Pengiriman Nanopartikel Artesunate Meningkatkan Efisiensi Anti-tumor dengan Mengaktifkan Apoptosis Sel yang Dimediasi Mitokondria
Abstrak
Artemisinin dan turunannya dianggap mengerahkan spektrum aktivitas anti-kanker yang luas, dan mereka menginduksi efek anti-kanker yang signifikan dalam sel tumor. Artemisinin dan turunannya dapat diserap dengan cepat, dan didistribusikan secara luas, membunuh sel tumor secara selektif. Karena konsentrasi rendah artesunat terutama bergantung pada onkosis untuk menginduksi kematian sel dalam sel tumor, efek antitumornya tidak diinginkan dan terbatas. Untuk mendapatkan efek anti-tumor yang lebih baik, dalam penelitian ini, kami memanfaatkan nanoteknologi baru untuk merancang nanopartikel albumin serum sapi yang dimuat artesunat baru untuk mencapai akumulasi mitokondria artesunat dan menginduksi apoptosis yang dimediasi mitokondria. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bila dibandingkan dengan ketergantungan artesunat bebas pada kematian onkotik, nanopartikel albumin serum sapi yang mengandung artesunat menunjukkan sitotoksisitas yang lebih tinggi dan efek apoptosis signifikan mereka diinduksi melalui distribusi artesunat di mitokondria. Temuan ini menunjukkan bahwa nanopartikel albumin serum sapi yang mengandung artesunat merusak integritas mitokondria dan mengaktifkan apoptosis sel yang dimediasi mitokondria dengan meningkatkan regulasi protein terkait apoptosis dan memfasilitasi pelepasan sitokrom C secara cepat.
Latar Belakang
Artemisinin dan turunannya telah banyak digunakan dalam pengobatan malaria karena aktivitas antimalaria yang tinggi dan toksisitas yang rendah. Para peneliti juga menemukan bahwa artemisinin dan turunannya menunjukkan aktivitas anti-tumor yang signifikan berdasarkan sedikit efek samping toksik dan toleransi yang lebih besar oleh pasien [1]. Dilaporkan bahwa artesunat (Ats) pasti menghambat pertumbuhan sel tumor dan selanjutnya menginduksi efek anti-kanker yang signifikan pada sel tumor [2,3,4]. Beberapa percobaan menunjukkan bahwa Ats menyebabkan tingkat apoptosis dan onkosis yang berbeda dalam sel tumor setelah 48 jam, dan bahwa tingkat apoptosis dan onkosis bergantung pada dosis Ats. Pada konsentrasi rendah, Ats tidak menginduksi apoptosis yang jelas pada sel tumor dan kematian sel yang diinduksi Ats disertai dengan kematian seperti onkosis [5,6,7,8]. Untuk mendapatkan efek anti-tumor yang lebih besar, dosis Ats yang lebih tinggi diterapkan, tetapi ini semakin menegaskan toksisitas serius dan penekanan sumsum tulang. Oleh karena itu, perlu dicari pengobatan yang efektif untuk mengurangi dosis efektif Ats untuk meningkatkan efisiensi anti tumornya [9,10,11]. Ditemukan bahwa mitokondria memainkan peran penting dalam mengatur efek apoptosis dan onkotik Ats. Mitokondria juga terlibat dalam mengatur proses transduksi dari berbagai sinyal apoptosis [12,13,14,15,16,17]. Ketika mitokondria diserang oleh obat-obatan, permeabilitasnya meningkat dan potensial membran telah menurun, sehingga menyebabkan pembengkakan endometrium membran mitokondria dan pelepasan cepat sitokrom C dari mitokondria ke dalam sitoplasma [18,19,20]. Selanjutnya, beberapa protein dari keluarga caspase diaktifkan, dan reaksi kaskade apoptosis sel diinduksi.
