CKAP4 Antibody-Conjugated Si Quantum Dot Micelles untuk Pencitraan Target Kanker Paru
Abstrak
Saat ini, berbagai nanomaterial fluoresen telah dirancang dan disintesis sebagai agen kontras optik untuk navigasi bedah. Namun, belum ada laporan tentang persiapan agen kontras fluoresen untuk navigasi operasi kanker paru-paru menggunakan titik kuantum silikon (Si QDs). Studi ini meningkatkan dan memodifikasi misel Si QD yang dapat terdispersi dalam air yang dilaporkan oleh Pi et al. untuk menyiapkan misel Si QD-CKAP4. Data menunjukkan bahwa misel Si QD-CKAP4 adalah partikel berbentuk bola dengan diameter hidro rata-rata sekitar 78,8 nm. Penyerapan UV-terlihat dari misel Si QD-CKAP4 berkisar antara 200 hingga 500 nm. Dengan panjang gelombang eksitasi 330 nm, fluoresensi kuat pada 640 nm diamati dalam spektrum emisi fluoresensi. Mikroskop laser confocal dan uji mikroskop fluoresensi menunjukkan bahwa misel Si QD-CKAP4 menunjukkan kemampuan penargetan yang baik untuk sel kanker paru-paru dan jaringan kanker paru-paru secara in vitro. Uji pencitraan fluoresensi in vivo menunjukkan bahwa misel Si QD-CKAP4 dimetabolisme oleh hati dan diekskresikan oleh ginjal. Selain itu, misel Si QD-CKAP4 secara khusus menargetkan jaringan kanker paru-paru secara in vivo dibandingkan dengan jaringan paru-paru yang sehat. Uji sitotoksisitas dan pewarnaan hematoxylin dan eosin menunjukkan bahwa misel Si QD-CKAP4 menunjukkan keamanan hayati yang tinggi secara in vitro dan in vivo. Si QD misel-CKAP4 adalah agen pencitraan yang ditargetkan secara khusus untuk kanker paru-paru dan diharapkan menjadi agen kontras fluoresen untuk navigasi bedah kanker paru-paru di masa depan.
Pengantar
Kanker merupakan salah satu penyakit utama yang mengancam kesehatan manusia di seluruh dunia [1]. Diantaranya, insiden dan mortalitas kanker paru menempati urutan tertinggi di antara semua tumor ganas dan menunjukkan tren yang meningkat setiap tahun [2]. Reseksi bedah adalah pengobatan utama untuk tumor padat. Namun, metode membedakan jaringan ganas dari jaringan sehat terutama terbatas pada isyarat taktil dan visual dan pengalaman ahli bedah [3].
Dalam beberapa tahun terakhir, operasi yang dipandu fluoresensi telah menjadi populer di bidang penelitian dalam panduan intraoperatif real-time untuk reseksi tumor [4]. Dengan bantuan agen kontras fluoresensi dan sistem pencitraan fluoresensi, ahli bedah dapat menggunakan panduan gambar waktu nyata untuk mereseksi tumor primer dan mengidentifikasi tumor sisa di rongga operasi. Dibandingkan dengan metode pencitraan biomedis tradisional, sistem pencitraan fluoresensi menawarkan beberapa keuntungan, seperti tidak adanya radiasi pengion dan resolusi spasial yang tinggi [3, 5, 6].
Saat ini, para peneliti telah melaporkan berbagai nanomaterial fluoresen untuk pencitraan biologis [7, 8]. Di antara mereka, titik-titik kuantum silikon (Si QDs) telah menjadi populer di bidang pencitraan biologis [9,10,11]. Namun, tidak ada laporan tentang persiapan agen kontras fluoresen untuk navigasi operasi kanker paru-paru menggunakan Si QD.
Pada tahun 2014, Pi dkk. melaporkan metode sintesis untuk misel Si QD baru yang dapat terdispersi dalam air [12]. Data penelitian menunjukkan bahwa misel Si QD menunjukkan keunggulan termasuk ukuran yang dapat dikontrol, efisiensi kuantum fluoresensi tinggi, dan stabilitas cahaya yang sangat baik [12]. Penelitian ini bertujuan untuk memperbaiki dan memodifikasi misel Si QD yang larut dalam air yang dilaporkan oleh Pi et al. untuk mempersiapkan agen kontras fluoresen baru, yang diharapkan dapat digunakan sebagai agen kontras fluoresen untuk navigasi dalam operasi kanker paru-paru di masa depan.
Pada tahun 2018, Yanagita dkk. melaporkan bahwa CKAP4 sangat diekspresikan dalam serum dan jaringan kanker pasien kanker paru dan dapat digunakan sebagai biomarker baru untuk diagnosis dini kanker paru [13]. Oleh karena itu, misel Si QD terkonjugasi antibodi CKAP4 mungkin merupakan agen kontras fluoresen baru, yang dapat digunakan sebagai agen kontras fluoresen untuk navigasi dalam operasi kanker paru-paru.
