Peningkatan Efektivitas Antitumor Artesunate yang Dikirimkan Nanopartikel melalui Aktivasi Apoptosis Mitokondria

Abstrak

Artemisinin dan turunannya dianggap memiliki aktivitas anti-kanker luas, dan mereka menginduksikan efek anti-kanker yang signifikan pada sel tumor. Artemisinin dan turunannya dapat terserap dengan cepat dan tersebar luas, secara selektif membunuh sel tumor. Karena konsentrasi rendah artesunate terutama bergantung pada onkosis untuk menginduksi kematian sel tumor, efek antitumor-nya tidak diinginkan dan terbatas. Untuk mendapatkan efek antitumor yang lebih baik, dalam studi ini, kami menggunakan teknologi nano baru untuk merancang nanopartikel serum albumina sapi yang dimuat artesunate untuk mencapai akumulasi mitokondria artesunate dan menginduksi apoptosis yang diantisipasi oleh mitokondria. Hasilnya menunjukkan bahwa dibandingkan dengan ketergantungan artesunate bebas pada kematian onkosis, nanopartikel serum albumina sapi yang dimuat artesunate menunjukkan sitotoksisitas yang lebih tinggi dan efek apoptotik yang signifikan diinduksi melalui distribusi artesunate dalam mitokondria. Temuan ini menunjukkan bahwa nanopartikel serum albumina sapi yang dimuat artesunate merusak integritas mitokondria dan mengaktifkan jalur apoptosis yang diantisipasi oleh mitokondria dengan meningkatkan protein terkait apoptosis dan memfasilitasi pelepasan cepat sitokrom C.

Latar Belakang

Artemisinin dan turunannya telah banyak digunakan dalam pengobatan malaria karena aktivitas anti-malarial yang tinggi dan toksisitas rendah. Peneliti juga menemukan bahwa artemisinin dan turunannya menunjukkan aktivitas anti-tumor yang signifikan berkat efek samping toksis yang sedikit dan toleransi yang lebih baik oleh pasien [1]. Dilaporkan bahwa artesunate (Ats) pastinya menghambat pertumbuhan sel tumor dan lebih lanjut menginduksi efek anti-kanker yang signifikan pada sel tumor [2,3,4]. Beberapa eksperimen menunjukkan bahwa Ats menyebabkan berbagai tingkat apoptosis dan onkosis pada sel tumor setelah 48 jam, dan tingkat apoptosis dan onkosis bergantung pada dosis Ats. Pada konsentrasi rendah, Ats tidak menginduksi apoptosis yang jelas pada sel tumor dan kematian sel yang diinduksi Ats disertai oleh kematian mirip onkosis [5,6,7,8]. Untuk mendapatkan efek anti-tumor yang lebih besar, dosis Ats yang lebih tinggi diterapkan, tetapi ini lebih lanjut mengonfirmasi toksisitas seriusnya dan penindasan sumsum tulang. Oleh karena itu, perlu untuk menemukan pengobatan yang efektif untuk mengurangi dosis efektif Ats untuk meningkatkan efisiensi anti-tumornya [9,10,11]. Ditemukan bahwa mitokondria memerankan peran penting dalam mengatur efek apoptotik dan onkosis dari Ats. Mitokondria juga terlibat dalam mengatur proses transduksi berbagai sinyal apoptosis [12,13,14,15,16,17]. Ketika mitokondria diserang oleh obat, permeabilitasnya meningkat dan potensi membran telah menurun, sehingga mengakibatkan pembengkakan membran mitokondria dan pelepasan cepat sitokrom C dari mitokondria ke sitoplasma [18,19,20]. Selanjutnya, beberapa protein dari famili caspase diaktifkan, dan reaksi runtut apoptosis sel diinduksi.