Untuk meningkatkan efek anti-tumor dari Ats, banyak teknik baru dicoba untuk meningkatkan distribusi obat dalam sel tumor atau untuk meningkatkan pengiriman obat yang ditargetkan ke dalam organel sel untuk menginduksi kematian sel [21,22,23]. Nanopartikel (NP) sebagai alat utama dalam pengobatan kanker yang ditargetkan telah diselidiki secara luas, dan mereka telah menunjukkan potensi yang menjanjikan. Karena NP menampilkan ukuran partikel yang lebih kecil dan luas permukaan yang tinggi, NP dapat memasuki sirkulasi darah melalui kapiler dan melewati celah sel endotel dan bermigrasi ke lokasi tumor, sehingga mencapai distribusi obat yang ditargetkan dan meningkatkan bioavailabilitas obat. . Selain itu, NP dapat mengontrol pelepasan obat melalui degradasi biomaterial dalam pola yang panjang dan halus, yang pada akhirnya memperpanjang waktu paruh eliminasi, meningkatkan konsentrasi darah yang efektif, dan mengurangi frekuensi pemberian dosis. Yang terpenting, NP yang mengandung obat dapat dikirim ke lokasi tertentu di dalam sel, meningkatkan kemanjuran pengobatan [24,25,26].
Untuk meningkatkan efek anti-tumor Ats pada konsentrasi rendah, kami mencoba merancang NP albumin serum sapi (BSA) baru yang memuat Ats. Karena pH rendah dalam sel tumor, akumulasi sejumlah besar proton hidrogen yang ada di membran luar mitokondria atau di ruang antar membran, sebaliknya, membran antar mitokondria kaya akan muatan negatif karena komposisi kimianya dan matriks mitokondria. sekresi, yang membuat potensial transmembran luar elektropositif dan negatif di dalam yang dapat membuat pengiriman BSA yang menguntungkan. Kemudian, akumulasi besar-besaran Ats di mitokondria dapat secara efektif memicu apoptosis yang dimediasi mitokondria. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jika dibandingkan dengan kematian onkotik tipikal yang diinduksi oleh Ats bebas, Ats secara khusus ditransfer ke dalam mitokondria dengan mediasi NP BSA dan mempromosikan aktivasi yang dimediasi mitokondria dari protein caspase terkait apoptosis. Ini memicu apoptosis sel yang signifikan, sehingga menyoroti sitotoksisitas yang lebih tinggi.
Metode
Materi
BSA dibeli dari Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA), dan Ats dibeli dari Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, People's Republic of China). Sel SMMC-7721 dan sel Plc dibeli dari Institut Biokimia dan Biologi Sel dari Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok (Shanghai, Republik Rakyat Tiongkok). Semua bahan kimia yang dibeli lainnya adalah kelas analitis; mereka diperoleh dari berbagai vendor.
Persiapan dan Karakterisasi NP BSA Ats-Loaded
Menurut literatur yang dilaporkan sebelumnya [27], NP BSA Ats-loaded disiapkan melalui metode desolvasi. Secara singkat, NP BSA yang mengandung Ats disiapkan dengan cepat menjatuhkan 1,0 mL alkohol anhidrat yang mengandung sejumlah Ats ke dalam 0,5 mL larutan BSA pada suhu 37 °C hingga opalescence. Dengan penghilangan etanol dengan evaporasi putar, NP BSA bermuatan Ats selanjutnya diendapkan dari media, dan kemudian 8% glutaraldehid dalam air (0,5 L/mg BSA) ditambahkan untuk menginduksi ikatan silang partikel di bawah pengadukan suspensi selama periode waktu. dari 24 jam. Akhirnya, NP dikumpulkan dan dicuci tiga kali dengan air deionisasi untuk menganalisis lebih lanjut karakterisasi fisiknya, termasuk diameter hidrodinamik, indeks polidispersitas (PDI), potensi zeta, dan morfologi menggunakan Brookhaven Zetasizer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA) dan mikroskop elektron transmisi (JEM-1200EX; JEOL, Tokyo, Jepang). Penentuan efisiensi enkapsulasi Ats di NP BSA diperkirakan menggunakan metode yang dilaporkan sebelumnya [27].
