Nanokarier Tetrahedron DNA Meningkatkan Apoptosis yang Diperankan Doxorubicin pada Sel Kanker Kolon HT-29

Latar Belakang

Doxorubisin (Dox) adalah salah satu agen antineoplastik yang paling banyak digunakan, dan banyak studi klinis menunjukkan bahwa Dox dapat secara menonjol menghambat pertumbuhan sel tumor dalam berbagai siklus pertumbuhan sel dengan menghambat sintesis RNA dan DNA [1, 2]. Studi sebelumnya mengusulkan bahwa proliferasi sel tumor secara efektif terblokir pada fase G1, dan metastase juga terhambat oleh Dox pada konsentrasi tertentu [3]. Selain itu, inhibisi yang efektif dapat dicakup dengan dosis yang relatif lebih kecil dibandingkan dengan obat antikanker lainnya [4]. Namun, Dox biasanya menimbulkan efek samping karena kurangnya target spesifik untuk sel tumor dan inhibisi nonselektif DNA dan RNA, yang serius membatasi aplikasi klinisnya [5, 6]. Sementara itu, kapasitas penyerapan sel yang rendah mengurangi akumulasi Dox dalam sel tumor [7]. Oleh karena itu, sistem pengiriman yang efisien untuk Dox harus dikembangkan untuk membuat Dox lebih spesifik dan efektif targeting, lebih mudah dikapsulasi, dan memiliki kapasitas penyerapan serta kompatibilitas biologis yang baik.

Penangkap obat berukuran nano, seperti liposom dan nanopartikel anorganik, dapat memfasilitasi Dox menembus membran sel tumor, meningkatkan efisiensi targeting [8]. Namun, pengiriman berbasis liposom tidak dapat mengurangi efek samping pada sel normal karena targeting yang relatif buruk; sementara penangkap anorganik, seperti nanopartikel silika mesoporos, tidak dapat terbiodegradasi sepenuhnya in vivo, menghambat proses penyerapan obat lebih lanjut dan membawa potensi bio-toksisitas. Untuk sistem pengiriman fungsional ini, kompleksitas persiapan, tidak homogenisasi struktur nanopartikel, dan efisiensi enkapsulasi yang rendah menghambat ekspansi klinis [9,10,11]. Sebagai penangkap obat berukuran nano dengan kinerja yang unggul pada pengiriman obat, struktur berbasis DNA, seperti tetrahedron DNA (DNA tetra), dapat menembus membran dengan menghindari ketidakcocokan antara DNA bermuatan negatif dan membran plasma [12,13,14,15,16,17]. Obat dan molekul targeting dapat terpasang secara kovalen pada tetrahedron DNA. Selain itu, penyerapan yang mudah dan biodegradasi urutan tetrahedron DNA menghindari retensi jangka panjang. Obat aptamer kaya guanin, seperti AS1411, telah berhasil dikirimkan ke sel tumor A549 dan berfungsi sebagai agen targeting dan inhibitor [18]. Faktor imun regulasi, seperti CpG dan siRNA, juga dapat dikirimkan ke sel tumor melalui penangkap tetra DNA untuk mengatur respons imun [19]. Dengan keuntungan toksisitas rendah, kompatibilitas biologis yang tepat, dan targeting yang dapat disesuaikan, tetra DNA menunjukkan bio-keamanan dan potensi untuk pengiriman Dox.

Dalam studi ini, partikel fungsional tetrahedron DNA yang dirangka dengan Dox sebagai obat antikanker, dan asam folat sebagai molekul pengenalan spesifik [20], dirancang, disintesis, dan dikarakterisasi. Efisiensi antikanker dievaluasi pada sel kanker kolon mengingat reseptor folat yang signifikan ditingkatkan pada permukaan membran sel. Secara spesifik, tingkat penyerapan seluler, tingkat apoptosis yang diinduksi Dox, dan inhibisi proliferasi sel diukur pada baris sel HT-29.