Dalam penelitian ini, DSPE-PEG-COOH digunakan untuk membuat misel Si QD dengan gugus karboksil pada permukaannya. Kami kemudian mengkonjugasikan antibodi CKAP4 dengan misel Si QD menggunakan EDC. Hasil penelitian menunjukkan bahwa misel Si QD-CKAP4 terdispersi dengan baik dalam larutan berair. Misel Si QD-CKAP4 menunjukkan fluoresensi merah yang kuat di bawah penyinaran sinar ultraviolet pada 365 nm. Karena konjugasi antibodi, misel Si QD-CKAP4 menunjukkan kemampuan penargetan yang baik ke sel dan jaringan kanker paru-paru baik secara in vitro maupun in vivo. Selain itu, misel Si QD-CKAP4 menunjukkan keamanan hayati yang tinggi baik secara in vitro maupun in vivo. Dalam penelitian ini, kami menyiapkan agen kontras fluoresen potensial untuk navigasi dalam operasi kanker paru-paru.
Metode
Reagen
Albumin serum sapi (BSA) dibeli dari Sigma (pengujian ≥ 98%; Missouri, USA); tetrahydrofuran (THF) dari Adamas-beta (kemurnian:99,9%; Basel, Swiss); DSPE-PEG-COOH dari Aladdin (Shanghai, Cina); Antibodi CKAP4 dari Abcam (0,55 mg/mL; Cambridge, UK); Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) dan phosphate buffer saline (PBS) dari Hyclone (Utah, USA); serum janin sapi (FBS) dan tyrisin dari Gibco (New York, AS); paraformaldehyde (4%), buffer permeabilisasi immunostaining dengan Triton X-100 dan buffer pemblokiran untuk immunostaining dari Beyotime (Shanghai, China); gliserin dari Solarbio (kemurnian ≥ 99%; Beijing, Cina); dan tripsin dari Kingmorn (0,25%; Shanghai, Cina).
Instrumentasi
Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) diambil menggunakan mikroskop elektron JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Jepang). Hidrodiameter ditentukan menggunakan JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK). Spektrum serapan UV-Vis diperoleh dengan menggunakan spektrofotometer Cary 50 (Varian, Palo Alto, CA, USA). Spektrum emisi fluoresensi diperoleh dengan menggunakan spektrofotometer F-182 4500 (Hitachi Ltd., Tokyo, Jepang). Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dilakukan menggunakan sistem PHI-5000C ESCA yang ditingkatkan RBD (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Hasil kuantum Photoluminescence (PL) (QYs) diperkirakan menggunakan spektrometer fluoresen (FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, Inggris). Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) dilakukan dengan menggunakan Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Difraksi sinar-X (XRD) diuji oleh SmartLab (Rigaku Corporation, Tokyo, Jepang).
Sel
Garis sel A549 dan 293 T dibeli dari Institut Biologi Sel Shanghai (Shanghai, Cina).
Persiapan Misel Si QD
Pertama, dodecly-Si QDs dibuat dengan reaksi hidrosilasi dan dilarutkan dalam THF untuk menyiapkan larutan dodecly-Si QDs (15 mg/mL) menurut metode yang dilaporkan sebelumnya [12]. Kemudian, 20 mg DSPE-PEG-COOH dilarutkan dan dicampur dalam 10 mL air deionisasi untuk membuat larutan DSPE-PEG-COOH (2 mg/mL, 10 mL). Selanjutnya, larutan Dodecly-Si QDs (15 mg/mL, 66 µL) perlahan-lahan ditambahkan ke dalam larutan DSPE-PEG-COOH 10 mL tetes demi tetes. Setelah agitasi ultrasonik selama 3 menit, diperoleh larutan yang jernih dan transparan. Solusinya kemudian ditempatkan di lemari asam dan diaduk selama 12 jam dalam gelap. Selanjutnya, larutan tersebut didialisis selama 24 jam dan kemudian dibekukan-kering selama 3 hari untuk mendapatkan misel Si QD.
Persiapan Si QD Micelles-CKAP4
Pada penelitian ini antibodi CKAP4 dikonjugasi dengan misel Si QD dengan mengaktifkan gugus karboksil oleh EDC [14]. Metodenya adalah sebagai berikut:4 mg misel Si QD didispersikan ke dalam 900 µL PBS untuk membuat larutan misel Si QD. EDC (10 mg) ditambahkan ke 100 µL PBS untuk menyiapkan larutan EDC. Kemudian, 100 L larutan EDC secara perlahan ditambahkan ke 900 L misel Si QD, dengan pengadukan ultrasonik selama 5 menit. Selanjutnya, 20 L antibodi CKAP4 ditambahkan secara perlahan, dan campuran larutan diaduk selama 2 jam pada suhu kamar di tempat gelap. Produk kemudian diultrafilter pada 4000 rpm selama 15 mnt. Setelah dicuci dengan PBS tiga kali, produk tersebut disebut sebagai Si QD misel-CKAP4.
