Kemampuan Keamanan Hayati dan Antibakteri Grafena dan Grafena Oksida In Vitro dan In Vivo
Abstrak
Dalam beberapa tahun terakhir, nanopartikel graphene (G) dan graphene oxide (GO) mulai diterapkan dalam modifikasi permukaan implan bedah. Namun, biosafety dan kemampuan antibakteri G dan GO masih belum jelas. Dalam penelitian ini, biosafety G dan GO in vitro dievaluasi dengan kultur bersama dengan sel punca mesenkim sumsum tulang (BMSCs) dan biosafety in vivo diamati dengan menanamkan bahan ke dalam jaringan otot tikus. Hasil biosafety menunjukkan bahwa 10 μg/ml adalah konsentrasi kritis keamanan untuk G dan GO. Ketika konsentrasinya lebih dari 10 μg/ml, sitotoksisitas G dan GO menunjukkan cara yang bergantung pada dosis.
Hasil antibakteri menunjukkan bahwa G menunjukkan kemampuan antibakteri dengan konsentrasi sama dan lebih dari 100 g/ml; GO mempresentasikan kemampuan antibakteri dengan konsentrasi yang sama dan lebih dari 50 μg/ml. Efek antibakteri G dan GO bergantung pada dosis in vitro.
Konsentrasi GO atau G antara 50 dan 100 μg/ml mungkin merupakan kisaran yang lebih baik untuk menjaga keseimbangan sitotoksisitas dan kemampuan antibakteri. Studi kami mengungkapkan bahwa G dan GO memiliki potensi untuk digunakan di klinik dengan biosafety dan sifat antibakteri yang baik dalam rentang konsentrasi tertentu.
Latar Belakang
Dalam beberapa tahun terakhir, implan bedah banyak digunakan untuk mengobati patah tulang dan penyakit lainnya, tetapi implan membutuhkan biosafety dan sifat antibakteri yang baik untuk menghindari penolakan dan infeksi. Faktanya, perawatan ortopedi untuk defek tulang infektif masih menjadi masalah utama. Pada aspek bakteri, Staphylococcus aureus adalah patogen yang paling umum di ortopedi dan implan ortopedi [1]. Karena kelainan tulang dan infeksi [2], pengobatannya sulit dan pasien membutuhkan waktu lama untuk sembuh. Jika luka tidak kunjung sembuh, pengobatan terakhir adalah amputasi anggota tubuh [3, 4].
Perawatan yang baik untuk defek tulang infektif harus memenuhi kontrol infeksi dan rekonstruksi permintaan perbaikan defek tulang secara bersamaan. Dengan perkembangan rekayasa jaringan tulang, semakin banyak aplikasi biomaterial yang digunakan di bidang perawatan ortopedi. Oleh karena itu, tingkat kesembuhan infeksi pada tulang dapat sangat meningkat. Bahan-bahan ini terutama termasuk tulang heterogen [5], bio-keramik [6] (seperti hidroksiapatit [7] dan kalsium fosfat [8]), polimer [9, 10], bahan protein (seperti serat kolagen [11]), dan seterusnya. Di samping bahan-bahan ini, Beatriz Pelaz et al. mengungkapkan pentingnya dan prospek yang menjanjikan dari nanoteknologi dalam implan [12]; di antara nanopartikel ini, graphene dan turunannya adalah bahan baru lainnya untuk memenuhi persyaratan perbaikan tulang.
Grafena adalah dua dimensi, dengan satu atau beberapa lapisan atom karbon dalam struktur sarang lebah [13,14,15]. Ini banyak digunakan dalam material komposit [16, 17], sensor [18, 19], energi [16, 20], dan bidang lainnya karena sifat fisiknya yang sangat baik. Grafena oksida adalah bahan grafena yang difungsikan permukaan yang berada dalam lapisan atom karbon yang terhubung dengan perpanjangan tak terbatas dua dimensi dari gugus aktif permukaan dasar yang mengandung oksigen dan bentuk oksida graphene-nya [21]. Grafena (G) dan turunannya telah menimbulkan perhatian besar di bidang biomedis karena struktur dua dimensinya yang unik, serta sifat fisik dan kimianya yang spesifik [22]. Grafena yang difungsikan dan turunannya memiliki banyak fungsi seperti pemuatan obat [23], antibakteri [24], bioimaging [25, 26], dan terapi kanker [27].
