Sintesis dan Studi In Vitro dari Integrin Penargetan Probe Mode Ganda αvβ3
Abstrak
Tumor ganas merupakan penyakit serius yang mengancam kehidupan manusia, dan diagnosis dini dan prediksi metastasis sangat penting untuk pilihan rencana pengobatan dan waktu pengobatan. Integral v3 , yang telah mendapat perhatian luas sebagai penanda molekuler neovaskularisasi tumor, merupakan target penting untuk memantau tumorigenesis dan perkembangan dalam penelitian pencitraan molekuler. Studi ini melaporkan penyelidikan molekuler mode ganda resonansi magnetik (MR)/fluoresensi, cRGD-Gd-Cy5.5, yang menargetkan integrin αv3 reseptor dan menggunakan liposom sebagai pembawa. Nanoprobe yang diperoleh memiliki ukuran 60,08 ± 0,45 nm, dengan dispersi yang baik dalam air, distribusi ukuran yang seragam, stabilitas yang diinginkan, dan relaksivitas yang tinggi. Tingkat relaksasi r1-nya adalah 10.515 mM
−1
s
−1
, jauh lebih tinggi daripada kelat Gd lainnya dalam penggunaan klinis. Probe tidak menunjukkan sitotoksisitas pada konsentrasi yang diuji secara in vitro, dan kemampuannya untuk menargetkan sel A549 dan sel SUNE-1-5-8F dievaluasi terlebih dahulu melalui pencitraan fluoresensi in vitro dan pencitraan MR. Hasilnya menunjukkan bahwa nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5 memiliki karakteristik yang baik, menunjukkan stabilitas dan keamanan hayati yang diinginkan, tingkat relaksasi T1 yang tinggi, dan penargetan serta pengikatan yang kuat pada tumor dengan ekspresi integrin v yang tinggi. 3 . Oleh karena itu, cRGD-Gd-Cy5.5 adalah agen yang menjanjikan untuk pemantauan visual metastasis tumor.
Latar Belakang
Infiltrasi tumor ganas dan metastasis jauh merupakan penyebab utama kegagalan pengobatan. Proses metastasis tumor ganas membutuhkan penghancuran matriks ekstraseluler (ECM) dan neovaskularisasi tumor [1]. Oleh karena itu, pemantauan penanda molekuler noninvasif in vitro yang terkait dengan neovaskularisasi tumor sangat penting dalam prediksi metastasis tumor dan diagnosis dini. Integral v3 , penanda molekuler tumor neovaskular yang dipelajari secara luas, telah mendapat perhatian luas. Integrin ini terkait erat dengan adhesi, proliferasi, dan diferensiasi sel endotel vaskular selama neovaskularisasi tumor [2].
Kemajuan dalam pencitraan molekuler telah memungkinkan pemantauan noninvasif pertumbuhan tumor pada tingkat molekuler. Studi pencitraan molekuler dari molekul target yang diinginkan harus memiliki dua elemen dasar:(1) komponen penargetan yang sesuai dan (2) komponen sinyal yang dapat dideteksi dengan teknik pencitraan. Integral v3 , yang secara khusus mengenali dan mengikat urutan arginin-glisin-aspartat (Arg-Gly-Asp, RGD) dalam protein ECM, diaktifkan melalui perubahan konformasi. Dengan demikian, urutan RGD telah banyak digunakan dalam sintesis pelacak penargetan tumor sebagai komponen penargetan yang penting [3]. Pencitraan resonansi magnetik (MR) telah menjadi salah satu alat diagnostik pencitraan molekuler yang paling kuat untuk memantau tumor karena radiasi non-pengion, resolusi jaringan lunak yang tinggi, dan kedalaman penetrasi yang tidak terbatas [4, 5]. Analisis statistik menunjukkan bahwa sekitar 50% pemeriksaan MR memerlukan penggunaan agen kontras untuk meningkatkan kualitas gambar [6, 7]. Pencitraan fluoresensi inframerah-dekat adalah jenis pencitraan optik, dan panjang gelombang cahaya inframerah-dekat, yang merupakan cahaya tak-tampak yang paling awal ditemukan, berkisar antara 700 hingga 900 nm. Teknik pencitraan fluoresensi inframerah-dekat memungkinkan ahli bedah untuk memvisualisasikan, menggambarkan, dan reseksi tumor selama operasi [8, 9]. Namun, dengan perubahan spektrum penyakit manusia, pencitraan molekuler mode tunggal gagal memenuhi persyaratan diagnosis presisi karena tingginya angka positif palsu dan negatif palsu. Dengan demikian, teknik pencitraan molekuler berdasarkan integrasi beberapa mode akan menjadi tren baru dalam pengembangan pencitraan molekuler [10].
