Nanokomposit Berbasis Grafena Oksida Dihiasi dengan Nanopartikel Perak sebagai Agen Antibakteri
Abstrak
Salah satu metode yang paling menjanjikan untuk melawan bakteri yang resistan terhadap obat adalah material yang dimodifikasi permukaannya dengan nanopartikel biosidal dan nanokomposit. Di sini, kami menyajikan nanokomposit dengan nanopartikel perak (Ag-NPs) pada permukaan graphene oxide (GO) sebagai bahan antibakteri dan antijamur multifungsi baru. Teknologi ultrasonik telah digunakan sebagai metode yang efektif untuk melapisi foil poliuretan. Toksisitas pada bakteri gram negatif (Escherichia coli ), bakteri gram positif (Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis ), dan ragi patogen (Candida albicans ) dievaluasi dengan analisis morfologi sel, penilaian viabilitas sel menggunakan uji PrestoBlue, analisis integritas membran sel menggunakan uji laktat dehidrogenase, dan produksi spesies oksigen reaktif. Dibandingkan dengan Ag-NP dan GO, yang telah banyak digunakan sebagai agen antibakteri, nanokomposit kami menunjukkan efisiensi antimikroba yang jauh lebih tinggi terhadap bakteri dan sel ragi.
Latar Belakang
Perkembangan antibiotik telah memainkan peran penting dalam mengendalikan jumlah infeksi bakteri. Namun, penggunaan yang tidak tepat dan penggunaan antibiotik yang berlebihan telah menyebabkan perkembangan resistensi multidrug pada banyak spesies bakteri. Beberapa strain telah menjadi resisten terhadap hampir semua agen yang tersedia secara umum:beta-laktam, tetrasiklin, dan aminoglikosida [1]. Patogen resisten utama adalah resisten methicillin Staphylococcus aureus , tahan vankomisin Enterococcus , dan penghasil -laktamase spektrum luas Klebsiella pneumoniae dan Escherichia coli [2, 3]. Bakteri, dengan populasi yang sangat besar dan waktu proliferasi yang cepat, mampu dengan cepat mengembangkan mekanisme resistensi antibiotik ketika sebagian dari populasi bakteri bertahan dari pengobatan antibiotik. Selain itu, bakteri resisten antibiotik mampu mentransfer salinan DNA yang mengkode mekanisme resistensi terhadap bakteri lain yang berkerabat jauh, yang kemudian mampu mewariskan gen resistensi ke generasi berikutnya. Dengan demikian, munculnya bakteri resisten antibiotik merupakan masalah serius yang dapat diatasi dengan pengembangan agen antimikroba baru. Agen antibakteri sangat penting dalam industri tekstil, desinfeksi air, obat-obatan, dan kemasan makanan. Nanopartikel dan nanomaterial dapat digunakan sebagai alternatif antibiotik [4]. Mekanisme aktivitas antibakteri nanopartikel bervariasi di antara berbagai jenis nanopartikel. Sementara beberapa mekanisme yang diusulkan berhubungan dengan struktur fisiokimia nanopartikel, yang lain berhubungan dengan peningkatan pelepasan ion antibakteri dari permukaan nanopartikel. Beberapa mekanisme aksi simultan terhadap mikroba akan membutuhkan berbagai mutasi DNA sinkron dalam sel mikroba yang sama untuk pengembangan resistensi; oleh karena itu, sulit bagi sel bakteri untuk menjadi resisten terhadap nanopartikel dan material nano. Nanomaterial antimikroba, seperti perak, tembaga, fullerene, dan nanotube karbon berdinding tunggal, dapat menawarkan beberapa keuntungan karena sifat fisikokimia yang unik dan luas permukaan yang tinggi [5,6,7,8]. Mekanisme pasti toksisitas nanopartikel (NP) terhadap berbagai bakteri tidak sepenuhnya dipahami. Menurut penelitian saat ini, proses utama yang mendasari efek antibakteri NP adalah gangguan membran sel bakteri, pelepasan ion logam, pembentukan ROS, penetrasi membran sel bakteri, dan induksi efek antibakteri intraseluler, termasuk interaksi dengan DNA dan protein [9, 10]. NP mampu menempel pada membran bakteri melalui interaksi elektrostatik dan mengganggu integritas membran bakteri. Muatan positif dari permukaan NP sangat penting untuk adhesi. Muatan positif memungkinkan penambahan elektrostatik antara NP dan membran sel mikroorganisme yang bermuatan negatif [11]. Hubungan elektrostatik antara NP dengan protein yang mengandung sulfur yang ada pada permukaan sel bakteri menyebabkan perubahan ireversibel pada struktur dinding sel yang mengakibatkan kerusakan dinding sel dan membran [12]. Membran bakteri sangat penting, terlepas dari status metabolisme sel, karena menyediakan permeabilitas selektif untuk homeostasis seluler dan transduksi energi metabolik. Aktivitas antibakteri dan antijamur kedua dari NP adalah karena kemampuannya menghasilkan ROS dan spesies radikal bebas [13]. Peningkatan kadar ROS menginduksi hiperoksidasi lipid, protein, dan DNA [14].
Selain itu, struktur banyak jenis NP cocok untuk membawa agen antimikroba [15, 16]. Pembawa dapat membantu melindungi obat dari resistensi oleh bakteri target. Sistem penghantaran obat berbasis nanopartikel dapat membantu menargetkan antibiotik ke tempat infeksi dan dengan demikian meminimalkan efek samping sistemik. Keuntungan lain termasuk peningkatan kelarutan obat hidrofobik, perpanjangan waktu sirkulasi sistemik dan waktu paruh obat, dan pelepasan obat berkelanjutan [4].
