Biosensor DNA Elektrokemial Ultra-Sensitif untuk Deteksi Vibrio cholerae Menggunakan Nanopartikel Polystyrene-Asam Akrilik dan Emas

Abstrak

Kami melaporkan biosensor DNA elektrokimia yang sangat sensitif untuk mendeteksi DNA Vibrio cholerae. Sensor menggunakan nanospheres latex polystyrene-co-asam akrilik (PSA) yang dimuat nanopartikel emas (AuNPs) sebagai matriks pengapung DNA. Voltametri pulsa diferensial (DPV) dengan label oligonucleotide berbasis antrakuinon mengukur sinyal hibridisasi. AuNPs secara signifikan memperkuat arus faradaik, menghasilkan respons linier yang dapat direproduksi dari 1,0×10⁻²¹ hingga 1,0×10⁻⁸ M (RSD = 4,5%, n = 5) dan batas deteksi (LOD) 1,0×10⁻²¹ M (R² = 0,99). Pemulihan dalam sampel ditambang bervariasi dari 91% hingga 109% (n = 3). Sensor mempertahankan 95% respons aslinya setelah 58 hari dan dapat digunakan ulang enam kali dengan RSD 5% (n = 5).

Latar Belakang

Vibrio cholerae tetap menjadi ancaman kesehatan global, terutama di setting sumber terbatas. Metode berbasis kultur tradisional lambat dan memakan tenaga, sementara PCR membutuhkan peralatan yang mahal dan operator terampil. Diagnostik yang cepat, murah, dan sangat sensitif sangat diperlukan untuk pengendalian wabah yang tepat waktu. Biosensor DNA elektrokimia menawarkan sensitivitas, spesifisitas, dan potensi miniaturisasi yang tinggi, menjadikannya ideal untuk pengujian point-of-care.

Metode

Reagen Kimia

Polystyrene, asam akrilik, HAuCl₄·3H₂O, sitrat natrium, dan reagen lainnya diperoleh dari Fluka, Sigma-Aldrich, dan Riedel-De Haën. Oligonukleotida target, mismatch, dan reporter disintesis oleh Bio Service Unit (NSTDA) dan Bioneer.

Alat

Pengukuran DPV dilakukan pada elektroda layar cetak karbon (SPE) dengan referensi Ag/AgCl dan elektroda kontra platinum, menggunakan potensiostat Autolab PGSTAT12. Parameter elektrokimia: langkah 0,02 V, laju pemindaian 0,5 V s⁻¹, buffer fosfat 0,05 M, pH 7.

Sintesis AuNPs dan Partikel Latex PSA

AuNPs disiapkan dengan reduksi sitrat (metode Turkevich). Partikel latex PSA disintesis melalui kopolimerisasi emulsi bebas sabun dari styrene dan asam akrilik, menghasilkan partikel sub-mikron (~186 nm) dengan grup karboksil yang melimpah untuk pemasangan DNA.

Modifikasi Elektroda dan Immobilisasi DNA

Partikel PSA ditampalkan pada SPE, diikuti dengan depo AuNPs. Pengaktifan EDC/NHS dalam buffer pH 5 mengaktifkan grup karboksil, kemudian sond penangkap 5 µM diimmobilkan. Hibridisasi dengan 1 µM DNA target dan label antrakuinon 5 mM (AQMS) berlangsung dalam dua tahap: penangkap–target dan binding reporter, masing-masing 1 jam.

Optimisasi

Pemuatan sond (1–6 µM) dan konsentrasi AQMS (0,1–5 mM) dioptimalkan; 4 µM sond dan 1 mM AQMS memberikan respons maksimal. pH 7, buffer fosfat 0,05 M, dan 2,0 M NaCl memberikan kondisi ionik optimal. Waktu hibridisasi 60 menit dan waktu immobilisasi sond 8 jam dipilih.

Penilaian Performa

Sensor menunjukkan rentang linier 1,0×10⁻²¹ hingga 1,0×10⁻⁸ M dengan LOD 1,0×10⁻²¹ M. Uji pemulihan dalam sampel ditambang (1,0×10⁻⁴ hingga 1,0×10⁻⁶ µg µL⁻¹) menghasilkan 91,4%–108,9% (n = 3). Studi umur simpan menunjukkan 95% aktivitas setelah 58 hari; sensor dapat diregenerasi dengan 0,1 M NaOH dan digunakan ulang enam kali dengan RSD 5%.

Hasil dan Pembahasan

SEM mengonfirmasi partikel PSA seragam (~186 nm). Analisis DPV menunjukkan bahwa pemuatan AuNPs mengurangi pemisahan potensi puncak (ΔEₚ), yang mengindikasikan transfer elektron yang ditingkatkan. Eksperimen hibridisasi mengungkapkan peningkatan yang signifikan dalam arus puncak DPV hanya ketika baik target dan sond reporter hadir, mengonfirmasi spesifisitas jenis sandwich. Pemuatan sond dan konsentrasi AQMS optimal diidentifikasi; kepadatan sond yang lebih tinggi menyebabkan respons mencapai plat, sementara AQMS berlebihan menyebabkan kebisingan latar belakang. pH 7, ion Na⁺, dan kekuatan ionik yang tinggi (2,0 M NaCl) memaksimalkan efisiensi hibridisasi.

Kurva kalibrasi menunjukkan linearitas yang sangat baik (R² = 0,99). Batas deteksi sub-zeptomolar sensor melebihi sistem berbasis PSA atau avidin-biotin yang pernah dilaporkan sebelumnya, sambil mempertahankan waktu ensayos yang cepat (~60 menit). Uji stabilitas menunjukkan hilangnya sinyal yang minimal selama 58 hari, dan protokol regenerasi memulihkan aktivitas penuh untuk hingga enam siklus.

Kesimpulan

Kami telah mengembangkan biosensor DNA elektrokimia yang kuat, tanpa amplifikasi, yang mendeteksi DNA V. cholerae pada konsentrasi sub-zeptomolar dengan spesifisitas dan keandalan yang tinggi. Pembuatan yang sederhana, waktu ensayos yang cepat, dan umur simpan panjang menjadikannya cocok untuk diterapkan di lapangan dalam setting wabah.