Dalam penelitian ini, kami menyiapkan probe molekuler mode ganda cRGD-Gd-Cy5.5 yang dapat digunakan dalam pencitraan histologis dan fungsional tumor (Skema 1). Dibandingkan dengan probe molekuler dengan Fe3 O4 sebagai unit sinyal [11, 12], cRGD-Gd-Cy5.5 luar biasa dengan (a) paramagnetisme tinggi (tujuh elektron tidak berpasangan di sekitar Gd
3 +
); (b) kemampuan untuk mengikat dengan pembawa untuk membentuk agen khelasi yang stabil, seperti Magnevist yang banyak digunakan di klinik; (c) resolusi ruang yang tinggi, dan definisi gambar yang lebih tinggi daripada agen kontras negatif [13, 14]. Kami memilih liposom sebagai molekul pembawa yang menghubungkan agen kontras MR dengan agen kontras fluoresensi. Fosfolipid umum memiliki dua rantai hidrokarbon hidrofobik panjang dan gugus hidrofilik dalam struktur molekulnya. Ketika ditambahkan ke air atau larutan penyangga, jumlah molekul fosfolipid yang sesuai mengasumsikan pengaturan dalam arah tertentu, dengan gugus hidrofiliknya menghadap fase air di kedua sisi dan rantai hidrokarbon hidrofobik saling berhadapan untuk membentuk lapisan ganda dalam liposom. Peptida siklik penargetan RGD dan molekul fluoresen Cy5.5 dikonjugasikan ke permukaan liposom melalui fosfolipid polietilen glikol (PEG) yang diperkenalkan dengan gugus amino, dan akhirnya, ion Gd dienkapsulasi dalam liposom untuk mencapai konstruksi probe molekuler multimodal yang ditargetkan dengan karakteristik yang diinginkan dalam hal struktur, komposisi, ukuran, bentuk, stabilitas, dan relaksivitas MR. Sitokompatibilitasnya dinilai melalui uji sitotoksisitas dan pengamatan morfologi sel. Akhirnya, potensi cRGD-Gd-Cy5.5 untuk pencitraan MR berbobot T1 dan pencitraan fluoresensi sel kanker in vitro dinilai.
Rute sintetis liposom yang didoping Gd, diikuti oleh konjugasi RGD dan Cy5.5 untuk aplikasi bio, untuk deteksi integrin v yang sangat sensitif 3
Hasil
Karakterisasi nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5
Larutan cRGD-Gd-Cy5.5 adalah cairan bening berwarna merah muda pucat, tanpa pengendapan yang jelas setelah didiamkan beberapa saat, menunjukkan dispersi yang baik. Mikroskop elektron transmisi (TEM) mengungkapkan penampilan kompleks liposom cRGD-Gd-Cy5.5 sebagai bentuk bola dengan ukuran seragam, tanpa agregasi granul atau kerusakan setelah pewarnaan negatif dengan 2% natrium fosfotungstat, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a. Distribusi ukuran partikel konsisten, mulai dari 50 hingga 80 nm, dengan ukuran partikel rata-rata 60,08 ± 0,45 nm. Ukuran partikel terhidrasi dari kompleks liposom cRGD-Gd-Cy5.5 yang diukur melalui hamburan cahaya dinamis (DLS) adalah 124.2 ± 0.215 nm (Gbr. 1b). Seperti yang ditunjukkan pada gambar, nanopartikel menunjukkan distribusi ukuran yang sempit dalam air dan dispersi yang baik. Potensi zeta permukaan adalah 39,5 ± 1,65 mV, menunjukkan muatan permukaan positif, yang konsisten dengan keberadaan gugus amino di permukaan (Gbr. 1c).
Data karakterisasi nanoprobe CRGD-GD-CY5.5. a Gambar TEM perbesaran rendah dari cRGD-Gd-Cy5.5. b Ukuran partikel dideteksi dengan analisis ukuran, dan ukuran rata-rata probe adalah 124,2 nm. c Potensi zeta sekitar 39,5 mV, permukaan yang tampak bersifat elektropositif
Uji mikroplate multifungsi menunjukkan bahwa liposom kosong tidak memiliki daerah penyerapan UV dan liposom yang digabungkan dengan fluoresen Cy5.5 dalam cahaya eksitasi 600 nm memiliki puncak penyerapan yang jelas pada 685 nm (Gbr. 1a), konsisten dengan panjang gelombang emisi fluoresen Cy5.5 . Molekul fluoresen menunjukkan bahwa Cy5.5 berhasil digabungkan. Hasil sistem pencitraan fluoresensi hewan kecil menunjukkan bahwa di bawah cahaya eksitasi 600 nm, fluoresen terkonjugasi-liposom Cy5.5 memiliki fluoresensi merah yang jelas, sedangkan liposom kosong tidak memiliki sinyal fluoresensi (Gbr. 2b).