Baru-baru ini, telah ditunjukkan bahwa graphene, alotrop karbon baru, memiliki aktivitas antibakteri. Grafena adalah bahan yang terbuat dari atom karbon yang terikat bersama dalam pola segi enam yang berulang. Fitur unik dari serpihan graphene adalah rasio ketebalannya terhadap permukaan. Permukaan graphene ditutupi dengan awan elektron, yang mungkin membuat bahan ini menjadi donor elektron dan memberinya kemampuan untuk membuat ikatan khusus. Tepi graphene memiliki ikatan lain (karakteristik untuk ikatan jenis intan sp3), dan tempat-tempat ini mungkin memiliki karakteristik fisikokimia yang berbeda [17]. Karakteristik ini menunjukkan bahwa graphene dapat terkena adhesi plastik ke struktur antar sel yang berbeda, termasuk sel bakteri [18,19,20]. Selain itu, karena memiliki dua sisi aktif (permukaan dan tepi), graphene dapat menempelkan molekul biologis pada tepinya dan menempel pada permukaan sel. Bentuk teroksidasi dari graphene, graphene oxide (GO), mudah terdispersi dalam air dan pelarut organik lainnya karena adanya fungsi oksigen. Gugus teroksigenasi memungkinkan fungsionalisasi kimia langsung dari lembar GO melalui interaksi kovalen dan non-kovalen. Aktivitas antibakteri yang kuat dari GO telah dilaporkan. Aktivitas antibakteri GO telah ditetapkan untuk stres membran yang disebabkan oleh tepi tajam nanosheet graphene oxide, yang dapat mengakibatkan kerusakan fisik pada membran sel, yang menyebabkan hilangnya integritas membran bakteri [21]. Baru-baru ini, nanopartikel antimikroba yang difungsikan dengan graphene telah digunakan sebagai bahan antibakteri yang menjanjikan [22, 23]. Nanokomposit dapat mengatasi keterbatasan komponen individu. Misalnya, nanomaterial antibakteri yang menempel pada substrat graphene lebih stabil dan terdispersi dengan baik [24]. Nanokomposit ini dapat mengandung logam, oksida logam, dan polimer.
Salah satu metode yang paling menjanjikan untuk melawan bakteri yang resistan terhadap obat adalah material yang dimodifikasi permukaannya dengan nanopartikel biosidal. Teknologi ultrasonik telah dikonfirmasi sebagai metode yang efektif untuk melapisi berbagai bahan dengan zat antibakteri dan fungisida [25,26,27,28]. Banyak peneliti mengklasifikasikan metode ultrasound sebagai "teknologi hijau" [29, 30]. Metode ini didasarkan pada penggunaan fenomena kavitasi, yaitu pembentukan, pertumbuhan, dan runtuhnya gelembung kavitasi dalam media cair [31, 32]. Gelembung yang meledak menghasilkan energi dalam jumlah besar di wilayah mikro hingga 5000 K dan tekanan hingga 2000 atm dalam waktu singkat [33, 34]. Akibatnya, gelombang kejut dan apa yang disebut microjet diarahkan ke permukaan padat yang dihasilkan [35]. Terletak di media cair, NP didorong oleh efek ledakan dan aliran jet dengan kecepatan tinggi (> 100 m/s) pada permukaan padat dan membentuk lapisan [36]. Kavitasi akustik juga dapat menyebabkan perubahan sifat fisik objek yang disonikasi, misalnya, mengubah ukuran serpihan GO [37, 38].
Kami mencapai hasil yang menjanjikan dalam penelitian kami sebelumnya dengan Salmonella enterica dan Listeria monocytogenes diobati dengan graphene murni, GO, dan pengurangan GO [20]. Dari berbagai jenis graphene, GO juga ditemukan memiliki aktivitas antibakteri tertinggi pada konsentrasi rendah. Sel bakteri didistribusikan ke seluruh permukaan GO. Dalam penelitian ini, kami berhipotesis bahwa GO yang didekorasi dengan nanopartikel perak (GO-Ag) akan memiliki pengaruh toksik yang lebih kuat pada sel mikroba daripada GO yang telanjang atau nanopartikel perak (Ag-NPs). Karena memiliki dua sisi aktif (permukaan dan tepi), oksida GO dapat menempelkan Ag-NP ke tepi dan menempel pada permukaan sel. Aktivitas antibakteri nanokomposit berbasis graphene mungkin karena gangguan membran sel dan stres oksidatif. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi aktivitas antimikroba nanokomposit berbasis GO yang didekorasi dengan Ag-NPs dibandingkan dengan GO dan Ag-NPs telanjang menggunakan bakteri gram negatif (Escherichia coli ), bakteri gram positif (Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis ), dan ragi patogen (Candida albicans ) menggunakan model in vitro. Penyelidikan terdiri dari analisis struktur nanokomposit menggunakan difraksi sinar-X, transmisi spektroskopi Raman, FT-IR, mikroskop elektron (TEM), mikroskop elektron pemindaian (SEM) dan mikroskop gaya atom (AFM), evaluasi morfologi sel mikroba, penilaian viabilitas sel dengan uji PrestoBlue™, penyelidikan integritas membran sel dengan uji laktat dehidrogenase (LDH), dan penilaian produksi spesies oksigen reaktif (ROS).
Metode
Sintesis, Modifikasi, dan Karakterisasi Grafena Oksida
Dalam penelitian ini, bubuk grafit yang tersedia secara komersial (Acros Organics, New Jersey, USA) dioksidasi dengan metode Hummers yang dimodifikasi [39]. Sepuluh gram bubuk grafit dicampur dengan 230 mL asam sulfat pekat (98%) di bawah 10 °C. Kemudian, 4,7 g natrium nitrat dan 30 g kalium permanganat ditambahkan secara bertahap ke dalam campuran asam sulfat dan grafit sambil mempertahankan suhu di bawah 10 °C. Kemudian, campuran dipanaskan hingga suhu 30 °C dan diaduk selama 2 jam. Pada langkah berikutnya, 100 mL air ditambahkan, dan suhu campuran mencapai ~ 100 °C. Akhirnya, campuran diperlakukan dengan 10 mL hidrogen peroksida. Untuk pemurnian, bubur disaring dan dicuci dengan air deionisasi sampai pH filtrat mencapai 6,5.
Pola difraksi sinar-X GO dikumpulkan pada suhu kamar dalam kisaran 2 sudut teta dari 10° hingga 100° dengan langkah 0,02° menggunakan difraktometer serbuk sinar-X (CuKα1 ) (X’Pert PRO, PANalytical, Almelo, Belanda).
