Miksel Titik Kuantum Silikon Terkait CKAP4: Agen Citra Terpadu Baru untuk Kanker Paru-paru

Abstrak

Saat ini, berbagai bahan nanomaterial fluorescent telah dirancang dan disintesis sebagai agen kontras optik untuk navigasi bedah. Namun, belum ada laporan tentang penyusunan agen kontras fluorescent untuk navigasi bedah kanker paru-paru menggunakan titik kuantum silikon (Si QDs). Penelitian ini meningkat dan memodifikasi miksel Si QD yang dapat dispersi dalam air yang dilaporkan oleh Pi et al. untuk menyusun miksel Si QD-CKAP4. Data menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 adalah partikel bola dengan diameter hidrodinamis rata-rata sekitar 78,8 nm. Absorpsi UV–visible miksel Si QD-CKAP4 bervariasi dari 200 hingga 500 nm. Dengan panjang gelombang eksitasi 330 nm, fluoresensi kuat pada 640 nm diamati dalam spektrum emisi fluoresensi. Uji mikroskopi konfokal laser dan mikroskopi fluoresensi menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan kemampuan targeting yang baik terhadap sel kanker paru-paru dan jaringan kanker paru-paru in vitro. Uji citra fluoresensi in vivo menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 dimetabolisme oleh hati dan diekskresi oleh ginjal. Selain itu, miksel Si QD-CKAP4 secara spesifik menargetkan jaringan kanker paru-paru in vivo dibandingkan dengan jaringan paru-paru sehat. Uji sitotoksitas dan warna hematoxylin dan eosin menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan biosafety tinggi in vitro dan in vivo. Miksel Si QD-CKAP4 adalah agen citra yang secara spesifik menargetkan kanker paru-paru dan diharapkan menjadi agen kontras fluorescent untuk navigasi bedah kanker paru-paru di masa depan.

Pendahuluan

Kanker adalah salah satu penyakit besar yang mengancam kesehatan manusia di seluruh dunia [1]. Di antara mereka, incidensi dan mortalitas kanker paru-paru menempati peringkat tertinggi di antara semua tumor ganas dan menunjukkan tren meningkat setiap tahun [2]. Resesi bedah adalah perawatan utama untuk tumor padat. Namun, metode untuk membedakan jaringan ganas dari jaringan sehat terutama terbatas pada indikasi taktil dan visual serta pengalaman dokter bedah [3].

Dalam beberapa tahun terakhir, bedah bimbingan fluoresensi telah menjadi populer di bidang penelitian dalam bimbingan intraoperatif real-time untuk resesi tumor [4]. Dengan bantuan agen kontras fluoresensi dan sistem citra fluoresensi, dokter bedah dapat menggunakan bimbingan citra real-time untuk meresesi tumor primer dan mengidentifikasi tumor sisa di ruang operasi. Dibandingkan dengan metode citra biomedis tradisional, sistem citra fluoresensi menawarkan beberapa keuntungan, seperti tidak ada radiasi ionisir dan resolusi spasial tinggi [3, 5, 6].

Saat ini, peneliti telah melaporkan berbagai bahan nanomaterial fluorescent untuk citra biologis [7, 8]. Di antara mereka, titik kuantum silikon (Si QDs) telah menjadi populer di bidang citra biologis [9,10,11]. Namun, belum ada laporan tentang penyusunan agen kontras fluorescent untuk navigasi bedah kanker paru-paru menggunakan Si QDs.

Pada 2014, Pi et al. melaporkan metode sintesis untuk miksel Si QD baru yang dapat dispersi dalam air [12]. Data studi menunjukkan bahwa miksel Si QD menunjukkan keuntungan termasuk ukuran yang dapat dikontrol, efisiensi kuantum fluoresensi yang tinggi, dan stabilitas cahaya yang unggul [12]. Penelitian ini bertujuan untuk meningkat dan memodifikasi miksel Si QD yang larut dalam air yang dilaporkan oleh Pi et al. untuk menyusun agen kontras fluorescent baru, yang diharapkan dapat digunakan sebagai agen kontras fluorescent untuk navigasi dalam bedah kanker paru-paru di masa depan.

Pada 2018, Yanagita et al. melaporkan bahwa CKAP4 diekspresi tinggi dalam serum dan jaringan kanker pasien kanker paru-paru dan dapat digunakan sebagai biomarker baru untuk diagnosis dini kanker paru-paru [13]. Oleh karena itu, miksel Si QD yang dikonjugasi antibodi CKAP4 mungkin menjadi agen kontras fluorescent baru, yang mungkin dapat digunakan sebagai agen kontras fluorescent untuk navigasi dalam bedah kanker paru-paru.

Dalam penelitian ini, DSPE-PEG-COOH digunakan untuk menyusun miksel Si QD dengan grup karboksil pada permukaannya. Kami kemudian mengonjugasi antibodi CKAP4 dengan miksel Si QD menggunakan EDC. Hasil menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 terdistribusi dengan baik dalam larutan air. Miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan fluoresensi merah kuat di bawah iradiasi cahaya ultraviolet pada 365 nm. Akibat konjugasi antibodi, miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan kemampuan targeting yang baik terhadap sel dan jaringan kanker paru-paru baik in vitro maupun in vivo. Selain itu, miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan biosafety tinggi baik in vitro maupun in vivo. Dalam penelitian ini, kami menyusun agen kontras fluorescent potensial untuk navigasi dalam bedah kanker paru-paru.