Sifat fluoresensi nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5. a Liposom berlabel fluoresensi Cy5.5 dideteksi oleh penganalisis enzim multifungsi, dan ada puncak emisi yang terlihat pada 670 nm pada cahaya eksitasi 600 nm. b Di bawah cahaya eksitasi 600 nm, fluorescent Cy5.5 yang digabungkan dengan liposom (kiri) memiliki pendaran yang jelas, sedangkan liposom kosong (kanan) tidak memiliki pencitraan fluoresensi
MR Relaksometri dari nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5
Tingkat relaksasi r1 merupakan parameter penting untuk mengevaluasi kinerja pencitraan agen kontras T1 MR. Oleh karena itu, kami mengukur waktu relaksasi T1 dari probe cRGD-Gd-Cy5.5 dengan konsentrasi Gd yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, tingkat relaksasi r1 dari cRGD-Gd-Cy5.5 adalah 10.515 mM
−1
s
−1
setelah pemasangan linier, jauh lebih tinggi daripada produk klinis Magnevist (4,56 mM
−1
s
−1
). Tingkat relaksasi r1 yang tinggi dari cRGD-Gd-Cy5.5 mungkin merupakan hasil dari struktur spasial khusus dari liposom pembawa dan efek amplifikasi sinyal biologis dari liposom. Saat konsentrasi Gd meningkat, cRGD-Gd-Cy5.5 meningkatkan intensitas sinyal MR (Gbr. 3a). Hasil ini menunjukkan bahwa cRGD-Gd-Cy5.5 sintetis memenuhi kebutuhan kontras gambar yang tinggi dalam pencitraan MR.
Sifat relaksasi nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5. a T1- gambar berbobot (Siemens, Verio,3.0T, MOLLI, urutan:TR = 5.8 ms, TE = 3.66 ms, TI = 16–3200 ms) dari partikel-partikel ini pada konsentrasi yang berbeda (Gd). b Kurva pas konsentrasi Gd dan waktu relaksasi; nilai r1 dari cRGD-Gd-Cy5.5 adalah 10.515 mM
−1
s
−1
Studi Sitotoksisitas dari Nanoprobe cRGD-Gd-Cy5.5
Sitotoksisitas in vitro dari cRGD-Gd-Cy5.5 dinilai melalui uji CCK-8, dibandingkan dengan viabilitas sel pada kelompok yang tidak diberi perlakuan (100%). Semua sel menunjukkan viabilitas sel lebih besar dari 70% dalam kisaran konsentrasi Gd yang diuji (50–400 μM) (Gbr. 4), yang menunjukkan bahwa probe molekuler ini memiliki kompatibilitas sel yang baik. Khususnya, viabilitas sel masih lebih tinggi dari 70% bahkan setelah 24 jam inkubasi dengan 400 μM Gd, konsentrasi yang jauh lebih tinggi daripada dosis yang digunakan secara in vitro dan in vivo.
Uji sitotoksisitas. Viabilitas sel adenokarsinoma paru manusia (A549), sel karsinoma nasofaring (SUNE-1-5-8F), sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVEC), dan garis sel normal payudara (MCF10A) yang diinkubasi dengan konsentrasi cRGD-Gd- yang berbeda. Cy5.5 selama 24 jam
Pewarnaan imunofluoresensi dan Uji Sitometri Aliran Integrin vβ3
Hasil imunofluoresensi menunjukkan bahwa ekspresi integrin vβ3 pada sel A549 dan 5-8F terlokalisasi pada membran sel dan sitoplasma. Integrin sel A549 terutama terletak di membran sel, dan intensitas fluoresensi pada permukaan sel A549 lebih tinggi daripada sel SUNE-1-5-8F. Intensitas fluoresensi sel MCF-10A sangat lemah, menunjukkan bahwa hampir tidak ada integrin vβ3 yang diekspresikan pada permukaan sel epitel mammae (Gbr. 5a). Hasil flow cytometry ditunjukkan pada Gambar 5c. Tingkat ekspresi integrin vβ3 diurutkan sebagai berikut:A549 (89,07%)> SUNE-1-5-8F (63,84%)> MCF-10A (1,56%), menunjukkan tingkat vβ3 dalam sel kanker secara signifikan lebih tinggi daripada pada payudara normal. sel kelenjar.
Gambar mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) dari sel A549, SUNE-1-5-8F, dan MCF-10A. a Gambar imunofluoresensi seluler dari integrin vβ3. Garis sel A549 dan SUNE-1-5-8F diekspresikan dalam membran sel, sel MCF-10A hampir tidak ada ekspresi integrin αv3 . b Sel A549, SUNE-1-5-8F, dan MCF10A diinkubasi dengan cRGD-Gd-Cy5.5 pada 200 μg mL
−1
konsentrasi pada 37 °C selama 1 jam. Jumlah probe yang terikat pada sel sesuai dengan hasil imunofluoresensi seluler. c Uji aliran cytometry untuk mendeteksi ekspresi integrin vβ3 dalam sel A549, SUNE-1-5-8F, dan MCF-10A
Serapan Seluler dari cRGD-Gd-Cy5.5
Berdasarkan hasil pewarnaan imunofluoresensi, sel A549 dan 5-8F yang diinkubasi dengan cRGD-Gd-Cy5.5 digunakan sebagai kelompok eksperimen, sedangkan sel MCF-10A yang diinkubasi dengan cRGD-Gd-Cy5.5 digunakan sebagai kelompok kontrol. Setelah inkubasi dengan cRGD-Gd-Cy5.5, sinyal fluoresensi merah diamati di membran sel A549 dan 5-8F, dengan intensitas sinyal dalam sel A549 lebih tinggi daripada di sel SUNE-1-5-8F (Gbr. 4b). 5b). Hasil ini konsisten dengan ekspresi integrin vβ3 yang dideteksi dengan pewarnaan imunofluoresensi. Hampir tidak ada sinyal fluoresensi merah yang ditemukan di membran sel MCF-10A pada kelompok kontrol.
