Menargetkan Sel Endotel dengan Nanopartikel GaN/Fe Multifungsi
Abstrak
Dalam makalah ini, kami melaporkan interaksi nanopartikel multifungsi dengan sel endotel hidup. Nanopartikel disintesis menggunakan pertumbuhan langsung galium nitrida pada nanopartikel seng oksida yang dicampur dengan oksida besi diikuti dengan dekomposisi inti dalam aliran hidrogen pada suhu tinggi. Menggunakan mikroskop elektron transmisi, kami menunjukkan bahwa sel endotel aorta babi mengambil nanopartikel berbasis GaN yang tersuspensi dalam media pertumbuhan. Nanopartikel disimpan dalam vesikel dan sel endotel tidak menunjukkan tanda-tanda kerusakan sel. Nanopartikel inert intraseluler digunakan sebagai elemen pemandu untuk transportasi terkontrol atau distribusi spasial sel yang dirancang dalam medan magnet eksternal.
Latar Belakang
Dalam beberapa tahun terakhir, banyak upaya telah dilakukan untuk memerangi kanker dan penyakit terkait menggunakan nanoteknologi. Salah satu pendekatan yang paling umum adalah berbasis nanopartikel yang dapat dimanfaatkan sebagai pembawa obat [1, 2]. Pendekatan ini, bagaimanapun, memiliki keterbatasan terkait dengan perlunya pelapisan nanopartikel dengan ligan pengenalan untuk adsorpsi obat dan ikatan kovalen, atau disebabkan oleh kebutuhan untuk mengenkapsulasi obat dalam nanopartikel. Pendekatan terapi alternatif adalah dengan memanfaatkan nanopartikel untuk terapi sel langsung, yaitu untuk menargetkan situs untuk tujuan mengobati penyakit secara biologis [3]. Sebagai contoh, sel-sel endotel yang dimuat dengan nanopartikel magnetik dapat dipandu ke lokasi cedera arteri melalui medan magnet yang diterapkan. Selain aplikasi terapeutik, pemandu sel berbantuan nanopartikel juga dapat berguna untuk pemisahan sel in vitro dan pelapisan seluler konstruksi tiga dimensi [4]. Dalam makalah ini, kami menunjukkan bahwa sel endotel mengambil nanopartikel berbasis GaN/Fe dan bahwa fenomena ini dapat digunakan untuk mengontrol distribusi spasial sel secara in vitro.
Metode
Sintesis Nanopartikel
Lapisan tipis GaN ditumbuhkan pada nanopartikel ZnO yang dicampur dengan Fe2 O3 oleh HVPE dalam dua langkah. Awalnya, lapisan nukleasi diendapkan pada 600 ° C selama 5 menit. Selanjutnya, suhu dinaikkan menjadi 800 °C dan dipertahankan pada suhu ini selama 10 menit. Rezim suhu kedua diperlukan untuk dekomposisi inti ZnO dan peningkatan kualitas kristal GaN. Pertumbuhan GaN telah dijelaskan secara rinci oleh kelompok kami sebelumnya [5, 6]. Singkatnya, kami menggunakan galium logam, amonia (NH3 ) gas, gas hidrogen klorida (HCl), dan hidrogen (H2 ) sebagai gas pembawa. Dalam proses pertumbuhan GaN, HCl, NH3 , dan H2 laju aliran masing-masing adalah 20, 600, dan 3500 sccm.
Budaya Sel
Sel endotel aorta babi diisolasi dari aorta dengan membuang lapisan sel endotel secara perlahan dengan pisau bedah. Sel dibudidayakan dalam inkubator standar pada 37 °C dengan 5% CO2 dalam EGM™-2 (Faktor Pertumbuhan Endotel Medium 2, Lonza). Pemisahan sel dilakukan dengan TrypLE™Select(1X) (Gibco®). Untuk semua percobaan, sel antara bagian 3 dan 8 digunakan. Sel diberi label dengan protein fluoresensi hijau (GFP) dengan transduksi lentiviral seperti yang dijelaskan di tempat lain [7].