Uji Sitotoksisitas
Dalam penelitian ini, trypan blue digunakan untuk menguji biosafety nanomaterial [15]. Sel A549 dan 293 T diinkubasi dalam pelat 24-sumur (1 × 10
6
/well) pada 37 °C selama 12 jam. Setelah media dibuang, serangkaian konsentrasi misel Si QD atau misel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si:0–152 µg/mL) ditambahkan ke dalam plat 24-sumur dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam. Setelah membuang media, sel dikumpulkan dan dicuci dua kali dengan PBS. Trypan blue dicampur dengan suspensi sel dengan perbandingan 1:1. Jumlah sel hidup dan mati dideteksi dan dicatat menggunakan Countstar. Viabilitas sel (%) = jumlah sel hidup/(jumlah sel hidup + jumlah sel mati) × 100. Tiga ulangan biologis digunakan. Perangkat lunak prisma (versi 7.01; Perangkat Lunak GraphPad, San Diego, CA, USA) digunakan untuk analisis statistik. Data dianalisis menggunakan ANOVA dua arah dengan post test Dunnett. Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05. *P < 0,05; **P < 0.01; dan ***P < 0.001.
Nanomaterials Menargetkan Sel Kanker Paru In Vitro
Kemampuan penargetan misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4 ke sel kanker paru secara in vitro terdeteksi sebagai berikut:Pertama, sel A549 diinkubasi dalam piringan confocal laser (3 × 10
5
sel/piring) pada 37 °C selama 12 jam. Setelah media dibuang, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Selanjutnya, 1 mL paraformaldehyde (4%) ditambahkan ke dalam sel dan diinkubasi pada suhu 25 °C selama 10 menit. Setelah membuang paraformaldehida, sel-sel dicuci dengan PBS tiga kali. Selanjutnya, 1 mL buffer permeabilisasi imunostaining dengan Triton X-100 ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 25 °C selama 10 menit. Setelah membuang buffer permeabilisasi imunostaining dengan Triton X-100, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Selanjutnya, 1 mL buffer pemblokiran untuk imunostaining ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 25 °C selama 10 menit. Setelah membuang buffer pemblokiran untuk imunostaining, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Kemudian, 200 L misel Si QD atau misel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si 150 g/mL) ditambahkan ke dalam sel dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam. Setelah membuang bahan nano, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Foto diambil menggunakan mikroskop laser confocal (Leica, Wetzlar, Jerman). Cahaya eksitasi disetel pada 405 nm, dan panjang gelombang emisi disetel pada 630 nm.
Kemampuan penargetan misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4 ke sel normal in vitro terdeteksi sebagai berikut:Pertama, 293 sel T dikumpulkan dalam tabung Eppendorf 1,5 mL dengan kepadatan 1 × 10
6
sel/tabung. Setelah disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang. Selanjutnya, 1 mL paraformaldehyde (4%) ditambahkan ke dalam sel dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang. Sel-sel kemudian dicuci tiga kali dengan PBS. Kemudian, 1 mL buffer permeabilisasi immunostaining dengan Triton X-100 ditambahkan ke dalam sel dan diinkubasi pada suhu 25 °C selama 10 menit. Sel-sel kemudian disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit. Setelah membuang supernatan, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Kemudian, 1 mL buffer pemblokiran untuk imunostaining ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 25 °C selama 10 menit. Sel-sel kemudian disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit. Setelah membuang supernatan, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Selanjutnya, 200 L misel Si QD atau misel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si 150 g/mL) ditambahkan ke dalam sel dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam. Setelah sentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang dan sedimen dicuci tiga kali dengan PBS. Sel-sel dipanen dan slide mikroskop disiapkan. Mikroskopi dilakukan dengan menggunakan mikroskop laser confocal. Cahaya eksitasi disetel pada 405 nm, dan panjang gelombang emisi disetel pada 630 nm.
Tiga percobaan independen dilakukan. Analisis kuantitatif intensitas fluoresensi rata-rata dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ (Bethesda, MD, USA). Perangkat lunak prisma (versi 7.01) digunakan untuk analisis statistik. Analisis data menggunakan one way ANOVA dengan post test Dunnett. Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05. ***P < 0.001.
Model Tikus Bertumor
Sepuluh tikus telanjang jantan (5–6 minggu) dibeli dari Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Semua tikus ditempatkan di bawah kondisi bebas patogen spesifik (SPF) di Pusat Hewan Eksperimental Universitas Tongji (Shanghai, Cina). Untuk menetapkan model tikus pembawa tumor, tikus disuntik secara subkutan dengan 1 × 10
6
sel A549. Tikus pembawa tumor digunakan dalam percobaan ketika diameter tumor mencapai 6 mm. Semua percobaan tikus dilakukan sesuai dengan pedoman institusional dan disetujui oleh Komite Penggunaan dan Perawatan Hewan Institusional Universitas Tongji.