Pencitraan MR In Vitro dan Pencitraan Fluoresensi
Berdasarkan tingkat relaksasi r1 yang tinggi dan kompatibilitas sel yang baik, cRGD-Gd-Cy5.5 digunakan sebagai zat kontras positif untuk pencitraan MR sel kanker secara in vitro. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, b, warna gambar MR berbobot T1 secara bertahap menjadi lebih cerah, menunjukkan bahwa intensitas sinyal MR sel A549 yang diobati dengan cRGD-Gd-Cy5.5 meningkat dengan konsentrasi Gd yang lebih tinggi. Perbedaan waktu relaksasi T1 antara kedua kelompok signifikan secara statistik, seperti yang ditunjukkan oleh t tes untuk dua sampel independen (p < 0,05). Data ini menunjukkan bahwa cRGD-Gd-Cy5.5 sintetis memiliki potensi untuk digunakan sebagai agen kontras positif dalam pencitraan MR in vitro sel kanker. Demikian pula, sistem fluoresensi hewan kecil menunjukkan peningkatan yang sesuai dalam intensitas fluoresensi saat konsentrasi probe meningkat (Gbr. 6c). Dari sinyal gambar dan data spesifik, efek pencitraan kelompok sasaran (cRGD-Gd-Cy5.5) lebih baik daripada kelompok non-penargetan (Gd-Cy5.5).
Resonansi magnetik sel dan pencitraan fluoresensi. a Sel diinkubasi dengan sel A549 selama 2 jam sesuai dengan konsentrasi Gd:0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04, dan 0,08 (mM). Gd-Cy5.5 digunakan sebagai kelompok kontrol. b Waktu relaksasi T1 dari gambar resonansi magnetik yang sesuai. c Gambar sistem pencitraan hidup hewan kecil
In Vivo MR dan Pencitraan Fluoresensi
Gambar MRI yang diperoleh sebelum injeksi agen kontras tidak menunjukkan perbedaan sinyal yang signifikan antara tumor dan organ/jaringan perifer lainnya. Pada 5 menit setelah injeksi dengan CRGD-Gd-Cy5.5, intensitas sinyal di lokasi tumor mulai diperkuat, tetapi hiperintensitas stabil dipertahankan sejak 6 jam setelah injeksi. Pada kelompok uji, parenkim tumor yang intensif diamati sejak 30 menit, dan penguatan ditingkatkan pada 2 jam (Gbr. 7a). Namun, pada kelompok yang diblokir reseptor, hanya penguatan lembut yang ditemukan di tepi tumor, dan tingkat penguatan melemah pada 2 jam dan sudah menghilang (Gbr. 7a). Pada gambar fluoresensi, intensitas fluoresensi pada kelompok yang ditargetkan secara bertahap meningkat sejak menit ke-30, tetapi masih tinggi pada jam keenam (Gbr. 7b), menunjukkan sirkulasi darah diperpanjang dan CRGD-Gd-Cy5.5 terkonsentrasi secara efisien di tumor. Pada kelompok yang diblokir reseptor, tidak ada konsentrasi probe spesifik yang diamati pada salah satu titik waktu yang diuji. Fluoresensi intensitas tinggi pada ginjal bilateral diamati pada jam keenam (Gbr. 7b). Kami menyimpulkan bahwa jalur metabolisme CRGD-Gd-Cy5.5 mungkin merupakan pembersihan melalui sistem ginjal.
MR dan pencitraan fluoresensi model tumor xenografting subkutan tikus telanjang karsinoma nasofaring. a Tikus telanjang dibius dan dicitrakan dengan pemindai MRI 3.0-T pada pra-injeksi dan pada 0,5, 2, dan 6 jam setelah injeksi. b Tikus telanjang dibius dan dicitrakan dengan sistem pencitraan fluoresensi pada 0,5, 2, dan 6 jam setelah injeksi
Diskusi
Integrin vβ3 sangat diekspresikan tidak hanya pada sel endotel neovaskularisasi tumor tetapi juga pada permukaan berbagai sel tumor, seperti melanoma maligna, glioma maligna, kanker prostat, kanker paru-paru, dan sel kanker payudara. vβ3 tidak diekspresikan atau diekspresikan pada tingkat rendah dalam sel epitel reguler dan sel endotel vaskular dewasa. Berdasarkan sifat-sifat di atas, integrin vβ3 telah menjadi target ideal untuk pemantauan in vivo metastasis tumor [16]. Namun, metode pengukuran tingkat ekspresi integrin vβ3 saat ini masih memiliki masalah non-invasif, pengulangan, dan ketepatan waktu pencitraan, yang masih harus dipecahkan. Mengingat masalah objektif di atas, penyelidikan molekuler mode ganda disintesis dalam penelitian ini untuk pemantauan dinamis ekspresi integrin vβ3 secara real-time, yang secara tidak langsung mencapai tujuan untuk memprediksi dan memantau metastasis tumor.