Pada aspek kapasitas antimikroba, Li et al. mengungkapkan bahwa mekanisme antimikroba G terutama disebabkan oleh transfer muatan [28] dan migrasi bakteri. Bakteri dipindahkan ke permukaan lembaran nano yang tajam, yang mengoyak bakteri dengan tepi yang tajam [29]. Selain itu, Tu et al. juga menunjukkan mekanisme antimikroba potensial lain yang G dapat menembus ke dalam sel, yang mengarah ke ekstraksi sejumlah besar fosfolipid dari membran sel [30]. Dengan demikian, G dan graphene oxide (GO) memiliki bioaktivitas dan kapasitas antimikroba, yang memenuhi persyaratan untuk memenuhi syarat sebagai bahan perbaikan tulang.
Namun, dengan produksi dan aplikasi skala besar, masalah keamanan hayati graphene sangat penting. Pekerja mungkin menderita paparan nanopartikel (NP) melalui berbagai media termasuk inhalasi, kontak kulit, dan jalur gastroenterik. Andrea Prodi dkk. menyarankan pendekatan bertahap untuk menilai paparan NP untuk perlindungan lebih lanjut [31]. Kecuali untuk penilaian, keamanan hayati dan biokompatibilitas adalah poin kunci penelitian lainnya. Kan Wang dkk. menunjukkan biokompatibilitas GO, yang menunjukkan toksisitas pada sel fibroblas manusia ketika dosisnya kurang dari 20 g/ml tetapi menunjukkan sitotoksisitas yang jelas ketika dosis lebih dari 50 g/ml, dengan penurunan adhesi sel yang signifikan [32]. Saat ini, pandangan yang lebih konsisten menegaskan bahwa G dan GO memiliki efek toksik pada bakteri tetapi bertentangan dengan efek toksik pada sel [33,34,35,36]. Fungsi dan toksisitas G dan GO masih membutuhkan studi yang lebih spesifik. Beatriz Pelaz dkk. mengangkat pertanyaan, "bagaimana mengurangi risiko dan meningkatkan manfaat sangat penting untuk pengembangan nanomedicines yang aman dan efektif," yang mengingatkan dan mendesak penelitian terhadap kombinasi potensi risiko G dan GO dan kemampuan antibakteri in vivo dan in vitro [12] .
Sel punca mesenkim sumsum tulang (BMSCs) adalah sel punca dewasa multipoten. Mereka telah menjadi sumber sel penting untuk memperbaiki cacat tulang dalam rekayasa jaringan [37, 38]. Selain itu, interaksi antara graphene dan turunannya serta sel punca masih kurang penelitian [39, 40].
Oleh karena itu, penelitian ini meneliti pengaruh G dan GO pada jaringan otot tikus BMSC in vitro, Staphylococcus aureus , bertujuan untuk menyelidiki sitotoksisitas dan kemampuan antibakteri G dan GO in vivo dan in vitro dan untuk mempromosikan penelitian nanomaterial karbon dan nanotoksisitas.
Hasil
Sitotoksisitas G dan GO
Sitotoksisitas G dan GO In Vitro
Di bawah mikroskop elektron, nanopartikel G atau GO menunjukkan bentuk yang tidak beraturan dengan ukuran 30,41 ± 5,59 nm, dan dapat ditemukan aglomerasi partikel (Gbr. 1a, b). Setelah kultur 7 hari, morfologi sel berubah menjadi bentuk gelendong (Gbr. 1c). Nodul kalsium terbentuk setelah kultur dengan media diferensiasi osteogenik (Gbr. 1d). Akumulasi minyak terbentuk setelah diferensiasi adipogenik (Gbr. 1e).
Sitotoksisitas G dan GO (a , b). Gambar TEM dari G (a ) dan GO (b ) menunjukkan jaringan nano yang terbentuk. c Sitomorfologi BMSC. d Alizarin red untuk pengendapan kalsium. e Minyak merah O untuk lipid. f Aktivitas sel setelah perawatan G dan GO, *P <0,01 dengan grup kontrol,
#P <0,01 dengan grup kontrol,
○P <0,05 dengan grup G 50 g/ml,
☆, , P <0,01 dengan konsentrasi yang sama dari kelompok G. r 2 (G) =0,843, r 2 (PERGI) =0,939. Bilah skala a , b 200 nm, c , d 100 m, e 50 m. r , koefisien korelasi
Ketika konsentrasi lebih tinggi dari 10 g/ml, G atau GO menghambat pertumbuhan BMSC. Sitotoksisitas tertinggi pada kelompok 1000 g/ml dan menunjukkan cara yang bergantung pada dosis. Ketika konsentrasi lebih tinggi dari 10 g/ml, sitotoksisitas kelompok GO lebih tinggi daripada kelompok G pada konsentrasi yang sama. Perbedaannya lebih signifikan dengan peningkatan konsentrasi (Gbr. 1f).
