Intensitas Rendah Berfokus Ultrasound-Augmented Nanopartikel Multifungsi untuk Mengintegrasikan Pencitraan Ultrasound dan Terapi Sinergis Kanker Payudara Metastatik
Abstrak
Metastasis kanker payudara diyakini memiliki efek negatif pada prognosisnya. Diuntungkan dari karakteristik penetrasi dalam dan non-invasif yang luar biasa, terapi sonodinamik (SDT) menunjukkan serangkaian potensi yang mengarah pada pengobatan kanker. Untuk meringankan keterbatasan monoterapi, nanoplatform multifungsi telah dieksplorasi untuk mewujudkan efisiensi pengobatan sinergis. Di sini, kami membuat sistem nano multifungsi baru yang merangkum klorin e6 (Ce6, untuk SDT), perfluoropentane (PFP, untuk pencitraan ultrasound), dan docetaxel (DTX, untuk kemoterapi) dalam struktur inti-cangkang PLGA yang dirancang dengan baik. Nanopartikel Ce6/PFP/DTX/PLGA sinergis (NP CPDP) yang ditampilkan dengan biokompatibilitas dan stabilitas yang sangat baik terutama memungkinkan aplikasi lebih lanjut. Setelah iradiasi ultrasound terfokus (LIFU) intensitas rendah, pencitraan ultrasound yang ditingkatkan dapat terungkap baik secara in vitro maupun in vivo. Lebih penting lagi, dikombinasikan dengan LIFU, nanopartikel menunjukkan kemampuan antitumor yang menarik melalui spesies oksigen reaktif sitotoksik yang diinduksi Ce6 serta pelepasan DTX untuk menghasilkan efisiensi terapeutik bersama. Lebih lanjut, strategi pengobatan ini mengaktifkan kemampuan anti-metastasis yang kuat dimana nodul metastasis paru-paru telah berkurang secara signifikan. Hasilnya menunjukkan bahwa nanoplatform berorientasi SDT yang dikombinasikan dengan kemoterapi dapat diberikan sebagai pendekatan yang menjanjikan dalam meningkatkan terapi sinergis yang efektif dan menekan metastasis paru dari kanker payudara.
Pengantar
Kanker payudara telah menghantui wanita selama bertahun-tahun sebagai salah satu tumor ganas yang paling mengancam. Karena heterogenitas yang tinggi dan kemampuan metastasis yang tinggi, dilaporkan bahwa metastasis jauh kanker payudara menyumbang lebih dari 90% dari kematiannya, sedangkan tingkat kelangsungan hidup 5 tahun pada pasien lanjut atau metastasis hanya 26%, menghasilkan hasil klinis yang buruk [1,2,3]. Karakterisasi negatif kanker payudara telah membuat sulit untuk disembuhkan sepenuhnya, mempromosikan strategi pengobatan menjadi lebih menantang dalam menghilangkan tumor primer serta metastasis jauh.
Pendekatan terapi tradisional seperti pembedahan dan kemoterapi masih dianggap efektif dalam mengobati kanker payudara [4]. Di antara semua obat kemoterapi, docetaxel (DTX) memainkan peran penting dalam mengobati kanker payudara metastatik (MBC) dan kanker payudara stadium lanjut (ABC) [5]. Sebagai obat antitumor lini pertama yang disintesis oleh zat kimia di pohon yew, efek antitumor DTX terutama dicapai dengan menghancurkan mitosis dan proliferasi sel [6]. Memiliki efisiensi antitumor yang luas, DTX menjadi salah satu agen kemoterapi yang paling efektif dalam mengobati kanker payudara [7]. Namun, agen kemoterapi biasanya menginduksi efek yang tidak diinginkan serta toksisitas seluruh tubuh, yang sangat membatasi efisiensi terapi [8]. Selain itu, tahapan klinis yang berbeda dan berbagai kondisi pribadi mengungkapkan bahwa pendekatan terapeutik tunggal mungkin tidak cukup efisien untuk memenuhi semua harapan dalam pengobatan kanker payudara. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk mengekang efek samping toksik dan meningkatkan efektivitas pengobatan DTX dalam persyaratan aplikasi di masa mendatang.
Ultrasound pertama kali dieksplorasi dalam diagnosis klinis karena keunggulannya yang luar biasa seperti bebas radiasi, noninvasif, dan efektivitas biaya [9, 10]. Terlepas dari fitur unik yang disebutkan di atas, ia juga mendapatkan banyak perhatian dalam prospek terapeutik berdasarkan bahan berstruktur nano [11]. Terapi sonodinamik awalnya diwujudkan dengan kavitasi dan 'efek sonoporasi' yang dipicu oleh ultrasound. Generasi ROS selama proses ini menginduksi sitotoksisitas terhadap sel kanker secara efektif, menyebabkan kerusakan DNA yang cepat dan apoptosis sel tumor [9]. Berbeda dengan penggunaan terapi fotodinamik (PDT) yang dangkal, SDT menerima hasil terapi yang lebih menyenangkan dalam mengobati tumor yang dalam dengan ultrasound terfokus intensitas rendah (LIFU), yang memiliki manfaat untuk mencegah cedera termal yang tidak diinginkan selama perawatan [12, 13]. Sebagai salah satu esensial dalam SDT, sonosensitizer telah dieksplorasi dalam berbagai terapi tumor [14]. Klorin e6 (Ce6) awalnya digunakan sebagai fotosensitizer umum, tetapi kemampuan terapeutiknya yang diinginkan dan afinitas yang sangat baik terhadap jaringan tumor membuatnya mampu digunakan sebagai sonosensitizer juga [15]. Dimainkan sebagai generasi kedua dari keluarga klorin, Ce6 telah membangkitkan perhatian yang luas dalam pengobatan tumor untuk generasi ROS yang diinginkan [16]. Namun, aplikasi tunggal Ce6 terus-menerus menimbulkan ketidakstabilan serta toksisitas kulit yang tidak diinginkan, yang semuanya membatasi eksplorasi SDT yang ekstensif.