Metode

Reagen dan Peralatan

Rantai oligonukleotida DNA dibeli dari TAKARA di Dalian, Tiongkok. Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) dan serum fetal sapi dibeli dari Gibco di NY, AS. Penisilina dan streptomisin dibeli dari Beyotime biotechnology di Shanghai, Tiongkok. Asam folat, doxorubisin, 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazolium bromide (MTT), dan agarose dibeli dari Sigma-Aldrich di MO, AS. Semua antibodi dibeli dari Abcam Company di Shanghai, Tiongkok. Reagen lainnya dibeli dari Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd., di Shanghai, Tiongkok.

UV-Vis spectrophotometer (Thermo Evolution 201) dan incubator suhu konstan dibeli dari Thermo Fisher di AS; mesin sentrifugal (GT10-1) dibeli dari Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd.; fluoresensi spectrophotometer (UV-1800) dibeli dari Shimadzu Corporation. Mikroskopi laser konfokal (Visitech) dibeli dari Leica companies; instrumen reaksi rantai polimerase (PCR, T100), elektroforesis protein, dan aparatur elektroforesis asam nukleat dibeli dari Bio-Rad Company; analis ukuran partikel cahaya dinamis dibeli dari Beckman Company; plates kultur sel dengan 96-well atau 24-well dibeli dari Dow Corning Corporation. HPLC (Agilent 1200) dengan kolom C18 dibeli dari Agilent Technologies.

Baris sel kanker kolon manusia HT-29 dipertahankan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% serum fetal sapi, 100 U/mL penisilina, dan 100 μg/mL streptomisin dalam atmosfer lembap yang mengandung 95% udara dan 5% karbondioksida pada 37 °C.

Sintesis dan Pemurnian Tetrahedron DNA

Dalam penelitian ini, sintesis mengikuti prosedur skematik dalam Gambar 1, dan urutan ssDNA tunggal dari tetrahedron DNA disediakan dalam Gambar 1 juga. Secara rinci, setiap ssDNA dilarutkan dalam buffer TE 0,5×, dan nilai optik densitas (OD) DNA ditentukan oleh UV spectrophotometer pada 260 nm. Buffer TE tambahan ditambahkan untuk membuat empat rantai pada konsentrasi yang sama. Rasio campuran dari empat ssDNA adalah 1:1:1:1 pada 1 μM dalam 100 μL. Reaksi dilakukan dalam mesin PCR dengan kondisi siklus: 95 °C, 10 menit, kemudian pendinginan alami ke 4 °C. Semua ssDNA difurnirkan oleh HPLC dengan 260 nm sebagai puncak serapan khas. Dalam spektrum HPLC, waktu puncak DNA tetra lebih cepat daripada ssDNA tunggal, dan produk dikumpulkan pada titik waktu yang sesuai.

Sintesis dan Karakterisasi Asam Folat-DNA tetra-Dox

Grup hidrogen bebas dari Dox dan asam folat dimodifikasi dengan grup azida dan kemudian dikopling dengan 3′-OH dari ssDNA melalui reaksi kimia klik [21]. Dengan menambahkan jumlah grup fungsional yang berbeda dari ssDNA yang ditandai, rasio grup fungsional dapat dikontrol stoikiometri melalui hibridisasi sisi yang spesifik. Untuk sintesis asam folat-DNA tetra, rasio molar asam folat dan tetrahedron DNA diatur sebagai 1:1. Untuk sintesis DNA tetra-Dox, rasio molar Dox dan tetrahedron DNA diatur sebagai 4:1. Untuk sintesis asam folat-DNA tetra-Dox, rasio molar asam folat, tetrahedron DNA, dan Dox masing-masing diatur sebagai 1:1:3. Semua sintesis dilakukan pada level mikromolar pada 37 °C dan kemudian disimpan pada 4 °C [22].

