Terapi Glioma Terpadu: Tetrahedron DNA yang Dimodifikasi Gint4.T Mengirim Doxorubicin untuk Menghambat Proliferasi Sel yang Dipengaruhi PDGFRβ
Abstrak
Glioma adalah salah satu tumor otak intrinsik paling mematikan karena pertumbuhan invasinya. Efek terapi glioma buruk karena adanya barrier otak-otak dan barrier otak-tumor serta penargetan obat yang tidak cukup. Tetrahedron DNA (TDN) menunjukkan potensi besar untuk pengiriman obat dan mungkin menjadi strategi terapi baru untuk glioma. Dalam studi ini, kami menggunakan TDN untuk mengirim doksorubisin (DOX) untuk terapi glioma. Gint4.T, aptamer yang dapat mengenali reseptor faktor pertumbuhan trombosit β pada sel tumor, digunakan untuk memodifikasi TDN (Apt-TDN) untuk pengiriman obat yang ditargetkan. TDN direkayasa mandiri melalui sintesis satu langkah, yang menunjukkan ukuran kecil (10 nm) dan muatan negatif. Uji serum sapi fetal menunjukkan stabilitasnya sebagai kendaraan pengiriman obat. Apt-TDN dapat diambil secara efektif oleh sel U87MG. Dibandingkan DOX dan DOX@TDN (TDN yang dimuat DOX), DOX@Apt-TDN (TDN yang dimodifikasi Gint4.T dan dimuat DOX) menunjukkan tingkat apoptosis awal yang lebih tinggi, penahanan siklus sel yang lebih tinggi, dan sitotoksisitas yang lebih besar terhadap sel U87MG. Simpulan, temuan kami menunjukkan bahwa DOX@Apt-TDN menyediakan terapi baru dengan potensi aplikasi klinis yang menjanjikan bagi pasien glioma.
Pendahuluan
Glioma, tumor yang berasal dari neuroepitelium, adalah malignitas intrakranium paling umum. Hampir 1/3 dari semua tumor otak adalah glioma, dan sekitar 4/5 dari tumor otak malignant primer adalah glioma [1,2,3,4]. Saat ini, terapi paling efektif untuk glioma adalah resesi bedah dan kemoterapi bersamaan radiasi pasca operasi, tetapi sayangnya, prognosis pasien tetap buruk. Kemoterapi tradisional untuk glioma tidak menunjukkan hasil yang baik karena penargetan tumor yang buruk, komplikasi akibat barrier otak-otak (BBB) dan barrier otak-tumor (BTB), dan penargetan obat yang tidak cukup. BBB adalah faktor paling penting yang mencegah pengiriman hampir semua makromolekul (termasuk obat dan gen) ke parenkim otak dan fungsinya yang tepat. Obat yang tidak dapat menyeberang BBB harus diwakili pada dosis yang cukup tinggi untuk mencapai konsentrasi terapi yang efektif di area yang diinginkan. Namun, obat berlebihan dapat menyebabkan efek samping sistemik yang parah dan akumulasi obat yang tidak diinginkan pada jaringan yang tidak terkena. Selain itu, obat anti-glioma konvensional yang ada memiliki kemampuan penargetan yang tidak cukup [3, 4]. Nanopartikel telah muncul sebagai alat pengiriman obat yang paling menjanjikan. Karena keuntungan ukurannya, nanoparticle dapat menyeberang BBB dan menghasilkan efek anti-tumor. Kafa et al. [5] merancang nanotubos carbon multi-dinding yang difungsionalisasi kimiawi (f-MWNTs) yang menargetkan ANG dan mengonfirmasi kemampuan mereka untuk menyeberang BBB melalui eksperimen in vivo dan in vitro. Namun, nanomaterial ini mungkin didistribusikan ke berbagai organ di seluruh tubuh atau bahkan masuk ke sistem saraf pusat (CNS), di mana mereka dapat menyebabkan neurotoksisitas [6].
