Magnetic Gold Nanoparticle-Labeled Heparanase Monoclonal Antibody dan Aplikasi Selanjutnya untuk Pencitraan Resonansi Magnetik Tumor

Metode

Garis Sel dan Tikus

Tujuh garis sel digunakan dalam penelitian ini. Garis sel positif-heparanase, termasuk garis sel kanker hati HepG2, garis sel kanker lambung manusia MKN45 dan SGC-7901, garis sel kanker usus besar SW480, dan garis sel osteosarcoma manusia U2OS, dibeli dari American Type Culture Collection. Garis sel heparanase-negatif, garis sel kanker payudara manusia MCF-7, dan garis sel fibroblas embrionik primer manusia HF disediakan oleh Dr. Liang (Bakar Research Institute, Third Military Medical University, Chongqing, China). Sel-sel HepG2 dikultur dalam DMEM yang mengandung 10% serum janin sapi. Sel SGC-7901, SW480, U2OS, dan HF dikultur dalam RPMI 1640 yang mengandung 10% serum janin sapi. Sel MKN45 dan MCF-7 dikultur dalam RPMI 1640 yang mengandung 15% serum janin sapi. Semua sel dikultur dalam 5% CO₂ inkubator pada 37 °C dan dilewatkan setiap 24-48 jam. Lima belas tikus telanjang BALB/c (berusia 4 hingga 5 minggu) dibeli dari Departemen Hewan, Universitas Kedokteran Militer Ketiga. Penelitian pada hewan dilakukan dalam kesepakatan dengan komite etika lokal dari Universitas Kedokteran Militer Ketiga. Semua tikus telanjang dipelihara di lingkungan bebas patogen tertentu.

Western Blot

Western blot dilakukan untuk mendeteksi ekspresi protein Hpa mengikuti prosedur yang dijelaskan dalam penelitian kami sebelumnya [17]. Setiap baris sel dilisiskan dengan reagen ekstraksi M-PER (Pierce Co.). Konsentrasi protein ditentukan dengan uji BCA (Bio-Rad, CA, USA). Tiga puluh mikrogram protein difraksinasi dengan 10% SDS-PAGE dan kemudian dipindahkan ke membran polivinildenadifluorida (PVDF) (Roche, Rotkreuz, Swiss). Membran diblokir dengan 5% (w /v ) susu skim dalam TBST (20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 150 mM NaCl, dan 0,1% [v /v ] Tween-20) selama 2 jam pada suhu kamar. Kemudian, membran diperiksa dengan pengenceran 1:200 antibodi anti-HPA (Insight, Israel) dalam buffer pemblokiran pada 4 °C semalaman. Membran dicuci empat kali dengan TBST dan diinkubasi dengan antibodi terkonjugasi peroksidase lobak terhadap IgG tikus selama 1 jam pada suhu kamar. Membran kemudian dibilas dengan TBST, dan pita protein divisualisasikan dengan Reagen Deteksi Western Blotting ECL (GE Healthcare, NJ, USA). Gambar dianalisis dengan perangkat lunak Quantity One 4.1 (Bio-Rad). Eksperimen diulang setidaknya tiga kali.

Pewarnaan imunohistokimia

Ekspresi Hpa pada garis sel di atas terdeteksi oleh imunositokimia. Secara singkat, sel-sel di atas dikultur pada kaca penutup steril pada suhu 37 °C dalam 5% CO₂ inkubator selama 48 jam. Setelah aktivitas peroksidase endogen diblokir oleh pengobatan dengan 0,3% H₂ O₂ -larutan metanol selama 20 menit, sel diinkubasi dengan antibodi primer Hpa (pengenceran antibodi adalah 1:100) semalaman pada suhu 4°C. Setelah dicuci dengan PBS yang mengandung 0,1% Triton X-100, slide diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 20 menit pada 20 °C. Akhirnya, slide diinkubasi selama 15 menit dengan reagen enzim avidin-biotin. Slide kemudian dicelupkan ke dalam larutan 3,3′-diaminobenzidin/H2O2. PBS digunakan sebagai kontrol negatif.

Konstruksi Penyelidikan Molekuler HPA&GoldMag dan Mikrograf Gaya Atom

Konstruksi probe molekuler dilakukan menggunakan kit GoldMagTM-CS (perusahaan bioteknologi nano magnetik Emas Xi'an, GNK0202, Xi'an, China) sesuai dengan instruksi pengoperasian. Konsentrasi antibodi HPA adalah 1 mg/ml. Sebuah mikrograf kekuatan atom (AFM) digunakan untuk mengevaluasi bentuk, ukuran, dan penampilan permukaan nanopartikel. Nanopartikel emas magnetik berlabel atau nanopartikel emas magnetik berlabel ditempatkan pada kaca penutup dan dikeringkan di udara pada suhu kamar selama 24 jam. Sampel kering dianalisis menggunakan mikroskop gaya atom (AFM, Nanoscope, Digital Instruments, Santa Barbara, CA).