Analisis kandungan karbon, hidrogen, nitrogen, dan sulfur menurut beratnya dalam GO dilakukan dengan menggunakan alat Vario EL III yang diproduksi oleh Elementar Analysensysteme GmbH (Langenselbold, Jerman). Sebelum melakukan pengukuran analisis kimia GO, sampel mengalami desorpsi 24 jam di stasiun desorpsi (VcPrep 061, Micromeritics, Norcross, GA, USA) di bawah vakum (0,05 mbar) pada 50 °C. Kandungan oksigen dihitung dengan mengurangkan kandungan karbon, hidrogen, nitrogen, dan belerang yang ditentukan dari berat 100%.
Spektroskopi Raman dilakukan menggunakan mikroskop Raman inVia (Renishaw, UK). Grafena oksida dianalisis dengan panjang gelombang laser 514-nm dengan 5% dari kekuatan awalnya. Spektrum dikumpulkan dari lima titik yang berbeda pada sampel. Waktu pemaparan adalah 10 s dan dua pemindaian dikumpulkan.
Pengukuran FT-IR dilakukan menggunakan spektrometer Nicolet iS10 (Thermo Fisher Scientific, USA) dalam mode reflektansi total yang dilemahkan pada kristal berlian. Lima mikroliter suspensi air grafena oksida diteteskan pada permukaan kristal berlian dan dibiarkan kering. Setelah dikeringkan, spektrum dikumpulkan pada kisaran 400–4000 cm
−1
.
Ukuran partikel rata-rata dan pengukuran potensial zeta dilakukan menggunakan Zetasizer Nano-ZS ZEN 3600 yang diproduksi oleh Malvern Instruments Ltd. (Malvern, UK) masing-masing menggunakan mode hamburan cahaya dinamis (DLS) dan elektroforesis laser Doppler, pada suhu kamar (23 ° C).
Analisis TEM/SEM/AFM Bahan Nano
Morfologi serbuk dan foil ditentukan menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM; JEM-1220 JEOL, Tokyo, Jepang, tegangan percepatan 80 kV) dan mikroskop elektron pemindaian (SEM; Zeiss, Ultra Plus, Oberkochen, Jerman). Sampel untuk pengamatan TEM disiapkan dengan menempatkan tetesan hidrokoloid ke grid TEM (Formvar pada 3 mm 200 Mesh Cu Grids, Agar Scientific, Stansted, UK). Segera setelah mengeringkan tetesan, kisi-kisi dimasukkan ke dalam mikroskop.
Untuk analisis SEM, sampel dilapisi dengan lapisan karbon tipis menggunakan sputter coater (SCD 005/CEA 035, BAL-TEC, Pfäffikon, Swiss). Prosedur pengukuran laboratorium internal diterapkan (P5.10, edisi 6 26.08.2015).
Pencitraan AFM (atomic force microscopy) dilakukan menggunakan perangkat lunak Asylum Research MFP3D Bio (versi:Asylum Research MFP3D 15.106.09). Pencitraan topografi permukaan dan deteksi GO pada permukaan foil yang diuji dilakukan menggunakan dua mode pencitraan, mode AC untuk pencitraan kontras fase dan mikroskop gaya lateral (LFM) untuk deteksi GO karena GO mengurangi gaya gesekan [40].
Persiapan Foil Poliuretan Dilapisi GO dan Ag-NP
Untuk menutupi foil poliuretan, suspensi Ag-NP (HydroSilver1000, Amepox, ódź, Polandia) dan GO digunakan. Suspensi GO, Ag-NPs, dan GO-Ag (GO (200 μg/mL), Ag-NPs (100 μg/mL), GO (200 μg/mL) + Ag-NPs (100 μg/mL)) disiapkan dalam air deionisasi (konduktansi 0,09 μS/cm, deionizer:HLP 20UV, Hydrolab, Staszyn, Polandia). Suspensi digunakan tanpa pemurnian dan penyaringan tambahan.
Pelapisan ultrasonik foil poliuretan (15 × 15 × 0,05 mm) dilakukan dalam labu kaca dengan volume 50 ml. Sampel foil diikat pada stand (Teflon) dan selanjutnya direndam dalam suspensi yang telah disiapkan. Proses pelapisan dilakukan menggunakan tanduk ultrasonik (klakson Ti, 13 mm, efisiensi 60%, 20 kHz, Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, USA) ditempatkan persegi pada sampel foil yang ada dalam suspensi. Suhu proses adalah 30 ± 1 °C. Sampel tertutup disiram dalam air deionisasi dan dikeringkan dalam ruang laminar dan kemudian dikemas dalam paket steril.
Energi Bebas Permukaan
Uji keterbasahan dilakukan dengan menggunakan Data Physics OCA – 20 goniometer (DataPhysics Instruments GmbH, Filderstadt, Jerman). Energi bebas permukaan (SFE) dihitung menggunakan metode Owens, Wendt, Rabel, dan Kaelble (OWRK) menggunakan dua cairan uji:air deionisasi dan diiodometana [41].
Pembudidayaan dan Persiapan Bakteri dan Ragi
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) dan Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990), Escherichia coli (ATCC 25922), dan Candida albicans (90028) diperoleh dari LGC Standards (Lomianki, Polandia). Strain disimpan sebagai suspensi spora dalam 20% (v /v ) gliserol pada 20 °C. Sebelum digunakan dalam percobaan, strain dicairkan dan gliserol dihilangkan dengan mencuci sel bakteri dengan air suling. Bakteri dan ragi kemudian ditumbuhkan pada media nutrisi berikut:agar kedelai tryptic untuk S . aureus dan E . koli , agar jantung otak untuk S . epidermidis , dan agar Sabouraud untuk C . Albicans (Merck Millipore, Darmstadt, Jerman). Bakteri dan ragi yang tumbuh di piring agar dipanen dengan mencuci piring dengan larutan garam suling steril. Untuk menghitung jumlah bakteri dalam suspensi sel, kerapatan optik suspensi pada 600 nm (OD600 ) diukur menggunakan spektrofotometer (Helios Epsilon, Unicam, Milwaukee, WI, USA). Kurva kalibrasi untuk masing-masing mikroorganisme disiapkan dengan melakukan pengenceran sepuluh kali lipat (hingga 10
− 5
) dari suspensi bakteri dan ragi dengan kepadatan optik yang diketahui. Masing-masing pengenceran ditebarkan satu mililiter pada cawan petri yang berisi media nutrisi. Setelah 24 jam inkubasi pada 37°C, jumlah koloni yang terbentuk pada cawan petri dihitung. Berdasarkan hasil pencacahan (dilakukan dalam rangkap tiga), dihitung kepadatan suspensi bakteri asli dalam unit pembentuk koloni (CFU)/mL.