DNA adalah bahan yang ideal untuk konstruksi nanostruktur karena perakitanya dapat dikontrol secara presisi dengan pasangan basis Watson-Crick [7]. Sampel ini, sejumlah nanostruktur DNA dua dimensi (2D) dan tiga dimensi (3D) telah dirancang dan divalidasi [8,9,10]. Nanostruktur DNA tetrahedral (TDN) telah menarik perhatian signifikan karena kompatibilitas biologis, stabilitas, situs modifikasi difungsional yang melimpah, dan imunogenisitas rendah [11,12,13]. Turberfield et al. menyintesis nanostruktur DNA tetrahedral dengan hasil tinggi menggunakan metode sintesis satu langkah [14]. Walsh et al. menemukan bahwa tetrahedron DNA yang berisi sona asam nukleat dapat masuk ke dalam sel mamalia tanpa perlu reagen transfeksi [15]. Lee et al. menunjukkan bahwa nanopartikel tetrahedral yang direkayasa mandiri dapat digunakan untuk pengiriman siRNA yang ditargetkan in vivo [16]. TDN telah menunjukkan peluang aplikasi yang luar biasa dalam diagnostik molekuler, pengiriman molekuler, dan terapi obat yang ditargetkan. Mereka juga banyak digunakan dalam penelitian tumor pada berbagai organ, seperti kanker payudara [17]. Demikian pula, TDN juga telah digunakan dalam penelitian penyakit sistem saraf. Tian et al. [18] menggunakan tetrahedron DNA sebagai dasar dan memodifikasinya dengan angiopep-2 (ANG) untuk berhasil membangun nanoprobe ANG-TDN, yang dapat menargetkan reseptor terkait protein lipoprotein densitas rendah 1 (LRP-1) untuk imaging yang ditargetkan. Penelitian menunjukkan bahwa ANG-TDN dapat menyeberang BBB. Ma et al. [19] menyatakan bahwa nanostruktur DNA tetrahedral dapat masuk ke dalam sel akar saraf (NSCs) tanpa perlu agen transfeksi, di mana mereka mempromosikan migrasi, proliferasi, dan diferenciasi sel akar saraf [20], dan memiliki potensi besar untuk perawatan dan regenerasi jaringan saraf. Oleh karena itu, kami menyelidiki kemungkinan penggunaan TDN dalam terapi glioma dan meningkatkan kemampuan penargetannya.
Reseptor faktor pertumbuhan trombosit β (PDGFRβ) adalah anggota penting dari keluarga protein tirosin kinase yang terlibat dalam proliferasi, migrasi, dan angiogenesi sel. Beberapa studi telah menunjukkan bahwa PDGFβ adalah target yang menjanjikan untuk terapi anti-tumor karena perannya dalam angiogenesi [21, 22]. Aptamer adalah oligonukleotida DNA atau RNA satu rantai pendek yang dihasilkan oleh metode evolusi sistematis ligan melalui pengayaan eksponensial (SELEX). Aptamer mirip dengan antibodi, yang memiliki afinitas dan spesifisitas yang tinggi terhadap target mereka [23]. Karena properti uniknya, aptamer memainkan peran penting dalam pengiriman terpadu agen kemoterapi, siRNA, dan nanoparticle yang dimuat obat. Gint4.T, aptamer RNA yang dapat secara spesifik terikat PDGFRβ, juga merupakan antagonis spesifik PDGFRβ [24]. Monaco et al. [25] menyatakan bahwa aptamer Gint4.T dapat menyeberang barrier otak-otak (BBB) dan secara spesifik mengenali PDGFRβ. Nanopartikel polimerik (PNPs) yang dikonjugasi Gint4.T dapat dengan mudah diambil oleh sel glioblastoma (GBM). Dalam studi ini, kami melaporkan sistem pengiriman obat baru yang menggabungkan aptamer Gint4.T dan TDN. TDN yang dimodifikasi Gint4.T (Apt-TDN) yang dimuat DOX (DOX@Apt-TDN) menunjukkan penyerapan sel spesifik yang ditingkatkan dan sitotoksisitas terhadap sel U87MG.
Metode
Bahan
Semua oligonukleotida DNA dan oligonukleotida RNA 2’F-Py dibeli dari Sangon Biotech (Shanghai, China), dan semua urutan oligonukleotida dicantumkan dalam Tabel 1. Larutan pewarna gel DNA GelRed dibeli dari Sangon Biotech. Baik serum sapi fetal (FBS) dan medium Eagle modifikasi Dulbecco (DMEM) dibeli dari Thermo Fisher (New York, USA). Doksorubisin (DOX) dibeli dari Mengbio Technology (Chongqing, China). Sel U87MG dibeli dari Perpustakaan Sel Akademi Ilmu Pengetahuan Hayati Shanghai (Shanghai, China). DAPI dibeli dari Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, China).