Metode

Reagen

Albumin serum sapi (BSA) dibeli dari Sigma (assay ≥ 98%; Missouri, USA); tetrahidrofuran (THF) dari Adamas-beta (kemurnian: 99,9%; Basel, Swiss); DSPE-PEG-COOH dari Aladdin (Shanghai, China); antibodi CKAP4 dari Abcam (0,55 mg/mL; Cambridge, UK); medium dulbecco yang dimodifikasi (DMEM) dan larutan garam fosfat (PBS) dari Hyclone (Utah, USA); serum fetal sapi (FBS) dan trypsin dari Gibco (New York, USA); paraformaldehida (4%), larutan permeabilisasi imunostaining dengan Triton X-100 dan larutan blokir untuk imunostaining dari Beyotime (Shanghai, China); gliserin dari Solarbio (kemurnian ≥ 99%; Beijing, China); dan trypsin dari Kingmorn (0,25%; Shanghai, China).

Instrumentasi

Citra mikroskop elektron transmisi (TEM) diambil menggunakan mikroskop elektron JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Jepang). Diameter hidrodinamis ditentukan menggunakan JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, Inggris). Spektrum absorpsi UV–Vis diperoleh menggunakan spektrofotometer Cary 50 (Varian, Palo Alto, CA, USA). Spektrum emisi fluoresensi diperoleh menggunakan spektrofotometer F-182 4500 (Hitachi Ltd., Tokyo, Jepang). Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dilakukan menggunakan sistem ESCA PHI-5000C yang di-upgrade RBD (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Rendemen kuantum fotoluminescensi (PL QY) diperkirakan menggunakan spektrometer fluoresensi (FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, Inggris). Spektroskopi inframerah transform Fourier (FTIR) dilakukan menggunakan Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Difraksi sinar-X (XRD) diuji oleh SmartLab (Rigaku Corporation, Tokyo, Jepang).

Sel

Baris sel A549 dan 293 T dibeli dari Institut Sel Biologi Shanghai (Shanghai, China).

Penyusunan Miksel Si QD

Pertama, dodesil-Si QD disiapkan oleh reaksi hidrosilasilasi dan dilarutkan dalam THF untuk menyusun larutan dodesil-Si QD (15 mg/mL) sesuai dengan metode yang sebelumnya dilaporkan [12]. Kemudian, 20 mg DSPE-PEG-COOH dilarutkan dan dicampur dalam 10 mL air deionisasi untuk menyusun larutan DSPE-PEG-COOH (2 mg/mL, 10 m5). Selanjutnya, larutan dodesil-Si QD (15 mg/mL, 66 µL) secara lambat ditambahkan secara titik ke dalam 10 mL larutan DSPE-PEG-COOH. Setelah penggetaran ultrasonik selama 3 menit, larutan jernih dan transparan diperoleh. Larutan kemudian ditempatkan dalam lemari asap dan diaduk selama 12 h dalam kegelapan. Selanjutnya, larutan dialisis selama 24 h dan kemudian di-freeze-dry selama 3 hari untuk mendapatkan miksel Si QD.

Penyusunan Miksel Si QD-CKAP4

Dalam penelitian ini, antibodi CKAP4 dikonjugasi dengan miksel Si QD dengan mengaktifkan grup karboksil oleh EDC [14]. Metode adalah sebagai berikut: 4 mg miksel Si QD dispersi dalam 900 µL PBS untuk menyusun larutan miksel Si QD. EDC (10 mg) ditambahkan ke 100 µL PBS untuk menyusun larutan EDC. Kemudian, 100 µL larutan EDC secara lambat ditambahkan ke 900 µL miksel Si QD, dengan penggetaran ultrasonik selama 5 menit. Selain itu, 20 µL antibodi CKAP4 secara lambat ditambahkan, dan larutan campuran diaduk selama 2 h pada suhu kamar dalam kegelapan. Produk kemudian difilter ultrafil pada 4000 rpm selama 15 menit. Setelah dicuci dengan PBS tiga kali, produk disebut sebagai miksel Si QD-CKAP4.

Uji Sitotoksitas

Dalam penelitian ini, trypan blue digunakan untuk menguji biosafety bahan nanomaterial [15]. Sel baris kanker paru-paru manusia A549 dan sel epitel ginjal manusia 293 T diinkubasi dalam plate 24-lubang (1 × 10⁶/lubang) pada 37 °C selama 12 h. Setelah membuang medium, serangkaian konsentrasi miksel Si QD atau miksel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si: 0–152 µg/mL) ditambahkan ke plate 24-lubang dan diinkubasi pada 37 °C selama 2 h. Setelah membuang medium, sel dikumpulkan dan dicuci dua kali dengan PBS. Trypan blue dicampur dengan suspensi sel dengan rasio 1:1. Jumlah sel hidup dan mati terdeteksi dan dicatat menggunakan Countstar. Keandalan sel (%) = jumlah sel hidup/(jumlah sel hidup + jumlah sel mati) × 100. Tiga replikasi biologis digunakan. Perangkat lunak Prism (versi 7.01; GraphPad Software, San Diego, CA, USA) digunakan untuk analisis statistik. Data dianalisis menggunakan dua-way ANOVA dengan uji lanjut Dunnett. Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05. *P < 0,05; **P < 0,01; dan ***P < 0,001.

