflammatory markers, such as TNF-α and IL-6, were dramatically decreased after administration of exosomes produced through human-induced pluripotent stem cell-derived MSCs [29]. There is a article finding that the SBP was markedly elevated in the group of women who later developed PE [30, 31]. It was displayed that PE patients were positively associated with SBP and diastolic blood pressures and proteinuria [32]. Also, a recent study has provided a proof that proteinuria heightened with advancing gestation in PE women [33]. A important finding was that rats from the PE group had increased TNF-α relative to the normal pregnant group [34]. Another study has verified that serum IL-6 and IL-1β were obviously elevated in women with PE in relation to controls [35]. The above findings suggested that PE patients usually showed high SBP, proteinuria and levels of inflammatory factors. Thus, it could be inferred from our results that the hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p had a therapeutic effect on PE.
In conclusion, our study provides evidence that hucMSCs-derived exosomes upregulate miR-18b-3p, which targets LEP to suppress the contents of inflammatory factors and reduce cell apoptosis rate in PE rat placenta tissues, thereby inhibiting the occurrence of PE. Thus, exosomal miR-18b-3p may be a potential candidate for treatment of PE via targeting LEP. This research identified the role of hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p targeting LEP during PE development for the first time, which provided a novel insight for PE treatment. However, due to the limitation of known researches, the study needs to be monitored rigorously and reported appropriately in the future clinical trials.
Tidak berlaku.
bahan nano
Abstrak Penyakit Parkinson (PD) ditandai dengan hilangnya neuron dopaminergik secara progresif di otak tengah, dan metode transplantasi sel induk memberikan strategi pengobatan yang menjanjikan. Dalam studi ini, pelacakan perilaku biologis sel yang ditransplantasikan in vivo sangat penting untuk pe
Sumber:Unsplash Kemunculan dan pertumbuhan teknologi telah memungkinkan untuk memaksimalkan produksi di tempat kerja dengan hasil yang jauh melampaui apa yang orang bayangkan. Otomatisasi proses dan mesin telah membuat pekerjaan lebih mudah bagi tim produksi dan administrasi secara keseluruhan. Beb
Layanan pelanggan RPA, panggilan robot Layanan pelanggan dan transformasi digital – dua istilah yang tidak dapat diabaikan oleh perusahaan di era saat ini. Seluruh ide menjalankan bisnis berputar di sekitar pelanggan. Dan, tujuan untuk mencapai profitabilitas dapat dicapai dengan penggunaan teknolo
Bisnis tidak dapat mengabaikan kekayaan yang terwakili dalam modal manusia mereka:makhluk-makhluk yang salah dengan kemampuan unik mereka untuk berani dan untuk bermimpi, untuk intuisi dan mengambil risiko dan, di atas segalanya, untuk mengenali ketika mereka menuju bencana Musim panas lalu melihat