Pengujian XTT
Uji XTT dimulai 24 jam setelah perubahan media ketika media baru yang dilengkapi dengan nanopartikel ditambahkan. Media kultur kemudian diganti dengan media EGM2 segar dengan reagen XTT dengan perbandingan 2:1. Reagen XTT terdiri dari 0,1 ml reagen kopling elektron dalam 5 ml XTT. Setelah 4 jam inkubasi pada 37 °C dengan 5% CO2 , absorbansi diukur pada pembaca pelat multi-mode Paradigma.
Penghitungan Sel
Setelah 2 hari inkubasi sel dengan konsentrasi nanopartikel yang berbeda, sel difiksasi dalam paraformaldehyde 4% selama 10 menit, dicuci dengan PBS, dan diwarnai dengan DAPI (1:7500 diencerkan dalam PBS) selama 10 menit. Bidang pandang acak difoto dari enam sumur independen dengan kamera resolusi tinggi yang dipasang pada mikroskop fluoresensi (Zeiss). Perangkat lunak berbantuan komputer DotCount v1.2 [8] digunakan untuk menghitung jumlah relatif sel di setiap sumur dan dibandingkan dengan kontrol.
Mikroskop Transmisi Elektron
Mikroskop elektron transmisi dilakukan setelah inkubasi sel dengan nanopartikel selama 1 hari. Setelah sel mencapai pertemuan 50%, media kultur diganti dengan media yang dilengkapi dengan nanopartikel 50 g/ml GaN/Fe dan sel diinkubasi selama 24 jam. Sel kemudian dicuci dengan PBS, difiksasi dalam glutaraldehid 2% dan formaldehida 2% pada suhu kamar selama 2 jam, dan kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C. Sampel dicuci dalam 0,1 M natrium cacodylate dan pasca-fiksasi dalam 1% OsO4 dalam 0,1 M natrium cacodylate selama 1 jam. Setelah fiksasi, sampel didehidrasi dalam seri aseton bertingkat dan disematkan di EPON. Polimerisasi dilakukan selama 2 hari pada suhu 60 °C. Bagian tipis dengan ketebalan ~50 nm dikumpulkan pada kisi-kisi slot tembaga berlapis formvar dan diwarnai dengan 4% uranil asetat dan timbal sitrat. Bagian seluler diselidiki secara rinci menggunakan mikroskop elektron transmisi FEI Tecnai 20 pada tegangan akselerasi 200 kV.
Hasil dan diskusi
Nanopartikel magnetik multifungsi telah dibuat dengan menumbuhkan lapisan GaN pada nanopartikel korban paduan ZnO dengan Fe2 O3 . Setelah pertumbuhan lapisan GaN menggunakan epitaksi fase uap hidrida (HVPE), inti ZnO terurai. Nanopartikel stabil secara kimia yang dihasilkan terutama terdiri dari cangkang GaN dengan sifat magnetik yang disebabkan oleh difusi atom besi dalam GaN yang diendapkan serta adanya atom Fe dalam film tipis paduan ZnO dengan Fe2 O3 pada permukaan bagian dalam kulit GaN. Nanopartikel ini diselidiki menggunakan mikroskop elektron. Setelah proses pertumbuhan HVPE dari GaN, nanopartikel kristal tunggal dengan ukuran melintang berkisar antara 20 hingga 100 nm tetap terpisah secara spasial (Gbr. 1). Hasil difraksi sinar-X dan karakterisasi spektroskopi Raman (Gbr. 1c, d) nanopartikel sebelum dan sesudah pertumbuhan GaN menunjukkan dekomposisi inti ZnO dan pembentukan nanopartikel GaN. Analisis kimia nanopartikel dilakukan dengan menggunakan analisis X-Ray dispersif energi (EDX) mengkonfirmasi pertumbuhan lapisan GaN dan dekomposisi inti ZnO (Gbr. 1e, f). Perhatikan bahwa material yang dihasilkan menampilkan konsentrasi Fe yang relatif tinggi (sekitar 50%) dibandingkan dengan nanopartikel awal.