Si QD Micelles-CKAP4 Menargetkan Jaringan Kanker Paru In Vitro
Tikus yang mengandung tumor dikorbankan dengan anestesi. Tumor dan jaringan paru-paru normal dikumpulkan untuk mempersiapkan bagian parafin. Setelah dehidrasi, pengambilan antigen, dan pemblokiran serum, misel Si QD atau misel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si 150 g/mL) ditambahkan ke jaringan dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam. Setelah membuang bahan nano, jaringan dicuci tiga kali dengan PBS. Jaringan diwarnai dengan 4′, 6-diamidino-2-phenylin-dole (DAPI) selama 10 menit. Setelah dicuci tiga kali dengan PBS, media antifade ditambahkan ke jaringan dan diinkubasi pada suhu 25 °C selama 5 menit. Setelah membuang media antifade, jaringan dicuci tiga kali dengan PBS. Foto diambil menggunakan mikroskop fluoresensi (Nikon, Tokyo, Jepang) dengan panjang gelombang eksitasi 405 nm dan panjang gelombang emisi 630 nm. Tiga percobaan independen dilakukan. Analisis kuantitatif intensitas fluoresen merah rata-rata dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ. Perangkat lunak prisma (versi 7.01) digunakan untuk analisis statistik. Analisis data menggunakan one way ANOVA dengan post test Dunnett. Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05. ***P < 0.001.
Pencitraan Fluoresensi Di Vivo
Dalam percobaan, sembilan tikus pembawa tumor dibagi menjadi tiga kelompok (kelompok injeksi misel Si QD-CKAP4, kelompok injeksi misel Si QD, dan kelompok injeksi salin). Tikus dalam kelompok injeksi misel Si QD-CKAP4 disuntik secara intravena dengan 200 L misel Si QD-CKAP4 (Si:4 mg/kg). Tikus dalam kelompok injeksi misel Si QD disuntik secara intravena dengan 200 L misel Si QD (Si:4 mg/kg). Tikus dalam kelompok injeksi saline disuntik secara intravena dengan 200 L saline. Gambar fluoresensi diperoleh pada titik waktu yang berbeda (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, dan 4 jam). Tikus-tikus dalam kelompok injeksi misel-CKAP4 Si QD dibius dan di-eutanasia pada 4 jam untuk mendeteksi sinyal fluoresensi di jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan tumor mereka. Dalam penelitian ini, pencitraan fluoresensi dilakukan menggunakan VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Gyeonggi-do, Korea) dengan set filter PE (λkegembiraan 450–500 nm, λemisi 600–650 nm). Perangkat lunak prisma (versi 7.01) digunakan untuk analisis statistik. Analisis data menggunakan one way ANOVA dengan post test Dunnett. Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05. *P < 0,05; **P < 0.01.
Pewarnaan Hematoksilin dan Eosin (H&E)
Dalam penelitian ini, 12 tikus pembawa tumor disuntik dengan saline (200 L), misel Si QD (Si:4 mg/kg, 200 L), atau misel Si QD-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) melalui vena ekor. Setelah 24 jam, tikus di-eutanasia. Pewarnaan H&E dilakukan pada jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal mereka. Perubahan patologis diamati dengan mikroskop optik [14, 16].
Hasil
Persiapan dan Karakterisasi Misel Si QD
Pertama, dodesil-Si QD dibuat dengan hidrosilasi menurut laporan yang diterbitkan sebelumnya (Skema 1, Langkah 1) [12]. Serupa dengan data yang dilaporkan, dodecyl-Si QDs yang disintesis oleh kelompok kami terdispersi dengan baik dalam metilbenzena [12]. TEM menunjukkan bahwa dodecyl-Si QDs berbentuk bola dengan ukuran yang relatif seragam. Ukuran QDs dodecyl-Si dalam gambar TEM diukur menggunakan perangkat lunak ImageJ. Data menunjukkan bahwa diameter QDs dodesil-Si berkisar antara 4,1 hingga 5,3 nm, dengan diameter rata-rata sekitar 4,7 nm (Gbr. 1a). Dalam gambar yang diperbesar dari QD dodecyl-Si, pinggiran kisi yang jelas dapat diamati (Gbr. 1a). Dalam penelitian ini, jarak bidang kisi diukur menggunakan perangkat lunak ImageJ. Data menunjukkan bahwa jarak rata-rata antara pinggiran kisi adalah sekitar 0,35 nm, yang hampir sama dengan QD dodesil-Si yang dilaporkan sebelumnya (0,34 nm). Oleh karena itu, QDs dodesil-Si yang disintesis dalam penelitian ini menunjukkan kristalinitas yang baik [12]. Hamburan cahaya dinamis (DLS) menunjukkan diameter hidrodinamik dodesil-Si QD berkisar antara 4,8 hingga 13,5 nm dengan rata-rata 6,5 nm (Gbr. 1b).
