Mengevaluasi sifat pengiriman gen antimikroba, apoptosis, dan sel kanker dari nanopartikel emas berlapis protein yang disintesis dari jamur mikoriza yang dapat dimakan Tricholoma crassum

Hasil dan diskusi

Biosintesis AuNP pada pH 5,5

Selama sintesis, pembentukan AuNP ditunjukkan dengan perubahan warna filtrat sel dari kuning muda menjadi ungu [23] akibat perubahan resonansi plasmon permukaan (SPR). 1 mM HAuCl₄ larutan tanpa filtrat jamur berwarna kuning kehijauan (Gbr. 1a, 'A') dan filtrat sel T. kasar yang berwarna kuning pucat (Gbr. 1a, 'B'). Setelah inkubasi, warna campuran berubah menjadi ungu dalam 1 jam (Gbr. 1a, 'C'), yang menunjukkan pembentukan AuNP.

Biosintesis AuNP menggunakan Tricholoma crassum dan analisis spektroskopi. a Perubahan warna selama reaksi. A 20 mM larutan HAuCl₄ . B Filtrat sel bebas miselia dari Tricholoma crassum . C 1 mM HAuCl₄ dengan filtrat sel 24 jam selama 1 jam menunjukkan warna ungu yang menunjukkan sintesis AuNP. b Spektrum UV-vis AuNPs yang disintesis dengan periode inkubasi yang berbeda (24, 48, 72 jam). Panah padat menunjukkan puncak penyerapan pada 552 nm selama 24 jam masa inkubasi. Panah putus-putus menunjukkan sedikit pergeseran merah dari maxima penyerapan dengan peningkatan masa inkubasi. c AuNPs disintesis di bawah pH yang berbeda menunjukkan warna yang berbeda. d spektrum UV-vis yang sama. Panah padat menunjukkan puncak penyerapan pada 552 nm untuk pH 5,5 dan panah putus-putus menunjukkan pergeseran biru dari serapan maksimum dengan peningkatan pH

Salah satu kelemahan dari metode lain produksi nanopartikel dari mikroorganisme adalah bahwa ini memakan waktu dan organisme menghasilkan racun. Sebelumnya, Phanerochate chrysosporium ekstrak bebas sel digunakan untuk menghasilkan AuNPs dalam 90 menit [3]. Baru-baru ini, nanopartikel perak dan emas dibiosintesis menggunakan Sporosarcina koreensis menggunakan perpanjangan waktu reaksi 1-2 hari [24]. Dalam laporan kami, waktu produksi AuNP telah dikurangi menjadi 1 jam saja.

Ultra-violet hingga spektroskopi tampak

Spektrum serapan optik nanopartikel logam diatur oleh bentuk, agregasi, dan SPR, yang bergeser sesuai dengan ukuran dan bentuk partikel [25, 26]. Gambar 1b menunjukkan spektrum UV-vis AuNP yang disintesis menggunakan filtrat sel yang dihasilkan selama 24, 48, dan 72 jam diikuti oleh 1 jam inkubasi dengan 1 mM HAuCl₄ larutan (pH 5,5). Di sini, puncak absorbansi adalah pada 552 nm untuk filtrat sel 24 jam. Pita resonansi plasmon transversal yang muncul pertama kali pada 552 nm bergeser sedikit ke arah merah dari 24 hingga 48 dan 72 jam (ditunjukkan sebagai garis padat vs. garis putus-putus Gambar 1b), mengkonfirmasikan pergeseran merah dengan intensitas absorbansi yang semakin diperkuat. Pelebaran puncak menunjukkan bahwa partikel bersifat polidispersi. SPR yang kuat berpusat di ca. 550–560 nm adalah tipikal dari koloid emas (Gbr. 1b). Sebagai konsentrasi filtrat sel meningkat dengan peningkatan masa inkubasi (yaitu, 24, 48, 72 jam), absorbansi juga meningkat secara proporsional. Ketika reaksi dilakukan pada 28 °C, reaksi mencapai keseimbangan setelah 1 jam dan stabil selama 30 hari tanpa bukti agregasi mungkin karena lapisan protein yang menstabilkan. Dalam penelitian sebelumnya, AuNP berlapis BSA tidak menunjukkan agregasi [27]. Studi lebih lanjut dilakukan menggunakan AuNP yang disiapkan dengan filtrat sel 24 jam.

