Tumor ganas tetap menjadi penyebab utama kematian di seluruh dunia, dan kemampuan untuk mendeteksi penyakit awal serta memprediksi penyebaran metastatis sangat penting untuk memilih strategi terapi yang paling efektif. Integrin αvβ3 adalah biomarker yang divalidasi untuk angiogenesis tumor, menjadikannya target yang menarik untuk citra molekuler. Di sini kami melaporkan sintesis dan evaluasi in vitro dari nanoprobe dual-mode berbasis liposom, cRGD-Gd-Cy5.5, yang menggabungkan kontras MR berobat T1 dengan fluoresensi inframerah dekat. Nanopartikel berdiameter ~60 nm, menunjukkan dispersi air yang baik, potensial zeta positif (+39,5 mV), dan r1 relaxivitas 10,5 mM‑1 s‑1—lebih dari dua kali dari agen klinis Magnevist. Ujian sitotoksisitas menunjukkan viabilitas sel >70 % pada konsentrasi Gd hingga 400 µM. Studi fluoresensi dan MR pada sel A549 dan SUNE‑1‑5‑8F menunjukkan penyerapan selektif pada sel kaya integrin-αvβ3, sedangkan sel normal MCF‑10A menunjukkan ikatan yang dapat diabaikan. Citra in vivo pada model karsinoma nasofaring tikus nuda menunjukkan peningkatan sinyal spesifik tumor yang bertahan setidaknya 6 jam setelah suntikan. Temuan ini menetapkan cRGD-Gd-Cy5.5 sebagai nanoprobe dual-modal yang aman dan sangat responsif untuk pemantauan real-time penyebaran tumor.
Latar Belakang
Penyebaran metastatis adalah penyebab utama kegagalan pengobatan pada tumor padat. Ciri khas dari proses ini adalah remodeling matriks selular eksternal (ECM) dan pembentukan vaskular baru, keduanya dimediasi oleh integrin αvβ3. Integrin ini diekspresikan pada tingkat tinggi pada sel endotel neovaskular tumor dan pada banyak jenis sel tumor, namun rendah atau tidak ada pada jaringan normal, menjadikannya target citra yang ideal.
Kemajuan terbaru dalam citra molekuler telah memungkinkan interogasi non-invasif terhadap biologi tumor. Probe efektif memerlukan moiety target dan sinyal terdeteksi. Urutan peptida RGD, yang mengikat integrin αvβ3 dengan affinitas tinggi, telah menjadi ligan target standar. Menggabungkan ini dengan resonansi magnetik, yang menawarkan kontras jaringan lunak yang tinggi dan penetrasi dalam, dan fluoresensi inframerah dekat, yang memberikan sensivitas tinggi untuk pedoman intraoperatif, menghasilkan pendekatan dual-modal yang kuat.
Sementara agen T1 berbasis Gd banyak digunakan secara klinis, mereka tidak memiliki spesifisitas tumor bawaan. Dengan mengenkapsulasi ion Gd dalam liposom dan menghiasi permukaan dengan RGD dan fluorofor Cy5.5, kami menciptakan probe yang tidak hanya meningkatkan relaxivitas tetapi juga memberikan kemampuan target yang sangat spesifik.
Hasil
Karakterisasi Nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5
Probe berupa cairan jernih warna muda tanpa endapan setelah diam, menunjukkan stabilitas koloid yang baik. Mikroskop elektron transmisi (TEM) menunjukkan liposom bola dengan ukuran seragam (~60 nm) tanpa agregasi (Fig. 1a). Pencaran cahaya dinamis (DLS) memberikan diameter hidrodinamik 124,2 ± 0,215 nm dan potensial zeta positif 39,5 ± 1,65 mV, mengonfirmasi fungsionalisasi grup amino permukaan (Fig. 1b,c).
Data karakterisasi cRGD-Gd-Cy5.5. a Citra TEM besar-besaran. b Distribusi ukuran oleh DLS (rata-rata 124,2 nm). c Potensial zeta (≈39 mV).
Spektroskopi fluoresensi mengonfirmasi konjugasi Cy5.5 yang berhasil, dengan puncak emisi yang jelas pada 685 nm pada eksitasi 600 nm (Fig. 2a). Citra hewan kecil in vivo menunjukkan fluoresensi merah cerah pada liposom-Cy5.5, sedangkan liposom kosong tidak menunjukkan sinyal (Fig. 2b).