Agen kontras dapat dibagi menjadi dua jenis menurut mekanisme pencitraan MR:senyawa Gd (agen kontras T1-positif) dan nanopartikel oksida besi paramagnetik (agen kontras T2-negatif). Dibandingkan dengan agen kontras lainnya, senyawa Gd memiliki keunggulan yang tak tertandingi dalam praktik klinis [17]. Ion Gd, yang merupakan bahan superparamagnetik, memberikan sinyal intensitas tinggi dalam gambar berbobot T1. Gd juga dapat mengikat berbagai zat untuk membentuk kompleks yang stabil dengan resolusi spasial yang tinggi dan rasio signal-to-noise yang tinggi. Namun, setiap jenis agen kontras memiliki keterbatasannya sendiri (yaitu, waktu sirkulasi darah yang pendek dari agen kontras T1 dan artefak kerentanan magnetik dari agen kontras T2) [18,19,20,21]. Senyawa Gd tradisional memiliki keterbatasan sebagai berikut. (1) Kelat Gd tradisional tidak memiliki efek penargetan. (2) Intensitas sinyal zat kontras kelat Gd lebih rendah daripada partikel oksida besi superparamagnetik ultrasmall (USPIO) pada konsentrasi yang sama. Untuk mengatasi masalah di atas, ion Gd dikaitkan dengan struktur makromolekul (seperti liposom, molekul dendritik, dan dekstran) untuk meningkatkan efek relaksasi T1, dan kompleks tersebut kemudian dikaitkan dengan ligan target tumor untuk menyiapkan probe molekuler. dan mencapai pencitraan tumor yang ditargetkan [23]. Dalam penelitian ini, liposom dipilih sebagai molekul pembawa yang menghubungkan agen kontras MR dengan agen kontras fluoresen. Struktur spasial khusus liposom memiliki efek amplifikasi sinyal biologis, dan secara efektif meningkatkan konsentrasi ion Gd di jaringan lokal, sehingga meningkatkan intensitas sinyal MR. Zhou dkk. [24] menggunakan nanopartikel -cyclodextrin-linked polyhedral oligomeric silsesquioxane (POSS) sebagai pembawa untuk menggabungkan senyawa RGD ke Gd untuk berhasil mendapatkan probe molekuler, cRGD-POSS-βCD-(DOTA-Gd), dengan tingkat relaksasi T1 9,50 mM
−1
S
−1
. Kompleks liposom-cRGD-Gd-Cy5 yang diperoleh dalam penelitian ini ditemukan memiliki tingkat relaksasi T1 sebesar 10.515 mM
−1
S
−1
, yang lebih dari dua kali tingkat relaksasi T1 dari agen Gd yang saat ini digunakan secara klinis (Magnevist), dan kompleks ini juga menunjukkan sifat pencitraan MR yang sangat baik.
Nanoprobe yang disiapkan oleh kelompok kami memiliki ukuran yang seragam, penampilan yang teratur, dan dispersibilitas yang baik. Potensi zeta mencerminkan stabilitas probe molekuler, dan nilai positif atau negatif yang lebih tinggi dari potensi zeta dikaitkan dengan sistem yang lebih stabil dan kemungkinan agregasi yang lebih kecil. Secara umum, molekul dengan potensial zeta lebih tinggi dari + 30 mV atau lebih rendah dari 30 mV dianggap memiliki stabilitas yang baik. Potensi zeta pada permukaan partikel probe yang diperoleh dalam penelitian ini adalah + 39.5 ± 1.65 mV, yang sedikit lebih rendah dari + 30 mV. Namun demikian, tidak ada agregasi yang diamati di bawah TEM.
Agen Gd adalah agen kontras MR yang paling banyak digunakan dalam praktik klinis saat ini, dan keamanan hayatinya tidak dapat diabaikan. Guo dkk. [25] menemukan bahwa kompleks Gd yang digabungkan dengan asam hialuronat dendritik adalah mikropartikel yang sangat aman dan efektif sebagai agen kontras MR, dengan sensitivitas tinggi dan keberadaan residu yang rendah dalam tubuh manusia. Melalui studi sitotoksisitas in vitro dari probe molekuler yang dibangun, probe molekuler ini terbukti memiliki sitotoksisitas rendah dan biosafety tinggi untuk sel tumor serta sel non-tumor (sel epitel dan sel endotel vaskular). Kami percaya bahwa liposom memiliki biokompatibilitas yang baik, dan biotoksisitas yang rendah mungkin merupakan keuntungan dari liposom yang mengenkapsulasi ion Gd.