Persiapan Nanostruktur DNA
Untuk merakit tetrahedron DNA (Tabel 1), 2 μL dari setiap oligonukleotida (S1, S2, S3, dan S4) ditambahkan ke dalam 42 μL buffer TM (10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, pH = 8). Larutan DNA kemudian dipanaskan ke 95 °C selama 5 menit dan kemudian didinginkan ke 4 °C selama 2 menit menggunakan mesin PCR Bio-Rad (California, USA) [26, 27]. Konsentrasi akhir TDN adalah 2 μM. TDN’ disiapkan dengan cara yang sama kecuali S1 diganti dengan S1’. Untuk sintesis Apt-TDN, aptamer Gint4.T ditambahkan ke dalam TDN dengan rasio mol yang sama, dan campuran diinkubasi pada 37 °C selama 60 menit. Sebelum sintesis, aptamer melalui tahap denaturasi-renaturasi singkat (85 °C selama 5 menit, pendinginan cepat selama 2 menit dan kemudian pemanasan ke 37 °C selama 10 menit) [25].
Elektroforesis Gel Agarosa
Gel agarose (3%) dijalankan dalam buffer TEB 0,5× pada 100 V selama 30 menit. Suhu aparatur elektroforesis dipertahankan pada 0 °C dengan menempatkan aparatur dalam mandi es. Sebelum elektroforesis, GelRed ditambahkan ke dalam gel agarose untuk mewarnai rantai DNA. Setelah proses selesai, pemindai fluoresensi Bio-Rad (California, USA) digunakan untuk menangkap gambar gel.
Pencaran Cahaya Dinamis
Malvern Zetasizer ZS90 (Malvern, UK) digunakan untuk mengukur ukuran hidrodinamis dan potensial zeta TDN. Total 1 mL TDN (100 nM) dilakukan analisis pencaran cahaya dinamis (DLS).
Pengiklanan Mikroskop Gaya Atom
TDN dicairkan hingga 100 nM dengan buffer TM (buffer Tris-HCl yang mengandung MgCl2). Kemudian, 10 μL dari setiap sampel TDN ditambahkan ke mica yang baru dibelah dan diinkubasi selama 10 menit. Sampel kemudian difoto pada instrumen mikroskop gaya atom (AFM) dalam mode AC (Agilent 5500, USA).
Pengukuran Kapasitas Muatan Obat dari TDN yang Disiapkan
Doksorubisin dilarutkan dalam air deionisasi untuk membuat larutan penyimpanan 500 μM. Doksorubisin pada konsentrasi yang berbeda (1 hingga 20 μM) dicampur dengan TDN (100 nM) atau Apt-TDN (100 nM) selama 6 jam pada suhu kamar (24–26 °C). Larutan campuran kemudian difusgensi pada 12.000×g selama 10 menit untuk mendapatkan TDN yang dimuat obat. Kemudian, 50 μL dari supernatant diambil dan dicampur dengan PBS pada rasio 1:1. Pembaca mikropiranha Varioskan LUX (California, USA) digunakan untuk mengukur intensitas fluoresensi doksorubisin (λex = 480 nm dan λem = 590 nm) untuk menentukan jumlah doksorubisin dalam supernatant [28]. Konsentrasi doksorubisin yang dimuat dalam TDN dihitung oleh kurva standar dan intensitas fluoresensi. Kami juga mencampur doksorubisin dengan TDN pada rasio mol yang meningkat.
Stabilitas Serum TDN In Vitro
TDN dicampur dengan medium lengkap dan diinkubasi pada 37 °C selama 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, atau 24 jam. Larutan TDN dicampur dengan FBS pada rasio 1:1 dan diinkubasi pada 37 °C selama 1, 3, 5, atau 7 jam. Setelah inkubasi, campuran dijalankan pada gel agarose 3%.
Sitotoksisitas TDN In Vitro
Untuk menentukan sitotoksisitas TDN, sel U87MG pada konsentrasi 1 × 10⁴ sel/well ditanam pada piring 96-lubang. Medium kultur sel dihilangkan, dan media segar yang berisi 0–500 nM TDN ditambahkan dan diinkubasi selama 24 jam dan 48 jam setelah inkubasi semalaman. Kemudian, 10 μL larutan CCK-8 ditambahkan ke setiap lubang, dan campuran diinkubasi selama 1 jam. Serapan pada 450 nm kemudian diukur menggunakan pembaca mikropiranha.