Biosintesis AuNPs pada pH dan spektroskopi UV-vis yang berbeda

AuNPs disintesis pada pH yang berbeda dari 3,5, 5,5, 7, 8, dan 9 menghasilkan warna pink sampai ungu tua (Gbr. 1c). Spektroskopi UV-vis menunjukkan serapan maksimal, dan panjang gelombang SPR meningkat dari pH 3,5 menjadi pH 5,5 yang menghasilkan pergeseran merah. Namun, dengan peningkatan pH lebih lanjut dari 7 ke pH 9, maksima absorbansi dan panjang gelombang SPR menurun, menunjukkan pergeseran biru (Gbr. 1d). Puncak pada pH 9 memiliki amplitudo yang lebih kecil dan warna yang tidak berubah, menunjukkan hanya sejumlah kecil AuNP yang terbentuk. Ini adalah biosintesis enzimatik, pH 9 mungkin menghambat reaksi enzim yang diperlukan untuk pembentukan AuNPs (Gbr. 1d). Nanopartikel yang dihasilkan pada pH yang berbeda tidak menyatu setelah 1 bulan pada suhu kamar.

Produksi AuNP menggunakan suhu, konsentrasi substrat, dan konsentrasi prekursor yang berbeda

Optimalisasi kondisi fisiko-kimia selama biosintesis sangat penting untuk menghasilkan nanopartikel yang efisien secara fungsional [28]. Sintesis menggunakan konsentrasi filtrat yang lebih tinggi menunjukkan peningkatan produksi AuNPs dengan intensitas warna dan serapan maksimum yang lebih banyak (Gbr. 2a, b). Sedikit pergeseran biru dari resonansi plasmon permukaan lokal maksimum (LSPR) diamati untuk sintesis dengan × 2 filtrat yang menunjukkan peningkatan jarak antar-partikel dan penurunan ukuran cluster [29, 30].

Biosintesis dan spektroskopi UV-vis AuNPs dari Tricholoma crassum menggunakan parameter sintesis yang berbeda. a , b Konsentrasi sel-filtrat yang berbeda. c , d Konsentrasi HAuCl yang berbeda₄ . e , f suhu reaksi yang berbeda. g , h Dalam gelap dan di bawah terang. Panah padat menunjukkan puncak penyerapan tipikal pada 552 nm untuk filtrat sel × 1 dan 1 mM HAuCl₄ pada 28 °C pH 5,5 dan panah putus-putus menunjukkan pergeseran biru dari serapan maksimal, panah putus-putus menunjukkan pergeseran merah pada pita SPR

Dari tiga konsentrasi emas klorida yang diuji (0,5, 1, dan 2 mM), sintesis maksimum untuk 1 mM, dengan serapan maksimal pada 552 nm. (Gbr. 2c, d). 28 °C ditemukan optimal untuk sintesis. Temperatur yang lebih tinggi (75 dan 100 °C) meskipun memediasi sintesis AuNP yang lebih cepat, warna gelap dan pergeseran merah dari penyerapan maksimum (Gbr. 2e, f) menunjukkan partikel yang lebih besar daripada pada 28 °C. Pada 0 dan 15 °C, tidak ada perkembangan warna atau puncak serapan dalam 550–600 nm. Sintesis dalam cahaya menghasilkan warna ungu tua (Gbr. 2g) dan pergeseran merah serapan maksimum dengan puncak lebar (Gbr. 2h) yang menandakan partikel yang lebih besar. Ukuran dan jumlah partikel diuji dengan DLS (Gbr. 3a-j). Variasi dalam ukuran dan agregasi nanopartikel ini tergantung pada sifat dan jumlah bahan organik terkait [30] yang sekali lagi bervariasi dengan kondisi sintesis.