Untuk meningkatkan efek anti-tumor Ats, banyak teknik baru telah dicoba untuk meningkatkan distribusi obat pada sel tumor atau untuk meningkatkan pengiriman terpadu obat ke organel sel untuk menginduksi kematian sel [21,22,23]. Nanopartikel (NP) sebagai alat kunci dalam pengobatan kanker yang ditargetkan telah banyak diselidiki, dan mereka telah menunjukkan potensi yang menjanjikan. Karena NP memiliki ukuran partikel yang lebih kecil dan luas permukaan yang tinggi, mereka dapat masuk ke sirkulasi darah melalui kapiler dan melewati celah sel endotel dan bermigrasi ke lokasi tumor, sehingga mencapai distribusi obat yang ditargetkan dan meningkatkan bioavailability obat. Selain itu, NP dapat mengontrol pelepasan obat melalui degradasi biomaterial dalam pola yang panjang dan halus, pada akhirnya memjangkau setengah hayat eliminasi, meningkatkan konsentrasi darah efektif, dan mengurangi frekuensi dosing. Yang terpenting, NP yang dimuat obat dapat dikirim ke lokasi tertentu dalam sel, meningkatkan efektivitas pengobatan [24,25,26].

Untuk meningkatkan efek anti-tumor Ats pada konsentrasi rendah, kami mencoba merancang NP BSA yang dimuat Ats yang baru. Karena pH rendah pada sel tumor, akumulasi sejumlah besar proton hidrogen yang ada pada membran luar mitokondria atau di ruang antara membran, sebaliknya, membran antara mitokondria kaya dengan muatan negatif karena komposisi kimia dan sekresi matriks mitokondria, yang membuat potensi transmembran yang positif di luar dan negatif di dalam yang dapat membuat pengiriman BSA yang menguntungkan. Kemudian, akumulasi massal Ats dalam mitokondria dapat secara efektif memicu apoptosis yang diantisipasi oleh mitokondria. Hasilnya menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kematian onkosis tipikal yang diinduksi oleh Ats bebas, Ats secara spesifik ditransfer ke dalam mitokondria dengan perantaraan NP BSA dan mempromosikan aktivasi protein caspase terkait apoptosis yang diantisipasi oleh mitokondria. Ini menyalurkan apoptosis sel yang signifikan, sehingga menunjukkan sitotoksisitas yang lebih tinggi.

Metode

Bahan

BSA dibeli dari Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, AS), dan Ats dibeli dari Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, Republik Rakyat Tiongkok). Sel SMMC-7721 dan Plc dibeli dari Institute of Biochemistry and Cell Biology of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Republik Rakyat Tiongkok). Semua bahan kimia lainnya yang dibeli adalah kelas analitik; mereka diperoleh dari berbagai vendor.

Persiapan dan Karakterisasi NP BSA yang Dimuat Ats

Menurut literatur yang telah dilaporkan sebelumnya [27], NP BSA yang dimuat Ats disiapkan melalui metode desolvasi. Singkatnya, NP BSA yang dimuat Ats disiapkan dengan dengan cepat meneteskan 1,0 mL alkohol anhidris yang berisi sejumlah Ats ke dalam 0,5 mL larutan BSA pada 37 °C hingga muncul keoplesan. Dengan pengapusan etanol melalui rotary evaporation, NP BSA yang dimuat Ats lebih lanjut dipresipitasi dari medium, dan kemudian 8% gluteraldehid dalam air (0,5 μL/mg BSA) ditambahkan untuk menginduksi silang-pengikatan partikel selama pengadukan suspensi selama 24 jam. Akhirnya, NP dikumpulkan dan dicuci tiga kali dengan air deionisasi untuk menganalisis karakterisasi fisiknya lebih lanjut, termasuk diameter hidrodinamik, indeks dispersi polidispers (PDI), potensi zeta, dan morfologi menggunakan Brookhaven Zetasizer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, AS) dan mikroskop elektron transmisi (JEM-1200EX; JEOL, Tokyo, Jepang). Penentuan efisiensi enkapsulasi Ats dalam NP BSA diestimasi menggunakan metode yang telah dilaporkan sebelumnya [27].