Targeting Miksel Si QD ke Sel Kanker Paru-paru In Vitro

Kemampuan targeting miksel Si QD dan miksel Si QD-CKAP4 terhadap sel kanker paru-paru in vitro terdeteksi sebagai berikut: Pertama, sel A549 diinkubasi dalam piring konfokal laser (3 × 10⁵ sel/dish) pada 37 °C selama 12 h. Setelah membuang medium, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Selanjutnya, 1 mL paraformaldehida (4%) ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 25 °C selama 10 menit. Setelah membuang paraformaldehida, sel dicuci dengan PBS tiga kali. Kemudian, 1 mL larutan permeabilisasi imunostaining dengan Triton X-100 ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 25 °C selama 10 menit. Setelah membuang larutan permeabilisasi imunostaining dengan Triton X-100, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Selanjutnya, 1 mL larutan blokir untuk imunostaining ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 25 °C selama 10 menit. Setelah membuang larutan blokir untuk imunostaining, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Kemudian, 200 µL miksel Si QD atau miksel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si 150 μg/mL) ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 37 °C selama 2 h. Setelah membuang bahan nanomaterial, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Foto diambil menggunakan mikroskop konfokal laser (Leica, Wetzlar, Jerman). Cahaya eksitasi diatur pada 405 nm, dan panjang gelombang emisi diatur pada 630 nm.

Kemampuan targeting miksel Si QD dan miksel Si QD-CKAP4 terhadap sel normal in vitro terdeteksi sebagai berikut: Pertama, sel 293 T dikumpulkan dalam tabung Eppendorf 1,5 mL dengan kepadatan 1 × 10⁶ sel/tube. Setelah sentrifuga pada 1000 rpm selama 5 menit, supernatant dibuang. Kemudian, 1 mL paraformaldehida (4%) ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah sentrifuga pada 1000 rpm selama 5 menit, supernatant dibuang. Sel kemudian dicuci tiga kali dengan PBS. Kemudian, 1 mL larutan permeabilisasi imunostaining dengan Triton X-100 ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 25 °C selama 10 menit. Sel kemudian disentrifuga pada 1000 rpm selama 5 menit. Setelah membuang supernatant, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Kemudian, 1 mL larutan blokir untuk imunostaining ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 25 °C selama 10 menit. Sel kemudian disentrifuga pada 1000 rpm selama 5 menit. Setelah membuang supernatant, sel dicuci tiga kali dengan PBS. Selanjutnya, 200 µL miksel Si QD atau miksel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si 150 μg/mL) ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada 37 °C selama 2 h. Setelah sentrifuga pada 1000 rpm selama 5 menit, supernatant dibuang dan endapan dicuci tiga kali dengan PBS. Sel dipanen dan slide mikroskop disiapkan. Mikroskopi dilakukan menggunakan mikroskop konfokal laser. Cahaya eksitasi diatur pada 405 nm, dan panjang gelombang emisi diatur pada 630 nm.

Tiga eksperimen independen dilakukan. Analisis kuantitatif intensitas fluoresensi rata-rata dilakukan menggunakan perangkat lunak ImageJ (Bethesda, MD, USA). Perangkat lunak Prism (versi 7.01) digunakan untuk analisis statistik. Data dianalisis menggunakan one-way ANOVA dengan uji lanjut Dunnett. Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05. ***P < 0,001.

Model Tikus Bawa Tumor

Sepuluh tikus telanjang jantan (5–6 minggu usia) dibeli dari Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Semua tikus dipegang dalam kondisi bebas patogen spesifik (SPF) di Pusat Hewan Eksperimental Universitas Tongji (Shanghai, China). Untuk membentuk model tikus bawa tumor, tikus diinjeksi subkutan dengan 1 × 10⁶ sel A549. Tikus bawa tumor digunakan dalam eksperimen ketika diameter tumor mencapai 6 mm. Semua eksperimen tikus dilakukan sesuai dengan pedoman institusi dan disetujui oleh Komite Penggunaan dan Perawatan Hewan Institusi Universitas Tongji.