Pengujian Antimikroba
Inokulum untuk uji antibakteri dibuat dari organisme yang tumbuh aktif (fase logaritmik). Inokulum semua mikroorganisme dibuat dari kultur semalam yang ditumbuhkan secara aerobik dalam kaldu Mueller-Hinton (MH) pada suhu 37°C. Konsentrasi bakteri dan ragi ditentukan dengan mengukur kepadatan optik pada 600 nm (OD600 ). Secara singkat, suspensi bakteri dan ragi dibuat dari biakan semalaman dan disesuaikan dengan 10
6
CFU/ml. Inokulum diinokulasikan secara merata pada permukaan agar MH dalam cawan petri dengan cara di usap. Foil steril yang dilapisi dengan GO, Ag-NPs, dan GO-Ag diendapkan ke permukaan agar. Foil tanpa nanopartikel digunakan sebagai kelompok kontrol. Pertumbuhan bakteri dan ragi di bawah foil diukur setelah 24 jam inkubasi pada 37°C.
Pengujian Viabilitas
Viabilitas sel dievaluasi menggunakan PrestoBlue™ Cell Viability Assay (Life Technologies, Taastrup, Denmark). Reagen PrestoBlue™ dengan cepat direduksi oleh sel yang aktif secara metabolik, memberikan ukuran kuantitatif viabilitas dan sitotoksisitas. Sel bakteri dan ragi dibiakkan pada foil yang dilapisi dengan GO, Ag-NPs, dan GO-Ag yang terletak pada sisipan yang dimasukkan ke dalam pelat 6-sumur (200 μL kaldu MH dengan 5 × 10
3
sel per foil) dan diinkubasi selama 24 jam. Pada langkah berikutnya, 90 μL dari setiap sampel dipindahkan ke pelat 96-sumur dan 10 μL reagen PrestoBlue™ ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 2 jam tambahan pada 37 °C. Kepadatan optik setiap sumur dicatat pada 570 nm pada pembaca enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA). Viabilitas sel dinyatakan sebagai persentase (ODtes ODkosong )/(ODkontrol ODkosong )×100%, di mana ODpengujian adalah kepadatan optik sel yang terpapar foil yang diuji, ODkontrol adalah kerapatan optik sampel kontrol, dan ODkosong adalah kepadatan optik sumur tanpa sel bakteri dan ragi.
Integritas Membran
Tes LDH (In Vitro Toxicology Assay Kit, berbasis dehidrogenase laktat, Sigma-Aldrich, Hamburg, Jerman) digunakan untuk mengevaluasi integritas membran sel. NAD tereduksi yang dihasilkan (NADH
+
) digunakan dalam konversi stoikiometri dari pewarna tetrazolium. Ketika alikuot bebas sel dari media dari kultur diuji, jumlah aktivitas LDH dapat digunakan sebagai indikator integritas membran. Jika membran rusak, molekul LDH intraseluler dilepaskan ke dalam media kultur. Sel bakteri dan ragi dikultur pada foil (GO, Ag-NPs, dan GO-Ag) yang terletak pada sisipan yang dimasukkan ke dalam pelat 6-sumur (200 μL MH kaldu dengan 5 × 10
3
sel per foil) dan diinkubasi selama 24 jam. Sel yang dikultur pada foil tanpa nanopartikel digunakan sebagai kontrol. Setelah waktu ini, sampel dipindahkan ke tabung mikrosentrifugasi dan disentrifugasi pada 1200 rpm selama 5 menit. Seratus mikroliter supernatan dipindahkan ke pelat 96 sumur, dan 100 L campuran uji LDH ditambahkan ke setiap sumur. Pelat ditutup dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Kepadatan optik setiap sumur direkam pada 450 nm pada pembaca ELISA (Infinite M200, Tecan, Männedorf, Swiss). Kebocoran LDH dinyatakan sebagai persentase {(ODtes ODkosong ) − (ODkontrol ODkosong )/(ODkontrol ODkosong )}×100%, di mana ODpengujian adalah kepadatan optik sel yang terpapar foil yang diuji, ODkontrol adalah kerapatan optik sampel kontrol, dan ODkosong adalah kerapatan optik sumur tanpa sel.
Analisis SEM Mikroorganisme
Sebelum analisis SEM, sampel bakteri dan ragi yang diinkubasi pada foil dengan GO-Ag dan bakteri yang tidak diberi perlakuan disiapkan. Secara singkat, setetes kultur bakteri dan ragi (10
6
CFU/ml) diinkubasi pada foil dengan nanokomposit GO-Ag, atau bakteri yang tidak diberi perlakuan diendapkan pada permukaan kaca penutup steril dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C di dalam cawan petri kosong. Semua sampel dikeringkan dan ditutup dengan emas. Terakhir, sampel dicitrakan dengan SEM (FEI Quanta 200, Tokyo, Jepang) pada tegangan akselerasi 15 kV.
Produksi ROS
Produksi ROS dievaluasi menggunakan DCFDA, Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK). DCFDA menggunakan reagen permeant sel 2′,7′–dichlorofluorescein diacetate, pewarna fluorogenik yang mengukur hidroksil, peroksil, dan aktivitas ROS lainnya di dalam sel. Setelah difusi ke dalam sel, DCFDA dideasetilasi oleh esterase seluler menjadi senyawa non-fluoresen, yang kemudian dioksidasi oleh ROS menjadi 2′,7′–dichlorofluorescein (DCF). Sel bakteri dan ragi dikultur pada foil (GO, Ag-NPs, dan GO-Ag) yang terletak pada sisipan yang dimasukkan ke dalam pelat 6-sumur (200 μL MH kaldu dengan 5 × 10
3
sel per foil) dan diinkubasi selama 24 jam. Sel yang dikultur pada foil tanpa nanopartikel digunakan sebagai kontrol. Setelah waktu ini, sampel dipindahkan ke tabung mikrosentrifugasi dan disentrifugasi pada 1200 rpm selama 5 menit. Seratus mikroliter supernatan dipindahkan ke pelat 96 sumur, dan 100 L DCFDA encer ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 45 menit pada 37 °C dalam gelap. Produksi DCF diukur dengan spektroskopi fluoresensi dengan panjang gelombang eksitasi pada 485 nm dan panjang gelombang emisi pada 535 nm pada pembaca ELISA (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA).