Uji MTT

Dua baris sel tumor, sel SMMC-7721 dan Plc, secara terpisah diinkubasi dengan serum fetal sapi (FBS) 20%. Kepadatan pertumbuhan sel disesuaikan menjadi l × l0⁶ sel/mL dengan penghitungan sel, dan kemudian suspensi sel dihaluskan menjadi l × l0⁵ sel/mL. Suspensi yang dihaluskan lebih lanjut secara terpisah ditambahkan ke dalam plate 96-lubang (100 μL per lubang, sekitar 1 × 10⁴ sel/lubang) untuk inkubasi berkelanjutan selama 24 jam pada 37 °C dalam kondisi 5% CO₂ dan 95% O₂. Medium diganti dengan medium bebas serum dengan kehadiran Ats bebas atau NP BSA yang dimuat Ats dengan konsentrasi Ats yang berbeda, dan kemudian diinkubasi selama 24 jam. Secara total 50 μL 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) (5 mg/mL) ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi selama 4 jam untuk mengakhiri kultur. Ketika warna tetrazolium MTT direduksi menjadi formazan yang tidak larut, plate 96-lubang disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit, dan supernatant dicampur dari setiap lubang, diikuti dengan penambahan 150 μL dimetil sulfoksida (DMSO), yang sepenuhnya melelehkan kristal. Absorbansi larutan diukur menggunakan pembaca plate mikro (Syneray-2; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, AS) pada 490 nm.

Distribusi Intrakelular Grup NP BSA dalam Sel

Sel SMMC-7721 dan Plc pada fase logaritmik dipilih dan diperlakukan dengan pencernaan tripsin; konsentrasi sel disesuaikan menjadi l × l0⁶ sel/mL. Selanjutnya, sel yang dikultur ditambahkan ke dalam plate kultur sel 6-lubang untuk menempel, dan medium kultur dihilangkan diikuti dengan penambahan NP BSA yang dilabeli rodamin B. Nukleus diwarnai dengan Hoechst (biru) selama 15 menit pada 37 °C, dan mitokondria diwarnai oleh Mitotracker Green FM. Lokasi NP BSA dalam sel dilacak dalam sel menggunakan mikroskop laser skaning konfokal (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Jepang).

Perubahan Potensi Membran Mitokondria

JC-1 dapat digunakan untuk menentukan perubahan potensi membran mitokondria. Ketika potensi membran mitokondria tinggi, JC-1 dapat melewati membran sel secara bebas dan membentuk agregat dalam mitokondria, menampilkan fluoresensi merah (panjang gelombang eksitasi, 525 nm; panjang gelombang emisi, 590 nm); ketika potensi membran mitokondria menurun, JC-1 dipindahkan dari matriks mitokondria ke sitoplasma sel untuk membentuk monomer fluoresensi hijau (panjang gelombang eksitasi, 490 nm; panjang gelombang emisi, 530 nm). Sel SMMC-7721 dan Plc secara masing-masing ditanamkan dalam piring konfokal untuk mencapai kepadatan l × l0⁶ sel/mL untuk inkubasi berkelanjutan selama 12 jam. Selanjutnya, medium kultur dibuang dan medium kultur bebas serum yang berisi dispersi Ats atau NP BSA yang dimuat Ats ditambahkan ke piring. Setelah 9 jam, medium dibuang dan sel dicuci dua kali dengan PBS, diikuti dengan penambahan 2 mL JC-1 pada konsentrasi 2 μmol/L; sel kemudian diinkubasi selama 30 menit pada 37 °C dalam kondisi gelap. Mikroskop laser skaning konfokal (FluoView FV10i; Olympus Corporation) digunakan untuk mengamati perubahan imaging membran mitokondria.