Dalam studi ini, serangkaian kompleks tetra DNA dikarakterisasi dengan elektroforesis gel akrilamida (PAGE) dengan gel pemisah 8% (39% Acr-Bis) untuk memeriksa keurnuran dan ukuran molekul relatif. Sampel terdiri dari berbagai struktur tetra DNA dan buffer loading 6× dengan rasio campuran 2:1. Sampel diwarnai dan dianalisis setelah elektroforesis gel selama 90 menit pada 110 V. Untuk mengetahui perbedaan ukuran partikel, sampel tetra DNA juga dipindai dengan instrumen dynamic light scattering (DLS) dengan cahaya dinamis.

Penyerapan Seluler yang Difasilitasi DNA Tetra

Untuk struktur kopling yang berbeda yang dirancang dalam penelitian ini, tingkat penyerapan oleh sel HT-29 dibandingkan untuk menentukan efisiensi pengiriman obat. Efisiensi penyerapan seluler dievaluasi dan dikuantifikasi menggunakan spektrum fluoresensi khas Dox, yaitu cahaya excitasi pada 470 nm dan cahaya emisi pada 590 nm. Sel HT-29 pada 2 × 10⁵/mL ditanam dalam plates 24-well dan dikultur selama 24 jam. Sel kemudian diinkubasi dengan berbagai struktur tetra DNA pada 10 μM selama 24 jam lagi. Medium kemudian dibuang, dan sel dicuci dengan PBS tiga kali. Untuk fixasi sel, paraformaldehida 4% segera ditambahkan pada suhu ruangan untuk ko-inkubasi 30 menit, dan sel dicuci dengan PBS tiga kali lagi. Akhirnya, plates 24-well diamati oleh mikroskopi konfokal laser untuk membandingkan efisiensi penyerapan seluler berdasarkan intensitas cahaya emisi.

Sitotoksisitas dan Efisiensi Antikanker

Sitotoksisitas dan efisiensi antikanker dievaluasi menggunakan uji MTT, di mana reaksi redoks terjadi antara MTT dalam DMSO dan dehidrogenase suksinat intrakeluler. Sel HT-29 ditanam dalam plates kultur 96-well dan dikultur selama 24 jam.

Untuk sitotoksisitas DNA tetra sebagai penangkap obat, medium yang mengandung struktur tetra DNA pada konsentrasi 0–100 μM ditambahkan untuk inkubasi 24- atau 48-jam lagi. Kemudian, 100 μL larutan MTT (5 mg/mL) ditambahkan ke setiap well, dan campuran diinkubasi pada 37 °C selama 4 jam. Cairan kemudian dibuang, dan sel dilisis serta dilarutkan dengan 200 μL DMSO. Absorpsi sobrenatan diukur pada 570 nm oleh Microreader. Sampel HT-29 yang tidak diobati dianggap sebagai grup kontrol.

Untuk kompleks tetra DNA yang dikopling dengan asam folat atau Dox, satu sisi, penelitian ini difokuskan pada stabilitas, bio-keamanan, dan efisiensi inhibisi; di sisi lain, apakah Dox dari DNA tetra-Dox memiliki properti antitumor yang dapat dibandingkan dengan sebelumnya juga dieksplorasi. Oleh karena itu, sitotoksisitas dan efisiensi antitumor kompleks tetra DNA dievaluasi. Kompleks masing-masing pada 100 μM diinkubasi dengan sel HT-29. Sampel sel dikumpulkan setiap 6 jam dan kemudian dideteksi dengan uji MTT untuk mengevaluasi efek periode inkubasi. Perhatian khusus diberikan pada perbedaan efisiensi antikanker yang timbul dari variasi struktur. Selanjutnya, efek konsentrasi terhadap inhibisi HT-29 setelah diobati dengan asam folat-DNA tetra-Dox dievaluasi pada 0–200 μM melalui uji MTT.