Imaging Fluoresensi
Serapan seluler DOX dan TDN dipelajari dengan mikroskopi fluoresensi (Olympus, Tokyo, Jepang). Sel U87MG ditanam pada selang kaca dalam piring 24-lubang dengan medium yang berisi 10% serum sapi fetal yang dipanaskan dan 1% penicilin dan streptomisin dan ditumbuhkan selama setidaknya 1 hari pada 37 °C dalam atmosfer lembap dengan 5% CO2 hingga sel mencapai setidaknya 75% kerapatan. Setelah inkubasi, media kultur dihilangkan. Media lengkap yang berisi 100 nM Cy3-TDN dan Cy3-Apt-TDN ditambahkan dan diinkubasi selama 3 jam. TDN dan Apt-TDN dilabeli dengan Cy3 untuk mendeteksi serapan seluler nanoparticle. Untuk menilai serapan seluler DOX, DOX (DOX 2 μM), DOX@TDN (DOX 2 μM), dan DOX@Apt-TDN (DOX 2 μM) ditambahkan ke sel U87MG dan diinkubasi selama 3 jam. Setelah 3 jam perawatan, sel difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 20 min dalam gelap dan kemudian diwarnai dengan 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) selama 5 min. Sel dicuci dengan PBS tiga kali dan diamati di bawah mikroskop fluoresensi.
Sitofluometri
Total 1 × 10⁶ sel U87MG ditanamkan ke dalam piring 6-lubang. Setelah inkubasi semalaman, media kultur dihilangkan, dan media yang dilengkapi dengan 100 nM Cy3-TDN, 100 nM Cy3-Apt-TDN, atau 100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 μM Apt bebas ditambahkan dan diinkubasi selama 3 jam. Kemudian, sel difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 20 menit, dan sitofluometri digunakan untuk menganalisis persentase sel positif Cy-3.
Siklus Sel dan Apoptosis
Setelah perawatan dengan DOX, DOX@TDN, atau DOX@Apt-TDN selama 24 jam, 5 × 10⁵ sel dikumpulkan dan difiksasi dalam etanol dingin 75% semalaman. Kemudian, sel diinkubasi dengan RNase dan iodida propidium selama 30 menit pada 37 °C dalam gelap. Siklus sel diteliti dengan sitofluometri. Selain itu, setelah perawatan yang berbeda, sel diwarnai dengan Annexin V-FITC/DAPI, dan apoptosis awal dijelajahi.
Uji CCK-8
Untuk menentukan kelayakan sel, sel U87MG (5 × 10³) ditanam pada piring 96-lubang dengan 100 μL medium dan ditumbuhkan semalaman pada 37 °C dalam atmosfer yang mengandung 5% CO2. Medium kemudian dihilangkan, dan media segar yang berisi DOX, DOX-TDN, atau DOX-Apt-TDN ditambahkan. Setelah 24 jam inkubasi, 10 μL larutan CCK-8 ditambahkan, dan sel ditumbuhkan selama 1 jam lagi. Pembaca mikropiranha digunakan untuk mengukur serapan pada 450 nm.
Analisis Statistik
Semua eksperimen dalam studi ini dilakukan tiga kali, dan semua data disajikan sebagai nilai rata-rata dengan deviasi standarnya (rata-rata ± SD). Analisis statistik dilakukan menggunakan program SPSS 24.0 (IBM, USA). Perbedaan signifikan ditentukan menggunakan uji t Student, dengan P < 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan di antara grup.
Hasil
Sintesis dan Karakterisasi TDN dan Apt-TDN
TDN direkayasa mandiri dari empat oligonukleotida (Tabel 1) melalui sintesis satu langkah seperti yang dilaporkan sebelumnya [18, 29]. Aptamer penargetan tumor Gint4.T digunakan untuk memodifikasi TDN melalui pasangan basis Watson-Crick. Tetrahedron DNA memiliki empat sisi, dengan setiap sisi terbentuk oleh satu oligonukleotida. Dengan demikian, empat oligonukleotida berhibridisasi satu sama lain untuk membentuk tetrahedron DNA (Gambar 1a). Analisis elektroforesis gel menunjukkan satu puncak menonjol pada jalur 4 dan 5, yang menunjukkan bahwa TDN dan Apt-TDN berhasil dibangun. Mobilitas Apt-TDN berkurang dibandingkan dengan TDN, yang menunjukkan bahwa aptamer Gint4.T berhasil memodifikasi TDN.