Dalam beberapa tahun terakhir, perkembangan nanoteknologi telah memainkan peran yang sangat penting di berbagai bidang, termasuk biosensing, pencemaran lingkungan, dan degradasi kontaminan [17,18,19,20,21,22,23]. Nanopartikel berbasis nanoteknologi memiliki banyak keunggulan, seperti diameter yang lebih kecil, luas permukaan luar yang lebih besar, dan resistansi difusi internal yang lebih rendah [24]. Sebelumnya, nanopartikel telah terlibat dalam aplikasi berbagai bahan seperti MOF [25], titanium dioksida [26], dan graphene [21]. Tren nanoteknologi yang berkembang pesat dikombinasikan dengan pengobatan kanker juga telah dieksplorasi secara luas, membuka jalan yang layak dalam mempromosikan strategi terapi gabungan [27]. Untuk mewujudkan aplikasi terapi tumor yang efektif, nanopartikel yang dirancang dengan hati-hati diatur terutama untuk meningkatkan efisiensi transportasi agen kemoterapi toksik melalui efek peningkatan permeabilitas dan retensi (EPR), memungkinkan peningkatan akumulasi di lokasi tumor [28, 29]. Selain itu, efek samping yang tidak diinginkan juga dapat dikurangi melalui enkapsulasi kemoterapi. Telah dilaporkan bahwa perfluoropentane (PFP) memiliki kapasitas yang luar biasa untuk mengubah dari fase cair ke fase gas di bawah iradiasi, yang dapat diterapkan sebagai probe molekul ultrasound baru, terutama dalam pencitraan dan pengobatan ultrasonik [30]. Lebih penting lagi, fase cair awal memungkinkan PFP mudah dienkapsulasi dalam berbagai bahan [31]. Selain itu, enkapsulasi PFP dapat sangat meningkatkan kemampuan pencitraan ultrasound di lokasi tumor sesuai dengan efek EPR yang disebutkan di atas dan menghindari batasan ukuran yang ditimbulkan oleh gelembung mikro berukuran mikrometer yang lebih besar. Kecuali untuk pencitraan tumor, kombinasi dari beberapa pendekatan terapeutik memiliki nilai yang sangat besar dalam pengobatan kanker yang berorientasi pada sistem nano. Secara khusus, praktik termasuk integrasi terapi sonodinamik dan kemoterapi telah memberikan penekanan untuk merevolusi efisiensi terapi tradisional. Xu dkk. [32] menunjukkan bahwa karena SDT, hasil terapi yang ditingkatkan dapat diungkapkan dengan obat kemoterapi dan dengan demikian menyebabkan aktivasi apoptosis sel tumor yang ditargetkan mitokondria. Pola ini mengungkap perlakuan sinergis, yang sangat diperhatikan dalam pemanfaatan di masa depan.
Di sini, dengan inspirasi yang disebutkan di atas, kami bermaksud menggunakan nanopartikel all-in-one (CPDP NPs) untuk membangun sistem diagnostik dan terapeutik, yang diwujudkan oleh terapi sinergis berorientasi SDT yang dikombinasikan dengan kemoterapi, serta peningkatan pencitraan ultrasonografi. Memiliki keamanan yang sangat baik dan stabilitas metabolisme yang ideal sebagai nanocarrier yang diinginkan, PLGA telah membuatnya menguntungkan dalam mengeksplorasi berbagai kemampuan antitumor [33, 34]. Oleh karena itu dalam strategi ini, menggunakan PLGA sebagai bahan lapisan luar, PFP dapat secara signifikan meningkatkan pencitraan ultrasound melalui kemampuan pergeseran fase yang dipicu oleh LIFU, sementara Ce6, sonosensitizer generasi kedua yang diinginkan, juga dapat diekspos ke LIFU untuk menginduksi pembentukan ROS. Selain itu, disertai pelepasan DTX, kemoterapi dan SDT akan direalisasikan untuk mencapai terapi sinergis pada akhirnya. Yang penting, struktur inti-cangkang dari CPDP NPs dapat diadministrasikan dengan mantap tanpa merusak jaringan atau sel normal dan juga memungkinkan nanopartikel memiliki efisiensi enkapsulasi yang relatif lebih tinggi [35]. Selain itu, isi dapat terlindung dengan baik dalam struktur inti-kulit ini [36,37,38], terutama untuk PFP, yang dapat secara efektif diubah dari cair menjadi gas karena keberadaan struktur. Dengan menggunakan struktur inti-kulit ini, strategi sinergis dapat ditunjukkan secara bersamaan dengan cara yang lebih stabil. Pertama, strategi sinergis membantu secara signifikan mengurangi efek samping DTX dengan enkapsulasi yang efektif, yang sangat penting untuk meringankan penderitaan dalam mengobati tumor ganas dan agresif; kedua, dibandingkan dengan kemoterapi tunggal, kombinasi SDT dan kemoterapi telah diverifikasi sebagai strategi yang menjanjikan untuk memperkuat efisiensi terapeutik. Ketiga, pencitraan ultrasound yang disempurnakan yang direalisasikan oleh PFP telah mengoptimalkan strategi diagnostik dan juga membantu memverifikasi efektivitas antitumor. Last but not least, seluruh sistem aman dan stabil dengan biokompatibilitas yang sangat baik. Digarisbawahi bahwa dalam strategi ini, metastasis paru-paru serta pertumbuhan tumor telah sangat dihambat baik secara in vitro maupun in vivo. Sebagai kesimpulan, strategi sinergis menunjukkan kemanjuran pengobatan yang produktif terhadap tumor ganas payudara dan metastasis jauhnya, dan dikombinasikan dengan kemampuan pencitraan ultrasoundnya, ini mungkin menjadi strategi pengobatan yang menjanjikan dalam aplikasi klinis lebih lanjut.