Pengujian MTT
Dua jenis garis sel tumor, sel SMMC-7721 dan sel Plc, diinkubasi secara terpisah dengan 20% serum janin sapi (FBS). Kepadatan pertumbuhan sel disesuaikan menjadi l × l0
6
sel/mL berdasarkan jumlah sel, dan kemudian suspensi sel diencerkan menjadi l × l0
5
sel/mL. Suspensi yang diencerkan selanjutnya ditambahkan secara terpisah ke dalam pelat 96-sumur (100 μL per sumur, sekitar 1 × 10
4
sel/sumur) untuk inkubasi terus menerus selama 24 jam pada 37°C dalam kondisi 5% CO2 dan 95% O2 . Media digantikan oleh media bebas serum dengan adanya Ats gratis atau BSA NP yang memuat Ats yang menampilkan konsentrasi Ats yang berbeda, dan kemudian diinkubasi selama 24 jam. Sebanyak 50 μL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (5 mg/mL) ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 4 jam untuk penghentian kultur. Ketika pewarna tetrazolium MTT direduksi menjadi formazan yang tidak larut, pelat 96-sumur disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit, dan supernatan dituang dari masing-masing sumur, diikuti dengan penambahan 150 μL dimetil sulfoksida (DMSO), yang sepenuhnya melarutkan kristal. Absorbansi larutan diukur menggunakan pembaca pelat mikro (Syneray-2; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) pada 490 nm.
Distribusi Intraseluler Grup NP BSA dalam Sel
Sel SMMC-7721 dan sel Plc pada fase logaritmik dipilih dan diperlakukan dengan pencernaan tripsin; konsentrasi sel disesuaikan ke l × l0
6
sel/mL. Selanjutnya, sel-sel yang dikultur ditambahkan ke dalam pelat kultur sel 6-sumur untuk kepatuhan, dan media kultur dihilangkan diikuti dengan penambahan NP BSA berlabel rhodamin B. Nukleus diwarnai dengan Hoechst (biru) selama 15 menit pada 37 ° C, dan mitokondria diwarnai oleh Mitotracker Green FM. Lokasi NP BSA dalam sel dilacak di dalam sel menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Jepang).
Perubahan Potensi Membran Mitokondria
JC-1 dapat digunakan untuk menentukan perubahan potensial membran mitokondria. Ketika potensial membran mitokondria tinggi, JC-1 dapat dengan bebas melewati membran sel dan membentuk agregat di dalam mitokondria, menunjukkan fluoresensi merah (panjang gelombang eksitasi, 525 nm; panjang gelombang emisi, 590 nm); ketika potensial membran mitokondria menurun, JC-1 dipindahkan dari matriks mitokondria ke sitoplasma sel untuk membentuk monomer fluoresen hijau (panjang gelombang eksitasi, 490 nm; panjang gelombang emisi, 530 nm). Sel SMMC-7721 dan sel Plc masing-masing diunggulkan dalam cawan confocal untuk mencapai kepadatan l × l0
6
sel/mL untuk inkubasi terus menerus selama 12 jam. Selanjutnya, media kultur dibuang dan media kultur bebas serum yang mengandung dispersi NP BSA Ats atau Ats-loaded ditambahkan ke dalam cawan. Setelah 9 jam, media dibuang dan sel dicuci dua kali dengan PBS, diikuti dengan penambahan 2 mL JC-1 pada konsentrasi 2 mol/L; sel-sel tersebut kemudian diinkubasi selama 30 menit pada 37 °C dalam kondisi gelap. Mikroskop confocal pemindaian laser (FluoView FV10i; Olympus Corporation) digunakan untuk mengamati perubahan pencitraan pada membran mitokondria.
Pengukuran Produksi ROS dan Pewarnaan Retikulum Endoplasma (ER)
Sel diinkubasi dengan 20% FBS dan kepadatan pertumbuhan sel diatur ke l × l0
6
sel/mL menurut jumlah sel; dan kemudian suspensi sel diencerkan menjadi l × l0
5
sel/mL. Suspensi yang diencerkan selanjutnya ditambahkan ke dalam pelat 96 sumur (100 μL per sumur, sekitar 1 × 10
4
sel/sumur) untuk inkubasi terus menerus selama 24 jam pada 37°C di bawah 5% CO2 dan 95% O2 . Kedua, NP BSA Ats dan Ats-loaded gratis diinkubasi dengan sel selama 6, 12, dan 24 jam, diikuti dengan inkubasi berkelanjutan dengan 10 μM 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA; Sigma-Aldrich Co.) untuk sekitar 30 mnt. Buffer PBS sedingin es digunakan untuk mencuci sel tiga kali untuk menghilangkan NP yang tidak diinternalisasi. Intensitas fluoresensi DCF intraseluler, yang tereksitasi pada 485 nm dan dipancarkan pada 530 nm, dideteksi menggunakan pembaca lempeng mikro (Synergy-2; BioTek Instruments) untuk menyelidiki tingkat stres oksidatif. Kelompok uji diperlakukan dengan sel SMMC-7721 dan sel Plc selama 24 jam, dan ER-Tracker Blue-White DPX probe (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ditambahkan ke dalam sel untuk inkubasi selama 30 menit. Setelah membuang larutan pemuatan dan mencuci sel dengan PBS, perubahan morfologi UGD diamati dengan mikroskop pemindaian laser confocal.
