Penggunaan Nanopartikel GaN/Fe untuk Pengarahan Magnetik Sel Endotel In Vitro
Abstrak
Kami melaporkan sintesis dan penyerapan selular nanopartikel multifungsi GaN/Fe dan menunjukkan kegunaannya sebagai panduan magnetik untuk sel endotel. Partikel dihasilkan dengan menumbuhkan cangkang GaN pada inti ZnO/Fe2O3 melalui epitaksi fasa uap hidrida (HVPE) diikuti dengan dekomposisi inti pada suhu tinggi. Mikroskopi elektron transmisi mengonfirmasi bahwa sel endotel aorta babi internalisasi nanopartikel GaN/Fe ke dalam vesikel tanpa mengganggu daya tahan sel. Partikel iners ini yang berepons magnet dapat digunakan untuk mengarahkan sel dalam medan magnet eksternal, menawarkan strategi baru untuk pengiriman sel yang ditargetkan dan rekayasa jaringan.
Latar Belakang
Nanoteknologi telah muncul sebagai alat yang kuat dalam onkologi, sebagian besar melalui pengobat berbasis nanopartikel [1,2]. Namun, pelapisan ligan, enkapsulasi obat, dan pengikatan kovalen dapat membatasi efisiensi pengiriman dan menimbulkan kekhawatiran keamanan. Strategi alternatif melibatkan penggunaan nanopartikel sebagai modulator biologis langsung—menargetkan dan mengarahkan sel itu sendiri [3]. Misalnya, nanopartikel magnetik dapat mengarahkan sel endotel ke lokasi cedera arteri ketika diekspos pada medan magnet eksternal. Selain aplikasi terapeutik, sel yang dipandu ini dapat membantu pemilihan sel in-vitro dan fungsionalisasi rangka [4]. Di sini kami menyajikan bukti pertama bahwa sel endotel dapat menginternalisasi nanopartikel GaN/Fe dan bahwa penyerapan ini memungkinkan penataan spasial terkontrol sel.
Metode
Sintesis Nanopartikel
Lapisan tipis GaN ditumbuhkan pada nanopartikel ZnO yang diligasi dengan Fe2O3 menggunakan proses HVPE dua tahap. Lapisan inisial ditambatkan pada 600 °C selama 5 menit, diikuti oleh fase pertumbuhan pada 800 °C selama 10 menit untuk mendekomposisi inti ZnO dan meningkatkan kualitas kristal GaN. Proses menggunakan galium logam, NH3, HCl, dan H2 sebagai gas pembawa dengan laju alur masing-masing 20, 600, dan 3500 sccm [5,6].
Kultur Sel
Sel endotel aorta babi primer diisolasi dengan pengikatan halus pada dinding aorta, kemudian dikultur dalam EGM™-2 (Lonza) pada 37 °C, 5% CO2. Passase 3–8 digunakan, dan sel ditransduksi dengan GFP melalui lentivirus [7]. Lepasan sel untuk eksperimen dilakukan dengan TrypLE™Select(1X) (Gibco®).
Uji XTT
Daya tahan sel dievaluasi 24 jam setelah penambahan nanopartikel. Reagen XTT (0,1 ml dalam 5 ml XTT) dicampur dengan medium EGM2 segar (2:1) dan diinkubasi selama 4 jam pada 37 °C, 5% CO2. Absorbansi diukur pada pembaca plate multi-mode Paradigm.
Penghitungan Sel
Setelah 48 jam paparan nanopartikel, sel dikonsentrasi dalam paraformaldehida 4%, dicuci dengan PBS, dan diwarnai dengan DAPI (1:7500). Citra ditangkap dari enam wells per kondisi menggunakan mikroskop fluresensi Zeiss dan dikuantifikasi dengan DotCount v1.2 [8].
Mikroskopi Elektron Transmisi
Sel yang diinkubasi selama 24 jam dengan 50 µg/ml nanopartikel GaN/Fe dikonsentrasi dalam glutaraldehida 2%/formaldehida 2%, post-konsentrasi dalam OsO4 1%, dehidrasi, dan diembed dalam EPON. Sesi ultra-tipis (~50 nm) diwarnai dengan asetat uranil 4% dan sitrat timbal, kemudian diperiksa pada FEI Tecnai 20 (200 kV).