Skema persiapan misel Si QD-CKAP4 dan pencitraan biologis yang ditargetkan dalam jaringan kanker paru-paru
a Gambar TEM dari QDs dodecyl-Si; b distribusi hidrodiameter dodesil-Si QDs; c Gambar TEM dari misel Si QD; d distribusi hidrodiameter misel Si QD; e Gambar TEM misel Si QD-CKAP4; f distribusi hidrodiameter misel Si QD-CKAP4; g Spektroskopi fotoelektron sinar-X C1s (XPS) dari misel Si QD; h Spektrum C1s XPS dari misel Si QD-CKAP4
Untuk menyiapkan misel Si QD yang dapat terdispersi dalam air, dodesil-Si QD dimodifikasi dengan perakitan sendiri dari DSPE-PEG-COOH (Skema 1, Langkah 2) [12]. Di sini, DSPE-PEG-COOH digunakan sebagai pengganti F127 untuk menyiapkan misel Si QD dengan gugus karboksil di permukaan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa misel Si QD terdispersi dengan baik dalam air. Gambar TEM menunjukkan bahwa misel Si QD adalah partikel bulat dengan sisipan Si QD. Diameter misel Si QD berkisar antara 22,7 hingga 54,6 nm, dengan diameter rata-rata sekitar 34,3 nm (Gbr. 1c). DLS menunjukkan bahwa diameter hidrodinamik misel Si QD berkisar antara 43,8 hingga 615,9 nm, dengan rata-rata 58,7 nm (Gbr. 1d). Potensi zeta rata-rata dari misel Si QD adalah sekitar 20.7 mV. Dalam penelitian ini, FTIR dilakukan untuk mengetahui komposisi misel Si QD (File tambahan 1:Gambar S1A). Data menunjukkan puncak serapan getaran ulur N–H, C–H, O–H, dan C=O berada pada 3430, 2920, 2850, dan 1640 cm
−1
, masing-masing; puncak serapan getaran lentur C–H dan O–H berada pada 1460 dan 1400 cm
−1
, masing-masing; puncak serapan getaran ulur Si–C, C–O, dan P–O–C berada pada 1250, 1100, dan 951 cm
−1
, masing-masing; puncak serapan getaran lentur Si–H dan O=C–N berada pada 850 dan 526 cm
−1
, masing-masing. Data ini menunjukkan bahwa gugus karakteristik DSPE-PEG-COOH (seperti N–H, O–H, C=O, C–O, P–O–C, dan O=C–N) dan gugus karakteristik dari dodecyl-Si QDs (seperti Si–C dan Si–H) dapat ditemukan dalam spektrum FTIR misel Si QD, menunjukkan bahwa dodecyl-Si QDs berhasil dienkapsulasi dalam misel yang dirakit sendiri oleh DSPE-PEG-COOH. Selain itu, misel Si QD dikarakterisasi dengan XRD (File tambahan 1:Gambar S1B). Puncak difraksi misel Si QD tajam, menunjukkan bahwa kristalinitas misel Si QD baik. Dalam pola XRD, puncaknya pada 2θ dari 27,073, 28,451, 56,598, dan 73,145 sesuai dengan (100), (002), (112), dan (203) bidang kristal silikon (PDF # 80-0005), menunjukkan bahwa Si QD berhasil dienkapsulasi dalam Si QD misel. Puncak di 2θ dari 31.692, 45.431, 66.200, 75.260, dan 83.955 sesuai dengan (200), (220), (400), (420), dan (422) bidang kristal NaCl (PDF # 77-2064). Penjelasan rasional untuk keberadaan NaCl dalam misel Si QD mungkin sebagai berikut:Setelah persiapan misel Si QD, kami melarutkan misel Si QD dalam PBS, yang mengarah ke keberadaan NaCl dalam misel Si QD.
Spektrum serapan UV–tampak menunjukkan bahwa penyerapan misel Si QD berkisar antara 200 hingga 500 nm (Gbr. 2a). Dengan panjang gelombang eksitasi 330 nm, fluoresensi kuat pada 650 nm diamati dalam spektrum emisi fluoresensi misel Si QD (Gbr. 2b). Larutan misel berair Si QD (konsentrasi Si:80 µg/mL) transparan dan jernih dalam cahaya alami; namun, ia memancarkan fluoresensi merah yang kuat di bawah sinar UV 365 nm (Gbr. 2c). Dalam penelitian ini, PL QYs absolut diuji menggunakan spektrometer fluoresen (FLS1000). Panjang gelombang eksitasi adalah 365 nm. Data menunjukkan bahwa PL QY absolut dari misel Si QD adalah sekitar 14,49%.
a Spektrum serapan UV-terlihat dari misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4; b spektrum emisi fluoresen misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4; c gambar misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4 yang terpapar dalam cahaya alami (kiri) dan sinar UV 365 nm (kanan)
Persiapan dan Karakterisasi Si QD Micelles-CKAP4
Kami mengkonjugasikan antibodi CKAP4 dengan misel Si QD menggunakan EDC (Skema 1, Langkah 3) [14]. Gambar TEM menunjukkan bahwa misel Si QD-CKAP4 adalah partikel bulat dengan sisipan Si QD. Diameter misel Si QD-CKAP4 berkisar antara 24,4 hingga 67,7 nm, dengan diameter rata-rata sekitar 35,5 nm (Gbr. 1e). DLS menunjukkan bahwa diameter hidrodinamik misel Si QD-CKAP4 berkisar antara 58,7 hingga 824,9 nm dengan rata-rata 78,8 nm, yang sedikit lebih besar daripada misel Si QD (Gbr. 1f). Peningkatan ini mungkin karena konjugasi antibodi CKAP4. Spektra C1s XPS menunjukkan enam jenis atom karbon di wilayah C1s:C(O)O (288,81 eV), C=O (286,5 eV), C–O (285,76 eV), C–N (285,25 eV), C –C (284,88 eV), dan C–H (284,34 eV) (Gbr. 1g). Namun, puncak C(O)O hampir menghilang dalam spektrum XPS dari misel Si QD-CKAP4, menunjukkan bahwa konjugasi antara gugus karboksil dan amina primer berhasil; oleh karena itu, antibodi CKAP4 berhasil terkonjugasi dengan misel Si QD (Gbr. 1h). Potensi zeta rata-rata dari misel Si QD-CKAP4 kira-kira 10,7 mV, lebih tinggi daripada misel Si QD. Penjelasan untuk fenomena di atas mungkin sebagai berikut:Ada banyak gugus karboksil pada permukaan misel Si QD; oleh karena itu, misel Si QD menunjukkan listrik negatif yang kuat. Namun, pada misel Si QD-CKAP4, penggabungan antibodi CKAP4 menyebabkan penurunan gugus karboksil pada permukaan misel Si QD-CKAP4; oleh karena itu, potensi zeta rata-rata dari misel Si QD-CKAP4 meningkat.