Evaluasi Onkosis dan Apoptosis Sel berdasarkan Flow Sitometri
Menurut protokol penelitian kami sebelumnya [28], uji pewarnaan Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI) digunakan untuk mengevaluasi onkosis sel dan apoptosis yang diinduksi oleh NP BSA bebas Ats dan Ats. Sel dilisiskan dengan typsin dan diunggulkan ke dalam pelat enam sumur pada konsentrasi l × l0
6
sel/mL selama 24 jam inkubasi terus menerus. Selanjutnya, media kultur dihilangkan dan media bebas serum yang mengandung Ats dan NP BSA bermuatan Ats ditambahkan ke dalam sumur. Setelah perawatan, sel-sel dikumpulkan dan disuspensikan dalam buffer Nicoletti (Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Beijing, Republik Rakyat Tiongkok) yang mengandung Annexin V (AV-FITC) berlabel PI dan FITC. Perubahan morfologi sel diamati dengan mikroskop pemindaian laser confocal. Untuk memverifikasi tingkat apoptosis dan onkosis sel yang diinduksi oleh NP yang dimuat Ats, persentase apoptosis awal (Q4), onkotik (Q2), nekrotik (Q1), dan sel hidup (Q3) diukur dengan flow cytometry.
Analisis Western Blot Protein Terkait Apoptosis dan Sitokrom C dalam Sel
Uji western blot dilakukan untuk menentukan tingkat protein relatif ketika Ats bebas atau NP bermuatan Ats diinkubasi dengan sel SMMC-7721 selama 24 jam. Sel dilisiskan dengan buffer radioimmunoprecipitation assay (RIPA) sedingin es yang mengandung koktail protease inhibitor dan inhibitor fosfatase (Roche, Basel, Swiss). Konsentrasi protein ditentukan menggunakan kit uji BSA yang dimodifikasi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan dinormalisasi sebelum memuat pada 10% natrium dodesil sulfat (SDS) - elektroforesis gel poliakrilamida (PAGE). Tingkat protein yang ditargetkan difoto dan dianalisis menggunakan sistem analisis gel UVP (iBox Scientia 600; UVP, LLC., Upland, CA, USA).
Hasil
Karakteristik NP BSA dengan Ats-Loaded dan Studi Viabilitas Seluler
Terlihat pada Gambar 1a, b bahwa NP BSA yang dibebani Ats menunjukkan bentuk bola, dan mereka tersebar secara homogen dengan PDI yang lebih rendah pada 0,016. Ukuran partikel rata-rata NP BSA bermuatan Ats adalah sekitar 99,9 ± 2,3 nm dan potensi zeta negatif dan bernilai sekitar –25,6 ± 4,3 mV. Profil rilis menunjukkan rilis yang lancar dan berkelanjutan yang ditunjukkan pada Gambar. 1c. Dibandingkan dengan pelepasan cepat Ats bebas dalam media in vitro, Ats yang terperangkap dalam inti NP BSA perlahan-lahan menyebar dari bagian dalam NP ke dalam media dan menunjukkan pola pelepasan yang halus dan berkelanjutan, karena degradasi BSA yang berkelanjutan. Lebih dari 85% Ats bebas dilepaskan sepenuhnya dalam 6 jam pertama, sedangkan jumlah akumulatif total obat yang dilepaskan dari NP ke media dalam periode 48 jam adalah 78,9%. Hal ini menunjukkan bahwa NP dapat mengontrol pelepasan obat melalui degradasi biomaterial dalam pola yang panjang dan halus, sehingga memperpanjang waktu paruh eliminasi, meningkatkan konsentrasi darah yang efektif, dan mengurangi frekuensi pemberian dosis.