Pengukuran Produksi ROS dan Pewarnaan Jaringan Endoplasmik (ER)

Sel diinkubasi dengan FBS 20% dan kepadatan pertumbuhan sel disesuaikan menjadi l × l0⁶ sel/mL dengan penghitungan sel; dan kemudian suspensi sel dihaluskan menjadi l × l0⁵ sel/mL. Suspensi yang dihaluskan lebih lanjut ditambahkan ke plate 96-lubang (100 μL per lubang, sekitar 1 × 10⁴ sel/lubang) untuk inkubasi berkelanjutan selama 24 jam pada 37 °C di bawah 5% CO₂ dan 95% O₂. Kedua, Ats bebas dan NP BSA yang dimuat Ats diinkubasi dengan sel selama 6, 12, dan 24 jam, diikuti oleh inkubasi berkelanjutan dengan 10 μM 2,7-diklorofluoresin diasetat (DCFH-DA; Sigma-Aldrich Co.) selama sekitar 30 menit. Larutan PBS dingin digunakan untuk mencuci sel tiga kali untuk menghapus NP yang tidak diinternalisasi. Intensitas fluoresensi DCF intrakelular, yang dieksitasi pada 485 nm dan diemisi pada 530 nm, terdeteksi menggunakan pembaca plate mikro (Synergy-2; BioTek Instruments) untuk menilai tingkat stres oksidatif. Grup uji diperlakukan dengan sel SMMC-7721 dan Plc selama 24 jam, dan sond ER-Tracker Blue–White DPX (Molecular Probes, Eugene, OR, AS) ditambahkan ke sel untuk inkubasi selama 30 menit. Setelah membuang larutan pemuatan dan mencuci sel dengan PBS, perubahan morfologi ER diamati oleh mikroskop laser skaning konfokal.

Evaluasi Onkosis dan Apoptosis Sel dengan Situsometri Aliran

Menurut protokol studi kami sebelumnya [28], uji pewarnaan Annexin V–fluorescein isothiocyanate (FITC)/iodida propidium (PI) digunakan untuk mengevaluasi onkosis dan apoptosis sel yang diinduksi oleh Ats bebas dan NP BSA yang dimuat Ats. Sel dilisis dengan tripsin dan ditanamkan ke dalam plate enam-lubang pada konsentrasi l × l0⁶ sel/mL untuk 24 jam inkubasi berkelanjutan. Selanjutnya, medium kultur dihilangkan dan medium bebas serum yang berisi Ats bebas dan NP BSA yang dimuat Ats ditambahkan ke lubang. Setelah perawatan, sel dikumpulkan dan disuspendi dalam larutan Nicoletti (Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Beijing, Republik Rakyat Tiongkok) yang berisi PI- dan AV-FITC yang dilabeli Annexin V. Perubahan morfologi sel diamati oleh mikroskop laser skaning konfokal. Untuk memverifikasi tingkat apoptosis dan onkosis sel yang diinduksi oleh NP yang dimuat Ats, persentase apoptosis awal (Q4), onkosis (Q2), nekrosis (Q1), dan sel hidup (Q3) diukur dengan situsometri aliran.

Analisis Western Blot Protein Terkait Apoptosis dan Sitokrom C dalam Sel

Uji western blot dilakukan untuk menentukan tingkat protein relatif ketika Ats bebas atau NP yang dimuat diinkubasi dengan sel SMMC-7721 selama 24 jam. Sel dilisis dengan larutan radioimmunoprecipitation assay (RIPA) dingin yang berisi inhibi protease dan inhibi fosfatase (Roche, Basel, Swiss). Konsentrasi protein ditentukan menggunakan kit assay BSA yang dimodifikasi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) dan dinormalisasi sebelum dimuat pada gel elektroforesis elektroforesis polyakrilamida (SDS)–10%. Tingkat protein target difoto dan dianalisis menggunakan sistem analisis gel UVP (iBox Scientia 600; UVP, LLC., Upland, CA, AS).