Properti fluoresensi cRGD-Gd-Cy5.5. a Emisi pada 670 nm pada eksitasi 600-nm. b Fluoresensi merah pada liposom yang dilabeli Cy5.5 versus tidak ada pada kosong.
Relaxometri MR Nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5
Pencocokan linear waktu relaksasi T1 versus konsentrasi Gd menghasilkan relaxivitas r1 sebesar 10,515 mM‑1 s‑1, lebih dari dua kali Magnevist (4,56 mM‑1 s‑1). Probe menunjukkan peningkatan intensitas sinyal bergantung pada dosis, mengonfirmasi kesesuaiannya sebagai agen kontras positif (Fig. 3a,b).
Properti relaksasi. a Citra T1-berbobot pada berbagai konsentrasi Gd. b Pencocokan linear menghasilkan r1 = 10,515 mM‑1s‑1.
Studi Sitotoksisitas Nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5
Ujian CCK-8 di seluruh sel A549, SUNE‑1‑5‑8F, HUVEC, dan MCF‑10A menunjukkan viabilitas >70 % pada konsentrasi Gd hingga 400 µM setelah 24 jam, menunjukkan biokompatibilitas yang baik (Fig. 4).
Ujian sitotoksisitas. Viabilitas sel >70 % untuk semua baris sel pada 400 µM Gd.
Ujian Staining Imunofluoresensi dan Citometria Aliran Integrin αvβ3
Citra konfokal menunjukkan staining integrin αvβ3 yang kuat pada membran sel A549 dan SUNE‑1‑5‑8F, dengan sinyal yang dapat diabaikan pada sel MCF‑10A (Fig. 5a). Citometria aliran mengukur ekspresi permukaan: A549 (89,07 %), SUNE‑1‑5‑8F (63,84 %), MCF‑10A (1,56 %).
Ekspresi Integrin αvβ3. a Citra konfokal. b Ikatan probe pada 200 µg mL‑1. c Hasil citometria aliran.
Penyerapan Seluler cRGD-Gd-Cy5.5
Fluoresensi merah terlihat pada membran sel A549 dan SUNE‑1‑5‑8F setelah inkubasi 1 jam, dengan intensitas proporsional terhadap ekspresi integrin. Tidak ada sinyal yang terlihat pada sel MCF‑10A, mengonfirmasi spesifisitas target.
Citra MR dan Fluoresensi In Vitro
Citra MR T1-berbobot menjadi semakin terang seiring meningkatnya konsentrasi Gd pada sel A549, dengan perbedaan yang signifikan secara statistik (p < 0,05). Citra fluoresensi menunjukkan peningkatan sinyal Cy5.5 yang sesuai, mengungguli kontrol Gd-Cy5.5 non-target (Fig. 6).
Citra in vitro. a Sel diinkubasi dengan berbagai Gd (0–0,08 mM). b Waktu relaksasi T1 yang sesuai. c Citra fluoresensi hewan kecil.
Citra MR dan Fluoresensi In Vivo
Pada tikus nuda yang membawa xenograft karsinoma nasofaring, kontras tumor meningkat secara signifikan 5 menit setelah suntikan dan tetap stabil hingga 6 jam. Kelompok yang diblokir reseptor hanya menunjukkan peningkatan yang sedikit, mengonfirmasi penyerapan yang dimediasi integrin. Citra fluoresensi mencerminkan temuan MR, dengan sinyal tumor puncak pada 6 jam dan ekskresi renal terlihat pada 6 jam (Fig. 7).
Citra in vivo. a Scan MR 3,0-T pra-suntikan, 30 menit, 2 jam, 6 jam. b Citra fluoresensi pada waktu yang sesuai.
Diskusi
Integrin αvβ3 diekspresikan tinggi pada vaskular tumor dan banyak jenis sel ganas, menjadikannya target yang menarik untuk citra non-invasif. Chelate Gd tradisional tidak memiliki spesifisitas tumor dan menawarkan relaxivitas yang terbatas. Dengan mengenkapsulasi Gd dalam liposom dan menghiasi permukaan dengan peptida RGD siklus dan Cy5.5, kami mencapai nanoprobe dual-mode yang menggabungkan resolusi spasial tinggi T1 MR dengan sensivitas fluoresensi inframerah dekat.
r1 probe sebesar 10,5 mM‑1 s‑1 melebihi agen klinis, sementara muatan permukaan positif dan ukuran ~60 nm mendukung akumulasi dan retensi tumor yang efisien. Ujian sitotoksisitas mengonfirmasi keamanan yang baik, dengan viabilitas di atas 70 % bahkan pada dosis Gd di atas klinis. Pentingnya, penyerapan probe berkorelasi kuat dengan tingkat ekspresi integrin, seperti yang ditunjukkan oleh staining imunofluoresensi, citometria aliran, dan citra in vitro.