DLS menunjukkan distribusi ukuran AuNP yang disintesis a dengan × 1 filtrat bebas sel, 1 mM HAuCl4 pada 28 °C dalam gelap, b di bawah cahaya, c dengan × 0,5 filtrat bebas sel, d dengan × 2 filtrat bebas sel, e pada 0 °C, f pada 15 °C, g pada 75 °C, j pada 100 °C, i dengan 0,5 mM HAuCl₄ dan j dengan 2 mM HAuCl₄

Scanning electron microscopy (SEM) dan transmission electron microscopy (TEM)

SEM menunjukkan AuNP berukuran kecil dan bentuk geometris yang berbeda pada perbesaran × 80000 (Gbr. 4a). Analisis TEM dengan jelas menunjukkan AuNP polidispersi dengan kisaran ukuran diameter 2–22 nm (Gbr. 4b). Grafik distribusi ukuran menunjukkan AuNPs dengan rentang ukuran 5-10 nm memiliki frekuensi tertinggi diikuti berturut-turut oleh 2–5 nm, 10-15 nm, 15-20 nm, dan 20–22 nm (Gbr. 4c). Ini adalah bentuk geometris yang berbeda seperti lingkaran kecil atau belah ketupat dengan diameter 5 nm atau kurang, segi enam, balok, segitiga sama kaki, dan segitiga hampir sama sisi dengan sisi bervariasi dari 4,36 hingga 22,94 nm (Gbr. 4d, e).

Mikroskop elektron dari AuNPs. a SEM pada perbesaran × 80.000. b TEM menunjukkan partikel terdispersi dengan ukuran berbeda dalam bidang mikroskopis. c Histogram yang menunjukkan distribusi ukuran partikel AuNPs. Tampilan yang diperbesar dari AuNP individu yang menunjukkan bentuk geometris yang berbeda dan representasi diagram mereka dengan dimensi. d Bulat (kiri) dan belah ketupat (kanan) dengan kisaran ukuran kecil. e Dari kiri:heksagonal, segitiga sama sisi, belah ketupat, polihedral, dan segitiga sama kaki

Mikroskop gaya atom (AFM)

Gambar 5a menunjukkan gambar AFM dari AuNP yang tersebar. Tampilan dua dimensi (Gbr. 5a) menunjukkan bahwa partikel memiliki ketebalan permukaan yang hampir sama. Ketinggian partikel ini divisualisasikan dengan AFM 3D permukaan tunggal (Gbr. 5b). Grafik AFM 2D dari AuNP yang terletak pada zona linier acak (ditandai dengan garis putus-putus, Gbr. 5c) menunjukkan ketinggian mulai dari 1 hingga 4 nm. Pita plasmon permukaan bidang menunjukkan bahwa ketebalan partikel lebih kecil dari panjang tepi.

AFM dan difraksi sinar-X dari AuNPs. a Gambar AFM:tampilan atas. b Gambar AFM:tampilan tiga dimensi. c Gambar AFM AuNPs dan profil grafis untuk ketinggian nanopartikel yang terletak di garis putus-putus di lapangan. d Pola difraksi sinar-X nanopartikel menunjukkan puncak khas emas

Studi difraksi sinar-X(XRD)

Pola XRD dari film tipis partikel mengungkapkan keberadaan hanya AuNPs. Puncak difraksi yang kuat pada sekitar 38° umumnya dianggap berasal dari {111} segi struktur kubus berpusat muka (FCC) [3]. Pola XRD di sini menunjukkan puncak difraksi dominan pada 38,23 yang dikaitkan dengan struktur FCC. Puncak difraksi dari empat segi lainnya lebih lemah. Empat puncak difraksi Bragg yang berbeda pada 38.23, 44.31, 64.60, 77.58, dan 81.63 sangat cocok dengan AuNPs (Gbr. 5d, File tambahan 1:Tabel S1).