Bahan dan Metode
Materi
PLGA-COOH (Mw 12.000 Da) dibeli dari Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (Jinan, China). Perfluoropentana (PFP) dan agarosa diperoleh dari Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO). Klorin e6 (Ce6) dibeli dari Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (Dalian, China). Kit uji sitotoksisitas Cell Counting Kit-8 (CCK-8) diperoleh dari Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Jepang). 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) dibeli dari MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, USA). Propidium iodida (PI) diperoleh dari Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (Beijing, Cina). Annexin V-FITC/PI diperoleh dari BD Biosciences (USA). Docetaxel (DTX) dibeli dari MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, USA). Semua reagen lainnya adalah produk murni analitik tanpa pemurnian lebih lanjut. Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (DMEM), serum janin sapi, dan tyrisin dibeli dari Gibco (ThermoFisher Scientific, USA) dan spektrofotometer UV (UV–Vis, Hitachi, Jepang).
Sintesis NP CPDP
Nanopartikel Ce6-PFP-DTX/PLGA (CPDP NPs) dibuat dengan metode emulsi ganda W/O/W menurut laporan sebelumnya [39, 40]. Secara singkat, 2 mg Ce6 pertama dilarutkan dalam 500 μL metanol. Selanjutnya, 50 mg PLGA-COOH dan docetaxel (2 mg) dilarutkan dalam 4 mL diklorometana, kemudian larutan sebelumnya secara bersamaan ditambahkan ke dalamnya. Kemudian, 200 L PFP ditambahkan ke larutan di atas. Akibatnya, campuran dipicu oleh probe ultrasonik (Sonics &Materials Inc., USA) untuk mendapatkan emulsi pertama (5 detik aktif dan 5 detik mati, 3 menit). Untuk mendapatkan emulsi kedua, 8 mL larutan poli(vinil alkohol) (PVA) (w/v = 4%) ditambahkan ke dalam emulsi di atas, menggunakan probe ultrasonik yang sama selama 2 menit. Setelah menambahkan 10 mL isopropil alkohol 2% ke dalam emulsi akhir, larutan dicampur di bawah suhu kamar secara mekanis selama minimal 4 jam untuk membuat diklorometana menguap sepenuhnya. Akhirnya, NP CPDP disentrifugasi selama tiga kali (12.000 rpm, 5 menit) dan kemudian dikumpulkan dan disimpan pada suhu 4 °C untuk digunakan lebih lanjut. NP PDP disiapkan dengan cara yang sama kecuali untuk Ce6. Semua proses eksperimental dioperasikan di atas es dan dilakukan secara ketat dalam kegelapan.
Karakterisasi NP CPDP
Ukuran partikel dan potensi zeta NP CPDP dan NP PDP diwujudkan oleh instrumen Malvern Zetasizer Nano (Malvern, UK). Morfologi dicirikan oleh mikroskop elektron transmisi (TEM) dan mikroskop optik. Untuk mengevaluasi stabilitas, NP CPDP dilarutkan dalam larutan buffer fosfat (PBS) dan diukur ukuran masing-masing 7 hari. Setiap sampel dalam rangkap tiga diukur. Efisiensi enkapsulasi NP CPDP dihitung melalui rumus berikut:
Efisiensi enkapsulasi (%) = (Berat pemuatan DTX atau Ce6/Berat total DTX atau Ce6) × 100%. Untuk memverifikasi enkapsulasi berbagai bahan, spektrum UV-Vis dari berbagai sampel diselidiki (UH5300, Hitachi). Enkapsulasi yang efektif juga dianalisis oleh TEM.
Tingkat Pelepasan Obat dari NP CPDP
Untuk mengevaluasi kemampuan pelepasan obat Ce6 dan DTX dalam NP CPDP, dua larutan dengan pH berbeda (larutan buffer fosfat, PBS:7.4, larutan buffer asetat, ABS:5.6) digunakan untuk menguji efisiensi pelepasan kumulatif. Secara singkat, NP CPDP pertama-tama didispersikan dengan 1 mL PBS atau ABS setelah campuran disegel ke dalam kantong dialisis (Mw:10.000); seluruh larutan kemudian dipindahkan ke dalam botol kaca (volume total:150 mL) yang ditambahkan 149 mL PBS atau ABS untuk menjaga volume total larutan pada 150 mL. Botol kaca kemudian ditempatkan ke dalam shaker suhu konstan 37 °C, dan pada periode yang berbeda (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 jam), larutan dikumpulkan dan segera ditambahkan dengan yang sama. volume sedang. Setiap kelompok diulang tiga kali. Terakhir, konsentrasi Ce6 dan DTX diukur dengan Synergy Hybrid Multi-Mode Read (BioTek, USA) masing-masing pada 403 dan 229 nm, dan laju pelepasan obat pada setiap titik waktu dihitung.
Pencitraan Ultrasonografi In Vitro
Untuk menyelidiki kemampuan ultrasonik NP CPDP, emulsi (1 mg/mL) pertama kali dipicu oleh peralatan transduser ultrasound terfokus (LIFU) intensitas rendah (Pusat Penelitian Teknik Medis Ultrasonik Ronghai, Chongqing, Cina), dan pola konduksinya ditetapkan sebagai siklus kerja 50%, durasi pulsa 1 dtk di bawah intensitas yang berbeda (1–2 W/cm
2
) untuk waktu durasi yang berbeda. Untuk pencitraan ultrasound, NP CPDP yang diiradiasi ditambahkan ke model agarosa yang disiapkan sebelumnya, masing-masing, menggunakan instrumen diagnostik ultrasound Philips EPIQ5 (frekuensi probe:12 MHz, MI:0,06) untuk mengamati pencitraan 2D dan CEUS dari NP CPDP. Sementara itu, perangkat lunak ImageJ diterapkan untuk menganalisis nilai skala abu-abu setiap grup.