Di bawah pengamatan SEM, ketika konsentrasi G atau GO adalah 10 g/ml, BMSC dalam kondisi baik dengan adhesi dan bentuk yang baik. Ketika konsentrasi G lebih dari 50 g/ml, sel-sel ditemukan berubah termasuk ukuran mengecil, sekresi permukaan meningkat, dan perluasan mikrovili permukaan sel. Ketika konsentrasi GO lebih dari 50 g/ml, BMSC ditemukan menyusut dan berubah bentuk dan sebagian besar sel mati. Hasil ini menunjukkan bahwa GO memiliki sitotoksisitas yang lebih tinggi terhadap BMSC dibandingkan dengan G di bawah konsentrasi yang sama (Gbr. 2).
Gambar SEM dari kultur bersama G, GO, dan BMSC. a Kelompok G, 10 g/ml. Sel-sel dalam kondisi baik. b Kelompok G, 50 g/ml. Ukuran sel mengecil, sekresi permukaan meningkat, dan mikrovili pada permukaan sel menjadi panjang. c Grup GO, 50 g/ml. BMSC menyusut dan berubah bentuk. G graphene, GO graphene oxide, B BMSC
Di bawah pengamatan TEM, kami menemukan G atau GO bisa masuk ke BMSC dan disimpan di internal sel. Dan ketika konsentrasi lebih dari 50 g/ml, perubahan lingkungan mikro seluler termasuk gangguan struktur sel, dan kekacauan mikrovili ditemukan, menunjukkan sitotoksisitas GO yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok G (Gbr. 3).
Gambar TEM dari kultur bersama G, GO, dan BMSC. a grup G. b grup PERGI. Baik G dan GO dapat menyebabkan gangguan struktur sel dan kekacauan mikrovili pada permukaan sel; GO menyebabkan perubahan lingkungan mikro seluler sitotoksisitas tinggi
Berdasarkan hasil pengamatan SEM dan TEM, kami menemukan bahwa 10 g/ml adalah konsentrasi kritis keamanan untuk G dan GO. Ketika konsentrasi GO lebih dari 10 g/ml, GO memiliki sitotoksisitas yang lebih tinggi terhadap BMSC dibandingkan dengan G.
Sitotoksisitas G dan GO Di Vivo
Untuk menganalisis sitotoksisitas G dan GO in vivo, kami memilih jaringan kerangka untuk mewakili dan mensimulasikan keadaan transplantasi lokal dalam ortopedi. Hasil pewarnaan HE jaringan skelet pada kelompok kontrol dan kelompok G menunjukkan struktur normal dengan miofibril otot sejajar sumbu vertikal. Pada potongan melintang, potongan myofibrillar ditampilkan sebagai bintik-bintik tipis dan nukleus terletak di tepi sel. Perubahan yang disebutkan di atas juga dapat ditemukan pada sel kerangka normal, yang menunjukkan bahwa G memiliki sedikit toksisitas terhadap jaringan otot.
Sebaliknya, pada kelompok GO, garis melintang serat otot di bagian longitudinal retak dan tidak jelas, menunjukkan atrofi dan nekrosis otot. Jadi, GO memiliki toksisitas yang lebih tinggi terhadap hewan (Gbr. 4).
Bagian jaringan diwarnai dengan pewarnaan HE. a Kontrol mewakili jaringan yang tidak terluka. b grup G. Sel-sel kerangka hadir sebagai strip lurus. Miofibril otot sejajar sepanjang sumbu panjang, garis melintang jelas, dan penampang blok tidak beraturan. Bagian myofibrillar muncul sebagai bintik-bintik tipis; nukleus terletak di tepi. c grup PERGI. Garis melintang serat otot pada potongan memanjang tampak retak dan tidak jelas
Properti Antibakteri G dan GO
Kemampuan Antibakteri In Vitro
Dalam percobaan bakteriostasis in vitro, intensitas foton dari ROI G atau GO menunjukkan cara yang bergantung pada dosis. Dan intensitas foton menurun seiring dengan peningkatan konsentrasi. Jika dibandingkan dengan grup G pada konsentrasi yang sama, grup GO memiliki intensitas foton yang lebih rendah (Gbr. 5).