Karakterisasi NP BSA Ats-loaded. a Gambar TEM dari NP BSA yang dimuat Ats. b Analisis hamburan cahaya dinamis (DLS) dari NP BSA bermuatan Ats yang diperoleh. c Profil pelepasan in vitro NP BSA bermuatan Ats dalam saline buffer fosfat dengan pH 7,4 pada 37 °C selama 48 jam. Viabilitas sel SMMC-7721 (d ) dan sel Plc (e ) setelah inkubasi dengan jumlah yang berbeda dari Ats gratis dan NP BSA yang dimuat Ats selama 24 jam. Data disajikan sebagai mean ± SD (n = 3).
#P < 0,05 versus Ats gratis yang sesuai
MTT digunakan untuk menguji efek penghambatan NP BSA Ats dan Ats-loaded bebas dalam sel SMMC-7721 dan sel Plc pada interval waktu yang berbeda. Hasilnya (Gbr. 1d, e) menunjukkan bahwa sitotoksisitas Ats bebas meningkat dengan meningkatnya konsentrasi obat, dan NP BSA yang mengandung Ats menunjukkan sitotoksisitas yang ditingkatkan secara bertahap. Ini membuktikan bahwa NP BSA Ats dan Ats-loaded menghambat pertumbuhan sel tumor dan bahwa rasio penghambatan tergantung pada dosis Ats. Dibandingkan dengan Ats bebas, NP BSA yang memuat Ats menunjukkan sitotoksisitas yang lebih tinggi dan sensitivitas yang lebih tinggi di kedua sel, dan mereka menghasilkan penghambatan sel yang lebih besar. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1d, e, pengobatan kedua sel dengan NP BSA bermuatan Ats menyebabkan penurunan viabilitas sel yang signifikan pada 24 jam jika dibandingkan dengan Ats bebas. Nilai konsentrasi penghambatan maksimal (IC50) 50% untuk sel SMMC-7721 dan sel Plc yang diobati dengan NP BSA bermuatan Ats adalah 50,1 dan 44,9 μg/mL pada 24 jam, yang dibandingkan dengan nilai yang diperoleh 69,2 dan 74,9 g/mL pada 24 jam dalam sel yang diobati dengan Ats gratis. Ini menunjukkan bahwa ketika Ats dimuat dalam NP BSA, ia mungkin mengubah lokasi intraselulernya, seperti yang dimediasi oleh NP, dan pada akhirnya membunuh lebih banyak sel.
Serapan Seluler In Vitro NP BSA
Distribusi intraseluler dan lokasi NP BSA di kedua jenis sel tumor diamati dengan mikroskop pemindaian laser confocal, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Setelah NP berlabel rhodamin B dikultur bersama dengan sel selama 3 jam, fluoresensi merah terlihat jelas dalam sitoplasma; dengan berlalunya waktu, sebagian besar NP BSA diinternalisasikan secara intraseluler dan disebarkan ke dalam sitoplasma, menunjukkan peningkatan fluoresensi merah yang bergantung pada waktu. Juga diamati bahwa NP BSA yang terletak di sitoplasma telah ditempatkan bersama dengan mitokondria, sebagaimana terbukti dengan munculnya fluoresensi kuning, yang berfungsi untuk menunjukkan bahwa fluoresensi merah yang melekat pada NP berlabel rhodamin B dan fluoresensi hijau yang dipancarkan oleh indikator mitokondria MitoTracker® green FM telah digabungkan. Ini membuktikan bahwa NP BSA yang diinternalisasi dapat secara khusus terakumulasi dalam mitokondria, menyoroti kemungkinan bahwa Ats dapat dikirimkan ke mitokondria dengan mediasi NP BSA.