Hasil

Karakteristik NP BSA yang Dimuat Ats dan Studi Kepatuhan Sel

Terlihat pada Gambar 1a, b bahwa NP BSA yang dimuat Ats menunjukkan bentuk bola, dan mereka terdiseminasi homogen dengan PDI yang rendah sebesar 0,016. Ukuran partikel rata-rata NP BSA yang dimuat Ats sekitar 99,9 ± 2,3 nm dan potensi zeta bernilai negatif sekitar –25,6 ± 4,3 mV. Profil pelepasan menunjukkan pelepasan yang halus dan berkelanjutan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1c. Dibandingkan dengan pelepasan cepat Ats bebas dalam medium in vitro, Ats yang terperangkap di inti NP BSA perlahan meluas dari dalam NP ke medium dan menunjukkan pola pelepasan yang halus dan berkelanjutan, berkat degradasi berkelanjutan BSA. Lebih dari 85% Ats bebas dilepaskan sepenuhnya dalam 6 jam pertama, sementara jumlah total kumulatif obat yang dilepaskan dari NP ke media dalam periode 48 jam adalah 78,9%. Ini menunjukkan bahwa NP dapat mengontrol pelepasan obat melalui degradasi biomaterial dalam pola yang panjang dan halus, sehingga memjangkau setengah hayat eliminasi, meningkatkan konsentrasi darah efektif, dan mengurangi frekuensi dosing.

Peningkatan Efektivitas Antitumor Artesunate yang Dikirimkan Nanopartikel melalui Aktivasi Apoptosis Mitokondria

MTT digunakan untuk memeriksa efek penghambatan Ats bebas dan NP BSA yang dimuat Ats pada sel SMMC-7721 dan Plc pada interval waktu yang berbeda. Hasil (Gambar 1d, e) menunjukkan bahwa sitotoksisitas Ats bebas meningkat seiring meningkatnya konsentrasi obat, dan NP BSA yang dimuat Ats menunjukkan sitotoksisitas yang meningkat secara bertahap. Ini membuktikan bahwa Ats dan NP BSA yang dimuat Ats menghambat pertumbuhan sel tumor dan rasio penghambatan bergantung pada dosis Ats. Dibandingkan dengan Ats bebas, NP BSA yang dimuat Ats menunjukkan sitotoksisitas dan sensitivitas yang lebih tinggi pada kedua sel, dan mereka menghasilkan inhibisi sel yang lebih besar. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1d, e, perawatan kedua sel dengan NP BSA yang dimuat Ats menyebabkan penurunan yang signifikan pada daya hidup sel pada 24 jam dibandingkan dengan Ats bebas. Nilai konsentrasi hemmaksimal 50% (IC50) untuk sel SMMC-7721 dan Plc yang dirawat dengan NP BSA yang dimuat Ats adalah 50,1 dan 44,9 μg/mL pada 24 jam, masing-masing, yang dibandingkan dengan nilai yang diperoleh sebesar 69,2 dan 74,9 μg/mL pada 24 jam pada sel yang dirawat dengan Ats bebas. Ini menunjukkan bahwa ketika Ats dimuat dalam NP BSA, itu mungkin mengubah lokasi intrakelularnya, yang diantisipasi oleh NP, dan pada akhirnya membunuh lebih banyak sel.

Pengambilan Sel In Vitro NP BSA

Distribusi intrakelular dan lokasi NP BSA pada kedua jenis sel tumor diamati oleh mikroskop laser skaning konfokal, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Setelah NP yang dilabeli rodamin B dikultur bersama sel selama 3 jam, fluoresensi merah terlihat jelas dalam sitoplasma; seiring berjalannya waktu, mayoritas NP BSA diinternalisasi secara intrakelular dan menyebar ke sitoplasma, menampilkan fluoresensi merah yang meningkat bergantung pada waktu. Juga diamati bahwa NP BSA yang berada dalam sitoplasma telah co-lokasi dengan mitokondria, seperti yang ditunjukkan oleh munculnya fluoresensi kuning, yang berfungsi untuk menunjukkan bahwa fluoresensi merah bawaan NP yang dilabeli rodamin B dan fluoresensi hijau yang diemisi oleh indikator mitokondria MitoTracker® green FM telah digabungkan. Ini membuktikan bahwa NP BSA yang diinternalisasi dapat secara spesifik terakumulasi dalam mitokondria, menggarisbawahi kemungkinan bahwa Ats dapat dikirim ke mitokondria dengan perantaraan NP BSA.