Berdasarkan penelitian sebelumnya [26,27,28], kelompok kami memilih garis sel adenokarsinoma paru A549 dengan ekspresi tinggi integrin vβ3 untuk digunakan dalam kelompok eksperimen, dengan penambahan inovatif sel karsinoma nasofaring SUNE-1-5-8F baris dalam percobaan penargetan sel in vitro; sel epitel payudara dengan hampir tidak ada ekspresi integrin vβ3 dimasukkan sebagai kelompok kontrol negatif. Probe molekuler terikat dengan baik ke membran sel sel adenokarsinoma paru A549 dan sel karsinoma nasofaring SUNE-1-5-8F tetapi tidak mengikat sel MCF-10A, menunjukkan bahwa probe memiliki kemampuan penargetan molekul yang sangat baik, yang dikonfirmasi oleh hasil uji imunofluoresensi. Hasil pencitraan MR lebih lanjut mengkonfirmasi properti penargetan dari probe molekuler liposomal cRGD-Gd-Cy5.5 dalam MR, dengan sinyal intensitas lebih tinggi daripada agen kontras non-target (Gd-Cy5.5) dalam sel tumor. Eksperimen in vivo mengonfirmasi bahwa probe dapat mempertahankan kestabilan dalam serum dan secara terus-menerus menargetkan situs tumor setidaknya selama 6 jam. Hasil dari studi in vitro memastikan studi in vivo berikutnya dari probe molekuler dalam model metastasis karsinoma nasofaring pada tikus telanjang.
Kesimpulan
Ringkasnya, metode persiapan untuk probe mode-ganda cRGD-Gd-Cy5.5 yang menargetkan integrin vβ3 adalah layak, dan probe ini memiliki stabilitas dan keamanan hayati yang diinginkan serta tingkat relaksasi T1 yang tinggi. Penyelidikan menunjukkan efek penargetan yang kuat terhadap sel-sel dengan ekspresi integrin vβ3 yang tinggi, yang meletakkan dasar yang kuat untuk pemantauan dinamis metastasis tumor yang non-invasif, efisien, dan real-time pada tingkat anatomi dan tingkat metabolisme molekul melalui MR/pencitraan molekuler fluoresensi in vivo.
Metode
Sintesis cRGD-Gd-Cy5.5
Ke dalam 20 mL kloroform, 70 mg lesitin, 20 mg kolesterol, dan 210 mg DSPE-PEG2000-NH ditambahkan, dan campuran tersebut ditempatkan dalam pembersih ultrasonik untuk melarutkan zat secara sempurna (seperti yang ditunjukkan oleh larutan bening tanpa zat granular). Solusinya kemudian ditempatkan dalam labu berbentuk buah pir untuk penguapan putar dalam penangas air 60 ° C sampai film seperti sarang lebah (tidak ada residu cair) terbentuk. Gd triklorida heksahidrat (10 mg) ditimbang dengan tepat dan dilarutkan dalam buffer karbonat pada pH 8,5 untuk mendapatkan larutan yang jernih, yang kemudian dicampur dengan film seperti sarang lebah di atas untuk hidrasi pada 50 °C selama 1 jam; langkah ini diikuti oleh dispersi dan penyempurnaan melalui probe ultrasonik dalam prosesor cair ultrasonik (VCX 750, Sonics, USA). Terakhir, campuran dikumpulkan dan dilewatkan melalui filter 0,22 m dan dilakukan ultrafiltrasi dengan tabung ultrafiltrasi 10 kD untuk menghilangkan Gd triklorida bebas dan mendapatkan liposom yang membawa Gd triklorida, yang kemudian disimpan pada suhu 4 °C.
Peptida siklik RGD kemudian digabungkan ke molekul Cy5.5 fluoresen. Peptida siklik RGD (5 mg) dilarutkan dalam 1 mL buffer asam klorida encer pada pH 5,0, dan 1 mg 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimida hidroklorida (EDC) dan 0,5 mg N -hidroksisuksinimida (NHS) ditambahkan dan kemudian diaktifkan pada suhu kamar selama 30 menit dalam osilator pada suhu konstan. Molekul peptida siklik RGD yang diaktifkan kemudian dicampur dengan 100 g molekul fluoresen Cy5.5 dan liposom, dan pH diukur sebagai 8,4 menggunakan kertas uji pH presisi. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu kamar dalam shaker selama 4 jam; langkah ini diikuti dengan penghilangan peptida siklik RGD yang tidak bereaksi dan molekul Cy5.5 fluorescent melalui penggunaan tabung ultrafiltrasi 10-kD.