a Sintesis tetrahedron DNA dan Gint4.T-TDN. Jalur 1: S1; jalur 2: S1+S2; jalur 3: S1+S2+S3; jalur 4: S1+S2+S3+S4 (TDN); jalur 5: TDN dicampur dengan Apt-tail (Gint4.T); Apt-TDN. Jalur 1 tidak terlihat karena pewarna asam nukleat tidak dapat mewarnai DNA satu rantai dengan benar. b Gambar AFM menunjukkan bahwa ketinggian TDN dan Apt-TDN sekitar 2 nm. c Penentuan ukuran partikel dan potensial zeta TDN dan Apt-TDN oleh pencaran cahaya dinamis (DLS). Ukuran partikel rata-rata TDN dan Apt-TDN masing-masing 10,10 nm (A) dan 13,54 nm (B). Potensial zeta rata-rata TDN dan Apt-TDN masing-masing −5,69 mV (C) dan −7,3 mV (D)
Ukuran TDN dan Apt-TDN ditentukan oleh DLS dan AFM. TDN dan Apt-TDN menunjukkan ukuran partikel 10,1 nm dan 13,5 nm, masing-masing, yang mencerminkan penambahan ligan Gint4.T (Gambar 1c (A), (B)). Karena diameter hidrodinamis mencakup molekul air, partikel lebih besar dari ukuran teoritis mereka. Ketinggian baik TDN maupun Apt-TDN yang ditentukan oleh gambar AFM sekitar 2 nm (Gambar 1b), yang menunjukkan bahwa modifikasi aptamer tidak mengubah struktur 3D. Potensial zeta rata-rata TDN dan Apt-TDN masing-masing −5,69 mV (C) dan −7,3 mV (D) (Gambar 1c (C) (D)). Berdasarkan parameter ini, kami menyimpulkan bahwa TDN dan Apt-TDN telah berhasil dirakit.
Stabilitas dan Sitotoksisitas TDN In Vitro
Analisis elektroforesis gel menunjukkan bahwa TDN tetap utuh saat diinkubasi dalam medium lengkap selama 24 jam pada 37 °C (Gambar 2a (A)). Selain itu, ketika konsentrasi serum sapi fetal ditingkatkan menjadi 50%, TDN tetap stabil selama setidaknya 7 jam (Gambar 2a (B)), yang konsisten dengan laporan sebelumnya [18, 26]. Untuk menentukan sitotoksisitas nanostruktur, uji CCK-8 digunakan untuk menilai kelayakan sel U87MG setelah perawatan dengan TDN pada berbagai konsentrasi. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2b, tidak ada sitotoksisitas yang signifikan yang diamati pada sel U87MG yang diobati dengan TDN pada 0–500 nM selama 24 jam dan 48 jam. Oleh karena itu, nanoparticle DNA dapat digunakan sebagai pengiriman obat yang stabil dan biosafe.
a Elektroforesis gel menunjukkan bahwa TDN tetap stabil selama 24 jam dalam medium lengkap pada 37 °C (A); TDN tetap stabil selama 7 jam ketika konsentrasi serum sapi fetal ditingkatkan menjadi 50% (B). b Sel U87MG dikultur bersama dengan TDN pada konsentrasi yang berbeda (10–500 nM) selama 24 jam dan 48 jam. Uji CCK-8 menunjukkan bahwa aktivitas sel U87MG tidak terpengaruh, yang menunjukkan biosafety TDN
Kapasitas Muatan Obat TDN dan Apt-TDN
Doksorubisin adalah obat kemoterapi spektrum luas yang dapat berseliweran ke dalam rantai DNA ganda. Kami menghitung kurva standar doksorubisin (Gambar 3a) dan kemudian menyelidiki berseliwerannya doksorubisin ke dalam TDN. Jumlah doksorubisin yang berseliweran dalam TDN dan Apt-TDN secara bertahap meningkat dengan peningkatan konsentrasi doksorubisin. Ketika konsentrasi doksorubisin 14 μM, jumlah doksorubisin yang berseliweran dalam TDN dan Apt-TDN mencapai puncak masing-masing sebesar 5,5 μM dan 6,0 μM, dan kemudian stagnan (Gambar 3b), yang menunjukkan bahwa rantai DNA sepenuhnya terisi. Sementara itu, kami mencampur doksorubisin dengan TDN pada rasio mol yang meningkat. Spektrum fluoresensi doksorubisin discan untuk analisis. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 3c, spektrum fluoresensi doksorubisin terkuat dengan doksorubisin pada rasio mol 0,05. Berdasarkan temuan ini, kami menyimpulkan bahwa sekitar 55 molekul doksorubisin terkandung dalam satu TDN, sementara 60 molekul terkandung dalam satu Apt-TDN.