Serapan Seluler dan Generasi In Vitro ROS dari NP CPDP oleh Iradiasi LIFU
Garis sel kanker payudara murine 4T1 diperoleh dari bank sel Shanghai dari Akademi Ilmu Pengetahuan Cina (Shanghai, Cina) dan diinkubasi dalam media RPMI 1640 yang dicampur dengan 10% FBS dan 1% streptomisin/penisilin pada 37 °C dalam 5% CO 2 inkubator yang dilembabkan.
Sel 4T1 pertama kali diinkubasi seperti kondisi sebelumnya pada kepadatan 1 × 10
4
sel per piringan untuk menguji serapan seluler menggunakan CLSM dalam interval waktu yang berbeda (1 jam, 2 jam, 4 jam, 8 jam). Untuk memverifikasi generasi ROS, sel-sel dipisahkan menjadi 5 kelompok berikut:kontrol, NP CPDP, LIFU, Ce6 + LIFU, CPDP NPs + LIFU. Setelah kultur konvensional 24 jam, media masing-masing digantikan oleh CPDP NP (200 L, 0,8 mg/mL) atau Ce6 (200 L), dan sel diinkubasi bersama selama 3 jam lagi. Kemudian, penyinaran LIFU (2 W/cm
2
, 120 s) dilakukan, masing-masing, menurut kelompok yang berbeda. Setelah ko-inkubasi dan pengobatan LIFU, 100 L larutan DCFH-DA encer ditambahkan, dan masing-masing kelompok dikultur dalam inkubator sebelumnya selama 15 menit. Mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) digunakan untuk mengkonfirmasi hasil produksi spesies oksigen reaktif, dan intensitas fluoresensi yang sesuai diukur dengan perangkat lunak ImageJ.
Sitotoksisitas In Vitro dan Kemampuan Pengobatan Bersama NP CPDP
Uji CCK-8 diterapkan untuk menilai sitotoksisitas NP CPDP. Secara singkat, sel kanker payudara murine 4T1 diinkubasi dalam piring 96-sumur, dengan kepadatan 1 × 10
4
per sumur selama 24 jam. Kemudian, NP CPDP diencerkan dengan media RPMI 1640 bebas serum pada berbagai konsentrasi (0,0.2,0.4,0.6,0.8 mg/mL, n = 3), dengan atau tanpa penyinaran LIFU (2 W/cm
2
, 120 dtk). Setelah 24 jam proses kokultur, viabilitas sel sel 4T1 dilakukan.
Untuk mengevaluasi efisiensi apoptosis sel dari pengobatan bersama, sel 4T1 dikultur seperti sebelumnya selama 24 jam dan kemudian dipisahkan menjadi lima kelompok berikut:(1) kontrol (tanpa perawatan apa pun), (2) LIFU (hanya dengan paparan LIFU pada 2 W/cm2)
2
), (3) NP CPDP (hanya dengan larutan NP CPDP pada 0,8 mg/mL), (4) NP PDP + LIFU dan (5) NP CPDP + LIFU. Setelah berbagai koinkubasi nanopartikel (200 μL) dan paparan LIFU, setiap kelompok diperlakukan dengan pewarnaan ganda annexin V (5 L) dan propidium iodida (5 L) selama 20 menit dan dianalisis melalui protokol flow cytometry.
Penghambatan Metastasis Sel In Vitro
Untuk menyelidiki penghambatan kemampuan metastasis sel, uji penyembuhan luka dan uji transwell dirancang. Untuk uji penyembuhan luka, sel 4T1 dikultur secara konvensional seperti sebelumnya di pelat 6-sumur. Setelah pertumbuhan sel mencapai 80% pertemuan, ujung pipet (10 μL) diterapkan untuk melakukan goresan buatan di sepanjang bagian tengah pelat 6-sumur. Kemudian, sel diperlakukan dalam kelompok yang sama yang disebutkan di atas. Setelah coincubation terus menerus selama 24 jam, sel dicuci dengan PBS 3 kali dan diamati di bawah mikroskop optik (Olympus, Jepang).
Untuk pengujian transwell, kompartemen atas ruang transwell (Corning, San Diego, USA) terutama diterapkan untuk meniru matriks ekstraseluler in vivo. Sel 4T1 dengan kepadatan 1 × 10
5
sel per sumur diunggulkan ke ruang atas dalam media RPMI 1640 bebas serum, sedangkan kompartemen bawah diisi dengan media kultur lengkap yang dicampur dengan 10% FBS. Kemudian, sel-sel dipisahkan sama seperti kelompok di atas dan diperlakukan masing-masing selama 24 jam. Setelah itu, sel-sel di permukaan bawah difiksasi dengan paraformaldehida dan diwarnai dengan kristal violet. Hasilnya diamati dengan mikroskop cahaya (Olympus, Jepang).
In Vivo Ultrasound Imaging
Tikus BALB/c betina sehat (4 minggu) dan tikus Kunming (4 minggu) diperoleh dari Pusat Hewan Laboratorium Universitas Medis Ningxia. Semua percobaan hewan dilakukan di bawah pedoman yang disetujui oleh Komite Peninjau Etika Kesejahteraan Hewan dari Universitas Kedokteran Ningxia. Untuk menetapkan model pembawa tumor tikus, tikus BALB/c diinokulasi dengan sel kanker payudara 4T1 (1 × 10
7
/mL) di sisi kanan. Setelah ukuran tumor tumbuh menjadi 60–80 mm
3
, tikus BALB/c disuntik dengan NP CPDP (200 L, 1 mg/mL) melalui vena ekor secara intravena. 24 jam kemudian, lokasi tumor tikus dilakukan dengan LIFU (2 W/cm
2
, 120 s), lalu, pencitraan 2D dan CEUS diperoleh melalui instrumen diagnostik ultrasound Philips EPIQ5 yang disebutkan sebelumnya. Analisis skala abu-abu diukur dengan perangkat lunak ImageJ.