Analisis Potensi Membran Mitokondria

Untuk menjelaskan apakah NP BSA yang dimuat Ats mengganggu fungsi mitokondria setelah pengiriman Ats ke mitokondria, perubahan potensi membran mitokondria ditentukan. Gambar 3 menunjukkan bahwa setelah pewarnaan JC-1, mayoritas mitokondria pada sel tumor yang dirawat dengan Ats bebas menunjukkan fluoresensi merah yang kuat dan intensitas fluoresensi hijau yang lemah. Ini menunjukkan bahwa mayoritas JC-1 berada dalam keadaan agregat, memperkuat integritas membran mitokondria dan potensi yang lebih tinggi. Sebaliknya, ketika JC-1 mewarnai sel yang dirawat dengan NP BSA yang dimuat Ats, mitokondria pada kedua sel tumor menunjukkan fluoresensi hijau yang lebih kuat, menunjukkan bahwa membran mitokondria terlewat secara serius dan potensinya secara signifikan menurun. Secara keseluruhan, ini membuktikan bahwa Ats berhasil dikirim ke mitokondria dengan perantaraan NP BSA, resulting dalam depolarisasi membran mitokondria.

Pengukuran Produksi ROS dan Pewarnaan ER

Telah banyak dikonfirmasi bahwa pembuatan sejumlah besar ROS dapat menyebabkan peroksidasi fosfolipid dalam membran dalam mitokondria dan juga dapat menginduksi penurunan potensi membran mitokondria, sehingga mengakibatkan pelepasan cepat sitokrom C. Kami menggunakan DCFH-DA sebagai sond fluoresens untuk mendeteksi perubahan ROS. DCFH-DA melewati membran sel secara bebas ke dalam sel dan diubah menjadi DCFH oleh hidrolisis esterase. DCFH yang dihasilkan tidak dapat melewati membran sel, dan dapat dengan mudah dimuat ke dalam sel. ROS intrakelular mengoksidasi DCFH yang tidak fluoresen menjadi DCF dengan warna fluoresensi hijau. Oleh karena itu, deteksi fluoresensi DCF dapat menunjukkan tingkat ROS intrakelular.

Ketika kedua sel dirawat dengan Ats bebas dan NP BSA yang dimuat Ats selama waktu tertentu, jumlah ROS intrakelular juga telah meningkat, menunjukkan hubungan yang bergantung pada waktu. Dibandingkan dengan Ats bebas, pembuatan ROS pada sel SMMC-7721 dan Plc yang dirawat dengan NP BSA yang dimuat Ats secara signifikan ditingkatkan. Gambar 4a menunjukkan bahwa tingkat ROS pada sel SMMC-7721 dan Plc yang terpapar NP BSA yang dimuat Ats selama 48 jam telah meningkat menjadi 1,53 kali dan 1,28 kali, masing-masing, dibandingkan dengan sel SMMC-7721 dan Plc yang dirawat dengan Ats bebas. Ini mendukung ide bahwa NP mempercepat produksi ROS intrakelular. Dibandingkan dengan grup kontrol dan Ats bebas, dan setelah dirawat dengan NP BSA yang dimuat Ats, intensitas pewarnaan fluoresensi dari ER-Tracker Blue–White DPX sebagai warna spesifik ER secara signifikan meningkat, menunjukkan bahwa stres ER juga terpicu pada sel yang dirawat dengan NP BSA yang dimuat Ats dengan peningkatan ROS yang sesuai. Temuan ini menyoroti bahwa Ats secara spesifik terletak dalam mitokondria, yang diantisipasi oleh NP BSA; ini mengakibatkan peningkatan yang signifikan pada tingkat radikal bebas oksigen dalam sel, sehingga memicu induksi stres ER dan mengaktifkan jalur mitokondria untuk menginduksi apoptosis sel yang bergantung pada caspase.