Penghitungan konsentrasi AuNP

Konsentrasi nanopartikel [15] ditemukan 15,56 mg/L untuk partikel yang dihasilkan dengan filtrat sel 24 jam yang diinkubasi dengan 1 mM HAuCl₄ .

Pengujian antimikroba dari AuNPs menggunakan bakteri dan jamur patogen

AuNPs menunjukkan aktivitas antimikroba yang kuat terhadap bakteri manusia serta bakteri dan jamur patogen tanaman. Uji aktivitas antimikroba nanopartikel menggunakan paper disc dengan peningkatan jumlah AuNP, yaitu 0,249, 0,498, 0,747, 0,996, dan 1,245 g. Bakteri manusia E. koli (DH5α), bakteri patogen tanaman A. tumefaciens (LBA4404) dan jamur patogen tanaman M. oryzae telah dipakai. AuNPs menghambat semua mikroorganisme ini bahkan pada konsentrasi terendah, dan zona penghambatan meningkat secara proporsional dengan peningkatan konsentrasi partikel (Gbr. 6). Gambar 6a–c menunjukkan bahwa zona hambat untuk E. koli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) dan M. oryzae , masing-masing. Gambar 6f–h menunjukkan grafik zona hambat ketiga mikroba ini sebagai fungsi dari jumlah AuNP yang digunakan. Ekstrak jamur saja tidak memiliki efek penghambatan. Kecenderungan komparatif penghambatan untuk ketiga mikroba menunjukkan efek penghambatan yang lebih besar pada DH5α dibandingkan dengan LBA4404 dan M. oryzae (File tambahan 2:Gbr. S1a).

Uji sifat antimikroba AuNPs pada bakteri patogen, jamur, dan bakteri multi-drug-resistant (MDR). a , f Pelat dan grafik yang sesuai menunjukkan uji difusi cakram nanopartikel dengan peningkatan zona hambat untuk E. koli . Zona hambat yang diperoleh dalam pengujian serupa dengan b , g Agrobacterium tumefaciens . c , h Magnaport the oryzae . d , i MDR E. koli . e , j MDR A. tumefaciens . Semua percobaan dilakukan dengan peningkatan jumlah AuNP pada cakram kertas; searah jarum jam dari atas:0,249 μg (20%), 0,498 g (40%), 0,747 μg (60%), 0,996 μg (80%), dan 1,245 μg (100%) AuNP. Data adalah mean ± SE dari tiga ulangan. Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik di antara sampel (P < 0,05, uji HSD Tukey). Pengaruh AuNPs pada kurva pertumbuhan k E. koli , l A. tumefaciens , m MDR E. koli , dan n MDR A. tumefaciens . Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan untuk dikontrol (t . Siswa tes, P < 0,05). o Mikroskop kontrol A. tumefaciens sel. p A. tumefaciens menunjukkan hilangnya integritas seluler setelah perawatan dengan AuNPs

Pengujian aktivitas antimikroba AuNPs menggunakan bakteri patogen manusia dan tanaman yang resisten terhadap banyak obat

Multi-drug-resistant (MDR) DH5α dan LBA4404 pembawa plasmid dengan gen resistensi dibuat. MDR DH5α yang membawa pUC19 resisten terhadap 100 μg/ml Ampisilin dan 35 μg/ml Kloramfenikol. LBA4404 yang ditransformasi dengan pCAMBIA2301 resisten terhadap 25 g/ml Rifampisin dan 50 g/ml Kanamisin. AuNPs menunjukkan aktivitas penghambatan yang kuat terhadap MDR DH5α dan MDR LBA4404 (Gbr. 6d, e). Gambar 6i, j adalah grafik yang menunjukkan peningkatan inhibisi dengan peningkatan konsentrasi nanopartikel. Kecenderungan komparatif penghambatan untuk dua bakteri MDR menunjukkan zona hambat yang lebih besar untuk A. tumefaciens dibandingkan dengan E.coli (File tambahan 2:Gbr. S1b).