Efisiensi Terapi Sinergis In Vivo dari CPDP NP
Setelah inokulasi sel kanker 4T1, ukuran tumor dicatat setiap dua hari, dan volume tumor dihitung dengan rumus sebagai:Volume = 1/2 × Length × Width
2
. Ukuran tumor dan berat badan mencit dicatat setiap 2 hari sekali, sedangkan gambar pertumbuhan tumor dicatat setiap 3 hari sekali. Saat volume tumor mencapai 60–80 mm
3
, tikus dengan ukuran tumor yang sama secara acak dibagi menjadi lima kelompok yang sama:kontrol, LIFU, NP CPDP, PDP + LIFU, dan CPDP NPs + LIFU (n = 3). Setiap kelompok disuntik secara intravena dengan berbagai NP (200 L) melalui vena ekor kecuali untuk kelompok kontrol (sebagai gantinya 200 L PBS). Dua puluh empat jam kemudian, lokasi tumor diekspos dengan iradiasi LIFU (2 W/cm
2
) selama 120 dtk. Seluruh pemberian SDT diulang setiap 3 hari dan berlangsung selama 18 hari. Berat badan dan volume tumor mencit diukur dan dihitung. Setelah perawatan, tikus dibunuh dan jaringan tumor dikirim ke H&E, TUNEL, dan PCNA untuk analisis histologis lebih lanjut.
Keamanan hayati NP CPDP Di Vivo
Untuk menyelidiki biosafety nanopartikel CPDP in vivo, tikus Kunming betina sehat (n = 3) dipisahkan menjadi 4 kelompok berikut:kontrol, 5 mg/mL, 10 mg/mL, dan 20 mg/mL. NP CPDP (200 L) disuntikkan melalui vena ekor tikus; kemudian, tikus diberi akses gratis ke makanan dan air tanpa pemberian lebih lanjut. Berat badan mencit diukur setiap 2 hari sekali. Setelah 30 hari, tikus dibunuh dan sampel darah dikumpulkan untuk analisis sel darah dan biokimia. Organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal) masing-masing dikumpulkan dan diselidiki untuk pewarnaan H&E.
In Vivo Menghambat Metastasis Paru-paru
Untuk mengevaluasi penghambatan metastasis paru masing-masing kelompok, seluruh proses dilakukan dengan mengamati jumlah nodul metastasis di paru-paru serta penilaian histologi pewarnaan H&E. Setelah semua tikus di-eutanasia, jaringan paru-paru diangkat dan difiksasi; kemudian, foto-foto nodul kanker diambil dan jaringan paru-paru dianalisis lebih lanjut dengan pewarnaan H&E.
Analisis Statistik
Data pengukuran semua dilakukan 3 kali dan dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD) dan dianalisis dengan ANOVA satu arah atau t standar Siswa uji melalui perangkat lunak SPSS (versi:19.0), sedangkan p nilai < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Karakterisasi NP CPDP dan Efisiensi Pelepasan Obat
Metode emulsi ganda diterapkan dalam pembuatan NP CPDP, yang mengenkapsulasi PFP material pergeseran fase, sonosensitizer Ce6, dan DTX obat-kemo secara bersamaan. Ketika didispersikan ke dalam PBS atau air deionisasi, larutan tersebut tampak berwarna abu-abu terang. NP CPDP menunjukkan bentuk bola homogen dan struktur inti-kulit yang jelas, apakah diamati melalui mikroskop optik atau mikroskop elektron transmisi (Gbr. 1a, b). Diameter rata-rata NP CPDP dan NP PDP adalah 249,5 ± 77,46 nm dan 246,6 ± 81,01 nm, dan potensi zeta permukaan rata-rata masing-masing adalah − 18,47 ± 0,55 mV dan 3.987 ± 0,66 mV (Gbr. 1c, d). Ukuran CPDP NPs dijamin dapat terakumulasi ke dalam lokasi tumor secara pasif melalui efek EPR [40]. Perbedaan muatan antara NP CPDP dan NP PDP terutama disebabkan oleh muatan negatif Ce6 [41]. Selain itu, potensi zeta negatif dari NP CPDP menunjukkan adsorpsi protein plasma yang lebih rendah, memverifikasi stabilitas relatif nanopartikel. Distribusi ukuran partikel dipertahankan antara kisaran 249,5 dan 385,1 nm dalam 7 hari (Gbr. 1e), menunjukkan kemantapan relatif NP CPDP. Menurut kurva standar, efisiensi enkapsulasi DTX dan Ce6 masing-masing adalah 83,84 ± 1,39% dan 60,54 ± 3,79%.
a TEM (bilah skala:500 nm) dan b gambar mikroskop cahaya NP CPDP (bilah skala:20 μm). c Distribusi ukuran dan d zeta potensi NP PDP dan NP CPDP. e Distribusi ukuran NP CPDP dalam 7 hari. f Tingkat pelepasan Ce6 dan g tingkat pelepasan DTX dalam kondisi yang berbeda (pH 7,4 dan pH 5,6, n = 3). h Spektrum UV-Vis dari Ce6, DTX, PFP/PLGA dan CPDP NP, masing-masing. Panah NP CPDP menunjukkan puncak karakteristik Ce6 dan DTX, menunjukkan enkapsulasi efektif dari kedua bahan. saya Hasil TEM dari dua nanopartikel. Nanopartikel PFP/PLGA menunjukkan cangkang tipis dan inti bulat (kiri). Nanopartikel CPDP yang dienkapsulasi Ce6 dan DTX menunjukkan cangkang yang jauh lebih tebal dan inti berbentuk oval (kanan)
Karena efisiensi pelepasan obat Ce6 dan DTX dari NP CPDP ditunjukkan pada Gambar 1f, g, peningkatan hampir dua kali lipat indeks pelepasan DTX tercatat pada pH 5,5 dibandingkan dengan nanopartikel yang dilarutkan dalam pH 7,4, yang menunjukkan pelepasan obat yang wajar. tingkat DTX dapat dicapai secara efektif dalam lingkungan mikro tumor asam. Hasil di atas dalam semua yang dipamerkan, NP CPDP yang dirancang halus dapat mengerahkan pelepasan obat kemoterapi yang stabil dan tepat waktu di lingkungan tumor asam, dan juga pada dasarnya diinginkan untuk dipersiapkan untuk SDT.