Western Blot dan Sitometria Aliran

Untuk mengkarakterisasi apoptosis seluler yang diinduksi oleh Dox yang difasilitasi oleh pengiriman DNA tetra, sampel protein dari sel yang diobati dipanaskan dan dipecahkan menggunakan cairan pirolisis, dianalisis dengan elektroforesis SDS-PAGE 12% pada kondisi 100 V pada arus konstan untuk memisahkan sampel, kemudian ditransfer ke membran PVDF diameter 0,22-μm selama 1 jam. Sampel diblokir dengan susu bubuk skimmed selama 1 jam. Setelah dicuci tiga kali dengan PBST, sampel diinkubasi selama satu malam dengan antibodi anti-kaspase-3 kelinci. Kemudian, sampel diurai dengan antibodi sekunder anti-kelinci IgG kambing selama 1 jam dan kemudian dicuci dengan PBST dan diinditrakan melalui sistem imaging protein Bio-Rad. Selanjutnya, GAPDH dipilih sebagai protein referensi internal karena ekspresinya yang stabil dalam sel.

Sitometria aliran lebih lanjut digunakan untuk mengukur tingkat apoptosis pada titik konsentrasi dan waktu yang dipilih melalui uji MTT. Sel HT-29 diinkubasi dengan inhibitor selama periode waktu dan kemudian diukur melalui sitometria aliran kuantitatif menggunakan metode pewarnaan ganda Annexin V-PI.

Pengukuran Proliferasi Sel

Metode penghitungan sel digunakan untuk mengukur proliferasi sel seiring waktu. Secara rinci, setelah diobati dengan asam folat-DNA tetra-Dox selama periode waktu pada 100 μM, sel dicerna dengan tripsin 0,25% selama 30 detik, dan kemudian volume medium lengkap yang sama ditambahkan untuk menghentikan reaksi. supernat dibuang setelah sentrifugasi pada 1000 rpm selama 3 menit, dan sel disuspend lagi dengan medium lengkap. Jumlah sel pada setiap titik deteksi dicatat di bawah mikroskopi optik menggunakan plates penghitungan sel, untuk menggambar kurva proliferasi seluler.

Analisis Statistik

Dalam penelitian ini, signifikansi perbedaan ditentukan menggunakan uji Student’s t (dua sisi; dua sampel varian sama). P < 0,05 berarti perbedaan yang signifikan antara grup yang berbeda.

Hasil

Persiapan Asam Folat-DNA tetra-Dox

Dalam proses sintesis spesifik, Dox dicampur dengan tetrahedron DNA dalam proporsi yang berbeda untuk menyelesaikan pemuatan dan rangkaian Dox (w_m = 543,52) dan asam folat (w_m = 441,4). Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2a, karena Dox dan asam folat adalah monomer dengan bobot molekular yang rendah dan mirip, DNA dalam tetrahedron dan konjugat dengan satu molekul fungsional memiliki bobot molekul yang setara. Namun, Dox atau asam folat yang dirangka dengan semua empat vertex tetrahedron membuat ukuran molekul tetra DNA meningkat secara signifikan. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2b, sebagian besar ukuran monomerek tetrahedron kurang dari 15 nm. Seiring bertambahnya grup kopling, struktur simetris dari tetra DNA hancur dan ukuran median partikel komposit meningkat secara signifikan. Khususnya, perluasan ukuran asam folat-DNA tetra-Dox memperluas median diameter menjadi 20 nm.

Efisiensi Pengiriman Obat

Setelah diinkubasi dengan berbagai struktur tetra DNA selama 24 jam, efisiensi intrakeluler Dox dievaluasi dengan citra fluoresensi, di mana fluoresensi merah intrakeluler adalah fluoresensi khas Dox; oleh karena itu, sel yang diinkubasi dengan DNA tetra tidak menunjukkan sinyal fluoresensi apa pun seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 3a, dan sinyal merah pada sel yang diinkubasi dengan kompleks asam folat-DNA tetra-Dox dan DNA tetra-Dox jelas lebih tinggi dari pada Dox, yang berarti penyerapan seluler Dox yang ditingkatkan secara signifikan akibat penetrasi seluler yang difasilitasi DNA tetra melalui membran, serta stabilitas intrakeluler konjugat antara Dox dan DNA tetra.