Targeting Miksel Si QD-CKAP4 ke Jaringan Kanker Paru-paru In Vitro

Untuk mengeksplorasi kemungkinan miksel Si QD-CKAP4 targeting jaringan kanker paru-paru, kami merancang eksperimen in vitro untuk memverifikasi properti targeting miksel Si QD-CKAP4 terhadap jaringan A549. Dalam penelitian ini, sel A549 diinokulasi subkutan ke dalam tikus. Setelah terbentuk tumor, jaringan tumor A549 dan jaringan paru-paru normal dikumpulkan dan diinkubasi dengan miksel Si QD dan miksel Si QD-CKAP4 pada 37 °C selama 2 h. Efek targeting terdeteksi menggunakan mikroskop konfokal laser (Gambar 5). Hasil menunjukkan bahwa jaringan A549 yang diinkubasi miksel Si QD-CKAP4 dapat memancarkan fluoresensi merah kuat pada panjang gelombang eksitasi 405 nm. Namun, hanya fluoresensi merah lemah yang diamati pada jaringan A549 yang diinkubasi miksel Si QD, jaringan paru-paru normal yang diinkubasi miksel Si QD-CKAP4, dan jaringan paru-paru normal yang diinkubasi miksel Si QD. Fluoresensi merah pada jaringan A549 yang diinkubasi miksel Si QD-CKAP4 secara signifikan lebih tinggi daripada jaringan A549 yang diinkubasi miksel Si QD, jaringan paru-paru normal yang diinkubasi miksel Si QD-CKAP4, dan jaringan paru-paru normal yang diinkubasi miksel Si QD. Data ini menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 dapat secara efektif targeting jaringan kanker paru-paru in vitro, yang diperkirakan menjadi agen kontras fluorescent potensial untuk kanker paru-paru.

Miksel Titik Kuantum Silikon Terkait CKAP4: Agen Citra Terpadu Baru untuk Kanker Paru-paru

Citra Fluoresensi In Vivo

Dalam eksperimen, sembilan tikus bawa tumor dibagi menjadi tiga grup (grup injeksi miksel Si QD-CKAP4, grup injeksi miksel Si QD, dan grup injeksi larutan garam). Tikus dalam grup injeksi miksel Si QD-CKAP4 diinjeksi secara intravena dengan 200 µL miksel Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg). Tikus dalam grup injeksi miksel Si QD diinjeksi secara intravena dengan 200 µL miksel Si QD (Si: 4 mg/kg). Tikus dalam grup injeksi larutan garam diinjeksi secara intravena dengan 200 µL larutan garam. Citra fluoresensi diperoleh pada berbagai titik waktu (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, dan 4 h). Tikus dalam grup injeksi miksel Si QD-CKAP4 dianestesi dan di-eutanasia pada 4 h untuk mendeteksi sinyal fluoresensi pada jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan tumor mereka. Dalam penelitian ini, citra fluoresensi dilakukan menggunakan VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Gyeonggi-do, Korea) dengan set filter PE (λ_eksitasi 450–500 nm, λ_emisi 600–650 nm). Perangkat lunak Prism (versi 7,01) digunakan untuk analisis statistik. Data dianalisis menggunakan one-way ANOVA dengan uji lanjut Dunnett. Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05. *P < 0,05; **P < 0,01.

Warni Hematoxylin dan Eosin (H&E)

Dalam penelitian ini, 12 tikus bawa tumor diinjeksi dengan larutan garam (200 µL), miksel Si QD (Si: 4 mg/kg, 200 µL), atau miksel Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg, 200 µL) melalui vena ekor. Setelah 24 h, tikus di-eutanasia. Warni H&E dilakukan pada jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal mereka. Perubahan patologis diamati oleh mikroskop optik [14, 16].

Hasil

Penyusunan dan Karakterisasi Miksel Si QD

Pertama, dodesil-Si QD disiapkan oleh hidrosilasilasi sesuai dengan laporan yang sebelumnya dipublikasikan (Scheme 1, Langkah 1) [12]. Mirip dengan data yang dilaporkan, dodesil-Si QD yang disintesis oleh kelompok kami terdistribusi dengan baik dalam metilbenzen [12]. TEM menunjukkan bahwa dodesil-Si QD berbentuk bola dengan ukuran relatif seragam. Ukuran dodesil-Si QD dalam citra TEM diukur menggunakan perangkat lunak ImageJ. Data menunjukkan bahwa diameter dodesil-Si QD bervariasi dari 4,1 hingga 5,3 nm, dengan diameter rata-rata sekitar 4,7 nm (Gambar 1a). Dalam citra diperbesar dodesil-Si QD, kerangka jaringan yang jelas dapat diamati (Gambar 1a). Dalam penelitian ini, jarak antara bidang jaringan diukur menggunakan perangkat lunak ImageJ. Data menunjukkan bahwa jarak rata-rata antara kerangka jaringan adalah sekitar 0,35 nm, yang hampir sama dengan dodesil-Si QD yang sebelumnya dilaporkan (0,34 nm). Oleh karena itu, dodesil-Si QD yang disintesis dalam penelitian ini menunjukkan kristalinitas yang baik [12]. Pencaharan cahaya dinamis (DLS) menunjukkan diameter hidrodinamis dodesil-Si QD bervariasi dari 4,8 hingga 13,5 nm dengan rata-rata 6,5 nm (Gambar 1b).