Pengujian pertumbuhan bakteri selama perjalanan waktu dengan adanya AuNP

Kurva pertumbuhan DH5α yang diobati dengan AuNPs berbeda secara signifikan dari set kontrol (Gbr. 6k, m). Pada set kontrol DH5α dan MDRDH5α, fase log dari kurva pertumbuhan dimulai dalam 2 jam setelah inokulasi, sedangkan pada DH5α dan MDR DH5α yang diberi perlakuan AuNP, tidak ada pertumbuhan yang diamati hingga 6 jam setelah inokulasi. Kurva pertumbuhan mencapai fase diam setelah 12 jam pada sel kontrol dan perlakuan, tetapi pertumbuhannya berkurang secara signifikan dalam kasus bakteri yang diberi perlakuan. Kurva pertumbuhan LBA4404 menunjukkan inisiasi fase log pada 4 jam setelah inokulasi pada set kontrol versus 6 jam pada set yang diberi perlakuan AuNP. Efek serupa pada kurva pertumbuhan MDR LBA4404 diamati meskipun pada kontrol MDR LBA4404, fase log dimulai dalam 2 jam (Gbr. 6l, n).

Pengaruh AuNPs pada morfologi dan viabilitas sel bakteri

Secara umum, sebagian besar nanopartikel dapat secara efisien melekat pada membran sel, teradsorpsi, dan selanjutnya mempengaruhi integritas sel [31]. Biasa A. tumefaciens bakteri berbentuk batang dengan garis yang jelas (Gbr. 6o). Bakteri ketika diinkubasi dengan AuNPs menunjukkan morfologi terdistorsi, disintegrasi membran luar yang mengakibatkan garis tidak teratur, dan hilangnya integritas bentuk dan ukuran sel (Gbr. 6p). Ini sesuai dengan yang diamati sebelumnya di E. koli sel diperlakukan dengan nanopartikel silika [32]. Kami menemukan bahwa inkubasi sel bakteri dengan nanopartikel untuk waktu yang lebih lama menunjukkan disintegrasi sel yang lengkap.

Uji perkecambahan spora jamur

AuNPs adalah penekan ampuh virulensi jamur patogen tanaman Alternaria solani . Pengobatan konidia jamur dengan peningkatan dosis AuNPs untuk periode inkubasi yang berbeda menunjukkan penurunan bertahap frekuensi perkecambahan dan panjang tabung kuman (Gbr. 7a). The representative pictures of conidia (Fig. 7a) and graphs show that the percentage of germination (Fig. 7b) and average lengths of the germ tubes (Fig. 7c) emerging from the fungal conidia decreased with increasing doses of the particles and increasing incubation periods. Thus, these AuNPs had significant antifungal property which is mediated through the suppression of germination of spores and retardation in the growth of hyphae.

Effect of the AuNPs on the spore germination of plant pathogenic fungus Alternaria solani; a Spores after treatment with AuNPs (bar = 30 μm). Rows top to bottom:control spores followed by spores treated with different dilutions of AuNPs (15.56 mg/L stock). Columns left to right:increasing time of incubation with AuNPs showing least germination at 6 h incubation with 100% AuNPs. b Spore germination frequency (%) at different concentrations of AuNPs as a function of time of incubation. Asterisks indicate significant differences to control (Student’s t test, P < 0.05). c Average germ tube length at different concentrations of AuNPs as a function of time of incubation. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Duncan’s multiple range test). Spore germination frequency and the average germ tube length decreased with increasing doses of the AuNPs and increasing incubation period

Thus, these AuNPs have antimicrobial functions on bacteria as well as fungi, which is rarely reported for AuNPs. These AuNPs being toxic to multi-drug-resistant human bacteria can be utilized in treatment of MDR or extensively drug-resistant (XDR) bacteria-related human diseases which are difficult to treat. Furthermore, the antimicrobial effect against typical phytopathogens like Agrobacterium and fungi, it makes the particles suitable for as bacteriocides and fungicides in the form of nano-agrochemicals. These would enable sustainable management of crop loss through elimination of excessive and indiscriminate use of agrochemicals causing deterioration of soil health, degradation of agro-ecosystem, environmental pollution, and resistance in pathogens [33].