Imunofluoresensi

Secara singkat, sel dikultur pada kaca penutup steril pada suhu 37 °C dalam 5% CO₂ inkubator selama 48 jam. Kemudian, sel difiksasi dengan 4% (w /v ) formaldehida dalam PBS selama 30 menit dan permeabilisasi dengan 0,2% (v /v ) Triton X-100 selama 5 menit pada suhu kamar. Sel diblokir dengan menginkubasi kaca penutup dengan 10% (v /v ) serum kambing dalam PBS selama 30 menit. Kemudian, sel-sel diwarnai dengan probe molekul HPA&GoldMag atau probe IgG&GoldMag tikus normal pada pengenceran 1:50 diikuti oleh IgG anti-tikus kambing berlabel Cy3 pada pengenceran 1:100. Sel-sel tersebut kemudian diwarnai dengan 0,4 mg/mL DAPI (Sigma-Aldrich) selama 10 menit pada suhu kamar. Gambar mikroskopis diperoleh menggunakan Mikroskop Laser Confocal. Probe IgG&GoldMag tikus normal digunakan sebagai kontrol negatif.

Flow Cytometry

Aktivitas probe HPA&GoldMag ditentukan oleh flow cytometry. Sel diblokir dengan serum kambing selama 1 jam. Kemudian, sel-sel diwarnai dengan probe HPA&GoldMag 10-g atau IgG&GoldMag tikus normal pada 4°C semalaman, dicuci empat kali dengan PBS, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi berlabel FITC terhadap IgG tikus selama 1 jam pada 37 °C. Sel-sel dicuci dengan PBS, dan intensitas fluoresensi diukur dengan flow cytometer (Becton Dickinson).

Studi In Vitro Nanopartikel Emas Magnetik untuk Pencitraan MR

Larutan nanopartikel emas magnetik (5 mg/ml) diencerkan secara serial dua kali (1:20–1:1280) menggunakan larutan agarosa 1%. Larutan dipadatkan dalam tabung EP. Pemindaian MR dilakukan menggunakan gel agarosa 1% sebagai kontrol kosong. Parameter pemindaian adalah sebagai berikut:T1WI; TR600 md/TE12 md; ketebalan, 2,0 mm; FOV, 150 mm; dan T2WI; TR6000 md/TE92 md; ketebalan, 2,0 mm; FOV, 150 mm. Probe molekuler HPA&GoldMag MR dibuat menggunakan mAb HPA yang diberi label dengan partikel emas magnetik 30 nm. Sel dikultur secara rutin dalam cawan kultur 100 mm, dan probe HPA&GoldMag atau probe IgG&GoldMag negatif kemudian ditambahkan ke kultur sel dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 90 menit. Probe yang tidak terikat diblokir dengan menambahkan jumlah serum kambing yang sesuai. Setelah dicuci dengan PBS tiga kali, sel dicerna dengan tripsin. Sel-sel kemudian dikumpulkan, dicampur dengan larutan agarosa 1%, dan dipindahkan ke dalam tabung EP 1,5 ml. Pemindaian MR dilakukan menggunakan pemindai MRI 3.0 T (parameter pemindaian sama seperti yang dijelaskan di atas) menggunakan kumparan resonansi magnetik khusus untuk hewan. Sebelum pemindaian, tikus dibius dengan 1% pentobarbital dan ditempatkan di tempat tidur pindai.

Studi In Vivo tentang Nanopartikel Emas Magnetik untuk Pencitraan MR

Tikus telanjang jantan berusia empat hingga 6 minggu (26-30 g) disuntikkan secara subkutan di pinggul dengan 200 l sel MKN45. Setiap tikus telanjang disuntik dengan sekitar 2,0 × 10 ⁶ sel. Setelah 2 minggu, tumor terlihat dan digunakan untuk pencitraan MR. Sebelum injeksi dan 2 jam setelah injeksi, pemindaian MR dilakukan menggunakan pemindai MRI 3.0 T. Parameternya adalah T2WI, TR6000 ms/TE92 ms; ketebalan, 1,5 mm; dan FOV, 120 mm. Setelah itu, jaringan tumor, limpa, hati, ginjal, limpa, jantung, dan paru-paru dikumpulkan untuk dilakukan pewarnaan Fe biru Prusia.