Hasil
Karakteristik GO dan Ag-NP
Analisis kimia mengungkapkan adanya nitrogen, karbon, belerang, hidrogen, dan oksigen (Tabel 1).
Analisis fase sampel GO (Gbr. 1) mengungkapkan adanya pengotor yang berasal dari sejumlah kecil grafit, natrium nitrat, dan mungkin bentuk tereduksi dari grafena oksida.
Pola difraksi sinar-X dari bubuk GO. Analisis fase sampel GO mengungkapkan adanya pengotor yang berasal dari sejumlah kecil grafit, natrium nitrat, dan mungkin bentuk tereduksi dari grafena oksida
Spektroskopi Raman dapat memberikan informasi tentang fitur struktural oksida graphene. Pita D dikaitkan dengan kelainan struktural, sedangkan pita G berasal dari regangan ikatan karbon sp
2
atom [42]. Pita tambahan (termasuk D′, 2D, dan D + G) muncul dari cacat yang ada pada struktur grafit bahan karbon. AkuD /AkuG rasio (dihitung dari intensitas pita D dan G) dapat digunakan untuk mengkarakterisasi ketidakteraturan struktur grafit dalam bahan karbon. Seperti dapat dilihat pada Gambar. 2, GO memiliki struktur yang sangat tidak teratur karena banyak gugus fungsi dalam struktur yang terbentuk selama oksidasi bubuk grafit. Posisi pita D adalah 1351 cm
−1
dan pita G 1590 cm
−1
; AkuD /AkuG rasionya adalah 1,15.
Spektrum Raman dari grafena oksida dengan dekonvolusi yang diusulkan dari pita D, G, D′, 2D, dan D + G. GO memiliki struktur yang sangat tidak teratur karena banyak gugus fungsi dalam struktur yang terbentuk selama oksidasi bubuk grafit. Posisi pita D adalah 1351 cm
−1
dan pita G 1590 cm
−1
; AkuD /AkuG rasionya adalah 1,15
Spektrum FT-IR dari graphene oxide yang dikumpulkan dalam mode ATR mengungkapkan bahwa GO memiliki banyak gugus fungsi yang ada dalam struktur. Puncak yang paling menonjol dapat diamati pada ~ 3500 cm
−1
, yang ditetapkan terutama untuk air dan gugus hidroksil (Gbr. 3). Puncak yang sangat intensif sekitar 1080 cm
−1
juga dapat dikaitkan dengan gugus hidroksil. Puncaknya sekitar 1600 cm
−1
biasanya diberikan pada ikatan C=C yang ada dalam karbon grafit. Namun, studi XPS kami sebelumnya menunjukkan bahwa ada beberapa ikatan C=C dalam grafena oksida [43]; karenanya, kami menghubungkan puncak ini dengan sebagian besar air yang masih ada dalam oksida graphene. Puncak lain yang diamati pada spektrum FT-IR menunjukkan bahwa GO kaya akan gugus yang mengandung ikatan C=O (terutama gugus karboksil), puncaknya sekitar 1720 cm
−1
, epoksi (C–O–C) dengan puncak yang terlihat sekitar 1200 cm
−1
, dan ikatan C–H (puncaknya sekitar 2800 cm
−1
). Analisis FT-IR sesuai dengan pengukuran XPS yang dilakukan untuk graphene oxide dimana juga hidroksil, karboksil, epoksi, dan gugus karbonil diidentifikasi [44]. GO dan GO setelah homogenisasi ultrasonik 10 menit dibandingkan (Gbr. 4 dan 5), dan demikian pula, Ag-NP dengan Ag-NP setelah homogenisasi ultrasonik 10 menit (Gbr. 4 dan 6) dibandingkan. Untuk menghindari perubahan morfologi senyawa, semua senyawa didinginkan dengan cepat dengan nitrogen cair dan dikeringkan dalam lyophilizer. Gambar 5a, b menunjukkan serpihan GO, sedangkan Gambar 5c, d menunjukkan efek ultrasound pada serpihan GO, yang mengalami pelipatan dan fragmentasi parsial. Gambar 6 juga menunjukkan efek serupa untuk Ag-NP, di mana perubahan morfologi material terlihat. Gambar 6a, b menampilkan poli(vinil alkohol) kering, yang digunakan untuk menstabilkan suspensi air Ag-NP. Efek destruktif dari homogenisasi ultrasonik terlihat jelas karena struktur polivinil alkohol dipecah menjadi bagian-bagian panjang yang heterogen dengan bukaan bulat kecil (Gbr. 6c, d).