The AuNPs have potent apoptogenic properties

The single cell gel electrophoretic assay or comet assay is a sensitive method to compare apoptoic effects of materials [34, 35]. Treatment of tobacco leaf cells with 7.78 mg/L of AuNPs for a period of 15, 20, and 30 min resulted in gradual increase in apoptosis indicated by increase in percentage of DNA in tail (Fig. 8a, ‘A’, ‘B’, ‘C’, ‘D’). The maximum migration of DNA occurred after 30 min of treatment showing a tail DNA value 28.44 ± 0.74% which was significantly higher than that of untreated control cells (1.7 ± 0.59%). The incubation periods of 15 and 20 min caused less DNA migration with tail DNA values of 7.25 ± 2.56 and 19.19 ± 1.54%, respectively (Fig. 8b). Therefore, these AuNPs have the capacity to induce apoptosis in eukaryotic cells in higher doses. Recently, nanoparticles are being used in novel strategies to target and kill cancer cells. As illustrated by dynamic and quantitative imaging, successful application of nanoparticles as an alternative therapy for cancer depends on the apoptotic properties of the particles [36]. Hence, the present finding shows potent apoptogenic properties of these AuNPs which holds promise in future cancer therapy.

Assay of apoptotic properties of the AuNPs. a Comet assay and fluorescent microscopic images of nuclei of tobacco leaves treated with AuNPs for A 0 min. B 15 min, C 20 min, and D 30 min (bar = 5 μm). In the control sets (0 min incubation), most of the DNA is located in the head of the comet while cells subjected to longer treatment show increasing DNA damage and longer comet tails. b Mean of % tail DNA ± SE after different periods of incubation. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P < 0.05, Tukey’s HSD test). c Assay of threshold dosage of AuNPs for apoptosis showing images of nuclei of tomato leaf cells treated with A 0% (control), B 5%, C 10%, D 15%, E 20% of AuNP suspension for 24 h (bar = 10 μm). d Mean % tail DNA ± SE after 24 h treatment with different concentration of AuNPs. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Tukey’s HSD test). Dosage below 10% show negligible DNA damage while higher than 20% show start of DNA damage

These AuNPs are non-apoptogenic at lower doses

Safe application of metal nanoparticles as therapeutic agent needs a pre-determination of biological effect of the particles at the borderline toxicity [37]. A threshold level of nanoparticles required for apoptosis was obtained through treatment of tomato leaf cells with different concentration of AuNP for 24 h (Fig. 8c). Low concentration, e.g., 5% v /v of AuNP stock suspension (15.56 mg/L) did not show significant apoptogenic effect on tomato cells even after 24 h of exposure. The nuclei after 10% AuNP treatment showed 6.52 ± 0.63 percentage of DNA in tail which was higher than untreated control nuclei (0.95 ± 0.66 percentage of DNA in tail) and those treated with 5% AuNP suspension (1.04 ± 0.89 percentage of DNA in tail). Treatment of tomato leaf cells with 15 and 20% AuNP resulted in a slight rise in DNA damage showing 7.15 ± 1.70 and 13.47 ± 2.16 percentage of DNA in tail, showing significant apoptogenic effect (Fig. 8d). Thus, in lower doses apoptogenic effect is negligible holding the possibility for these nanoparticles to be used as antimicrobial agent or drug/gene delivery vehicle in eukaryotic cells.