Spektrum serapan UV–tampak menunjukkan bahwa penyerapan misel Si QD-CKAP4 berkisar antara 200 hingga 500 nm, mirip dengan hasil misel Si QD (Gbr. 2a). Dengan panjang gelombang eksitasi 330 nm, fluoresensi kuat pada 640 nm diamati dari misel Si QD-CKAP4 dalam spektrum emisi fluoresensi (Gbr. 2b). Hasil ini menunjukkan bahwa konjugasi antibodi tidak memberikan pengaruh yang signifikan pada sifat fluoresensi dari misel Si QD-CKAP4. Larutan berair Si QD misel-CKAP4 (konsentrasi Si:80 µg/mL) transparan dan jernih dalam cahaya alami. Di bawah sinar UV 365 nm, ia dapat memancarkan fluoresensi merah yang kuat, konsisten dengan hasil misel Si QD (Gbr. 2c). Tes PL QY menunjukkan bahwa PL QY absolut dari misel Si QD-CKAP4 adalah sekitar 16,96%.
Uji Sitotoksisitas Misel Si QD-CKAP4 In Vitro
Garis sel kanker paru-paru manusia A549 dan garis sel epitel ginjal manusia 293 T digunakan sebagai sel target untuk menyelidiki keamanan hayati misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4. Dalam penelitian ini, perbedaan konsentrasi misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si 0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76, dan 152 g/mL) pertama kali diinkubasi dengan sel A549 atau 293 T pada suhu 37 °C selama 2 jam. Viabilitas sel dideteksi menggunakan trypan blue (Gbr. 3) [15]. ID50 misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4 diperoleh dengan menggunakan software GraphPad. Data menunjukkan bahwa ID50 misel Si QD lebih besar dari 152 µg/mL dalam sel A549 dan 293 T. ID50 misel Si QD-CKAP4 adalah 25,94 µg/mL dalam sel A549 dan 72,69 µg/mL dalam 293 sel T. Hasil ini menunjukkan bahwa sitotoksisitas misel Si QD-CKAP4 secara signifikan lebih tinggi daripada misel Si QD dan sitotoksisitas misel Si QD-CKAP4 dalam sel A549 secara signifikan lebih tinggi daripada 293 sel T. Fenomena ini mungkin karena sitotoksisitas yang bergantung pada komplemen [17]. Selain itu, hasil ini juga menunjukkan bahwa misel Si QD-CKAP4 menunjukkan keamanan biologis yang lebih tinggi pada sel normal daripada sel kanker paru-paru, yang menjadi dasar penerapannya secara in vivo.
Viabilitas sel A549 a dan 293 T b diinkubasi dengan misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4 dengan konsentrasi berbeda (konsentrasi Si:0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76, dan 152 µg/mL) selama 2 jam (n = 3; rata-rata ± SD; ANOVA dua arah dengan uji pasca Dunnett; *P < 0,05; **P < 0.01; dan ***P < 0.001)
Si QD Micelles-CKAP4 Menargetkan Sel Kanker Paru In Vitro
Untuk menyelidiki lebih lanjut fungsi penargetan misel Si QD-CKAP4 dalam sel kanker paru-paru in vitro, sel A549 dan 293 T digunakan sebagai sel target. Misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4 pertama kali diinkubasi dengan sel A549 dan 293 T pada suhu 37 °C selama 2 jam. Efek penargetan terdeteksi menggunakan mikroskop laser confocal (Gbr. 4). Hasil penelitian menunjukkan bahwa fluoresensi merah pada misel Si QD-CKAP4 yang diinkubasi A549 secara nyata lebih tinggi dibandingkan dengan misel Si QD-CKAP4 dan kelompok koinkubasi 293 T, misel Si QD dan kelompok koinkubasi A549, dan misel Si QD. dan 293 kelompok inkubasi bersama. Hasil ini menunjukkan bahwa misel Si QD-CKAP4 dapat secara khusus menargetkan sel A549 in vitro.