Saat UV–Vis dipamerkan, DTX dan Ce6 mengungkapkan puncak serapan unik masing-masing pada 229 nm dan 403 nm, dan sebaliknya, PFP/PLGA tidak menunjukkan puncak apa pun. Perlu dicatat bahwa spektrum NP CPDP menunjukkan puncak yang sama di dekat dua panjang gelombang di atas, sedangkan sisanya menunjukkan kecenderungan spektrum PFP/PLGA yang sama, yang menunjukkan keberhasilan enkapsulasi berbagai bahan (Gbr. 1h). Untuk memverifikasi lebih lanjut enkapsulasi yang efektif, Gambar 1i menunjukkan nanopartikel PFP/PLGA memiliki cangkang yang jauh lebih tipis dan inti bulat, sedangkan nanopartikel CPDP menunjukkan cangkang yang relatif lebih tebal dan inti berbentuk oval karena enkapsulasi DTX dan Ce6.
Pencitraan Ultrasonografi In Vitro
Disoroti bahwa PFP memiliki kemampuan pergeseran fase yang sangat baik. Transformasi cair-ke-gas tidak hanya membantu agregat nanopartikel dalam situs tumor tetapi juga memberikan hak kemampuannya untuk meningkatkan efisiensi pencitraan ultrasound [42]. Untuk membuktikannya, iradiasi LIFU diterapkan sebagai pemicu untuk menginduksi transformasi fase PFP, yaitu efek akustik droplet vaporization (ADV) [43]. Hasilnya menunjukkan bahwa intensitas skala abu-abu dipertahankan pada tingkat yang relatif rendah sebelum penyinaran LIFU, sementara setelah intensitas dan waktu penyinaran LIFU meningkat, kecenderungan peningkatan pencitraan ultrasound terungkap baik dalam 2D maupun CEUS (Gbr. 2a). Analisis akustik ImageJ semakin meyakinkan hasilnya dengan peningkatan nilai skala abu-abu (Gbr. 2b, c), yang konsisten dengan temuan pencitraan. Perlu dicatat bahwa hasil paling signifikan dari 2D dan CEUS diperoleh saat intensitas LIFU mencapai 2 W/cm
2
dan berlangsung selama 120 s. Hasil di atas menunjukkan bahwa PFP berhasil dienkapsulasi dalam NP CPDP, dan kemampuan pencitraan ultrasound telah ditingkatkan secara signifikan di bawah intensitas yang lebih tinggi serta waktu pemberian LIFU yang lebih lama.
a Gambar USG 2D dan CEUS di bawah intensitas dan waktu durasi LIFU yang berbeda. b Intensitas skala abu-abu yang sesuai pada intensitas dan waktu pencitraan 2D yang berbeda dan c Pencitraan CEUS (**p < 0.01, n = 3)
Serapan Seluler dan Pembuatan NP CPDP In Vitro ROS oleh Iradiasi LIFU
Seperti yang ditunjukkan oleh hasil CLSM pada Gambar. 3, serapan seluler NP CPDP menunjukkan tren yang ditingkatkan dalam interval waktu yang berbeda, mencapai agregasi paling signifikan pada coincubation 8 jam.
Serapan seluler 4T1 dari NP CPDP selama interval waktu yang berbeda (Biru:sel 4T1 bernoda DAPI. Merah:NP CPDP berlabel DiR, bilah skala adalah 50 μm)
Strategi utama terapi sonodinamik (SDT) adalah pembentukan ROS—serangkaian produk reduksi elektron tunggal—untuk menginduksi apoptosis sel kanker dan menghambat proliferasi sel [44]. Hal ini disorot bahwa ketika terkena ultrasound, sonosensitizer cenderung memicu produksi ROS; sementara itu, sejumlah besar energi akan dilepaskan selama seluruh proses [45]. Mengingat bahwa ultrasound dan sonosensitizer adalah elemen yang dapat dibuang untuk mempromosikan SDT, oleh karena itu, generasi ROS intraseluler dirancang dan dianalisis untuk menyelidiki perbedaan antara kelompok yang terbagi. Menurut Gambar 4a, jumlah ROS yang dihasilkan oleh kelompok iradiasi Ce6 plus LIFU dapat diabaikan, yang mungkin karena metabolisme yang cepat dari Ce6 bebas menyebabkan produksi ROS yang tidak memuaskan. Sebaliknya, intensitas fluoresen terkuat diungkapkan oleh kelompok CPDP NPs + LIFU. Diasumsikan bahwa Ce6 yang dienkapsulasi terlindungi dengan baik dan dengan demikian telah dijauhkan dari metabolisme. Akibatnya, setelah stimulasi LIFU, Ce6 dilepaskan untuk menghasilkan ROS yang melimpah. Relatif, tidak ada sinyal fluoresen signifikan yang ditemukan di grup lain (Gbr. 4b).