Pemantauan intensitas bioluminesensi S . aureus in vitro. G dan GO menunjukkan cara yang bergantung pada dosis dalam kemampuan antibakteri in vitro. a Bioluminesensi Xen-29 dicitrakan secara in vitro setelah inkubasi 0, 8, dan 24 jam pada 37 °C, dengan variasi warna yang mewakili intensitas cahaya (Bin M(8), FOV12, f1, 15 s). b PI =0 jam, r 2 (GO-0 j) =0,924. c PI =8 jam, r 2 (G-8 j) =0,584, r 2 (GO-8 jam) =0,960. d PI =24 jam, r 2 (G-24 j) =0,616, r 2 (GO-24 jam) =0,943.*P <0,01 dengan grup kontrol,
#P <0,01 dengan grup kontrol,
☆, , , P <0,01 dengan konsentrasi yang sama dari kelompok G. r , koefisien korelasi
Pada 0, 8, dan 24 jam, pada konsentrasi G 100, 500, dan 1000 g/ml, G menunjukkan daya hambat terhadap pertumbuhan Xen-29 dibandingkan dengan kelompok kontrol. Namun, intensitas foton pada kelompok 10 dan 50 g/ml tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Ketika konsentrasi GO 50, 100, 500, dan 1000 g/ml, pada 0, 8, dan 24 jam, GO menunjukkan efek penghambatan pertumbuhan terhadap Xen-29. Demikian pula, intensitas foton pada kelompok 10 dan 50 g/ml tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa G menunjukkan kemampuan antibakteri dengan konsentrasi lebih dari 100 g/ml, dan GO menunjukkan kemampuan antibakteri dengan konsentrasi lebih dari 50 g/ml. Kemampuan antibakteri G atau GO bergantung pada dosis. GO memiliki kemampuan antibakteri yang lebih kuat dibandingkan dengan G pada konsentrasi yang sama.
Kemampuan Antibakteri Pada Vivo
Dalam percobaan bakteriostasis in vivo, kelompok GO menunjukkan nilai intensitas foton (PI) yang lebih rendah secara signifikan pada 0 dan 24 jam. Nilai PI mengalami penurunan dibandingkan dengan kelompok G dan kelompok kontrol. Namun, nilai PI kelompok G secara statistik tidak berbeda secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gbr. 6). Hasil menunjukkan bahwa GO menunjukkan kemampuan antibakteri yang kuat tetapi G tidak menunjukkan kemampuan antibakteri yang jelas secara in vivo pada konsentrasi 100 g/ml.
Pemantauan intensitas bioluminesensi S . aureus dalam hidup. GO menunjukkan cara yang bergantung pada dosis dalam kemampuan antibakteri in vivo. a Bioluminesensi Xen-29 dicitrakan in vivo setelah 0 dan 24 jam inkubasi, dengan variasi warna yang mewakili intensitas cahaya (Bin M(8), FOV12, f1, 60 s). b PI =0 jam,
#P <0,01 dengan kelompok kontrol. c PI =24 jam,
#P <0,01 dengan grup kontrol
Diskusi
Dengan perkembangan rekayasa jaringan, semakin banyak aplikasi biomaterial yang digunakan di bidang perawatan ortopedi [41]. Keamanan hayati yang baik diperlukan untuk biomaterial. G dan GO telah digunakan secara luas di bidang medis karena keamanan dan sifat fisik dan kimianya yang unik. Pada aspek kemampuan antibakteri, G dan GO merupakan zat antibakteri yang baik. Mekanisme antibakteri utama adalah transfer muatan [28, 29] dan penetrasi ke dalam sel [30]. Dengan demikian, kemampuan antibakteri G dan GO dapat memenuhi persyaratan bahan perbaikan tulang di bawah kisaran aman.
Dalam penelitian ini, untuk mengidentifikasi sifat keamanan hayati, kami mengamati efek sitotoksik G dan GO terhadap BMSC melalui SEM dan TEM, dan efek ini disajikan sebagai cara yang bergantung pada dosis. Selain itu, GO memiliki efek sitotoksik yang lebih tinggi. Pada aspek sifat antibakteri, kami selanjutnya mengamati bahwa G dan GO memiliki sifat antibakteri sebagai cara yang bergantung pada dosis, dan efek GO secara signifikan lebih baik daripada G in vivo. Kesimpulannya, konsentrasi dalam kisaran 50~100 g/ml mungkin lebih baik untuk menjaga keseimbangan efek sitotoksik minor dan kemampuan antibakteri utama.