Data in vivo menunjukkan target tumor yang spesifik, kontras yang bertahan hingga 6 jam, dan ekskresi renal, yang menunjukkan profil farmakokinetik yang menguntungkan. Atribut ini memposisikan cRGD-Gd-Cy5.5 sebagai platform yang menjanjikan untuk pemantauan multimodal real-time progresi dan metastasi tumor.
Kesimpulan
Nanoprobe dual-mode liposom cRGD-Gd-Cy5.5 adalah alat yang kuat, aman, dan sangat responsif untuk target integrin αvβ3. Relaxivitas superior, ikatan tumor spesifik, dan sitotoksisitas rendah memberikan dasar yang kokoh untuk translasi klinis masa depan dalam citra non-invasif dan real-time metastasi tumor.
Metode
Sintesis cRGD-Gd-Cy5.5
Liposom disiapkan dengan melarutkan lecithin, kolesterol, dan DSPE-PEG2000-NH2 dalam kloroform, diikuti oleh evaporasi rotary untuk membentuk film tipis. Film dihidrasi dengan larutan GdCl3 (10 mg) dalam buffer karbonat (pH 8,5) pada 50 °C, kemudian di sonikasi dan difilter (0,22 µm) sebelum ultrafiltraasi (10 kDa) untuk menghapus Gd bebas. Peptid RGD diaktifkan dengan EDC/NHS dan dikonjugasi ke Cy5.5, kemudian diikat ke permukaan liposom pada pH 8,4. Formulasi akhir disimpan pada 4 °C.
Karakterisasi Nanopartikel
Ukuran dan morfologi partikel dievaluasi dengan TEM dan DLS. Properti optik diukur dengan pembaca mikropirat (400–800 nm absorpsi, eksitasi 600-nm). Spektrum FT-IR dan UV-Vis mengonfirmasi fungsionalisasi permukaan.
Pengukuran Laju Relaksasi
Pengenceran seri probe discan pada scanner MR 3,0-T menggunakan urutan MOLLI (TR = 5,8 ms, TE = 3,66 ms). Nilai T1 diekstraksi dari ROI 0,3 cm2 dan diplot terhadap konsentrasi Gd untuk menghitung r1.
Kultur Sel dan Ujian Sitotoksisitas
Baris sel tumor dan normal manusia (A549, SUNE‑1‑5‑8F, HUVEC, MCF‑10A) dikultur dalam DMEM dengan 10 % FBS. Ujian CCK-8 dilakukan pada 50–400 µM Gd selama 24 jam untuk menentukan viabilitas.
Staining Imunofluoresensi dan Ujian Citometria Aliran Integrin αvβ3
Sel diperbaikan, diblokir, dan diinkubasi dengan anti-αvβ3 antibody, diikuti oleh secondary antibody floresien dan staining DAPI. Mikroskopi konfokal dan citometria aliran (eksitasi 488 nm) mengukur ekspresi permukaan.
Ujian Ikatan Probe Molekuler ke Integrin αvβ3
Sel diinkubasi dengan probe selama 1 jam, dicuci, dan diimajing dengan mikroskopi konfokal untuk menilai ikatan.
Citra MR dan Fluoresensi In Vitro Sel Tumor
Sel A549 diinkubasi dengan berbagai konsentrasi Gd (0–0,08 mM) selama 2 jam, kemudian dicuci, ditanam dalam agarose, dan diimajing pada scanner MR 3,0-T. Citra fluoresensi dilakukan pada sistem hewan kecil.
Citra MR dan Fluoresensi In Vivo
Tikus Balb/c nuda yang membawa xenograft karsinoma nasofaring menerima suntikan vena ekor 0,05 mmol Gd/kg cRGD-Gd-Cy5.5. Citra MR dan fluoresensi dilakukan pra-suntikan, 30 menit, 2 jam, dan 6 jam setelah suntikan. Kelompok yang diblokir reseptor menerima RGD bebas (10 mg) 1 jam sebelum suntikan probe.