Analisis kuantitatif lebih lanjut dari intensitas fluoresensi (Gambar 3b) membuktikan temuan visual, dan tidak ada perbedaan yang signifikan antara kompleks asam folat-DNA tetra-Dox dan DNA tetra-Dox (P < 0,05). Metodologi ko-inkubasi obat dan sel menghambat pameran sepenuhnya dari kemampuan targeting asam folat. Konsentasi yang cukup tinggi mengonfirmasi pengenalan spesifik dari reseptor folat, yang secara teoritis lebih nyata dalam aplikasi in vivo dengan sistem sirkulasi yang kompleks. Singkatnya, pengiriman DNA tetra menjamin efisiensi antikanker Dox.

Sitotoksisitas dan Efisiensi Antikanker

Pertama, vitalitas sel HT-29 yang diinkubasi bersama dengan berbagai konsentrasi DNA tetra diperiksa menggunakan uji MTT. Tidak ada sitotoksisitas yang jelas dari perawatan DNA tetra pada sel HT-29 pada 0–100 μM selama 24 dan 48 jam (Gambar 4a). Oleh karena itu, nano-tetrahedron DNA menyediakan platform penangkap obat yang bio-aman.

Kedua, akibat perbedaan efisiensi pengiriman Dox, asam folat-DNA tetra-Dox dan DNA tetra-Dox menunjukkan efisiensi inhibisi yang lebih signifikan dalam waktu 48 jam (Gambar 4b). Karena tidak ada komponen antikanker yang efektif, DNA tetra-asam folat mengakibatkan penurunan yang tidak signifikan (< 10%) dari vitalitas selama ko-inkubasi 48 jam. Karena Dox tidak dapat objektif menembus membran, penurunan vitalitas seluler yang diinduksi Dox lebih rendah dari pada grup lain. Khususnya, asam folat-DNA tetra-Dox menunjukkan penurunan yang lebih awal dan signifikan pada 6 jam setelah inkubasi, membuktikan bahwa targeting asam folat membantu obat menargetkan membran, dan membuat Dox bekerja lebih tepat waktu. Di sisi lain, DNA tetra-Dox mulai menunjukkan efek yang jelas pada 12 jam setelah inkubasi, menunjukkan pentingnya grup targeting.

Selanjutnya, sel HT-29 diobati dengan asam folat-DNA tetra-Dox pada 0–200 μM untuk mendeteksi konsentrasi efektif (Gambar 4c). Vitalitas sel HT-29 menurun dengan cepat seiring peningkatan konsentrasi kompleks (0–100 μM), tetapi tidak ada perbedaan yang signifikan antara konsentrasi 100 dan 200 μM, yang mengindikasikan pola dose-dependent dari asam folat-DNA tetra-Dox, di mana 100 μM dapat dianggap sebagai konsentrasi efektif untuk efek antitumor. Selain itu, vitalitas sel berubah secara signifikan dari 24 hingga 48 jam untuk grup pada 10, 20, dan 50 μM, yang mengindikasikan bahwa periode waktu inkubasi juga merupakan faktor yang mempengaruhi efisiensi antikanker berbasis asam folat-DNA tetra-Dox.

Apoptosis yang Diinduksi oleh Asam Folat-DNA tetra-Dox

Oleh karena itu, berdasarkan uji western blot (Gambar 5a), terdapat peningkatan signifikan ekspresi kaspase-3 yang diinduksi oleh asam folat-DNA tetra-Dox dan DNA tetra-Dox, yang membuktikan bahwa apoptosis adalah cara utama kematian sel yang diinduksi Dox.

Sitometria aliran (Gambar 5b–e) lebih lanjut membuktikan bahwa inkubasi 6 jam dengan asam folat-DNA tetra-Dox pada 100 μM menginduksi apoptosis sebesar 68,7%. Sementara itu, tingkat apoptosis yang diinduksi oleh Dox dan DNA tetra-Dox hanya 32,8 dan 60,5% dengan kondisi inkubasi yang sama.