Penelitian ini menunjukkan bahwa baik G dan GO menghadirkan efek sitotoksik terhadap BMSC dan sel kerangka dan toksisitas GO lebih tinggi daripada G. Sejumlah besar penelitian telah menunjukkan toksisitas sel nano G dan sifat fisik dan kimia materialnya (seperti ukuran, bentuk, dan gugus fungsi permukaan) menuju sel [35, 42, 43]. Selain itu, peneliti menemukan bahwa pristine G dapat menginduksi sitotoksisitas melalui penipisan potensial membran mitokondria (MMP) dan peningkatan spesies oksigen reaktif intraseluler (ROS) [12], sehingga memicu apoptosis dengan aktivasi jalur mitokondria [34, 44] . Tetapi fenomena bahwa sitotoksisitas GO lebih tinggi dari G mungkin terkait dengan gugus yang terkandung di permukaan GO [45]. Para peneliti telah menemukan bahwa sitotoksisitas GO berhubungan langsung dengan kandungan serum. Hu W dkk. menunjukkan bahwa GO memiliki kapasitas adsorpsi yang kuat yang dapat menyerap protein serum untuk membentuk inklusi protein [46], menunjukkan dasar sitotoksik GO yang lebih tinggi dibandingkan dengan G. Eksperimen kami mengkonfirmasi kesimpulan yang disebutkan di atas. Selain itu, toksisitas hewan merupakan indikator penting lain dari evaluasi keamanan biologis G dan GO. Dalam penelitian ini, respon patologis yang serius pada jaringan otot ditemukan pada kelompok GO, menunjukkan toksisitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok G.
Kedua, sifat antibakteri sejalan dengan perubahan dosis G dan GO; Konsentrasi GO 50~100 g/ml dapat menyeimbangkan toksisitas biologis dan kemampuan antibakteri dengan lebih baik. Studi kami menunjukkan bahwa toksisitas biologis dan kemampuan antibakteri hadir sebagai cara yang bergantung pada dosis. Oleh karena itu, beberapa rentang konsentrasi dapat menjaga keseimbangan toksisitas biologis minor dan kemampuan antibakteri utama.
Hasil menunjukkan bahwa baik G dan GO memiliki beberapa toksisitas biologis terhadap BMSC dan jaringan otot, tetapi pada kelompok GO, kemampuan antibakterinya signifikan secara in vivo. Berdasarkan hasil toksisitas G dan GO sebelumnya, kami menemukan bahwa konsentrasi 50~100 g/ml mungkin lebih baik untuk menjaga keseimbangan toksisitas biologis minor dan kemampuan antibakteri utama, sehingga memberikan bukti baru terhadap keamanan hayati dan antibakteri. kemampuan G dan GO in vivo dan in vitro dalam pekerjaan klinis.
Meskipun GO memiliki banyak efek toksik, toksisitas dapat dihindari dengan modifikasi GO [47, 48]. Pada saat yang sama, bahan GO yang dimodifikasi dapat terdegradasi dan dibersihkan di dalam tubuh [49]; Oleh karena itu, arah penelitian baru dari modifikasi untuk GO didesak. Selain itu, efek G dan GO terhadap organ atau jaringan penting lainnya masih memerlukan penelitian lebih lanjut untuk mencapai pengobatan holisme. Sementara itu, apakah GO menyebabkan kerusakan stres oksidatif pada bakteri dan adanya mekanisme antibakteri tambahan perlu dipelajari lebih lanjut. Sebelum penerapannya pada rekayasa jaringan, mekanisme toksisitas G dan GO serta cara-cara yang dimodifikasi untuk mengurangi toksisitas masih memerlukan klarifikasi lebih lanjut.
Metode
Hewan
Tikus jantan Sprague-Dawley (SD) dan tikus Balb/C jantan dibeli dari Institut Pasteur Iran dan dipelihara dalam kondisi terang/gelap 12 jam pada suhu 25 °C. Tikus SD pada usia 4 minggu digunakan untuk isolasi BMSC. Tikus Balb / C digunakan untuk percobaan hewan in vivo. Semua hewan dibesarkan di Pusat Hewan Laboratorium Universitas Kedokteran Militer Keempat, dan operasinya mengikuti Standar Bedah Eksperimental Hewan dari Rumah Sakit Xijing. Semua eksperimen hewan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional dari Universitas Kedokteran Militer Keempat.