Untuk menyusun miksel Si QD yang dapat dispersi dalam air, dodesil-Si QD dimodifikasi oleh self-assembly dari DSPE-PEG-COOH (Scheme 1, Langkah 2) [12]. Di sini, DSPE-PEG-COOH digunakan sebagai pengganti F127 untuk menyusun miksel Si QD dengan grup karboksil pada permukaan. Hasil menunjukkan bahwa miksel Si QD terdistribusi dengan baik dalam air. Citra TEM menunjukkan bahwa miksel Si QD adalah partikel bola dengan Si QD yang disisipkan. Diameter miksel Si QD bervariasi dari 22,7 hingga 54,6 nm, dengan diameter rata-rata sekitar 34,3 nm (Gambar 1c). DLS menunjukkan bahwa diameter hidrodinamis miksel Si QD bervariasi dari 43,8 hingga 615,9 nm, dengan rata-rata 58,7 nm (Gambar 1d). Zeta potensial rata-rata miksel Si QD sekitar − 20,7 mV. Dalam penelitian ini, FTIR dilakukan untuk menyelidiki komposisi miksel Si QD (Berkas Tambahan 1: Gambar S1A). Data menunjukkan bahwa puncak absorpsi getaran peregangan N–H, C–H, O–H, dan C=O berada pada 3430, 2920, 2850, dan 1640 cm⁻¹, masing-masing; puncak absorpsi getaran membungkus C–H dan O–H berada pada 1460 dan 1400 cm⁻¹, masing-masing; puncak absorpsi getaran peregangan Si–C, C–O, dan P–O–C berada pada 1250, 1100, dan 951 cm⁻¹, masing-masing; puncak absorpsi getaran membungkus Si–H dan O=C–N berada pada 850 dan 526 cm⁻¹, masing-masing. Data ini menunjukkan bahwa grup karakteristik DSPE-PEG-COOH (seperti N–H, O–H, C=O, C–O, P–O–C, dan O=C–N) dan grup karakteristik dodesil-Si QD (seperti Si–C dan Si–H) dapat ditemukan dalam spektrum FTIR miksel Si QD, menunjukkan bahwa dodesil-Si QD berhasil dikapsulasi dalam miksel self-assembly yang dibentuk oleh DSPE-PEG-COOH. Selain itu, miksel Si QD dikarakterisir oleh XRD (Berkas Tambahan 1: Gambar S1B). Puncak difraksi miksel Si QD tajam, menunjukkan bahwa kristalinitas miksel Si QD baik. Dalam pola XRD, puncak pada 2θ 27,073, 28,451, 56,598, dan 73,145 sesuai dengan bidang kristal (100), (002), (112), dan (203) silikon (PDF # 80-0005), menunjukkan bahwa Si QD berhasil dikapsulasi dalam miksel Si QD. Puncak pada 2θ 31,692, 45,431, 66,200, 75,260, dan 83,955 sesuai dengan bidang kristal (200), (220), (400), (420), dan (422) NaCl (PDF # 77-2064). Penjelasan rasional untuk keberadaan NaCl dalam miksel Si QD mungkin sebagai berikut: Setelah penyusunan miksel Si QD, kami melarutkan miksel Si QD dalam PBS, yang mengarah pada keberadaan NaCl dalam miksel Si QD.

Spektrum absorpsi UV–visible menunjukkan bahwa absorpsi miksel Si QD bervariasi dari 200 hingga 500 nm (Gambar 2a). Dengan panjang gelombang eksitasi 330 nm, fluoresensi kuat pada 650 nm diamati dalam spektrum emisi fluoresensi miksel Si QD (Gambar 2b). Larutan air miksel Si QD (konsentrasi Si: 80 µg/mL) transparan dan jernih dalam cahaya alami; namun, ia memancarkan fluoresensi merah kuat di bawah cahaya UV 365 nm (Gambar 2c). Dalam penelitian ini, PL QY absolut diuji menggunakan spektrometer fluoresensi (FLS1000). Panjang gelombang eksitasi adalah 365 nm. Data menunjukkan bahwa PL QY absolut miksel Si QD sekitar 14,49%.

Penyusunan dan Karakterisasi Miksel Si QD-CKAP4

Kami mengonjugasi antibodi CKAP4 dengan miksel Si QD menggunakan EDC (Scheme 1, Langkah 3) [14]. Citra TEM menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 adalah partikel bola dengan Si QD yang disisipkan. Diameter miksel Si QD-CKAP4 bervariasi dari 24,4 hingga 67,7 nm, dengan diameter rata-rata sekitar 35,5 nm (Gambar 1e). DLS menunjukkan bahwa diameter hidrodinamis miksel Si QD-CKAP4 bervariasi dari 58,7 hingga 824,9 nm dengan rata-rata 78,8 nm, yang sedikit lebih besar dari miksel Si QD (Gambar 1f). Peningkatan ini mungkin karena konjugasi antibodi CKAP4. Spektrum XPS C1s menunjukkan enam jenis atom karbon pada wilayah C1s: C(O)O (288,81 eV), C=O (286,5 eV), C–O (285,76 eV), C–N (285,25 eV), C–C (284,88 eV), dan C–H (284,34 eV) (Gambar 1g). Namun, puncak C(O)O hampir hilang dalam spektrum XPS miksel Si QD-CKAP4, menunjukkan bahwa konjugasi antara grup karboksil dan amina primer berhasil; oleh karena itu, antibodi CKAP4 berhasil dikonjugasi dengan miksel Si QD (Gambar 1h). Zeta potensial rata-rata miksel Si QD-CKAP4 sekitar − 10,7 mV, lebih tinggi dari miksel Si QD. Penjelasan untuk fenomena di atas mungkin sebagai berikut: Ada banyak grup karboksil pada permukaan miksel Si QD; oleh karena itu, miksel Si QD menunjukkan listrik negatif yang kuat. Namun, pada miksel Si QD-CKAP4, pengikatan antibodi CKAP4 menyebabkan pengurangan grup karboksil pada permukaan miksel Si QD-CKAP4; oleh karena itu, zeta potensial rata-rata miksel Si QD-CKAP4 meningkat.