Karakterisasi Nanopartikel
Ukuran partikel nanopartikel ditentukan oleh TEM (GEOL Tokyo, Jepang). Sejumlah kecil kompleks liposom-cRGD-Gd-Cy5.5 ditambahkan ke air ultra murni (pH = 6.0) untuk pengenceran ke dalam larutan 1 mg/mL. Setetes sampel ditempatkan pada grid tembaga dilapisi dengan menggunakan pipet transfer steril, dan 2% natrium fosfotungstat ditambahkan tetes demi tetes setelah beberapa menit untuk restaining. Larutan pewarnaan negatif yang berlebihan disedot setelah 1-2 menit. Grid tembaga kemudian dikeringkan dan ditempatkan di bawah mikroskop elektron transmisi 80-kV untuk observasi. Sekitar 40 hingga 50 nanopartikel dipilih secara acak untuk mengamati morfologi dan ukuran partikelnya, dan gambar skala 50-nm dan 100-nm disimpan. Ukuran partikel diukur menggunakan perangkat lunak NanoMeasure, dan rata-rata dihitung dari tiga pengukuran berulang.
Sebuah penganalisis ukuran partikel (Malvern, Inggris) digunakan untuk mengukur ukuran hidrodinamik dan potensi zeta nanopartikel. Setetes larutan kompleks liposom-cRGD-Gd-Cy5.5 diencerkan dengan air ultra murni dan kemudian dipindahkan ke tabung Eppendorf, yang ditempatkan dalam pembersih ultrasonik selama 5 menit untuk menyebarkan partikel secara merata. Partikel yang terdispersi dievaluasi oleh DLS dalam penganalisis ukuran partikel nano untuk menentukan ukuran partikel dan potensi zeta.
Sifat optik kompleks cRGD-Gd-Cy5.5 liposomal dicirikan menggunakan pembaca pelat mikro multifungsi (BioTek, USA). Dua mikroliter masing-masing larutan liposom dan liposom-cRGD-Gd-Cy5.5 ditambahkan ke 998 μL buffer fosfat-buffered saline (PBS) dan dicampur dengan baik sebelum ditambahkan ke kuarsa kuvet; penyerapan ultraviolet pada 400–800 nm kemudian diperoleh melalui pembaca pelat mikro multifungsi. Solusi kompleks liposom-cRGD-Gd-Cy5.5 (1,5 mL) dipindahkan ke tabung Eppendorf, dan jumlah yang sama dari larutan liposom kosong digunakan sebagai kontrol kosong. Pencitraan fluoresensi dilakukan menggunakan sistem pencitraan fluoresensi hewan kecil.
Modifikasi gugus amino permukaan pada liposom dikonfirmasi menggunakan spektroskopi FT-IR (Nicolet-5700, USA). Spektrum penyerapan UV-vis diperoleh (UV 2550, Shimadzu, Jepang); konsentrasi 0,1 mg/mL liposomal cRGD-Gd-Cy5.5 digunakan untuk pengukuran.
Pengukuran Kecepatan Relaksasi
Sampel probe fluoresensi liposomal Gd yang dimodifikasi cRGD diencerkan dengan air deionisasi untuk mendapatkan konsentrasi Gd berikut:0,18, 0,1275, 0,085, 0,0425, dan 0,017 mM. Lima mililiter dari setiap sampel yang diencerkan ditempatkan dalam botol dengan tutup ulir, dan botol-botol itu kemudian dipasang pada rak tabung multifungsi sesuai dengan urutan konsentrasi. Sampel probe fluoresen liposomal Gd yang dimodifikasi cRGD menjalani pemindaian MR melalui kumparan kepala dan leher untuk mendapatkan gambar berbobot T1 untuk konsentrasi probe yang berbeda. Urutan pemindaian yang digunakan untuk gambar berbobot T1 adalah urutan pemulihan inversi look-locker yang dimodifikasi (MOLLI), di mana parameternya ditetapkan sebagai berikut:waktu pengulangan (TR) = 5,8 md, waktu gema (TE) = 3,66 md, inversi waktu pemulihan (TI) = 16–3200 md, dan ketebalan pemindaian = 5 mm. Setelah pemindaian selesai, peta pseudo-warna diperoleh. Sebuah 0,3 cm
2
area of interest digambarkan dalam gambar setiap sampel di peta, dan nilai T1 yang sesuai dibaca.
Uji Kultur Sel dan Sitotoksisitas
A549 sel adenokarsinoma paru manusia, sel karsinoma nasofaring manusia SUNE-1-5-8F, sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs), dan sel epitel payudara manusia MCF-10A diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) . Sel dikultur dalam media 1640 lengkap (Euroclone-Lonza) yang mengandung 10% serum janin sapi (Euroclone-Lonza), 100 unit/mL penisilin, 100 g/mL streptomisin, dan 2 mM glutamin di bawah 5% CO2 pada 37 °C.
Metode CCK-8 digunakan untuk menguji sitotoksisitas probe molekuler terhadap sel yang berbeda, termasuk sel epitel normal dan sel tumor. Sel A549, sel 5-8F, HUVEC, dan sel MCF-10A diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 5 × 10
3
sel/sumur dan dikultur semalaman. The adherent cells were then incubated with 100 μL of fresh 1640 medium containing cRGD-Gd-Cy5.5 of various Gd concentrations (0, 50, 100, 200, and 400 μM) for 24 h. Subsequently, the cells were washed three times with PBS and then incubated with 100 μL of Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) containing no fetal bovine serum (FBS). After 10% Cell Counting Kit-8 reagent (Dojindo, Japan) was added to each well, the sample was incubated for 10 h. The absorbance at 450 nm of each well was then measured using an ELISA microplate reader (Multiskan MK3, Thermo Scientific, Logan, UT). Cells treated with PBS only were employed as the control group. For each sample, five parallel wells were analyzed to obtain the mean and standard deviation.