Inhibisi Proliferasi Sel

Berdasarkan uji MTT, 100 μM adalah konsentrasi efektif untuk induksi apoptosis dan dipilih dalam eksperimen proliferasi sel. Seperti yang ditunjukkan oleh kurva proliferasi sel (Gambar 6), karena proses penyerapan seluler yang memakan waktu, inhibisi proliferasi sel tidak sepenuhnya terlihat pada tahap awal ko-inkubasi. Efeksi inhibisi yang signifikan ditampilkan setelah diinkubasi dengan asam folat-DNA tetra-Dox selama lebih dari 6 jam, membuktikan keberadaan endositosis yang ditingkatkan DNA tetra. Sementara itu, 6 jam adalah periode waktu yang sebanding dengan periode waktu efektif yang terdeteksi dalam Gambar 4b.

Pembahasan

Sebagai cara modifikasi DNA yang umum, reaksi kimia klik memiliki keuntungan efisiensi reaksi tinggi, kontrol yang baik, dan operasi yang mudah [21]. Elektroforogram yang ditampilkan dengan satu pita (Gambar 2a), yang mengindikasikan bahwa produk dengan keurnuran tinggi diperoleh melalui kopling kovalen melalui reaksi kimia klik. Properti fluoresensi Dox membuatnya dapat dilacak in vitro dan in vivo; sementara, fluoresensi di dalam sel tumor secara tidak langsung membuktikan stabilitas asam folat-DNA tetra-Dox selama proses menembus membran sel. Oleh karena itu, asam folat-DNA tetra-Dox mampu dan stabil untuk aplikasi biomedis.

DNA tetra memiliki kemampuan untuk mengirimkan obat ke dalam sel. Semua urutan DNA yang digunakan dalam penelitian ini tidak dienkode untuk informasi genetik apa pun. Dengan demikian, tidak ada efek samping pada ekspresi gen dan metabolisme sel yang dilaporkan dalam semua pemeriksaan. Sementara itu, karena ekspresi reseptor folat yang tinggi pada permukaan sel tumor, asam folat dipilih sebagai molekul targeting spesifik dari sistem pengiriman obat untuk meningkatkan efisiensi penyerapan kompleks tetra DNA. Namun, pada kondisi konsentrasi DNA tetra yang relatif tinggi, keuntungan targeting reseptor folat tidak sepenuhnya terwujud in vitro. Oleh karena itu, untuk aplikasi in vivo, asam folat berpotensi meningkatkan efisiensi targeting dalam sistem sirkulasi yang kompleks.

Saat ini, obat antikanker umumnya membawa efek samping yang tidak diinginkan, jadi penelitian untuk meningkatkan kemampuan targeting sel tumor dan efisiensi pengiriman telah menjadi topik hangat [23,24,25]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa kapasitas tetrahedron DNA untuk mengangkut obat didasarkan pada kompatibilitas yang baik. Tetrahedron DNA adalah wadah buatan yang menguntungkan untuk modifikasi dan kompatibilitas biologis yang tepat. Dalam studi ini, kopling sukses Dox dan asam folat dengan tetrahedron DNA mencapai efek inhibisi yang memuaskan dan menyebabkan apoptosis yang jelas pada sel HT-29. Karena DNA tetra dapat dimodifikasi dan dikopling dengan obat dan molekul targeting, penrichatan konsentrasi obat lokal dalam sel tumor terwujud. Hasil di atas membuktikan pengenalan yang baik untuk sel tumor dan efek inhibisi yang ditingkatkan yang sesuai melalui pengiriman DNA tetra, dan sistem pengiriman obat nano ini dapat digunakan lebih luas.

Kesimpulan

Sebagai strategi pengiriman obat yang baru berkembang, struktur DNA berukuran nano memiliki biaya rendah, stabilitas tinggi, dan kelayakan sintesis; sementara, ini bio-aman karena tidak ada aktivitas imun eksogen. Strategi kopling tetrahedron DNA memfasilitasi pengiriman terarah Dox, meningkatkan efisiensi antikanker Dox pada sel kanker kolon, dan menyediakan inspirasi dan ide yang menjanjikan untuk desain obat.