Spektrum absorpsi UV–visible menunjukkan bahwa absorpsi miksel Si QD-CKAP4 bervariasi dari 200 hingga 500 nm, mirip dengan hasil miksel Si QD (Gambar 2a). Dengan panjang gelombang eksitasi 330 nm, fluoresensi kuat pada 640 nm diamati dari miksel Si QD-CKAP4 dalam spektrum emisi fluoresensi (Gambar 2b). Hasil ini menunjukkan bahwa konjugasi antibodi tidak memiliki pengaruh signifikan pada properti fluoresensi miksel Si QD-CKAP4. Larutan air miksel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si: 80 µg/mL) transparan dan jernih dalam cahaya alami. Di bawah cahaya UV 365 nm, ia dapat memancarkan fluoresensi merah kuat, sesuai dengan hasil miksel Si QD (Gambar 2c). Uji PL QY menunjukkan bahwa PL QY absolut miksel Si QD-CKAP4 sekitar 16,96%.

Uji Sitotoksitas Miksel Si QD-CKAP4 In Vitro

Baris sel kanker paru-paru manusia A549 dan baris sel epitel ginjal manusia 293 T digunakan sebagai sel target untuk menyelidiki biosafety miksel Si QD dan miksel Si QD-CKAP4. Dalam penelitian ini, berbagai konsentrasi miksel Si QD dan miksel Si QD-CKAP4 (konsentrasi Si 0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76, dan 152 µg/mL) pertama kali diinkubasi dengan sel A549 atau 293 T pada 37 °C selama 2 h. Keandalan sel terdeteksi menggunakan trypan blue (Gambar 3) [15]. ID50 miksel Si QD dan miksel Si QD-CKAP4 diperoleh menggunakan perangkat lunak GraphPad. Data menunjukkan bahwa ID50 miksel Si QD lebih besar dari 152 µg/mL pada sel A549 dan 293 T. ID50 miksel Si QD-CKAP4 adalah 25,94 µg/mL pada sel A549 dan 72,69 µg/mL pada sel 293 T. Hasil ini menunjukkan bahwa sitotoksitas miksel Si QD-CKAP4 secara signifikan lebih tinggi dari miksel Si QD dan sitotoksitas miksel Si QD-CKAP4 pada sel A549 secara signifikan lebih tinggi dari pada sel 293 T. Fenomena ini mungkin karena sitotoksitas yang bergantung pada komplement [17]. Selain itu, hasil ini juga menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan biosafety biologis yang lebih tinggi pada sel normal dibandingkan dengan sel kanker paru-paru, yang memberi dasar untuk aplikasinya in vivo.

Targeting Miksel Si QD-CKAP4 ke Sel Kanker Paru-paru In Vitro

Untuk menyelidiki lebih lanjut fungsi targeting miksel Si QD-CKAP4 pada sel kanker paru-paru in vitro, sel A549 dan 293 T digunakan sebagai sel target. Miksel Si QD dan miksel Si QD-CKAP4 pertama kali diinkubasi dengan sel A549 dan 293 T pada 37 °C selama 2 h. Efek targeting terdeteksi menggunakan mikroskop konfokal laser (Gambar 4). Hasil menunjukkan bahwa fluoresensi merah pada A549 yang diinkubasi miksel Si QD-CKAP4 secara signifikan lebih tinggi daripada grup yang diinkubasi miksel Si QD-CKAP4 dan 293 T, grup yang diinkubasi miksel Si QD dan A549, dan grup yang diinkubasi miksel Si QD dan 293 T. Hasil ini menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 dapat secara spesifik targeting sel A549 in vitro.

Targeting Miksel Si QD-CKAP4 ke Jaringan Kanker Paru-paru In Vitro

Citra Fluoresensi In Vivo

Sembilan tikus bawa tumor dibagi menjadi tiga grup (grup injeksi miksel Si QD-CKAP4, grup injeksi miksel Si QD, dan grup injeksi larutan garam). Tikus dalam grup injeksi miksel Si QD-CKAP4 diinjeksi secara intravena dengan 200 µL miksel Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg). Tikus dalam grup injeksi miksel Si QD diinjeksi secara intravena dengan 200 µL miksel Si QD (Si: 4 mg/kg). Tikus dalam grup injeksi larutan garam diinjeksi secara intravena dengan 200 µL larutan garam. Citra fluoresensi diperoleh pada berbagai titik waktu (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, dan 4 h). Sinyal fluoresensi yang signifikan tidak diamati pada jaringan kanker paru-paru di antara semua tikus dalam tiga grup (data tidak ditampilkan). Ini mungkin karena penetrasi fluoresensi yang lemah dari miksel Si QD-CKAP4 dan miksel Si QD.

