Nanopartikel Emas Dilapisi Protein dari Tricholoma crassum: Potensi Antimikroba, Apoptosis, dan Pengiriman Gen

Abstrak

Kami melaporkan sintesis hijau pertama dari nanopartikel emas (AuNPs) dilapisi protein menggunakan jamur mikoriza makan Tricholoma crassum. AuNPs, berdiameter 5–25 nm dan berupa berbagai bentuk, terbentuk dalam satu jam pada 28 °C. Spektroskopi UV–vis menunjukkan puncak SPR karakteristik pada 552 nm, yang bergeser seiring waktu reaksi dan pH. Karakterisasi rinci dengan SEM, TEM, AFM, XRD, dan DLS mengonfirmasi monodispersity dan korona protein alami 40 kDa. Partikel menunjukkan aktivitas antimikroba yang kuat terhadap patogen Gram-negatif, Gram-positif, dan jamur, termasuk strain multidrug-resistan, dan menghambat pemijakan spora. Uji Comet mengungkapkan induksi apoptosis yang bergantung pada dosis pada sel tanaman, sementara lapis protein 40 kDa memfasilitasi pengiriman gen yang efisien ke sel Sarcoma 180, yang dibuktikan oleh ekspresi GFP. Uji hemolisis menunjukkan toksisitas darah yang dapat diabaikan di bawah 20 µl mL⁻¹, yang menunjukkan jendela terapeutik yang aman. Produksi skala besar dalam fermentor dapat dilakukan, memosisi AuNPs ini sebagai agen serbaguna untuk aplikasi antimikroba, antikanker, dan pengiriman gen.

Latar Belakang

Pengadopsi cepat nanopartikel dalam pertanian, kedokteran, dan produk konsumen telah meningkatkan kebutuhan untuk memahami profil keamanannya. Sintesis hijau, yang menggunakan organisme hidup atau enzimnya, menawarkan rute ramah lingkungan dan hemat biaya yang menghilangkan kimia berbahaya. Jamur filamen, dengan pengeluaran enzim yang tinggi, sangat ahli dalam menghasilkan nanopartikel logam ekstraselular. Meskipun beberapa jamur telah menghasilkan nanopartikel emas (AuNPs), sedikit laporan yang menjelaskan korona protein alami pada partikel ini, yang krusial untuk stabilitas koloid dan fungsionalisasi. Nanopartikel emas menarik untuk penggunaan terapeutik karena mereka tidak menimbulkan resistensi dan dapat dirancang untuk menargetkan sel tumor melalui efek permeasi dan retensi yang ditingkatkan (EPR). AuNPs yang dilapisi protein meningkatkan penyerapan seluler dan menyediakan situs pengerasan untuk obat atau gen, sehingga menghilangkan kebutuhan akan langkah pengapit kimia tambahan. Meskipun demikian, kompatibilitas biologis, sitotoksisitas, dan risiko agregasi harus dievaluasi dengan hati-hati sebelum aplikasi klinis.

Metode

Kondisi Pertumbuhan Jamur, Bakteri, dan Tanaman

Tricholoma crassum dibudidayakan untuk sintesis nanopartikel. Uji antimikroba menggunakan E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404), dan derivatif multidrug-resistan mereka, serta patogen tanaman M. oryzae dan A. solani. Bibit tomat dan tembakau dibudidayakan dalam kondisi terkontrol (28 ± 1 °C, 16:8 jam terang/gelap, 50 µmol m⁻² s⁻¹).

Sintesis AuNPs

Mat mikelium diinkubasi dalam kaldu dextrose kentang (PDB) selama 7 hari pada 28 °C. Setelah 24, 48, atau 72 jam, 1 g mikelium diayunkan dengan 10 mL air deion selama 24 jam pada 50 RPM. Filtrat (pH 5,2) dicampur dengan 1 mM HAuCl₄ dan diaduk pada 28 °C dalam gelap selama 1 jam. Dengan menyesuaikan pH filtrat (3,5–9) dan suhu reaksi (0–100 °C), kami menyesuaikan ukuran dan bentuk partikel. Variasi volume filtrat (×0,5–×2) dan konsentrasi Au³⁺ (0,5–2 mM) lebih menyempurnakan sintesis.

Teknik Karakterisasi

• Spektroskopi UV–Vis (450–750 nm) untuk analisis SPR.
• SEM, TEM, dan AFM untuk morfologi dan distribusi ukuran.
• XRD untuk konfirmasi fase kristal.
• DLS untuk ukuran hidrodinamis.
• SDS-PAGE untuk identifikasi korona protein.