Analisis Statistik

Semua data disajikan sebagai mean ± standar deviasi. Analisis ANOVA dilakukan dengan menggunakan software SPSS13.0. P nilai <  0,05 menunjukkan bahwa perbedaan tersebut signifikan.

Hasil

HPA Diekspresikan Secara Berbeda di Berbagai Sel Kanker

Analisis pewarnaan Western blot dan imunohistokimia digunakan untuk menguji ekspresi Hpa dalam sel HepG2, SGC-7901, MKN45, MCF-7, SW480, dan U2OS. Hasilnya menunjukkan bahwa ekspresi Hpa jauh lebih tinggi pada sel HepG2, SGC-7901, MKN45, SW480, dan U2OS, sedangkan ekspresi Hpa yang jauh lebih rendah terdeteksi pada sel MCF-7 (Gbr. 1).

Ekspresi protein Hpa di berbagai garis sel. a Western blot digunakan untuk mendeteksi ekspresi protein HPA (65 kDa) di berbagai lini sel tumor. Jalur 1, HepG2; jalur 2, SGC-7901; jalur 3, MKN45; jalur 4, MCF-7; jalur 5, SW480; jalur 5, U2OS. b Analisis imunohistokimia ekspresi HPA dalam garis sel HepG2, SGC-7901, MKN45, MCF-7, SW480, dan U2OS

Konstruksi dan Deteksi Penyelidikan Molekul HPA&GoldMag

Probe molekuler HPA&GoldMag disiapkan dengan menggabungkan mAbs HPA dengan nanopartikel emas magnetik menggunakan reaksi kopling antara permukaan nanopartikel emas magnetik. Mikroskop kekuatan atom (AFM) digunakan untuk mengamati secara langsung struktur permukaan probe. Kami menunjukkan bahwa diameter rata-rata nanopartikel emas magnetik adalah 13,78 nm tanpa pelabelan dengan HPA mAbs (Gbr. 2a); ukuran partikel menjadi homogen. Setelah diberi label dengan mAb HPA, diameter rata-rata adalah sekitar 24,80 nm (Gbr. 2b). Hasil ini menunjukkan bahwa nanopartikel emas magnetik cocok untuk dipasangkan dengan mAbs HPA.

a Model kopling nanopartikel emas magnetik dengan HPA mAbs. b Pemindaian gaya atom nanopartikel emas magnetik

Probe Molekuler HPA&GoldMag Dapat Secara Khusus Mengikat ke HPA

Pertama, spesifisitas pengikatan antara probe molekuler dan HPA dievaluasi dengan imunofluoresensi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sejumlah besar fluoresensi merah terdeteksi di sitoplasma sel HepG2, MKN45, SW480, dan U2OS, sementara hanya sedikit fluoresensi merah yang terdeteksi di sel MCF-7, dan tidak ada fluoresensi yang terdeteksi di sel HF. . Namun, IgG&GoldMag tikus negatif tidak menunjukkan interaksi apa pun dengan HPA di garis sel mana pun (Gbr. 3). Kami selanjutnya menggunakan flow cytometry untuk menguji spesifisitas probe molekuler HPA&GoldMag. Kami menunjukkan respons negatif dalam sel HF dan mengamati tingkat positif 40% dalam sel MCF-7 dan tingkat positif 95% dalam sel HepG2, SW480, U2OS, dan MKN45. Hasil ini menunjukkan bahwa probe dapat secara khusus mengikat HPA yang diekspresikan dalam sel tumor.

Spesifisitas dan aktivitas pengikatan probe terdeteksi oleh imunofluoresensi dan flow cytometry. a Imunofluoresensi dilakukan menggunakan probe seperti yang ditunjukkan. b Flow cytometry digunakan untuk menguji spesifisitas probe molekuler HPA&GoldMag