Tikus dalam grup injeksi miksel Si QD-CKAP4 dianestesi dan di-eutanasia pada 4 h untuk mendeteksi sinyal fluoresensi pada jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan tumor mereka. Data menunjukkan bahwa sinyal fluoresensi yang signifikan dapat diamati pada jaringan hati, ginjal, dan tumor. Namun, tidak ada sinyal fluoresensi yang signifikan pada jantung, limpa, atau jaringan paru-paru sehat (Gambar 6). Sinyal fluoresensi yang signifikan pada hati dan ginjal menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 dimetabolisme oleh hati dan diekskresi oleh ginjal. Selain itu, sinyal fluoresensi pada jaringan tumor A549 secara signifikan lebih tinggi daripada pada jaringan paru-paru sehat. Fenomena ini berkontribusi pada kemampuan targeting miksel Si QD-CKAP4 terhadap jaringan kanker paru-paru. Hasil ini menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 secara spesifik targeting jaringan kanker paru-paru, yang diharapkan menjadi agen kontras fluorescent untuk navigasi bedah kanker paru-paru di masa depan.

Evaluasi Biosafety Miksel Si QD-CKAP4 In Vivo

Terakhir, kami menyelidiki toksisitas akut miksel Si QD-CKAP4 in vivo. Dalam penelitian ini, tikus bawa tumor (n = 12) diinjeksi secara intravena dengan larutan garam (200 µL), miksel Si QD (Si: 4 mg/kg, 200 µL), atau miksel Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg, 200 µL) dan kemudian di-eutanasia 24 jam kemudian. Citra warni H&E jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal ditunjukkan dalam Gambar 7. Dibandingkan dengan tikus yang diinjeksi larutan garam, tidak ada perubahan patologis yang jelas pada organ utama tikus yang diinjeksi miksel Si QD dan tikus yang diinjeksi miksel Si QD-CKAP4. Data di atas menunjukkan bahwa miksel Si QD (Si: 4 mg/kg) dan miksel Si QD-CKAP4 (Si: 4 mg/kg) tidak menunjukkan toksisitas yang signifikan in vivo.

Diskusi

Saat ini, berbagai bahan nanomaterial fluorescent telah dirancang dan disintesis sebagai agen kontras optik untuk navigasi bedah [3, 4]. Pada 2020, On et al. menyiapkan nanopartikel kitosan glikol (CNPs) yang dikonjugasi fluorofor [indocyanine green (ICG) atau cyanine 5.5 (Cy5.5)] sebagai agen kontras fluorescent untuk navigasi bedah kanker paru-paru [18]. Namun, belum ada laporan tentang penyusunan agen kontras fluorescent untuk navigasi bedah kanker paru-paru menggunakan Si QDs.

Penelitian ini berhasil menyintesis miksel Si QD-CKAP4, yang dapat targeting citra jaringan kanker paru-paru. Miksel Si QD-CKAP4 diharapkan dapat digunakan sebagai agen kontras optik untuk navigasi dalam bedah kanker paru-paru di masa depan. Keuntungan miksel Si QD-CKAP4 adalah sebagai berikut: (1) Kami menyintesis agen kontras fluorescent untuk navigasi bedah kanker paru-paru menggunakan Si QD untuk pertama kalinya, yang memperluas kotak alat perpustakaan navigasi bedah kanker paru-paru. (2) Penelitian ini mengoptimalkan miksel Si QD yang dapat dispersi dalam air yang dilaporkan oleh Pi et al. untuk menambahkan kemampuan targeting pada miksel Si QD [12]. Oleh karena itu, ini memberikan kemungkinan baru untuk menerapkan Si QD dalam bidang biomedis. (3) Prinsip targeting miksel Si QD-CKAP4 terhadap kanker paru-paru didasarkan pada ekspresi tinggi protein CKAP4 dalam jaringan kanker paru-paru. Akibat konjugasi antibodi CKAP4, miksel Si QD-CKAP4 dapat secara aktif targeting jaringan kanker paru-paru. Dibandingkan dengan bahan nanomaterial yang secara pasif targeting tumor melalui efek EPR, miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan spesifisitas yang lebih kuat terhadap jaringan kanker paru-paru. (4) Miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan sitotoksitas selektif terhadap sel tumor dalam rentang konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan biosafety biologis yang tinggi dalam rentang konsentrasi obat rasional, yang menunjukkan potensi nilai aplikasi klinisnya.