Spektrum FT-IR (ATR, attenuated total reflectance) dari graphene oxide dengan penugasan yang diusulkan dari gugus fungsi yang ada di GO. Puncak yang paling menonjol diamati pada ~ 3500 cm
−1
, (dikaitkan dengan air dan gugus hidroksil), ~ 1080 cm
−1
(gugus hidroksil), ~ 1600 cm
−1
(ditugaskan ke ikatan C=C yang ada dalam karbon grafit). Puncak lain yang diamati pada spektrum FT-IR menunjukkan bahwa GO kaya akan gugus yang mengandung C=O (terutama gugus karboksil), puncaknya sekitar 1720 cm
−1
, epoksi (C–O–C) dengan puncak yang terlihat sekitar 1200 cm
−1
, dan ikatan C–H (puncaknya sekitar 2800 cm
−1
)
Gambar TEM dari serpihan GO yang diaglomerasi (a ), serpihan GO setelah perawatan ultrasonik (b ), Ag-NP yang diaglomerasi (c ), Ag-NP setelah perawatan ultrasonik (d ), dan GO-Ag (e , f ). Penurunan ukuran partikel GO rata-rata setelah perlakuan ultrasonik disebabkan oleh defragmentasi atau pelipatan serpihan GO. Penurunan ukuran Ag rata-rata setelah perlakuan ultrasonik disebabkan oleh defragmentasi aglomerat Ag. Catatan:Panah menunjuk ke Ag-NPs/agglomerates
Perbandingan morfologi serpihan GO yang diliofilisasi (a , b ) dan serpihan GO setelah perawatan ultrasonik (c , d ) menggunakan pemindaian mikroskop elektron. Penurunan ukuran partikel GO rata-rata setelah perlakuan ultrasonik disebabkan oleh defragmentasi atau pelipatan serpihan GO
Perbandingan morfologi campuran Ag-NP terliofilisasi (a , b ) dan campuran Ag-NP setelah perlakuan ultrasonik (c , d ) menggunakan pemindaian mikroskop elektron
Ukuran Rata-rata dan Potensi Zeta
Hasil rata-rata ukuran partikel/aglomerat dalam suspensi air disajikan pada Tabel 2. Analisis ukuran rata-rata dilakukan untuk suspensi pekat yang tidak dikenai homogenisasi ultrasonik (seperti yang diterima) dan untuk suspensi encer. Suspensi yang diencerkan sebelum pengujian dikenai homogenisasi ultrasonik, dengan parameter homogenisasi identik dengan yang digunakan selama pelapisan ultrasonik foil dengan lapisan nanomaterial (Ag-NPs, GO). Untuk suspensi Ag-NP, tindakan ultrasound menyebabkan peningkatan ukuran partikel rata-rata dari 80 menjadi 218 nm. Penyebab utama peningkatan ukuran partikel rata-rata setelah homogenisasi ultrasonik dalam suspensi (selain dari proses aglomerasi Ag-NP) adalah bahwa Ag-NP didorong ke dalam poli(vinil alkohol) yang digunakan untuk stabilisasi suspensi. The large standard deviation of the Ag-NP sample homogenized by ultrasound resulted from the presence of both loose Ag-NPs and Ag-NPs driven into the poly(vinyl alcohol) in the suspension. In the case of GO suspension, the average particle size of the sample subject to ultrasonic homogenization was 263 nm and was ca 7.7 times smaller than the average particle size of the sample that was not subject to homogenization. The obtained results are convergent with the SEM tests (Fig. 5), which show the destructive effect of ultrasounds on GO flakes. The decrease of the average GO particle size was caused by defragmentation or folding of the GO flakes. However, it should be emphasized that the results of the average particle size of GO suspension samples involve an error related to the nanomaterial shape. The results obtained by the DLS method are a hydrodynamic average that is calculated based on the shape of a sphere that has the same diffusion coefficient as the measured particles; however, the shape of GO was flakes, which was confirmed by SEM images.
Test results of the zeta potential analysis of samples are provided in Table 3. The zeta potential of Ag-NPs in a water suspension was merely − 5.9 mV, which resulted in a lack of electrostatic stability of the sample. The sample of Ag-NP suspension was stabilized sterically by preserving Ag-NP distances through poly(vinyl alcohol) addition, which prevented agglomeration/aggregation of Ag-NPs. The zeta potential of the GO suspension sample, in turn, was − 41 mV, which gave a moderate electrostatic stability to the sample. A moderate electrostatic stability of a sample is characterized by slow sedimentation with virtually negligible change of particle size in the period of declared fitness of the suspension. The zeta potential result of the mixture of Ag-NPs and GO was − 7.1 mV, which potentially means that during the action of the ultrasounds, the GO flakes were coated by poly(vinyl alcohol) and Ag-NPs. The obtained zeta potential result of the mixture of Ag-NPs and GO sample in the water suspension implied that electrostatic stability was not present.
Foil Characteristics
In order to determine the morphology of the created layers, four types of foil samples were compared (Fig. 7):pure polyurethane foil (A, B), GO-coated polyurethane foil (C, D), Ag-NP-coated polyurethane foil (E, F), and GO-Ag mixture-coated polyurethane foil (G, H).
Scanning electron microscopy images of a , b non-coated polyurethane foil with a smooth surface with single impurities; c , d foil coated with GO, the broken-down GO flakes deposited on the polyurethane foil surface; e , f foil coated with Ag-NPs on which grid structures composed of polyvinyl alcohol and Ag-NPs are observed; and g , h foil coated with GO-Ag, which was mixed under the influence of ultrasounds and deposited on the foil surface
Figure 7a, b shows an uncoated polyurethane foil with a smooth surface with single impurities. In Fig. 4c, d, the broken-down GO flakes deposited on the polyurethane foil surface are noticeable. Figure 7e, f shows the foil surface coated with Ag-NPs on which grid structures composed of polyvinyl alcohol and Ag-NPs are observable. Figure 7g, h presents a mixture of GO-Ag composition, which was mixed under the influence of ultrasounds and deposited on the foil surface.
AFM Analysis and Surface Free Energy
AFM and LFM were used to complement the information about the surface morphology investigated by SEM. The investigation confirmed evolution of surface morphology by sonication of the polyvinyl alcohol with Ag-NP, GO, and GO-Ag NP solutions on the foils. Pure polyurethane foil was used as a reference foil in relation to foils coated by the ultrasonic method. The images in Fig. 8 are the AFM phase contrast images made in AC; additionally, cross sections of the GO flakes are attached under the corresponding images. Figure 8a is an image of pure polyurethane film; Fig. 7b depicts the Ag-NP-coated film, where characteristic and homogeneous grid structures are observable, being similar to those in Fig. 8e, f. Figure 8c, d shows GO-Ag-NP-coated film. Figure 8e shows the surface of the foil almost entirely covered with GO flakes; the phase contrast image helps to observe these two phases, the darker area is GO and the lighter area is polymer foil. It was noticed that the morphology of the foils has changed after Ag-NP coating comparing to the not-coated foils. The GO-Ag-NP coating differs from the previous one because it contains also small amounts of GO flakes seen as small black spots on the image, as it was mentioned earlier. Figure 8f depicts magnification of one GO flake made in LFM. The reduced friction confirms that it is, in fact, a GO flake.