Deteksi kemampuan misel Si QD-CKAP4 yang menargetkan sel A549 secara in vitro. a A549 dan 293 T diinkubasi dengan misel Si QD-CKAP4 dan misel Si QD (konsentrasi Si 150 µg/ml) pada suhu 37 selama 2 jam. Setelah membuang supernatan dan mencuci dua kali, sel-sel digambarkan dengan mikroskop pemindaian laser confocal (Bar, 25 µm). b Analisis kuantitatif intensitas fluoresen rata-rata diukur dengan ImageJ (n = 3; rata-rata ± SD; ANOVA satu arah dengan post test Dunnett; ***P < 0.001)
Si QD Micelles-CKAP4 Menargetkan Jaringan Kanker Paru In Vitro
Untuk mengeksplorasi kemungkinan misel Si QD-CKAP4 yang menargetkan jaringan kanker paru-paru, kami merancang eksperimen in vitro untuk memverifikasi properti penargetan misel Si QD-CKAP4 hingga jaringan A549. Dalam penelitian ini, sel A549 diinokulasikan secara subkutan ke mencit. Setelah pembentukan tumor, jaringan tumor A549 dan jaringan paru normal dikumpulkan dan diinkubasi dengan misel Si QD dan misel Si QD-CKAP4 pada suhu 37 °C selama 2 jam. Efek penargetan dideteksi menggunakan mikroskop laser confocal (Gbr. 5). Hasil penelitian menunjukkan bahwa jaringan A549 yang diinkubasi misel Si QD-CKAP4 dapat memancarkan fluoresensi merah kuat pada panjang gelombang eksitasi 405 nm. Namun, hanya fluoresensi merah lemah yang diamati pada jaringan A549 yang diinkubasi misel Si QD, jaringan paru normal yang diinkubasi misel Si QD, dan jaringan paru normal yang diinkubasi misel Si QD. Fluoresensi merah pada jaringan A549 yang diinkubasi misel Si QD secara signifikan lebih tinggi daripada jaringan A549 yang diinkubasi misel Si QD, misel Si QD-CKAP4 yang diinkubasi jaringan paru normal, dan jaringan paru normal yang diinkubasi misel Si QD. Data ini menunjukkan bahwa misel Si QD-CKAP4 dapat secara efektif menargetkan jaringan kanker paru-paru secara in vitro, yang dianggap sebagai agen kontras fluoresen yang potensial untuk kanker paru-paru.
Deteksi kemampuan misel Si QD-CKAP4 yang menargetkan jaringan A549 secara in vitro. a Jaringan A549 dan jaringan paru normal dikultur dengan misel Si QD-CKAP4 dan Si QD (konsentrasi Si:150 g/ml) pada suhu 37 selama 2 jam. Setelah dicuci dua kali, jaringan diwarnai dengan DAPI untuk memvisualisasikan nukleus. Jaringan digambarkan dengan mikroskop pemindaian laser confocal (Bar, 200 m). b Analisis kuantitatif intensitas fluoresen merah rata-rata diukur dengan ImageJ (n = 3; rata-rata ± SD; ANOVA satu arah dengan post test Dunnett; ***P < 0.001)
Pencitraan Fluoresensi Di Vivo
Nine tumor-bearing mice were divided into three groups (Si QD micelles-CKAP4 injection group, Si QD micelles injection group, and saline injection group). Mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were intravenously injected with 200 µL Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg). Mice in the Si QD micelle injection group were intravenously injected with 200 µL of Si QD micelles (Si:4 mg/kg). Mice in the saline injection group were intravenously injected with 200 µL saline. Fluorescence images were acquired at different time points (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, and 4 h). The significant fluorescence signals were not observed in lung cancer tissues among all the mice in the three groups (data not shown). This might be because of the weak fluorescence penetration of the Si QD micelles-CKAP4 and Si QD micelles.
The mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were anesthetized and euthanized at 4 h to detect the fluorescence signal in their heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor. Data showed that a significant fluorescence signal could be observed in the liver, kidney, and tumor tissues. However, there was no significant fluorescence signal in the heart, spleen, or healthy lung tissues (Fig. 6). The significant fluorescence signal in the liver and kidney indicated that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. In addition, the fluorescence signal in A549 tumor tissues was significantly higher than that in healthy lung tissues. This phenomenon contributed to the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer tissues. These results indicate that Si QD micelles-CKAP4 specifically targets lung cancer tissue, which is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.
a Bright photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. b Fluorescence photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. c Relative fluorescence intensities of heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor tissue (n = 3; mean ± SD; one-way ANOVA with Dunnett’s post test; *P < 0,05; **P < 0.01)
Biosafety Evaluation of Si QD Micelles-CKAP4 In Vivo
Finally, we investigated the acute toxicity of the Si QD micelles-CKAP4 in vivo. In this study, tumor-bearing mice (n = 12) were intravenously injected with saline (200 µL), Si QD micelles (Si:4 mg/kg, 200 µL), or Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) and then euthanized 24 h later. H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys are shown in Fig. 7. Compared with saline-injected mice, there were no evident pathological changes in the major organs of Si QD micelles-injected mice and Si QD micelles-CKAP4-injected mice. The above data indicated that Si QD micelles (Si:4 mg/kg) and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) showed no significant toxicity in vivo.