Uji Antimikroba dan Antijamur

Uji disk difusi dan kurva pertumbuhan mengukur inhibi terhadap strain bakteri dan jamur. Pemijakan spora jamur dievaluasi dengan konsentrasi AuNP yang bervariasi. Metode melibatkan inkubasi standar dan observasi mikroskopik.

Penilaian Apoptosis

Uji Comet pada inti sel daun tembakau dan tomat mengukur fragmentasi DNA setelah paparan AuNP. Berbagai konsentrasi (0–30 % v/v) dan waktu inkubasi (15–30 menit) diuji.

Pengiriman Gen ke Sel Sarcoma 180

Plasmid pCAMBIA1302 (penanda GFP) kompleks dengan AuNP dan diinkubasi dengan sel Sarcoma 180. Ekspresi GFP mengonfirmasi transfeksi yang berhasil. Uji hemolisis dengan eritrosit manusia mengevaluasi kompatibilitas darah.

Hasil dan Pembahasan

Pembentukan AuNP dan Ciri Spektroskopis

Transisi dari kuning pucat ke ungu dalam 1 jam menunjukkan pembentukan AuNP. Spektra UV–Vis menunjukkan puncak SPR pada 552 nm untuk filtrat 24 jam, bergeser merah dengan inkubasi yang lebih lama dan bergeser biru dengan pH yang lebih tinggi. Sintesis optimal terjadi pada 28 °C dengan 1 mM HAuCl₄, menghasilkan partikel monodisperse yang stabil selama >30 hari.

Efek Parameter Sintesis

Peningkatan volume filtrat atau konsentrasi Au³⁺ meningkatkan intensitas warna dan absorbansi, dengan geser biru ringan pada ×2 filtrat. Suhu yang lebih tinggi (75–100 °C) menghasilkan partikel yang lebih besar dan kurang stabil. Paparan cahaya meningkatkan ukuran partikel dan melebarkan puncak SPR.

Morfologi dan Distribusi Ukuran

SEM dan TEM mengungkapkan AuNP 5–22 nm dalam bentuk yang berkisar dari bola dan romboid hingga heksagon dan segitiga. AFM mengonfirmasi tinggi bawah-10 nm, dan XRD mengonfirmasi emas kubusik mematikan dengan difraksi {111} dominan pada 38,23°.

Aktivitas Antimikroba

AuNP menghambat pertumbuhan E. coli, A. tumefaciens, dan M. oryzae dengan zona inhibisi yang bergantung pada dosis. Strain multidrug-resistan juga tertekan, yang menunjukkan efikasi spektrum luas. Analisis kurva pertumbuhan menunjukkan fase log yang tertunda dan kepadatan sel yang berkurang setelah pengobatan AuNP.

Pemijakan Spora Jamur

Peningkatan konsentrasi AuNP secara progresif mengurangi pemijakan spora dan panjang germ-tube A. solani, yang menunjukkan potensi antijamur.

Sifat Apoptogenik

Uji Comet mengungkapkan kerusakan DNA yang signifikan pada paparan AuNP >20 %, sementara 5–10 % menyebabkan apoptosis yang dapat diabaikan. Jadi, ada jendela terapeutik untuk aplikasi antimikroba atau pengiriman gen tanpa sitotoksisitas.

Identifikasi Korona Protein

SDS-PAGE nanopartikel yang direbus menunjukkan satu pita 40 kDa yang identik dengan protein ekstraselular dari T. crassum. Lapis protein memstabilkan partikel dan menyediakan situs ikatan untuk DNA.

Pengiriman Gen dan Hemolisis

Kompleks AuNP–plasmid mencapai ekspresi GFP pada sel Sarcoma 180, sedangkan plasmid telanjang tidak. Hemolisis tetap di bawah 8 % pada konsentrasi hingga 20 µl mL⁻¹, yang mengonfirmasi toksisitas darah rendah.

Kesimpulan

Jamur mikoriza makan Tricholoma crassum memungkinkan sintesis hijau cepat dari AuNPs dilapisi protein dengan berbagai bentuk dan properti antimikroba, apoptosis, dan pengiriman gen yang kuat. Korona protein alami 40 kDa memastikan stabilitas koloid dan fungsionalisasi, sementara data hemolisis mendukung penggunaan terapeutik yang aman. Produksi skala besar dalam fermentor dapat dilakukan, menawarkan platform yang dapat diskalakan untuk aplikasi antimikroba, antikanker, dan nanomedisin.