Dalam penelitian ini, uji PL QY menunjukkan bahwa PL QY absolut miksel Si QD sekitar 14,49% dan PL QY absolut miksel Si QD-CKAP4 sekitar 16,96%. Studi oleh Pi et al. menunjukkan bahwa PL QY dodesil-Si QD sekitar 26%, yang sangat tinggi untuk Si QD yang memancarkan cahaya merah dengan puncak PL kurang dari 700 nm [12, 19, 20]. Namun, PL QY miksel Si QD dalam penelitian ini sekitar 14,49%, yang lebih rendah dari dodesil-Si QD. Ini mungkin karena cacat permukaan yang diperkenalkan selama proses emulsi, yang hampir konsisten dengan penurunan PL QY pada miksel Si QD (dodesil-passivated Si QD dikapsulasi dalam miksel self-assembly dari F127 dalam emulsi) dalam studi yang dilaporkan oleh Pi et al. [12, 21]. Dalam penelitian ini, PL QY miksel Si QD-CKAP4 sekitar 16,96%, yang sedikit lebih tinggi dari miksel Si QD (14,49%). Ini mungkin karena pada miksel Si QD-CKAP4, pengikatan antibodi CKAP4 memperbaiki beberapa cacat permukaan miksel Si QD, yang mengarah pada peningkatan ringan PL QY.

Seperti yang kita ketahui, ada tantangan dalam aplikasi citra biologis Si QD: Meskipun Si menunjukkan sitotoksitas yang sedikit, partikel Si mungkin menunjukkan sitotoksitas saat ukuran menurun hingga tingkat tertentu. Dalam penelitian ini, uji sitotoksitas menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan sitotoksitas selektif terhadap sel kanker paru-paru pada 9,5–19 µg/mL. Oleh karena itu, akibat konjugasi antibodi CKAP4, sitotoksitas miksel Si QD-CKAP4 terhadap sel normal secara signifikan lebih rendah daripada sel kanker paru-paru, yang memberikan kondisi yang kuat untuk aplikasi biologis miksel Si QD-CKAP4.

Dalam penelitian ini, baris sel kanker paru-paru manusia A549 dan baris sel epitel ginjal manusia 293 T digunakan sebagai sel target untuk menyelidiki kemampuan targeting miksel Si QD dan miksel Si QD-CKAP4. Sel A549 dan 293 T masing-masing melekat dan setengah melekat. Selama eksperimen, jumlah sel 293 T berkurang karena sentrifuga dan pencucian berulang kali. Oleh karena itu, seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4, jumlah sel 293 T lebih rendah daripada sel A549.

Selain itu, perlu diperhatikan bahwa sel A549 termasuk baris sel kanker paru-paru p53 tipe liar. Oleh karena itu, hanya sel A549 tidak dapat sepenuhnya mencerminkan kemampuan targeting miksel Si QD-CKAP4 terhadap kanker paru-paru. Studi lebih lanjut akan dilakukan untuk menguji kemampuan targeting dan efek citra miksel Si QD-CKAP4 pada baris sel p53-negatif (seperti H1299) untuk memberikan dasar eksperimental yang kokoh untuk aplikasi klinis miksel Si QD-CKAP4 [22].

Kesimpulan

Penelitian ini meningkat dan memodifikasi miksel Si QD yang dilaporkan oleh Pi et al. untuk menyusun miksel Si QD-CKAP4 yang dapat dispersi dalam air. Miksel Si QD-CKAP4 adalah partikel bola dengan diameter hidrodinamis rata-rata sekitar 78,8 nm. Absorpsi UV–visible miksel Si QD-CKAP4 bervariasi dari 200 hingga 500 nm. Dengan panjang gelombang eksitasi 330 nm, fluoresensi kuat pada 640 nm diamati dalam spektrum emisi fluoresensi. Miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan kemampuan targeting yang baik terhadap sel kanker paru-paru dan jaringan kanker paru-paru baik in vitro maupun in vivo. Selain itu, uji citra fluoresensi in vivo lebih lanjut menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 dimetabolisme oleh hati dan diekskresi oleh ginjal. Uji sitotoksitas dan warni H&E menunjukkan bahwa miksel Si QD-CKAP4 menunjukkan biosafety tinggi baik in vitro maupun in vivo. Miksel Si QD-CKAP4 adalah agen citra yang secara spesifik targeting kanker paru-paru dan diharapkan menjadi agen kontras fluorescent untuk navigasi bedah kanker paru-paru di masa depan.

Ketersediaan Data dan Bahan

Data dan analisis dalam pekerjaan saat ini tersedia dari penulis yang bersangkutan atas permintaan yang wajar.

Singkatan

Si QD:: Titik Kuantum Silikon
Si QD miksel-CKAP4:: Miksel titik kuantum silikon yang dikonjugasi antibodi CKAP4
Dodesil-Si QD:: Si QD yang dipassivasi dodesil
BSA:: Albumin Serum Sapi
THF:: Tetrahidrofuran
DMEM:: Medium Dulbecco yang Dimodifikasi
PBS:: Larutan Garam Fosfat
FBS:: Serum Fetal Sapi
TEM:: Mikroskop Elektron Transmisi
DLS:: Pencaharan Cahaya Dinamis
XPS:: Spektroskopi Fotoelektron Sinar-X
FTIR:: Spektroskopi Inframerah Transform Fourier
XRD:: Difraksi Sinar-X
SPF:: Bebas Patogen Spesifik
DAPI:: 4′, 6-Diamidino-2-fenilindol
H&E:: Hematoxylin dan Eosin

nMOSFET Germanium Mobilitas Tinggi dengan Dielektrik Gate ZrO₂ Fotodetektor Berkinerja Tinggi Menggunakan Heterojuncsi Monolateral MoS₂/WS₂

bahan nano