Analisis nanopartikel. a Gambar SEM nanopartikel GaN yang ditumbuhkan pada nanopartikel korban paduan ZnO dengan Fe2 O3 . b Gambar TEM dari nanopartikel GaN/Fe yang dihasilkan. c Pola XRD ZnFe awal2 O4 nanopartikel dan resultan GaN/ZnFe2 O4 nanopartikel. d Spektrum Raman dari nanopartikel awal dan yang dihasilkan setelah pertumbuhan GaN. e Analisis EDX paduan ZnO dengan Fe2 O3 nanopartikel. f Analisis EDX dari nanopartikel yang dihasilkan setelah pertumbuhan lapisan GaN
Nanopartikel berbasis GaN/Fe diinkubasi dengan sel endotel aorta babi primer. Seperti yang ditunjukkan sebelumnya, nanopartikel GaN ditoleransi oleh sel endotel dalam konsentrasi kurang dari 100 g/ml [5]. Selama proses inkubasi, sel endotel mengambil sebagian besar nanopartikel di media kultur sekitarnya sambil mempertahankan migrasi dan proliferasi sel. Namun demikian, kami melihat beberapa penurunan jumlah sel yang layak dengan peningkatan konsentrasi nanopartikel dalam media kultur. Kecenderungan ini dikonfirmasi oleh hasil uji XTT yang disajikan pada Gambar 2.
Dampak nanopartikel pada viabilitas sel. Pengurangan XTT yang bergantung pada konsentrasi diukur setelah 1 hari sel diinkubasi dengan konsentrasi nanopartikel yang berbeda. Jumlah sel yang dihitung pada akhir uji XTT dinyatakan relatif terhadap sel yang tidak diobati. Nilai dinyatakan sebagai rata-rata ± standar deviasi dari dua percobaan independen dengan enam ulangan
Untuk memahami bagaimana nanopartikel GaN/Fe berinteraksi dengan sel dan untuk mengidentifikasi lokalisasinya di dalam sel, kami melakukan analisis morfologis menyeluruh menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM). Setelah inkubasi sel endotel aorta babi dengan nanopartikel 50 g/ml selama 1 hari, nanopartikel terbukti terlokalisasi dalam vesikel di dalam sel (Gbr. 3a). Tidak ada partikel nano yang ditemukan di sitoplasma atau di inti sel. Proses penyerapan nanopartikel disajikan pada Gambar. 3b-d. Sebagian besar nanopartikel diambil oleh sel melalui salah satu jalur uptake klasik, yaitu melalui mikropinositosis, endositosis yang dimediasi clathrin, atau endositosis yang dimediasi caveolin [9]. Proses internalisasi tergantung pada jenis sel dan lingkungan seluler lokal serta pada sifat fisiokimia partikel itu sendiri (misalnya, ukuran, bentuk, muatan permukaan). Dalam kasus sel endotel, endositosis yang dimediasi caveolin dilaporkan memiliki pengaruh yang lebih tinggi pada serapan nanopartikel daripada mekanisme lain karena banyaknya caveolin dalam jenis sel ini [10, 11].