Distribusi seluler in vitro NP BSA setelah diinkubasi dengan sel tumor yang berbeda. Gambar fluoresen sel SMMC-7721 (a ) dan sel Plc (b ). Bilah skala , 100 μm
Analisis Potensi Membran Mitokondria
Untuk mengklarifikasi apakah NP BSA yang dimuat Ats mengganggu fungsi mitokondria setelah pengiriman Ats di mitokondria, perubahan potensial membran mitokondria ditentukan. Gambar 3 menunjukkan bahwa setelah pewarnaan JC-1, sebagian besar mitokondria dalam sel tumor yang diobati dengan Ats bebas menunjukkan fluoresensi merah yang kuat dan intensitas fluoresensi hijau yang lemah. Ini menunjukkan bahwa sebagian besar JC-1 ada dalam keadaan teragregasi, memperkuat integritas membran mitokondria dan potensi yang lebih tinggi. Sebaliknya, ketika JC-1 menodai sel-sel yang diobati dengan NP BSA yang dimuati Ats, mitokondria di kedua sel tumor menunjukkan fluoresensi hijau yang lebih kuat, menunjukkan bahwa membran mitokondria rusak parah dan potensinya menurun secara signifikan. Secara keseluruhan, terbukti bahwa Ats berhasil dikirim ke mitokondria dengan mediasi NP BSA, menghasilkan depolarisasi membran mitokondria.
Perubahan pencitraan potensi membran mitokondria setelah inkubasi NP BSA Ats dan Ats-loaded gratis dengan sel SMMC-7721 dan sel Plc. Bilah skala , 100 μm
Pengukuran Produksi ROS dan Pewarnaan UGD
Telah dikonfirmasi secara luas bahwa pembentukan sejumlah besar ROS dapat menyebabkan peroksidasi fosfolipid di membran mitokondria bagian dalam dan juga dapat menginduksi penurunan potensial membran mitokondria, sehingga menghasilkan pelepasan sitokrom C yang cepat. Kami menggunakan DCFH- DA sebagai probe fluoresen untuk mendeteksi perubahan ROS. DCFH-DA melewati secara bebas melalui membran sel ke dalam sel dan diubah menjadi DCFH oleh hidrolisis esterase. DCFH yang dihasilkan tidak dapat melewati membran sel, dan dapat dengan mudah dimuat ke dalam sel. ROS intraseluler mengoksidasi DCFH non-fluoresen menjadi DCF dengan warna neon hijau. Oleh karena itu, deteksi fluoresensi DCF dapat menunjukkan tingkat ROS intraseluler.
Ketika kedua sel diperlakukan dengan NP BSA Ats dan Ats-loaded gratis untuk jangka waktu tertentu, jumlah ROS intraseluler juga meningkat, menunjukkan hubungan yang bergantung pada waktu. Dibandingkan dengan Ats gratis, generasi ROS dalam sel SMMC-7721 dan sel Plc yang diobati dengan NP BSA yang dimuat Ats meningkat secara signifikan. Gambar 4a menunjukkan bahwa level ROS dalam sel SMMC-7721 dan sel Plc yang terpapar pada NP BSA yang dimuat Ats selama 48 jam masing-masing telah meningkat menjadi 1,53 kali lipat dan 1,28 kali lipat jika dibandingkan dengan sel SMMC-7721 dan sel Plc yang diobati dengan Ats gratis. Ini mendukung gagasan bahwa NP mempercepat produksi ROS intraseluler. Dibandingkan dengan kelompok kontrol dan Ats bebas, dan setelah dirawat dengan NP BSA bermuatan Ats, intensitas pewarnaan fluoresensi dari ER-Tracker Blue-White DPX sebagai pewarna spesifik ER meningkat secara signifikan, menunjukkan bahwa stres ER juga dipicu. dalam sel yang diobati dengan NP yang dimuati Ats dengan peningkatan level ROS yang sesuai. Temuan ini menyoroti bahwa Ats secara khusus terletak di mitokondria, seperti yang dimediasi oleh BSA NP; ini menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam tingkat radikal bebas oksigen di dalam sel, sehingga memicu induksi stres ER dan mengaktifkan jalur mitokondria untuk menginduksi apoptosis seluler yang bergantung pada caspase.
Kuantifikasi generasi ROS dalam sel yang diobati dengan Ats gratis dan NP BSA yang dimuat Ats pada waktu yang berbeda (a ). Pewarnaan ER dengan ER-Tracker Blue–White DPX probe (b ). Bilah skala , 100 μm. Data disajikan sebagai mean ± SD (n = 3).