a Kurva standar konsentrasi DOX dalam buffer PBS; λex = 480 nm dan λem = 590 nm. Jumlah DOX yang dibawa oleh TDN dan Apt-TDN. b DOX yang berseliweran ke dalam DNA ganda TDN dan Apt-TDN. Ketika konsentrasi DOX mencapai 14 μM dan konsentrasi DOX yang berseliweran dalam TDN dan Apt-TDN mencapai puncak masing-masing sebesar 5,5 μM dan 6,0 μM, satu tetrahedron DNA dapat membawa 55 molekul Dox, sementara satu tetrahedron DNA yang dimodifikasi aptamer membawa 60 molekul DOX. c Spektra fluoresensi DOX dalam supernatant. Doksorubisin dicampur dengan TDN pada rasio mol yang meningkat (0, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, dan 0,05 dari atas ke bawah). Ketika rasio mol 1:20, fluoresensi terkuat
Serapan Seluler yang Ditargetkan dari Apt-TDN
DNA adalah makromolekul yang bermuatan negatif, yang membuat masuknya ke dalam sel membran yang bermuatan negatif sulit. Biasanya, molekul DNA individu harus mengakses sel dengan bantuan reagen transfeksi. Di sini, kami melabeli TDN dan Apt-TDN dengan Cy3 untuk memantau serapan seluler nanoparticle. Setelah diinkubasi dengan sel U87MG selama 3 jam, sinyal fluoresensi merah Cy3 muncul dalam sitoplasma sel, yang menunjukkan bahwa TDN terikat dengan membran sel dan diambil ke dalam sel tanpa bantuan agen transfeksi (Gambar 4a). Apt-TDN menunjukkan fluoresensi merah yang lebih tinggi, yang menunjukkan bahwa kehadiran aptamer Gint4.T secara signifikan meningkatkan penyerapan tetrahedron DNA oleh sel U87MG. Namun, ketika aptamer bebas ditambahkan, fluoresensi Cy3 menurun ke tingkat yang diamati untuk TDN sendiri. Karena inhibisi kompetitif oleh aptamer bebas, kami menyimpulkan bahwa aptamer pada TDN tidak dapat memfasilitasi penyerapan TDN. Berdasarkan inhibisi kompetitif ini, kami membuktikan bahwa Apt-TDN dapat menargetkan sel U87MG. Sitofluometri lebih lanjut membuktikan bahwa persentase sel U87MG positif Cy3 lebih tinggi dalam grup Apt-TDN dibandingkan dengan grup TDN. Apt bebas menurunkan persentase sel U87MG positif Cy3 dalam grup Apt-TDN (Gambar 4b).
a Serapan sel U87MG TDN dan Apt-TDN (TDN-Gint4.T). TDN masuk ke sel U87MG secara langsung tanpa agen transfeksi, dan serapan Apt-TDN (terhubung dengan aptamer Gint4.T) secara signifikan meningkat dan terhambat secara kompetitif oleh Apt bebas (Gint4.T), yang menunjukkan bahwa aptamer Gint4.T memainkan peran yang signifikan dalam penargetan seluler. Skala bar mewakili 50 μm. b Kurva sitofluometri menunjukkan serapan seluler TDN, Apt-TDN, dan Apt-TDN+Apt setelah diinkubasi selama 3 jam
Serapan Seluler DOX@TDN dan DOX@Apt-TDN
Kami menggunakan spektrum fluoresensi khas doksorubisin untuk menilai efisiensi serapan obat. Setelah 3 jam perawatan, doksorubisin seluler diimage dengan mikroskopi fluoresensi (Gambar 5a). Doksorubisin bebas dapat masuk ke sel U87MG dan terletak di inti sel. Dengan penambahan DOX@TDN, fluoresensi lebih tinggi daripada doksorubisin bebas. Hasil ini menyiratkan bahwa nanoparticle DNA meningkatkan penyerapan seluler doksorubisin. Ketika DOX@Apt-TDN ditambahkan, sinyal merah di inti sel bahkan lebih tinggi daripada sel yang diobati dengan DOX@TDN. Analisis semi-kuantitatif serapan seluler DOX lebih lanjut mengonfirmasi bahwa Apt-TDN memfasilitasi peningkatan lebih dari dua kali lipat dalam serapan seluler DOX dibandingkan dengan obat tunggal. Kami menyimpulkan bahwa ini karena Gin4.T secara spesifik terikat reseptor, diikuti oleh lebih banyak nanoparticle yang dapat masuk ke dalam sel. Setelah pencernaan dalam lisosom, doksorubisin dapat dilepaskan ke sitoplasma dan lebih lanjut berfungsi di inti sel.