Hasil dan Pembahasan
Nanopartikel GaN/Fe dirancang dengan melapisi inti ZnO/Fe2O3 dengan GaN, diikuti dengan penghapusan inti. Partikel yang dihasilkan menunjukkan cangkang GaN (~20–100 nm) yang disematkan dengan Fe, memberikan respons magnetik sambil mempertahankan piezoelektrik GaN. Analisis SEM, TEM, XRD, Raman, dan EDX mengonfirmasi dekomposisi inti, pertumbuhan GaN, dan kandungan Fe sekitar 50% [Figure 1].
Analisis nanopartikel. a SEM GaN pada inti ZnO/Fe2O3. b TEM partikel GaN/Fe. c XRD ZnFe2O4 vs. GaN/ZnFe2O4. d Spektra Raman sebelum dan setelah pertumbuhan GaN. e EDX ZnO/Fe2O3. f EDX setelah pertumbuhan GaN.
Saat diinkubasi dengan sel endotel aorta babi, nanopartikel terutama diinternalisasi ke dalam vesikel, tanpa lokosialisasi sitoplasma atau inti (Fig. 3a). Penyerapan terjadi melalui jalur klasik—micropinocitosis, endositosis mediated clathrin, dan endositosis mediated caveolin—kemungkinan didominasi oleh caveolae pada sel endotel [9,10,11]. Uji daya tahan menunjukkan penurunan modest, bergantung konsentrasi, dalam aktivitas metabolik pada 50 µg/ml, sementara dosis lebih rendah (<10 µg/ml) mempertahankan >90% daya tahan (Fig. 2).
Dampak nanopartikel pada daya tahan sel. Reduksi XTT setelah 1 hari inkubasi dengan berbagai konsentrasi. Hasil dinyatakan relatif terhadap kontrol tidak diobati (mean ± SD, n = 6).
Mengingat beban Fe yang tinggi, partikel menunjukkan feromagnetisme yang kuat, sementara cangkang GaN mempertahankan piezoelektrik. Properti ganda ini memungkinkan aktuasi jarak jauh melalui polarisasi yang diinduksi ultrasound dan manipulasi magnetik. Untuk memvalidasi pengarahan magnetik, sel endotel yang dimuat dengan 50 µg/ml GaN/Fe dilepas, disuspendasi kembali, dan ditempelkan pada EGM™-2. Saat plate kultur ditempatkan di bawah magnet permanen, sel menunjukkan distribusi yang sangat tidak acak yang cocok dengan peta medan magnet, sedangkan sel kontrol menunjukkan penempatan acak (Fig. 4). Ini menunjukkan bahwa nanopartikel GaN/Fe dapat digunakan untuk mengarahkan sel dengan cara yang dapat diprediksi.
Citra TEM satu sel endotel setelah 1 hari dengan nanopartikel GaN/Fe. a Distribusi vesikel. b–d Jalur penyerapan (panah merah menunjukkan partikel kepadatan tinggi).
Pengarahan sel endotel yang dipenuhi nanopartikel dengan medan magnet. a Sel dengan nanopartikel, tanpa medan. b Sel tanpa nanopartikel, medan diterapkan. c Sel dengan nanopartikel di bawah tujuh magnet neodymium. d Sel dengan nanopartikel di bawah magnet cincin.
Kesimpulan
Kami telah mendirikan bahwa nanopartikel GaN/Fe dengan aman diinternalisasi oleh sel endotel dan disimpan dalam vesikel. Respons magnetiknya memungkinkan penataan sel yang presisi dan didorong oleh medan, membuka peluang untuk pengiriman sel yang ditargetkan dan pembuatan jaringan yang dirancang. Selain itu, piezoelektrik intrinsik GaN menawarkan platform untuk stimulasi listrik jarak jauh dari fungsi seluler. Pekerjaan yang sedang berlangsung akan mengeksplorasi aplikasi in vivo dan integrasi aktivasi piezoelektrik untuk modulasi terapeutik.