Immunofluorescence Staining and Flow Cytometry Assay of Integrin αvβ3
A total of 20,000 A549, 5-8F, and MCF-10A cells each were seeded in confocal plates (Thermo Scientific) and cultured for approximately 24 h when the cells successfully grew on the slides. The cells were washed three times with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde (Boster) at room temperature for 30 min, and then washed three times (10 min each) in PBS. The cells were then incubated in 3% bovine serum albumin (PBST) for 30 min to block non-specific antibody binding and washed three times with PBS. The fixed cells were incubated with anti-integrin αvβ3 monoclonal antibody (1:500; Abcam, Cambridge, UK) at 4 °C overnight and then incubated with anti-mouse fluorescent secondary antibody (1:500) (Abcam) for 1 h. 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:1000; Sigma) was used to stain the nucleus. A laser confocal scanning microscope (Nikon A1, Tokyo, Japan) was used to detect the green fluorescence signal from integrin αvβ3 and the DAPI signal from nuclei.
The integrin αvβ3 expression levels in different cell lines were quantified using flow cytometry. In brief, three types of cells were collected:A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A, which were washed in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA). After being sealed with the PBS containing 5% BSA, the cells were cultivated in VNR-1 antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA) at density 2 μg/1 × 10
6
and 4 °C for 30 min. The secondary antibody was DyLight 488 goat anti-mouse IgG (H+L) (ab96879), diluted 1/500, and at 22 °C for 30 min. Quantitative assays were conducted on a flow cytometer (Gallios, Beckman Coulter, USA) at excitation wavelength 488 nm and emission wavelength 530 nm. Each time, at least 1 × 10
5
cells (n = 3) were collected.
Binding Assay of the Molecular Probe to Integrin αvβ3
A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A cells were inoculated into confocal plates. The cells were incubated at 37 °C for 1 h with the molecular probe of the same Gd concentration after the cells reached the logarithmic growth phase. The cells were then washed three times in PBS and placed under a laser confocal scanning microscope for observation.
In Vitro MR Imaging and Fluorescence Imaging of Tumor Cells
To verify the tumor cell-targeting ability of the cRGD-modified Gd-loaded liposomal fluorescent probe, the probe was incubated with A549 cells and then examined using MR imaging and a small animal fluorescence imaging system. A549 cells were seeded in six-well plates with 2 mL of 1640 medium containing 10% FBS and 1% penicillin–streptomycin in each well and then incubated at 37 °C and 5% CO2 . In the experimental groups, cRGD-Gd-Cy5.5 was incubated with A549 cells for 2 h with Gd concentrations of 0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, and 0.08 mM. The cells of the control groups were incubated with the non-targeted gadolinium contrast agent (Gd-Cy5.5) for 2 h at the same Gd concentrations as the experimental groups. The cells were then washed with PBS, trypsinized, centrifuged, and finally placed in glass tubes containing 1 mL of PBS (with 0.5% agarose) for MR imaging. Specific imaging parameters were described above. A small animal live imaging system (IVIS Lumina XRMS Series III, MA, USA) was used for fluorescence imaging of the A549 cells.
In Vivo MR and Fluorescence Imaging
To validate whether CRGD-Gd-Cy5.5 had tumor targetability in vivo in animals, we conducted animal experiments following the Guide for Care and Use of Laboratory Animals, released by the Animals Ethics Committee of Laboratory Animal Center, Guangxi Medical University. We successfully established a Balb/c nude mice nasopharyngeal carcinoma subcutaneous xenografting tumor model for magnetic resonance/fluorescent scanning. A 3.0-T MRI scanner containing 40-mm-diameter mouse volume coils (Discovery 750, GE, Germany) was used for T1-weighted imaging, operated at field of view = 80 × 80 mm, repetition time = 742 ms, echo time = 69 ms, and layer thickness = 2.0 mm. The nude mice were divided into two groups (n = 3), including a test group and a receptor-blocked group. All mice were injected via tail vein with CRGD-Gd-Cy5.5 (0.05 mmol Gd/kg). Each mouse was scanned at four time points:before injection, 30 min, 2 h, and 6 h after injection. In the receptor-blocked group, 1 h before injection with CRGD-Gd-Cy5.5, each mouse was injected via the tail vein with free CRGD polypeptide (10 mg) and was MRI-scanned at the same four time points. The fluorescent images were photographed by a fluorescence imaging system (Bruker, USA). The grouping, drug injection, and scanning time points were all the same as described above. During the imaging, the mice (n = 3) were anesthetized using a gas mixture of oxygen and isoflurane. The nude mice were kept at heart rate 60–120/min and respiratory rate at 20–40/min. Finally, direct visual comparison of tumor images was conducted by two experienced radiologists.