MR Imaging dari HPA&GoldMag Probe In Vitro

Setelah pengenceran serial menggunakan agarosa 1%, pencitraan MR nanopartikel emas magnetik menggunakan urutan T2WI menunjukkan pengurangan sinyal yang berbeda. Sinyal T2WI dari pengenceran 1:640 jauh lebih rendah daripada kontrol gel agarosa 1% (P < 0,05) (Gbr. 4a, b). Hasil penelitian menunjukkan bahwa nanopartikel emas magnetik dapat mereduksi sinyal MR secara efektif bahkan dalam konsentrasi rendah, menunjukkan bahwa nanopartikel emas magnetik cocok untuk pencitraan molekuler. Kemudian, probe molekuler HPA&GoldMag digunakan untuk memberi label pada sel HepG2, SGC7901, MKN45, SW480, U2OS, HF, dan MCF-7 yang kemudian dicampur dengan agarosa 1% dan ditempatkan di bawah resonansi magnetik 3,0 T (MR) (Gbr. 4c). Pemindaian MR menggunakan urutan T1WI (Gbr. 4c, d) atau T2WI (Gbr. 4c, e) untuk pemindaian aksial plus koronal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dibandingkan dengan urutan T1WI, sinyal menggunakan urutan T2WI pemindaian MR berkurang secara signifikan (P < 0,05) sedangkan sinyal dalam sel HF setelah pelabelan tidak berubah secara signifikan (P> 0,05), dan sinyal dalam sel MCF-7 setelah pelabelan berkurang secara minimal (P < 0.05).

a Pencitraan MR nanopartikel emas magnetik setelah dua pengenceran serial. b Diagram hasil statistik kekuatan sinyal pencitraan MR dari dua nanopartikel emas magnetik yang diencerkan secara serial. c Pencitraan MR semua sel setelah pelabelan dengan probe. Jalur 1, HF; jalur 2, MCF-7; jalur 3, HepG2; jalur 4, SGC-7901; jalur 5, MKN45; jalur 5, SW480; jalur 6, U2OS. d Hasil statistik membandingkan kekuatan sinyal dari pencitraan MR menggunakan urutan T1WI pada sel yang diberi label dengan probe HPA&GoldMag. e Hasil statistik untuk kekuatan sinyal yang terdeteksi dengan pencitraan MR menggunakan urutan T2WI pada sel yang diberi label dengan probe HPA&GoldMag

MR Imaging Probe HPA&GoldMag pada Tikus Telanjang

Semua tikus telanjang dibius dengan natrium pentobarbital dengan dosis 50 mg/kg. Probe molekuler disuntikkan ke dalam vena ekor tikus telanjang, dan pemindaian MR dilakukan sebelum dan 2 jam setelah pemberian. Karena probe dapat diserap oleh makrofag di paru-paru dan hati dan diekskresikan oleh ginjal, hasil pemindaian menunjukkan bahwa setelah injeksi, tumor, hati, ginjal, dan jaringan paru-paru pada tikus telanjang secara signifikan mengurangi sinyal, dibandingkan dengan sinyal. yang terdeteksi sebelum injeksi (P < 0,05) (Gbr. 5).

a Pencitraan MR tikus telanjang sebelum dan 2 jam setelah injeksi kontrol atau probe HPA&GoldMag. Panah menunjukkan tumor pada tikus. b Perbandingan kekuatan sinyal dari gambar MR menggunakan T2WI sebelum dan sesudah injeksi kontrol atau probe HPA&GoldMag pada tikus telanjang. ^* P < 0.01

Diskusi

Invasi tumor dan metastasis merupakan proses biologis yang kompleks yang menyebabkan prognosis tumor yang buruk. Dengan demikian, diagnosis dini metastasis tumor merupakan strategi penting untuk memilih strategi pengobatan klinis. MRI adalah metode non-invasif yang berguna untuk deteksi tumor; memungkinkan pencitraan jaringan kontras tinggi multidimensi. Namun, MRI tidak dapat mendeteksi tumor dengan ukuran kecil dan agen kontras tinggi seperti nanopartikel logam (besi, emas, dll.) harus digunakan untuk peningkatan visualisasi tumor [18,19,20]. Pengembangan agen kontras baru berdasarkan bahan nano baru bermanfaat untuk meningkatkan teknik MRI untuk deteksi dini kanker. Di antara agen pencitraan, partikel oksida besi superparamagnetik (SPIO) digunakan sebagai agen kontras umum dalam pencitraan molekuler MR, di mana nanopartikel emas magnetik adalah bahan nanokomposit superparamagnetik dengan Fe₃ O₄ (inti)/Au (kulit) struktur [21,22,23,24]. Sifat superparamagnetik nanopartikel anorganik berguna untuk magnetic resonance imaging (MRI) [25]. Kombinasi nanopartikel ini dengan agen spesifik jaringan (antibodi atau zat dengan berat molekul rendah) memungkinkan deteksi dan diagnosis tumor yang tepat. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa HPA diekspresikan dalam banyak tumor, dan tingkat ekspresinya terkait erat dengan potensi metastasis tumor [26]. HPA dapat menghancurkan integritas ECM dan BM melalui degradasi HSPG, yang melepaskan molekul aktif seperti bFGF, HGF, dan VEGF yang berlabuh di ECM, sehingga mendorong perkembangan tumor [27,28,29,30]. Karena HPA terutama diekspresikan pada tumor stadium pertengahan hingga akhir, penelitian kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa HPA dapat digunakan sebagai TAA umum untuk terapi tumor [13,14,15]. Oleh karena itu, HPA mungkin menjadi target yang berpotensi berguna untuk pencitraan dan terapi molekuler tumor.