a Gambar CLSM generasi ROS dengan berbagai perlakuan dan b analisis intensitas FL yang sesuai (****p < 0,0001, n = 3). Bilah skala adalah 50 μm
Sitotoksisitas In Vitro dan Kemampuan Pengobatan Bersama NP CPDP
Uji Cell Counting Kit-8 (CCK-8) diperkenalkan untuk menguji sitotoksisitas in vitro NP CPDP. Dalam hal ini, kelompok yang berbeda dirancang dengan atau tanpa iradiasi LIFU pada konsentrasi yang berbeda. Hasilnya menunjukkan bahwa setelah ko-inkubasi 24 jam tanpa paparan LIFU, tidak ada efek yang jelas dari tingkat kelangsungan hidup NP CPDP bahkan pada konsentrasi tertinggi (0,8 mg/mL), menunjukkan keamanan hayati yang diinginkan dari NP CPDP (Gbr. 3d). 5a). Sebaliknya, itu menunjukkan bahwa ada penurunan mencolok dari viabilitas sel setelah iradiasi LIFU, menunjukkan kombinasi NP CPDP dan LIFU telah sangat memicu kematian sel 4T1, yang konsisten dengan generasi ROS in vitro.
a Relative cell viability with or without LIFU irradiation under different CPDP NPs concentrations. b 4T1 tumor cell apoptosis and necrosis by flow cytometry assay and c the data of corresponding necrosis and apoptosis rate analysis (****p < 0.0001, ***p < 0.001, n = 3)
To further evaluate SDT efficacy, a flow cytometry assay was introduced. As the results shown in Fig. 5b, c, the index of cell necrosis and apoptosis was highest observed in CPDP NPs + LIFU group, while other groups showed no obvious and necrosis and apoptosis. Notably, the necrosis and apoptosis rate of CPDP NPs + LIFU group was threefold higher than that of CPDP NPs only group, which ensured the significant tumor cell death efficiency of SDT from another respect. Intriguingly, compared with PDP NPs + LIFU group, cell necrosis and apoptosis rate in CPDP NPs + LIFU group was significantly increased, exhibiting the synergistic therapy efficiency of SDT and chemotherapy.
In Vitro Inhibition of Cell Metastasis
The invasive and migration capability of tumor cells are indispensable in tumor progression [46, 47]. As shown in Fig. 6a, the closure between the physical gap of CPDP NPs + LIFU group was significantly wider than other groups, indicating a relatively slower speed of migrating efficiency. According to the ImageJ software analysis (Fig. 6c), the migration rate of CPDP NPs + LIFU group was also remarkably reduced compared with other groups.
a The wound healing and b The transwell assay after various treatments. c The corresponding migration rate of wound-healing assay. d The corresponding migration number of tranwell assay (****p < 0.0001, n = 3)
Similarly in the transwell assay, compared with the swift migration speed of other groups, CPDP NPs + LIFU group revealed a significant reduction of cell number (Fig. 6b), which demonstrated an excellent anti-migration capability of the synergistic therapy. Specifically, with the absence of SDT (CPDP NPs only and LIFU only group), the number of tumor cells was mildly decreased (Fig. 6d). On the whole, due to the combination of SDT as well as chemotherapy, metastasis of 4T1 cells has been remarkably inhibited in vitro.
In Vivo Ultrasound Imaging
Since PFP was encapsulated in CPDP NPs, it is also necessary to evaluate the characteristic ultrasound imaging capability in vivo. After the injection via the tail vein of CPDP NPs, LIFU was then applied to the tumor site to acquire both 2D and CEUS imaging (Fig. 7a). The clear graphic difference between the two groups indicated that after LIFU irradiation, the corresponding intensity of CPDP NPs was elevated obviously compared with the pre-irradiation group. Further data of the average echo intensity also confirmed this result, which was also consistent with the in vitro imaging result previously (Fig. 7b, c).
a 2D and CEUS images with and without LIFU irradiation. b , c The corresponding grayscale intensity analysis measured by ImageJ (**p < 0.01, *p < 0.05, n = 3)
In Vivo Synergistic Therapeutic Efficiency of CPDP NPs
Seeing from Fig. 8a, b, the tumor volume of CPDP NPs + LIFU group was significantly smaller after 18 days of treatment than that of other groups, which may attribute to the effectiveness of ROS originated from SDT treatment as well as chemotherapy to exert a valid synergistic therapy efficiency. Similarly, photographs of mice-bearing tumors (Fig. 8a) also showed the same trend, verifying the cooperative treating efficacy of CPDP NPs triggered by LIFU exposure. Furthermore, there was no obvious weight reduction of mice between different groups (Fig. 8c). The results above all indicated a much higher inhibition rate of CPDP NPs + LIFU group, revealing that the synergistic therapy could significantly prevent tumor growth.
a Images of tumor-bearing mice under various treatments within the certain 18 days (n = 3). b Tumor volume analysis according to various treatments (**p < 0,01). c Weights of tumor-bearing mice under various treatments (ns no significance, n = 3). d H&E, PCNA and TUNEL results under various treatments (scale bar:200 μm). e Analysis of PCNA proliferation index of tumors under various treatments. f Analysis of TUNEL apoptotic index of tumors under various treatments (****p <0.0001, n =3)
To further testify the therapeutic results of all groups, both H&E, PCNA, and TUNEL staining were utilized (Fig. 8d). The proliferate rate of PCNA in CPDP NPs + LIFU group was only 20.50%, which was fourfold lower than control group, threefold lower than LIFU and CPDP NPs only group and twofold lower than PDP + LIFU group, respectively, demonstrating a significant anti-tumor proliferation rate (Fig. 8e). As it is shown in Fig. 8d, f, the TUNEL results indicated CPDP NPs + LIFU group exhibited an obvious apoptosis index of 72.86%, which was much higher than control (9.66%), LIFU (12.86%), CPDP NPs (19.59%), and PDP NPs + LIFU (37.06%) group. The results above all demonstrated the effectiveness of synergistic therapy exerted in vivo, which was also proved consistent with the previous in vitro results.