a Serapan seluler DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN. Dimodifikasi dengan aptamer Gint4.T, Apt-TDN dapat mengirim lebih banyak doksorubisin ke sel U87MG dibandingkan TDN. Selain itu, TDN dapat membawa lebih banyak obat ke sel dibandingkan obat sendiri. Skala bar menunjukkan 50 μm. b Analisis semi-kuantitatif intensitas fluoresensi doksorubisin dengan perawatan PBS, DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN (dibandingkan dengan kosong: *p < 0,05, **p < 0,01)
Sitotoksisitas DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN
Untuk studi sitotoksisitas, tiga grup sel U87MG diobati dengan berbagai konsentrasi doksorubisin (Gambar 6a). Nilai IC50 untuk doksorubisin adalah 13,39 μM untuk perawatan DOX, 7,826 μM untuk perawatan DOX@TDN, dan 4,205 μM untuk perawatan DOX@Apt-TDN. Di antara tiga perawatan, DOX@Apt-TDN menunjukkan sitotoksisitas tertinggi pada 24 jam, yang menunjukkan spesifisitas Apt-TDN untuk sel U87MG. Setelah 24 jam, sel dalam grup DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN dikumpulkan dan digunakan untuk menjelajahi apoptosis awal. Data kami menunjukkan bahwa tingkat apoptosis awal lebih tinggi dalam grup DOX@Apt-TDN dibandingkan dengan dua grup lainnya (Gambar 6b). Selain itu, proporsi sel pada fase G0/G1 meningkat dalam grup DOX-Apt-TDN dibandingkan dengan grup DOX dan DOX-TDN (p < 0,01), dan rasio sel pada fase S menurun dalam grup DOX-Apt-TDN (p < 0,01) (Gambar 6c). Persentase sel pada fase G2 tidak berubah (data tidak ditampilkan).
a Sitotoksisitas DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN pada berbagai konsentrasi. Laju inhibisi sel U87MG secara signifikan meningkat dengan peningkatan konsentrasi DOX, tetapi grup DOX@TDN dan DOX@Apt-TDN menunjukkan sitotoksisitas yang secara signifikan meningkat dibandingkan dengan grup DOX. Laju inhibisi sel grup DOX@Apt-TDN juga secara signifikan lebih tinggi dibandingkan grup DOX@TDN (dibandingkan DOX, **p < 0,05; dibandingkan DOX, ***p < 0,01; dibandingkan DOX@Apt-TDN, #p < 0,05). b Apoptosis sel U87MG setelah diinkubasi dengan PBS, DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN selama 24 jam. c Histogram sitofluometri siklus sel U87MG setelah diinkubasi dengan PBS, DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN selama 24 jam (dibandingkan kontrol, **p < 0,05; dibandingkan kontrol, ***p < 0,01; dibandingkan DOX@Apt-TDN, #p < 0,01)
Pembahasan
Baik melalui eksperimen in vitro maupun in vivo, stabilitas obat dan pengangkutnya harus ditentukan. Setelah rekayasa TDN, stabilitasnya pertama kali ditentukan in vitro. Studi ini menunjukkan bahwa struktur 3D nanoparticle DNA dapat meningkatkan stabilitasnya dalam serum dengan menghambat ikatan enzim. Keamanan biologis nanostruktur yang relevan adalah persyaratan terpenting untuk aplikasinya. Tidak ada sitotoksisitas yang signifikan yang diamati pada sel U87MG yang dikultur bersama dengan berbagai konsentrasi TDN selama 24 jam atau 48 jam. Tidak ada urutan DNA yang digunakan dalam studi ini yang mengenkode informasi genetika, dan tidak ada efek samping yang dilaporkan dalam uji sitotoksisitas. Oleh karena itu, TDN dapat berfungsi sebagai pengiriman obat yang aman dan stabil.