Nanopartikel emas magnetik adalah nanomaterial komposit superparamagnetik dengan Fe₃ O₄ (core)/Au (shell) struktur yang dihasilkan dari reduksi Au ³⁺ oleh hidroksilamin hidroklorida dari superparamagnetik Fe₃ O₄ partikel [31, 32]. Karena metode pelabelan cukup sederhana, mereka dapat digunakan untuk aplikasi biologis seperti pemilihan sel, pemurnian protein, pemisahan asam nukleat, dan immunoassays. Oleh karena itu, dengan mengikuti prosedur yang telah ditetapkan, kami berhasil menyiapkan dan mengkarakterisasi nanopartikel oksida besi berlapis emas yang terkait dengan antibodi anti-HPA. Dalam penelitian ini, partikel emas magnetik 30 nm digunakan karena jauh lebih stabil daripada partikel emas magnetik 50 nm. Satu miligram partikel emas magnetik 30 nm dapat mengikat sekitar 200 g mAb HPA. Data kami menunjukkan bahwa penggunaan nanopartikel emas magnetik pada pengenceran 1:640 (sekitar 10 μg) menghasilkan penurunan sinyal dibandingkan dengan kelompok kontrol kosong dalam pemindaian MRI 3,0 T (P < 0,05). Dengan demikian, nilai kritis untuk pencitraan in vivo menggunakan partikel emas magnetik dapat dihitung.

Aktivitas dan spesifisitas probe HPA mAb yang digabungkan nanopartikel emas magnetik kemudian dideteksi menggunakan mikroskop laser confocal, flow cytometry, dan mikroskop kekuatan atom. Secara singkat, probe diuji secara in vitro dengan inkubasi probe yang ditargetkan dan probe kontrol negatif dengan sel HPA (+) dan (−). Di sini, sel kanker payudara MCF-7 manusia menunjukkan ekspresi HPA yang lemah, sementara sel MKN45, SW480, U2OS, HepG2, dan SGC-7901 memiliki ekspresi HPA yang lebih tinggi. Selanjutnya, IgG tikus normal digunakan sebagai kontrol untuk mAbs HPA untuk lebih membuktikan spesifisitas nanopartikel.

Setelah spesifisitas probe diuji secara in vitro, probe yang ditargetkan dan kontrol disuntikkan pada tikus telanjang yang disuntikkan secara subkutan dengan sel kanker lambung MKN45 manusia. Setelah diameter jaringan tumor mencapai 1 cm, pemindaian MR dilakukan menggunakan ruang MRI 3,0 T untuk mendeteksi perubahan sinyal pada tumor sebelum dan sesudah injeksi dengan probe. Hasil pemindaian menunjukkan bahwa sinyal tumor berkurang secara signifikan 2 jam setelah injeksi probe dibandingkan dengan sinyal sebelum injeksi probe. Hasil ini menunjukkan bahwa probe HPA&GoldMag memiliki aktivitas kekebalan yang sangat baik dan efek yang lebih baik pada tikus telanjang yang membawa sel MKN45.

Kesimpulan

Singkatnya, kami menunjukkan bahwa probe molekuler HPA&GoldMag yang digabungkan dengan mAbs HPA memiliki sifat fisik dan kimia yang sangat baik. Probe secara khusus dapat menargetkan banyak sel tumor yang mengekspresikan HPA tinggi baik secara in vitro maupun in vivo. Menggunakan pemindaian MRI 3.0 T, probe terbukti secara signifikan mengurangi sinyal T2WI di jaringan tumor; ini dapat memberikan dasar eksperimental untuk pencitraan molekuler dari metastasis tumor.

Singkatan

AFM:

Mikrograf gaya atom

BM:

Membran bawah tanah

CT:

Computed tomography

ECM:

Matriks ekstraseluler

HPA:

Heparanase

HSPG:

Proteoglikan heparan sulfat

MRI:

Pencitraan resonansi magnetik

PVDF:

Polivinilidedifluorida

TAA:

Antigen terkait tumor

Struktur Elektronik dan Karakteristik IV dari Nanoribbons InSe Persiapan Polietilena/Grafena Nanokomposit In situ Polimerisasi dengan Berat Molekul Ultra Tinggi melalui Struktur Spherical dan Sandwich Dukungan Grafena/Sio2