AFM phase contrast images and cross sections topographic images of graphene flakes:a non-coated foil polyurethane foil; b Ag-NPs coated foil where characteristic and homogeneous grid structures are observed; c , d GO-Ag-coated foil; e GO-coated foil, the surface of the foil almost entirely covered with GO flakes; the phase contrast image helps to observe these two phases, the darker area is GO and the lighter area is polymer foil; f LFM image of graphene flake. Red marks, area of cross section
The polar component for the GO-coated foil increased in relation to pure foil, from 2.3 ± 0.6 to 68.9 ± 2.8 mJ/m
2
, while the dispersion component decreased from 34.4 ± 1.3 to 8.2 ± 1.2 mJ/m
2
. SFE increased from 36.7 ± 1.4 to 77.0 ± 3.4 mJ/m
2
. A similar effect was not observed on foil surfaces coated with Ag-NPs and GO-Ag mixture. SFE of foil samples coated with Ag-NPs and GO-Ag mixture does not differ statistically (Table 4).
Antibacterial Properties
The antibacterial activity of the different foils coated with GO, Ag-NPs, and GO-Ag were tested with E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans. Results showed that after co-incubation with bacteria at 37 °C for 24 h, foils inhibited the growth of all tested microorganisms but to various degrees. The maximum antibacterial effect against all tested microorganisms was with foil coated with the GO-Ag nanocomposite. The bacterial growth of the cells treated with foils coated with GO and Ag-NPs was slightly lower than that of cells in the control group whereas the growth of bacterial cells treated with foils coated with GO-Ag was greatly inhibited, 88.6% of E . coli , 79.6% of S . aureus , 76.5% of S . epidermidis , and 77.5% of C . albicans (Figs. 9, 10, and 11).
Antimicrobial properties of GO-Ag coated foils. The growth of E . coli (b , c ), S . aureus (c , d ), S . epidermidis (e , f ), and C . albicans (g –i ) colonies is reduced after co-incubation with GO-Ag-coated foils at 37 °C for 24 h. a Representative agar plate with GO-Ag-coated foils. Notes:Black arrows point to GO-Ag coated foils; arrowheads point to colonies of microorganisms
Morphology of microorganisms after co-incubation with GO-Ag-coated foils. Scanning electron microscopy images of bacteria and yeast in the control foils (a , c , e , g ) and foils coated with GO-Ag (b , d , f , h ) after incubation at 37 °C for 24 h. E . coli (a , b ), S . aureus (c , d ), S . epidermidis (e , f ), and C . albicans (g , h ) show decreased growth and deformed morphology after co-incubation with GO-Ag-coated foils
Foils coated with nanomaterials decrease E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans viability. Viability of bacteria and yeast after incubation on foils coated with Ag-NPs, GO, and GO-Ag at 37 °C for 24 h was assessed with Presto Blue assay. C control group (foil without nanoparticles), Ag foil coated with silver nanoparticles, GO foil coated with graphene oxide, GO-Ag foil coated with composite of graphene oxide and silver nanoparticles. Note:The columns with different letters (a–d) indicate significant differences between the concentrations (P = 0.001); error bars are standard deviations
Membrane Integrity
In cases where the cell membrane is damaged, intracellular LDH molecules could be released into the culture medium. The LDH level outside the cells demonstrates the cell membrane integrity. Foils coated with GO, Ag-NPs, and GO-Ag disrupted cell membrane functionality and integrity with significant differences between control groups and the Ag-NPs and GO-Ag groups (Fig. 12). The highest disruption of cell membranes was observed in the GO-Ag groups, 66.3% of E . coli , 59.4% of S . aureus , 54.8% of S . epidermidis , and 48.5% of C . albicans .
Foils coated with nanomaterials decreased E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans membrane integrity. Membrane integrity of bacteria and yeast after incubation on foils coated with Ag-NPs, GO, and GO-Ag at 37 °C for 24 h was assessed with LDH assay. C control group (foil without nanoparticles), Ag foil coated with silver nanoparticles, GO foil coated with graphene oxide, GO-Ag foil coated with composite of graphene oxide and silver nanoparticles. Note:The columns with different letters (a–c) indicate significant differences between the concentrations (P = 0.000); error bars are standard deviations
ROS Production
Low levels (or optimum levels) of ROS play an important role in signaling pathways. However, when ROS production increases and overwhelms the cellular antioxidant capacity, it can induce macromolecular damage (by reacting with DNA, proteins, and lipids) and disrupt thiol redox circuits. Foils coated with Ag-NPs and GO-Ag (P < 0.05) increased the ROS production of all tested microorganisms compared to the control group. Foils coated with GO only increased the ROS production of C . albicans . The highest ROS production was observed in the GO-Ag group (Fig. 13).
Effect of foils coated with nanomaterials on the production of reactive oxygen species. E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans were cultured on foils coated with Ag-NPs, GO, and GO-Ag at 37 °C for 24 h. Production of reactive oxygen species was assessed with DCFDA, Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit. C control group (foil without nanoparticles), Ag foil coated with silver nanoparticles, GO foil coated with graphene oxide, GO-Ag foil coated with composite of graphene oxide and silver nanoparticles. Note:The columns with different letters (a–d) indicate significant differences between the concentrations (P = 0.000); error bars are standard deviations
Discussion
The discovery of antibiotics, natural products produced by microorganisms that are able to prevent the growth of bacteria and thus cure infectious diseases, revolutionized medical therapy; however, the overuse and misuse of antibiotics have been key factors contributing to antibiotic resistance. Now, the era of antibiotics is coming to an end, and new antibacterial agents are needed. In recent years, studies have reported nanoparticles as a promising alternative to antibacterial reagents because of their antibacterial activity in several biomedical applications [19, 45]. Nanoparticles can be an effective way to control many pathogenic and antibiotic-resistant microorganisms. Among many metal nanoparticles, Ag-NPs have been intensely studied because of the distinct properties of their antibacterial activity [7]. Ag-NPs have been proved effective against over 650 microorganisms including bacteria (both gram-positive and negative), fungi, and viruses; however, the precise mechanism of antimicrobial action is not understood completely [46]. Ag-NP exposure to microorganisms could cause adhesion of nanoparticles to the peptidoglycan and the cell membrane [47], penetration inside the cell [48], induction of ROS [49], and damaging of intracellular structures [50]. However, bare Ag-NPs aggregate when they come into contact with bacteria; thus, they lose their active surface area and show weaker antibacterial activity [51]. To overcome this problem, nanocomposites composed of graphenic materials and Ag-NPs or other metal nanoparticles could be fabricated. GO with oxygen-containing functional groups is water soluble and therefore more biocompatible than pristine graphene. As a result, Ag-based GO nanocomposites may be used as antibacterial agents. However, the information about antimicrobial properties of graphene-based composites is limited, and mechanisms of toxicity or lack of toxicity are not fully explained.