Biosafety of CPDP NPs In Vivo
Despite the effective therapeutic outcome, it is of great importance to explore the biosafety of the novel established nanoparticles as well. On behalf of the safe distribution of CPDP NPs in vivo, the metabolic safety was conducted. The results showed that instead of apparent body weight loss, the mice body weight elevated gradually in all the groups of mice (Fig. 9a), which indicated a negligible negative influence of CPDP NPs. In addition, as various organs and the blood samples exhibited in Fig. 9b, no significant changes were observed in blood cell, biochemistry analysis index, and H&E staining (Fig. 9c) among different treating groups, indicating the excellent biosafety of CPDP NPs in vivo.
a The weights of healthy Kunming mice under various concentrations of CPDP NPs (n = 3). b The blood biochemistry and blood routine examination under various concentrations of CPDP NPs within a certain period of 30 days (n = 3). c H&E results of different organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of mice under the same treatment (scale bar:50 μm)
In vivo Inhibition of Lung Metastasis
It is well established that the lung is the main target organ for distant metastasis of breast cancer [48]. In order to evaluate the suppressing efficiency of metastasis, lung tissues of mice were utilized for anti-metastatic investigation. As seen from Fig. 10a, b, compared with control, LIFU, CPDP NPs, and PDP + LIFU group, the CPDP NPs + LIFU group exhibited the most remarkable decrease of lung nodules, which suggested its desirable lung metastatic inhibition efficiency. A similar trend of decreasing also further indicated by H&E staining (Fig. 10c), which in all demonstrated this synergistic therapy strategy could exert effective effort in eliminating lung metastasis in mice.
a Images of the general appearances of lung tissues. b The analysis of the metastatic lung nodules between various treatments (**p < 0.01, n = 3). c Corresponding images of lung metastatic H&E staining results (scale bar:50 μm)
Diskusi
It has been greatly acknowledged that the metastasis of breast cancer will extensively influence its poor prognosis [3, 49]. As a desirable therapeutic approach, SDT may serve for its high efficiency and deep penetrating capability has been extensively convinced [11, 50]. Admittedly, since certain limitations exist in the single application of sonosensitizers, using SDT alone may still be less sufficient in further cancer exploration. The development of nanotechnology combined with clinical medicine has been promoted significantly in recent years, owning to the inspiring merits such as negligible toxicity, none invasiveness, and excellent biocompatibility. Using this novel approach, researchers have made many efforts in exploring multifunctional therapeutic strategies to enhance antitumor efficiency.
The biosafety is the priority of nano-agents. As a widely accepted material approved by the Food and Drug Administration (FDA) certification, it is highlighted that PLGA could be performed as a desirable carrier in application [51, 52]. Based on its advantages, we established a nano-system to realize multifunctional therapy efficiency, exploiting PLGA as the outer structure to encapsulate sonosensitizer Ce6, phase-shift material PFP and chemotherapeutic agent DTX. The CPDP nanoparticles (CPDP NPs) were primarily observed by the core–shell structure and appropriate size so that a desirable aggregation through the EPR effect could be achieved. The cell viability of CPDP NPs has been proved to be above 80% after 24-h coincubation, indicating the well safety of this nanoplatform. Besides, the phase transformation of encapsulated PFP has also guaranteed CPDP NPs as a contrast-enhanced agent when activated by LIFU. The enhanced ultrasound imaging capability will not only ensure the ideal therapeutic window but also promote the promising future for CPDP NPs to realize an integration of accurate diagnosis and precise treatment.
The key strategy in SDT is the generation of ROS. Compared with the single employment of Ce6, the encapsulated Ce6 in PLGA exerted a desirable protection, which could be verified by the ROS result. In our study, there was only a negligible amount of ROS generated by single use of Ce6, while nanoparticle-encapsulated Ce6 produced a considerable amount of ROS, which was further proved by SDT efficiency. The result indicated that ROS generation was preserved by the encapsulated Ce6 in CPDP NPs, which could lay a firm foundation for later tumor inhibition. Besides, the drug-releasing rate showed even at pH 5.5, little Ce6 was released from nanoparticles, demonstrating a well protection of sonosensitizer by PLGA, which was further proved by the ROS production and SDT outcome with high efficiency. Interestingly, the drug-releasing efficiency of DTX and Ce6 at pH 5.5 was quite different according to the results (more than 40% and around 20%, respectively), which may possibly cause by the diverse encapsulation efficiency of the two drugs. The minor releasing rate of Ce6 demonstrated that it could be effectively protected in PLGA so that substantial ROS generation through LIFU stimulation could be reached to get a more convinced SDT efficiency. Another reason for this difference may be due to the different solvents of the two drugs during the preparation process. Specifically, DTX and PLGA were directly dissolved in dichloromethane, while Ce6 needed to be first dissolved in methanol and then added dropwise to dichloromethane, due to its poor solubility in the latter [53]. Since drug release in nanoparticles is directly related to the effectiveness of subsequent combination therapy, the assessment of drug-releasing rate as well as ROS generation result has mutually proved this point. Current researches have suggested that using chemotherapy alone may not significantly reverse tumor progression [41]. In this study, the nanoplatform we designed demonstrated strong evidence that compared with the single employment of chemotherapy, the synergistic treatment has remarkably elevated therapeutic efficiency both in vitro and in vivo. Since LIFU stimulation optimized the therapeutic strategy, an increased cell apoptosis rate was remarkably elevated. It is worth noting that due to this synergistic strategy, lung metastasis could be significantly inhibited both at tumor cell level and inoculated mice model, which is consistent with previous reports [16, 52].
Conclusion
In conclusion, the safe and stable CPDP NPs we designed and prepared plus LIFU irradiation could remarkably eliminate breast tumor progression and its lung metastasis. With an enhanced imaging capability, this nanoplatform was also considered to be a promising contrast-enhanced agent in clinical. Hence, the novel synergistic strategy combined with LIFU might be considered as an effective treating application to reverse the poor outcome of metastatic breast cancer.