Evaluasi Apoptosis dan Nekrosis Sel

Sel dirawat dengan uji pewarnaan Annexin V-FITC/PI. Sel hidup tidak terikat dengan Annexin V-FITC/PI, sehingga tidak ada fluoresensi yang muncul. Sel apoptotik tidak terikat dengan PI, tetapi mereka diwarnai dengan Annexin V-FITC, menghasilkan fluoresensi hijau. Sebaliknya, untuk sel onkosis, membran sel mereka rusak hingga sejauh mana, dan inti sel melebar hingga hancur menjadi potongan, sehingga menunjukkan fluoresensi hijau dan merah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5a, dibandingkan dengan grup kontrol, ketika Ats bebas dan NP yang dimuat diinkubasi dengan sel selama 24 jam, fluoresensi hijau dan merah yang kuat diamati pada sel, menunjukkan bahwa Ats bebas dan NP BSA yang dimuat Ats menginduksi onkosis dan apoptosis sel tumor. Khususnya setelah dirawat dengan NP BSA yang dimuat Ats, intensitas fluoresensi pewarnaan yang diperoleh dari Annexin V-FITC dan PI telah secara signifikan meningkat, menunjukkan bahwa tingkat onkosis dan apoptosis secara signifikan ditingkatkan pada sel yang dirawat dengan NP yang dimuat Ats.

Persentase apoptosis awal (Q4), onkosis (Q2), nekrosis (Q1), dan sel hidup (Q3) ditunjukkan pada Gambar 5b. Temuan ini menunjukkan bahwa ketika sel dirawat dengan Ats bebas, tingkat onkosis secara bertahap meningkat menjadi 24,4 dan 4,6%, dan tingkat apoptosis tetap pada 4,9 dan 7,1% pada sel SMMC-7721 dan Plc, masing-masing, menunjukkan bahwa Ats bebas memicu terjadinya onkosis dan apoptosis untuk mengakibatkan kematian sel. Sebaliknya, NP BSA yang dimuat Ats secara signifikan meningkatkan tingkat apoptosis dan onkosis sel. Rasio apoptosis secara signifikan meningkat menjadi 10,9% pada sel SMMC-7721 dan 11,5% pada sel Plc. Rasio onkosis meningkat menjadi 29,0% pada sel SMMC-7721 dan 21,6% pada sel Plc. Ini menunjukkan bahwa pengiriman mitokondria Ats dengan perantaraan NP BSA mempercepat kematian sel tumor dengan meningkatkan efek onkosis dan apoptosis. NP BSA yang dimuat Ats memicu proses transduksi sinyal apoptosis dan mempromosikan reaksi runtut apoptosis sel yang diantisipasi oleh mitokondria.

Analisis Western Blot

Untuk menjelajahi ketergantungan kematian sel pada apoptosis yang diinduksi oleh Ats bebas dan NP yang dimuat, uji western blot dilakukan untuk mendeteksi ekspresi protein apoptosis. Ditemukan bahwa pada sel SMMC-7721 yang dirawat dengan NP yang dimuat Ats, tingkat ekspresi protein Bax intrakelular secara signifikan meningkat (Gambar 6). Temuan ini menunjukkan bahwa dengan bantuan NP BSA, Ats terakumulasi dalam mitokondria dan menyebabkan disfungsi mitokondria. Protein monomer Bax sitoplasmik dipindahkan ke membran luar mitokondria dan mengalami oligomerisasi, membentuk saluran protein di membran luar mitokondria, sehingga lebih lanjut mengakibatkan peningkatan permeabilitas membran. Tingkat ekspresi sitokrom C dalam sitoplasma juga secara khusus dan signifikan ditingkatkan, dan ekspresi caspase-3 dan caspase-9 ditemukan menunjukkan tren naik. Oleh karena itu, berkat permeabilitas membran mitokondria yang lebih tinggi, sitokrom C secepatnya dilepaskan ke sitoplasma, mengaktifkan protein sinyal kematian sel (caspase) dan mempromosikan reaksi runtut apoptosis sel. Sebaliknya, Ats bebas tidak memiliki perbedaan yang signifikan pada ekspresi protein terkait apoptosis dan sitokrom C, yang menunjukkan bahwa Ats bebas tidak memicu apoptosis sel yang diantisipasi oleh mitokondria dan terutama bergantung pada onkosis untuk mengakibatkan kematian sel. NP BSA meningkatkan akumulasi obat dalam mitokondria dan mengaktifkan efek apoptosis yang diantisipasi oleh mitokondria, sehingga mengakibatkan apoptosis yang signifikan dan meningkatkan ekspresi protein utama terkait apoptosis, seperti yang ditunjukkan dalam analisis western blot kami.