+P < 0,05 versus kelompok kontrol pada 12 jam, *P < 0,05 versus kelompok kontrol pada 24 jam,
#P < 0,05 versus kelompok kontrol pada 24 jam
Evaluasi Apoptosis dan Nekrosis Sel
Sel diperlakukan dengan uji pewarnaan Annexin V-FITC/PI. Sel hidup tidak berikatan dengan Annexin V-FITC/PI, sehingga tidak ada fluoresensi yang muncul. Sel-sel apoptosis tidak mengikat PI, tetapi mereka diwarnai dengan Annexin V-FITC, menghasilkan fluoresensi hijau. Sebaliknya, untuk sel onkotik, membran selnya rusak sampai batas tertentu, dan inti sel melebar hingga pecah berkeping-keping, sehingga menunjukkan fluoresensi hijau dan merah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, dibandingkan dengan kelompok kontrol, ketika NP bebas Ats dan Ats-loaded diinkubasi dengan sel selama 24 jam, fluoresensi hijau dan merah yang kuat diamati dalam sel, menunjukkan bahwa NP BSA bebas Ats dan Ats-loaded menginduksi onkosis sel tumor dan apoptosis. Terutama setelah dirawat dengan NP BSA yang dimuat Ats, intensitas fluoresensi pewarnaan yang diperoleh dari Annexin V-FITC dan PI telah meningkat secara signifikan, menunjukkan bahwa derajat onkosis dan apoptosis ditingkatkan secara signifikan dalam sel-sel yang diobati dengan NP yang dimuati Ats.
Morfologi perubahan ultrastruktural sel yang diobati dengan NP BSA Ats dan Ats-loaded gratis menggunakan uji pewarnaan Annexin V-FITC/PI (a ). Bilah skala , 100 μm. Analisis flow cytometer dari apoptosis seluler dan onkosis setelah 24 jam inkubasi dengan NP BSA bebas Ats dan Ats-loaded masing-masing (b )
Persentase apoptosis awal (Q4), onkotik (Q2), nekrotik (Q1), dan sel hidup (Q3) ditunjukkan pada Gambar 5b. Temuan ini menunjukkan bahwa ketika sel diperlakukan dengan Ats bebas, tingkat onkotik secara bertahap meningkat menjadi 24,4 dan 4,6%, dan tingkat apoptosis tetap pada 4,9 dan 7,1% pada sel SMMC-7721 dan sel Plc, masing-masing, menunjukkan bahwa Ats bebas dipicu terjadinya onkosis dan apoptosis yang berujung pada kematian sel. Sebaliknya, NP BSA yang dimuat Ats secara signifikan meningkatkan tingkat apoptosis dan onkosis sel. Rasio apoptosis meningkat secara signifikan menjadi 10,9% pada sel SMMC-7721 dan menjadi 11,5% pada sel Plc. Rasio onkotik meningkat menjadi 29,0% pada sel SMMC-7721 dan menjadi 21,6% pada sel Plc. Ini menunjukkan bahwa pengiriman Ats mitokondria dengan mediasi NP BSA mempercepat kematian sel tumor dengan meningkatkan efek onkotik dan apoptosis. NP BSA ats-loaded memicu proses transduksi sinyal apoptosis dan mempromosikan reaksi kaskade apoptosis seluler yang dimediasi mitokondria.
Analisis Western Blot
Untuk mengeksplorasi ketergantungan kematian sel pada apoptosis yang diinduksi oleh Ats bebas dan NP bermuatan Ats, uji western blot dilakukan untuk mendeteksi ekspresi protein apoptosis. Ditemukan bahwa dalam sel SMMC-7721 yang dirawat dengan NP yang dimuati Ats, tingkat ekspresi protein Bax intraseluler meningkat secara signifikan (Gbr. 6). Temuan ini menunjukkan bahwa dengan bantuan NP BSA, Ats terakumulasi dalam mitokondria dan menyebabkan disfungsi mitokondria. Protein monomer Bax sitoplasma dipindahkan ke membran luar mitokondria dan mengalami oligomerisasi, membentuk saluran protein di membran luar mitokondria, sehingga selanjutnya menyebabkan peningkatan permeabilitas membran. Tingkat ekspresi sitokrom C dalam sitoplasma juga secara khusus dan signifikan ditingkatkan, dan ekspresi caspase-3 dan caspase-9 ditemukan menunjukkan tren yang meningkat. Oleh karena itu, karena permeabilitas membran mitokondria yang lebih tinggi, sitokrom C dilepaskan dengan cepat ke dalam sitoplasma, mengaktifkan protein pensinyalan kematian sel (caspases) dan mendorong reaksi kaskade apoptosis seluler. Sebaliknya, Ats bebas tidak memiliki perbedaan yang signifikan pada ekspresi protein terkait apoptosis dan sitokrom C, menunjukkan bahwa Ats bebas tidak memicu apoptosis sel yang dimediasi mitokondria dan terutama mengandalkan onkosis untuk menyebabkan kematian sel. NP BSA meningkatkan akumulasi obat di mitokondria dan mengaktifkan efek apoptosis yang dimediasi mitokondria, sehingga mengarah pada apoptosis yang signifikan dan meningkatkan ekspresi protein yang relevan dengan apoptosis primer, seperti yang ditunjukkan dalam analisis western blot kami.