The AuNPs are protein-coated

A few previous studies have mentioned nanoparticles coated with protein of natural origin [15]. Lower magnification TEM showed that the AuNPs are surrounded by protein-like material (Fig. 9a, b). In order to confirm the nature of the material, the AuNPs were washed and run on SDS-PAGE along with cell-free extracts in other lanes (Fig. 9c). Boiling in SDS served to detach the surface bound proteins from the nanoparticles. The boiled nanoparticles (lane 4) showed the presence of a single intense band of 40 kDa which was similar to a protein band present in lane 2 (cell filtrate). However, in the sample that was not boiled (lane 3), a faint protein band bound to AuNP was seen at the 116 kDa level. Although another faint band did appear at the 40 kDa level due to dissociation of the capping proteins from the particles. Protein coats are known to promote stability of nanoparticles in solution and their catalytic activity [28, 38]. The naturally formed protein coat around the nanoparticles makes them functionally efficient for biomedical uses including easy adsorption and delivery of DNA or hydrophobic drugs [39]. Peptides and protein-aided delivery of AuNPs have been successfully used to overcome blood-brain barrier in treatment of central nervous system disorders [14]. Hence, these biocompatible AuNPs can be potentially suitable for several biomedical applications due to the small size, unique physico-chemical properties, and other advantages.

Protein cap analysis. a , b TEM images showing capping protein layer (arrows) around AuNPs. c SDS-PAGE of extracellular protein secreted from T. crassum and protein associated with nanoparticles. Lane 1, molecular size marker. Lane 2, total extracellular protein. Lane 3, nanoparticles loaded without boiling show faint protein band bound to the AuNPs at 116 kDa mark. There is also a band of detached protein at 40 kDa mark. Lane 4, nanoparticles after boiling with 1% SDS loading buffer showing disappearance of the 116 kDa band and a distinct 40 kDa band. Arrow indicates 40 kDa

The AuNPs could deliver green fluorescence protein (GFP) gene into Sarcoma 180 cancer cell lines

Plasmid DNA pCAMBIA1302 harboring gfp marker gene, complexed with AuNPs, was used to treat Sarcoma 180 cells. The cells produced green fluorescence indicating uptake of plasmid DNA/AuNPs complex and subsequent expression of the gene in the cancer cell, while the cells treated only with naked plasmid DNA did not show the fluorescence (Fig. 10a, b). This confirms the high potential of these particles to not only deliver genes into cancer cells, the genes were stably expressed and remained functional once delivered into the cells.

Gene delivery using AuNPs into Sarcoma 180 cancer cells and hemolysis assay with human erythrocytes; fluorescence microscopic image of a cancer cells expressing green fluorescence protein after uptake of DNA-AuNP complex and b control cells treated with free plasmid DNA (bars = 20 μm). c Percentage hemolysis with different dilutions of AuNPs. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Tukey’s HSD test)

Earlier metallic nanoparticles have been shown to exhibit immense therapeutic potential in treating variety of diseases like retinal neovascularization, HIV, Dalton’s lymphoma, and exhibited activity against hepatitis virus, respiratory syncytial virus, and herpes simplex virus [18]. Congruent to these reports, gold nanocarrier-based drug delivery in present study using AuNPs can be considered as a prospective mediator in numerous medical applications including diagnostics, drug delivery, and cancer therapeutics.

Compatibility of the AuNPs with human erythrocytes and toxicity assay

Erythrocytes are simple and convenient model of the cell membrane system and used for studying nanoparticle-membrane interactions [40]. The hemolytic assay elucidates membrane-lytic activity of the AuNPs at different concentrations. Figure 10c shows that membrane-lytic activity of the nanoparticles was negligible at low concentrations. The highest hemolytic activity found at higher concentrations of nanoparticle suspension (up to 20 μl/mL) was less than 8% which indicates very low blood toxicity. The gradually increasing hemolytic activity with increasing concentration of AuNPs is likely due to increased affinity and adhesion of larger number of particles with the erythrocytes. This affinity of the particles to cell membranes is expected to facilitate their cellular transport. Low hemolytic activity along with effective cellular uptake render nanoparticles highly suitable for the development of safe and efficient theranostic agents [41].