Gambar TEM diambil dari sel endotel tunggal yang diinkubasi dengan nanopartikel GaN/Fe. a Distribusi nanopartikel dalam vesikel seluler. b –d Proses penyerapan nanopartikel menjadi vesikel. Panah merah menunjukkan nanopartikel yang tampak lebih gelap di TEM karena kepadatan atom yang tinggi dibandingkan dengan media biologis
Karena penggabungan jumlah Fe yang tinggi di atas, nanopartikel yang dihasilkan menunjukkan feromagnetisme, bersama dengan piezoelektrik yang melekat pada bahan semikonduktor GaN [12, 13]. Kedua sifat dasar ini dapat digunakan untuk aktivasi jarak jauh dari beberapa proses dalam nanopartikel dan/atau penuntun terkontrol dan distribusi spasialnya di media yang relevan. Sifat piezoelektrik dapat digunakan untuk menginduksi polarisasi listrik dalam nanopartikel GaN dengan, misalnya, medan ultrasound yang diterapkan. Dengan cara ini, seseorang dapat mengirimkan sinyal listrik ke sel untuk mengaktifkan atau menghambat proses seluler tertentu. Mengenai sifat magnetik yang diberikan oleh konten Fe, mereka memungkinkan seseorang untuk mencapai visualisasi dinamis dan kontrol posisi spasial sel. Untuk mendemonstrasikan kemungkinan terakhir secara eksperimental, sel-sel endotel diinkubasi dalam media EGM™-2 yang dilengkapi dengan 50 g/ml nanopartikel GaN/Fe selama 3 hari (sampai pertemuan sel 70-80%). Selanjutnya, sel-sel dilepaskan dari permukaan dan disuspensikan kembali dalam EGM™-2. Perhatikan bahwa pelepasan sel dengan TrypLE™ Select dan sentrifugasi tidak memengaruhi viabilitas sel atau mengakibatkan pelepasan partikel nano dari sel (data tidak ditampilkan). Segera setelah penyemaian, sel-sel diinkubasi dalam inkubator standar pada suhu 37 °C di bawah 5% CO2 , di mana pelat kultur ditempatkan pada magnet permanen. Gambar 4 menunjukkan distribusi sel endotel bermuatan nanopartikel di hadapan dan tidak adanya medan magnet. Gambar 4a menggambarkan sel bermuatan nanopartikel yang diinkubasi tanpa adanya medan magnet, sedangkan pada Gambar 4b, sel endotel tanpa nanopartikel diinkubasi dalam medan magnet. Gambar-gambar ini menunjukkan distribusi sel secara acak dalam kedua kasus. Inkubasi sel bermuatan nanopartikel dalam gradien medan magnet mengarah pada distribusi sel yang telah dirancang sebelumnya di area tertentu, sesuai dengan peta medan magnet. Gambar 4c menggambarkan sel-sel dalam pelat kultur setelah 1 hari inkubasi di medan magnet yang dihasilkan oleh tujuh magnet melingkar neodymium tanah jarang dengan diameter 5 mm dan ketebalan 1 mm. Gambar 4d mengilustrasikan distribusi sel setelah inkubasi dalam medan magnet yang dihasilkan oleh magnet tunggal berbentuk cincin dengan diameter 7 mm dan ketebalan 1 mm. Dalam kedua kasus, magnet ditempatkan di bawah pelat kultur.
Membimbing sel endotel nanopartikel-sarat menggunakan medan magnet. Kelompok kontrol menunjukkan distribusi spasial a sel endotel ditargetkan dengan nanopartikel dan diinkubasi tanpa adanya medan magnet dan b sel endotel bebas nanopartikel diinkubasi dalam medan magnet. c , d Distribusi sel endotel yang ditargetkan dengan nanopartikel setelah 1 hari inkubasi dalam medan magnet
Kesimpulan
Kami telah menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa nanopartikel berbasis GaN / Fe yang menunjukkan sifat magnetik diambil oleh sel endotel dan disimpan di dalam vesikel. Sel endotel bermuatan nanopartikel GaN/Fe dapat dipandu secara terkontrol menggunakan medan magnet terapan. Hasil ini membuka kemungkinan baru untuk merekayasa jaringan tiga dimensi secara in vitro atau untuk menargetkan sel in vivo ke lokasi cedera jaringan. Bersamaan dengan ini, kehadiran dalam sel-sel nanopartikel GaN dengan sifat piezoelektrik yang melekat membuka jalan bagi stimulasi listrik jarak jauh dari proses biologis seluler. Pendekatan yang menjanjikan ini sedang diselidiki di laboratorium kami.