H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys in tumor-bearing mice injected with saline, Si QD micelles (Si:4 mg/kg), and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) for 24 h (magnification:200×)
Discussion
At present, various fluorescent nanomaterials have been designed and synthesized as optical contrast agents for surgical navigation [3, 4]. In 2020, On et al. prepared fluorophore [indocyanine green (ICG) or cyanine 5.5 (Cy5.5)]-conjugated glycol chitosan nanoparticles (CNPs) as a fluorescent contrast agent in lung cancer surgery navigation [18]. However, there are no reports on the preparation of fluorescent contrast agents for lung cancer surgery navigation using Si QDs.
This study successfully synthesized Si QD micelles-CKAP4, which could target the imaging of lung cancer tissues. Si QD micelles-CKAP4 is expected to be used as an optical contrast agent for navigation in lung cancer surgery in the future. The advantages of Si QD micelles-CKAP4 are as follows:(1) We synthesized a fluorescent contrast agent for lung cancer surgery navigation using Si QDs for the first time, which expands the toolbox of the lung cancer surgery navigation tool library. (2) This study optimized water-dispersible Si QD micelles reported by Pi et al. to add targeting ability to Si QD micelles [12]. Thus, it provides a new possibility for applying Si QDs in the biomedical field. (3) The principle of Si QD micelles-CKAP4 targeting lung cancer is based on the high expression of CKAP4 protein in lung cancer tissue. Owing to the conjugation of CKAP4 antibody, Si QD micelles-CKAP4 could actively target lung cancer tissue. Compared with the nanomaterials that passively target tumors via the EPR effect, Si QD micelles-CKAP4 showed stronger specificity to lung cancer tissue. (4) Si QD micelles-CKAP4 showed selective toxicity to tumor cells in a specific range of concentrations. Therefore, Si QD micelles-CKAP4 showed high biological safety in the range of rational drug concentrations, which exhibited its potential clinical application value.
In this study, PL QY tests showed that the absolute PL QY of Si QD micelles was approximately 14.49% and the absolute PL QY of the Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%. A study by Pi et al. showed that the PL QY of dodecyl-Si QDs was approximately 26%, which was very high for Si QDs that emit red light with a PL peak at less than 700 nm [12, 19, 20]. However, the PL QY of the Si QD micelles in this study was approximately 14.49%, which was lower than that of dodecyl-Si QDs. This might be because of the surface defects introduced during the emulsion process, which was nearly consistent with the decrease in PL QY in Si-QD micelles (dodecyl-passivated Si QDs were encapsulated in the micelles self-assembled from F127 in the emulsion) in the study reported by Pi et al. [12, 21]. In this study, the PL QY of Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%, which was slightly higher than that of Si QD micelles (14.49%). This could be because in the Si QD micelles-CKAP4, the coupling of the CKAP4 antibody repaired some surface defects of the Si QD micelles, leading to a slight enhancement of the PL QY.
As we all know, there is a challenge in Si QDs biological imaging applications:Although Si exhibits little cytotoxicity, Si particles may exhibit cytotoxicity as the size decrease to a certain extent. In this study, cytotoxicity tests showed that Si QD micelles-CKAP4 exhibited selective cytotoxicity to lung cancer cells at 9.5–19 µg/mL. Therefore, as a result of CKAP4 antibody conjugation, the cytotoxicity of Si QD micelles-CKAP4 to normal cells was significantly less than that of lung cancer cells, which provides a powerful condition for the biological application of Si QD micelles-CKAP4.
In this study, human lung cancer cell line A549 and human renal epithelial cell line 293 T were used as target cells to investigate the targeting ability of Si QD micelles and Si QD micelles-CKAP4. A549 and 293 T cells were adherent and semi-adherent, respectively. During the experiment, the number of 293 T cells decreased because of repeated centrifugation and washing. Therefore, as shown in Fig. 4, the number of 293 T cells was lower than that of A549 cells.
In addition, it should be noted that A549 cells belong to the p53 wild-type lung cancer cell line. Therefore, only A549 cells cannot fully reflect the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer. Further studies will be conducted to test the targeting ability and imaging effect of Si QD micelles-CKAP4 on p53-negative cell lines (such as H1299) to provide a solid experimental basis for the clinical application of Si QD micelles-CKAP4 [22].
Kesimpulan
This study improved and modified the Si QD micelles reported by Pi et al. to prepare water-dispersible Si QD micelles-CKAP4. Si QD micelles-CKAP4 were spherical particles with a mean hydrodiameter of approximately 78.8 nm. UV–visible absorption of the Si QD micelles-CKAP4 ranged from 200 to 500 nm. With an excitation wavelength of 330 nm, strong fluorescence at 640 nm was observed in the fluorescence emission spectra. Si QD micelles-CKAP4 exhibited good targeting ability to lung cancer cells and lung cancer tissues both in vitro and in vivo. In addition, the in vivo fluorescence-imaging assay further showed that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. Cytotoxicity and H&E staining assays showed that the Si QD micelles-CKAP4 exhibited high biosafety both in vitro and in vivo. Si QD micelles-CKAP4 is a specifically targeted imaging agent for lung cancer and is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.
Ketersediaan Data dan Materi
The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.