The aim of this work was to study the action of graphene oxide-based nanocomposites decorated with Ag nanoparticles on S . aureus , S . epidermidis , E . coli , and C . albicans growth; membrane integrity; and ROS production. After co-incubation with the bacterial and yeast cells for 24 h, foils coated with GO-Ag nanocomposite inhibited the growth of all tested microorganisms with varying degrees, 88.6% of E . coli , 79.6% of S . aureus , 76.5% of S . epidermidis , and 77.5% of C . albicans . This action is most probably due to an increase in cell membrane and wall penetration by the nanoparticles. Some researchers suggest that the antimicrobial activity of graphene-based nanocomposites may be due to the disruption of cell membrane integrity and oxidative stress [52].
Foils coated with GO, Ag-NPs, and GO-Ag disrupted cell membrane functionality and integrity with significant differences between the control group and the Ag-NPs and GO-Ag groups. The highest disruption of cell membranes was observed in the GO-Ag groups, 66.3% of E . coli , 59.4% of S . aureus , 54.8% of S . epidermidis , and 48.5% of C . albicans . However, foils coated with bare Ag-NPs also disrupted cell membranes. It has been proposed that Ag-NPs are able to interact with bacterial membranes by increasing permeability and changing the structure of membranes, which finally leads to cell death [50]. Ag-NPs can cause direct damage to the bacterial cell membrane. Bacteria may be killed by the combined bactericidal effects of the released Ag
+
ions and Ag nanoparticles. Additionally, the antimicrobial potential of Ag-NPs is also influenced by the thickness of the cell wall of the microorganisms [53]. The wall of gram-positive cells contains a thick layer (20–80 nm) of peptidoglycan, which is attached to teichoic acids. In gram-negative bacteria, the cell wall comprises a thin (7–8 nm) peptidoglycan layer and contains an outer membrane. The thicker peptidoglycan layer in gram-positive bacteria, such as S . aureus and S . epidermidis , may explain why these bacteria are more resistant to the antibacterial effects of GO-Ag.
Many studies have sought to establish a mechanism of action of antibacterial activity exhibited by silver in both its colloidal and ionic form. A disruption of membrane functionality from an interaction between released Ag
+
ions and the cell membrane and extensive cell membrane damage caused by the formation of ROS ultimately causes damage to the cell due to oxidative stress. Additionally, Ag
+
ions could cause dysfunction of the respiratory electron transport chain by uncoupling it from oxidative phosphorylation by inhibiting respiratory chain enzymes [54]. Foils coated with Ag-NPs and GO-Ag increased the ROS production of all tested microorganisms compared to the control group. The biological targets are DNA, RNA, proteins, and lipids. Lipids are one major target during oxidative stress. Free radicals can directly attack polyunsaturated fatty acids in bacterial and yeast membranes and activate peroxidation of lipids. A fundamental effect of lipid peroxidation is a decrease in membrane fluidity, which can significantly disrupt membrane-bound proteins. DNA is also a main target. Mechanisms of DNA damage involve abstractions and addition reactions by free radicals leading to carbon-centered sugar radicals and OH- or H-adduct radicals of heterocyclic bases. The sugar moieties producing single- and double-strand breaks in the backbone, adducts of base and sugar groups, and cross-links to other molecules can block replication. Foils coated with GO increased the ROS production at very low levels. However, Hu et al. [55] demonstrated that GO had a detrimental effect on E . coli due to decreased production of ATP and increased ROS production. Zhao et al. [56] reported the antibacterial activity of GO and reduced GO. Also, Gurunathan et al. [57] presented that GO and reduced GO showed significant antibacterial activity in a concentration- and time-dependent manner. Their results demonstrated that oxidative stress is a key mechanism for the antibacterial activity of GO and reduced GO through ROS generation. Nanda et al. [53] reported the effect of cystamine-conjugated GO against E . coli , S . typhimurium , E . faecalis , and B . subtilis with ROS production and high antibacterial activity.
Kurantowicz et al. [20] confirmed that bacteria could adhere to the GO surface, which results in the highest antibacterial activity. GO is characterized by a high degree of oxygenated functional groups:carbonyl, carboxylate, and hydroxyl. We hypothesize that these groups can be attractive groups for bacterial and yeast attachment. These groups are present on a large range of nutrients (amino acids, fatty acids) which are commonly recognized by microorganisms. In the present study, foils coated with GO induced membrane disruption and ROS production at a lower level than the Ag-NP and Ag-GO groups; however, cell viability was decreased, which is likely connected to the smaller active surface of GO after ultrasonic modifications.
Kesimpulan
Ag-NPs, GO, and Ag-GO nanocomposites demonstrated the antibacterial activity that is stronger against gram-negative bacteria (E . coli ) versus gram-positive bacteria (S . aureus and S . epidermidis ) and yeast (C . albicans ). The results showed that the decoration of GO with Ag-NPs promotes a synergistic effect and reduces dramatically the concentrations required to inhibit all tested bacterial and yeast strains. The antimicrobial potential of Ag-GO is also influenced by the thickness of the cell wall of the microorganisms. The thicker peptidoglycan layer in gram-positive bacteria, such as S . aureus and S . epidermidis , may explain why these bacteria are more resistant to the antibacterial effects of GO-Ag. A disruption of membrane functionality from an interaction between released Ag nanoparticles/Ag
+
ions and the cell membrane and extensive cell membrane damage caused by the formation of ROS ultimately caused damage to the cell due to oxidative stress. In order to explain the mechanism of ROS production, additional studies are needed. Our research indicates the potential applicability of GO-Ag as an antimicrobial agent.
Singkatan
AFM:
Mikroskop kekuatan atom
Ag-NPs:
Silver nanoparticles
DLS:
Hamburan cahaya dinamis
PERGI:
Grafena oksida
GO-Ag:
Graphene oxide decorated with silver nanoparticles