Pembahasan

Onkosis dan apoptosis mewakili dua cara berbeda di mana sel mengalami kematian. Apoptosis adalah proses aktif kematian sel terprogram yang terjadi pada organisme sel selular. Di sisi lain, onkosis menggambarkan kematian sel yang tidak bergantung pada caspase yang ditandai dengan pembengkakan, permeabilitas yang meningkat, dan pecahan membran, yang sering disebut nekrosis. Bentuk kematian sel ini dianggap sebagai kecelakaan dan tidak terkontrol. Berdasarkan penyelidikan kami, kami menemukan bahwa Ats menghambat pertumbuhan sel tumor dan rasio penghambatan bergantung pada dosis Ats. Ats terutama bergantung pada tingkat onkosis dan mengakibatkan kematian sel; ini juga mengaktifkan kematian sel yang tidak bergantung pada caspase dalam bentuk onkosis. Sebaliknya, dan terpisah dari terjadinya kematian mirip onkosis yang jelas, ketika sel tumor dirawat dengan NP BSA yang dimuat Ats, NP BSA yang dimuat Ats diinternalisasi ke dalam sitoplasma dan dengan cepat terletak dalam mitokondria untuk melepaskan Ats, yang diantisipasi oleh NP. Ats dalam mitokondria menghasilkan ROS dan memicu stres ER; ini lebih lanjut mengaktifkan jalur apoptosis sel yang bergantung pada caspase dan diantisipasi oleh mitokondria dengan menurunkan potensi membran mitokondria, melepaskan sitokrom C, dan mempromosikan ekspresi protein Bax, caspase 3 terbelah, dan caspase 9. Secara keseluruhan, NP BSA yang dimuat Ats meningkatkan pengiriman mitokondria Ats dan meningkatkan tingkat onkosis dan apoptosis untuk menginduksi kematian sel, sehingga meningkatkan sitotoksisitas obat dan menginduksi kematian sel yang signifikan.

Kesimpulan

Singkatnya, kami menjelaskan bahwa Ats bebas pada sel tumor sangat bergantung pada tingkat onkosis untuk menghambat proliferasi sel tumor dalam bentuk kematian mirip onkosis; sehingga sitotoksisitas obat terbatas dan tidak diinginkan. Sebaliknya, NP BSA yang dimuat Ats mengaktifkan jalur apoptosis mitokondria dan secara bersamaan memicu efek onkosis; bersama-sama, mereka meningkatkan efektivitas anti-tumor sinergis Ats. Hasil studi ini menyoroti signifikansi NP BSA yang dimuat Ats dalam peningkatan efek sitotoksis dan apoptosis Ats, dan lebih lanjut menunjukkan peran NP BSA dalam diversifikasi jalur kematian sel yang diinduksi oleh Ats. Dibandingkan dengan Ats bebas, NP BSA yang dimuat Ats menginduksi sitotoksisitas yang lebih besar dan efek apoptosis sel yang signifikan pada sel tumor.

Efeksi Kecepatan Geser terhadap Keausan Tribokimia Silikon Tanpa Oksida Respons Suhu Optik yang Ditingkatkan pada Kaca Keramik Hexagonal NaGdF₄ Doped Er³⁺ melalui Co-Doping Tm³⁺

bahan nano