Efisiensi penargetan nanostruktur yang dimodifikasi aptamer sangat penting untuk pengiriman obat yang selektif ke sel kanker. Berbeda dengan antibodi, aptamer secara kimiawi stabil, murah, dan dapat diproduksi massal. Selain itu, berbeda dengan bahan lain, aptamer dapat dengan mudah terikat pada tetrahedron DNA dengan prinsip komplementer basis. Dengan demikian, kombinasi aptamer dan tetrahedron DNA mendasari pengiriman obat yang ditargetkan dan terapi generasi berikutnya. Hasil kami menunjukkan bahwa TDN dapat masuk ke dalam sel tanpa agen transfeksi, yang serupa dengan hasil Walsh et al. dan Ma et al. [15, 19]. Dibandingkan dengan TDN, penyerapan Apt-TDN oleh sel U87MG secara signifikan meningkat. Setelah penambahan aptamer bebas, peningkatan ini menghilang. Hasil ini menyiratkan bahwa Gint4.T adalah antagonis spesifik PDGFRβ [25]. Studi kami menunjukkan bahwa aptamer Gint4.T dapat menargetkan sel U87MG karena ekspresi tinggi PDGGRβ pada permukaan sel glioma. Camorani et al. [24] juga menunjukkan bahwa aptamer Gint4.T dapat menargetkan sel tumor dengan secara spesifik berinteraksi dengan domain ekstraseluler PDGFRβ. Keuntungan penargetan aptamer Gint4.T telah terbuktilah hingga beberapa tingkat melalui studi in vitro, tetapi pengujian in vivo lebih lanjut diperlukan untuk mengonfirmasi temuan ini. Studi ini juga mengonfirmasi bahwa DOX@Apt-TDN lebih sitotoksik dibandingkan DOX atau DOX@TDN, yang mungkin berasal dari dua faktor. Pertama, aptamer Gint4.T dapat secara spesifik terikat domain ekstraseluler PDGFR, memblokir proliferasi sel tumor dan menghambat pertumbuhan sel tumor [24]. Ini konsisten dengan hasil eksperimen kami. Dibandingkan dengan grup kontrol, perubahan siklus sel U87MG setelah perawatan dengan DOX, DOX@TDN, dan DOX@Apt-TDN meningkat secara signifikan pada sel tumor fase G0/G1, menurun pada sel fase S, dan memblokir sel tumor pada fase G0/G1, yang menunjukkan bahwa mereka dapat menghambat siklus sel U87MG dan menghambat proliferasinya. Dibandingkan dengan grup DOX dan DOX@TDN, grup DOX@Apt-TDN memiliki kemampuan yang jauh lebih kuat untuk menghambat proliferasi sel U87MG. Selain itu, Gint4.T secara spesifik terikat sel tumor dan meningkatkan penargetan sel dari kompleks DOX@Apt-TDN. Dengan demikian, kita dapat meningkatkan efisiensi penargetan obat dan mengurangi dosis administrasi sistemik obat anti-tumor untuk mencegah efek samping sistemiknya.
Kesimpulan
Modifikasi dengan Gint4.T meningkatkan spesifisitas dan efisiensi TDN dalam terapi glioma dengan menargetkan PDGFRβ yang diekspresikan dalam jumlah besar pada sel glioma. Selain itu, ketika dimuat dengan Apt-TDN, ini dapat secara signifikan mempromosikan efek anti-glioma DOX. Oleh karena itu, DOX@Apt-TDN dapat berfungsi sebagai strategi terapi yang menjanjikan terhadap glioma bagi pasien. Kelemahan studi ini adalah hanya telah divalidasi in vitro. Dalam studi selanjutnya, kami akan lebih menjelajahi dalam model hewan.
Ketersediaan Data dan Bahan
Data yang relevan termasuk dalam artikel.
Singkatan
BBB:
Barrier Otak-Otak
BTB:
Barrier Otak-Tumor
TDN:
Nanostruktur DNA Tetrahedral/Tetrahedron DNA
DOX:
Doksorubisin
PDGFRβ:
Reseptor Faktor Pertumbuhan Trombosit β
Apt-TDN:
TDN yang Dimodifikasi Gint4.T
DOX@ TDN:
TDN yang Dimuat DOX
DOX@Apt-TDN:
TDN yang Dimodifikasi Gint4.T dan Dimuat DOX
CNS:
Sistem Saraf Pusat
ANG:
Angiopep-2
LRP-1:
Reseptor Terkait Protein Lipoprotein Densitas Rendah 1