Analisis Western blot dari tingkat ekspresi caspase-3 yang dibelah, caspase-9, Bax, dan sitokrom C dalam sel SMMC-7721. *P < 0,05 versus ekspresi protein Bax dari kelompok kontrol;
#P < 0,05 versus ekspresi caspase-3 yang dibelah dari kelompok kontrol;
+P < 0,05 versus ekspresi protein caspase-9 dari kelompok kontrol;
xP < 0,05 versus ekspresi protein sitokrom C dari kelompok kontrol. Data disajikan sebagai mean ± SD (n = 3)
Diskusi
Onkosis dan apoptosis mewakili dua cara berbeda di mana sel mengalami kematian. Apoptosis adalah proses aktif kematian sel terprogram yang terjadi pada organisme multiseluler. Onkosis, di sisi lain, menggambarkan kematian sel caspase-independen yang ditandai dengan pembengkakan, peningkatan permeabilitas, dan pecahnya membran, yang sering disebut sebagai nekrosis. Bentuk kematian sel ini diyakini tidak disengaja dan tidak terkendali. Berdasarkan penyelidikan kami, kami menemukan bahwa Ats menghambat pertumbuhan sel tumor dan bahwa rasio penghambatan bergantung pada dosis Ats. Ats terutama bergantung pada derajat onkosis dan menyebabkan kematian sel; itu juga mengaktifkan kematian sel caspase-independen dalam bentuk onkosis. Sebaliknya, dan secara terpisah dari terjadinya kematian seperti onkosis yang jelas, ketika sel tumor diobati dengan NP BSA yang dimuat Ats, NP BSA yang dimuat Ats diinternalisasi ke dalam sitoplasma dan dengan cepat ditempatkan di dalam mitokondria untuk melepaskan Ats, seperti yang dimediasi oleh NP. Ats di mitokondria menghasilkan ROS dan memicu stres ER; itu lebih lanjut mengaktifkan jalur apoptosis sel yang bergantung pada caspase yang dimediasi mitokondria dengan mengurangi potensi membran mitokondria, melepaskan sitokrom C, dan mempromosikan ekspresi protein Bax, caspase 3 yang dibelah, dan caspase 9. Secara bersama-sama, NP BSA yang dimuat Ats meningkatkan pengiriman Ats mitokondria dan meningkatkan derajat onkosis dan apoptosis untuk menginduksi kematian sel, sehingga meningkatkan sitotoksisitas obat dan menginduksi kematian sel yang signifikan.
Kesimpulan
Secara singkat, kami mengklarifikasi bahwa Ats bebas dalam sel tumor sangat bergantung pada derajat onkosis untuk menghambat proliferasi sel tumor dalam bentuk kematian seperti onkosis; dengan demikian, sitotoksisitas obat terbatas dan tidak diinginkan. Sebaliknya, NP BSA yang dimuat Ats mengaktifkan jalur apoptosis mitokondria dan secara bersamaan memicu efek onkotik; bersama-sama, mereka meningkatkan kemanjuran anti-tumor sinergis dari Ats. The results of this study highlighted the significance of Ats-loaded BSA NPs in the enhancement of the cytotoxic and apoptotic effects of Ats, and they further signify the role of BSA NPs in diversifying the pathways of cell death induced by Ats. Compared with free Ats, Ats-loaded BSA NPs induced greater cytotoxicity and significant cell apoptosis effects in tumor cells.