Grafena dan Grafena Oksida
G atau GO (lapisan 1-2) (Hengqiu Graphene Technology, China) masing-masing ditambahkan ke dalam etanol absolut (digunakan untuk uji mikroskop elektron transmisi, TEM), buffer PBS (digunakan untuk percobaan sel in vitro), dan larutan garam (digunakan untuk percobaan hewan in vivo) untuk menyiapkan larutan G atau GO (hasil pengujian spektroskopi Raman disediakan oleh Hengqiu Graphene Technology). Konsentrasi awal larutan G atau GO adalah 1 mg/ml. Larutan G atau GO didispersikan menggunakan ultrasonik 2 jam sebelum percobaan.
Sitotoksisitas
Budaya Sel
Media kultur sel mengandung 10% serum janin sapi (Gibco, Carlsbad, California, USA), DMEM/F12 (Corning, NY, USA), 100 U/ml penisilin, dan 100 U/ml streptomisin (Sigma, St. Louis, Missouri, AS). BMSC diekstraksi dari tikus jantan berumur 4 minggu dengan metode kultur sumsum tulang [50]. Setelah eksekusi tikus, femur dan tibia dikeluarkan dalam kondisi aseptik. Rongga meduler dicuci dengan media kultur sel; kemudian, campuran disentrifugasi di bawah 1500 rpm selama 10 menit untuk mengumpulkan sumsum tulang. Sumsum tulang disuspensikan kembali dengan media kultur sel dan diinokulasi dalam botol kultur sel berlapis gelatin pada suhu 37 ° C dan inkubator sel karbon dioksida 5%. Medium dalam botol kultur sel diganti setelah 48 jam dan sel-sel yang tidak patuh dibuang; kemudian, media kultur diganti setiap 48 jam. Sel bagian ketiga hingga kelima digunakan untuk eksperimen berikutnya.
Diferensiasi osteogenik dan diferensiasi adipogenik pada BMSC dilakukan dengan media diferensiasi (Cyagen, CA, USA). Setelah induksi diferensiasi 2 minggu, sel difiksasi dengan larutan formaldehida 4% selama 30 menit; kemudian dilakukan pewarnaan alizarin red untuk diferensiasi osteogenik dan pewarnaan oil red untuk diferensiasi adipogenik.
Aktivitas Sel
Konsentrasi suspensi BMSC disesuaikan menjadi 5 × l0
4
/l dan sel dikultur dalam pelat 96 lubang dengan 100 l di setiap lubang. Setelah 24 jam, media diganti dengan media kultur sel yang mengandung G atau GO dengan konsentrasi 0 (sebagai kelompok kontrol), 10, 50, 100, 500, dan 1000 g/ml. Setelah kultur 24 jam, 10 l alamarBlue (Bio-rad, Hercules, CA, USA) ditambahkan ke setiap lubang untuk kultur 4 jam lebih lanjut. Microplate (Bio-rad, Hercules, CA, USA) digunakan untuk mendeteksi nilai OD (optical density) pada 570 dan 600 nm, dan kemudian, kalkulator kolorimetri alamarBlue® (Bio-rad, Hercules, California, USA) digunakan untuk mengevaluasi tingkat proliferasi sel.
Karakterisasi Menggunakan SEM
BMSC diunggulkan dalam pelat kaca tipis 24 lubang dengan ketebalan 0,17 mm dan diameter 14 mm. Setelah kultur 24 jam, media diganti dengan media kultur sel yang mengandung G atau GO dengan konsentrasi 0 (sebagai kelompok kontrol), 10, 50, 100, 500, dan 1000 g/ml. Sel dilanjutkan dengan kultur selama 24 jam dan supernatan dibuang setelahnya. Sel difiksasi dengan larutan glutaraldehid 2,5% selama 24 jam. Kemudian, sel diamati dengan memindai mikroskop elektron (Hitachi S-4800 SEM, JPN) setelah dehidrasi dan penyepuhan.
Karakterisasi Menggunakan TEM
Suspensi G dan GO disesuaikan menjadi 50 g/ml. Sel dikultur bersama dengan G atau GO selama 24 jam dan kemudian dicerna oleh tripsin 0,25%. Supernatan dibuang setelah disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Sel difiksasi dengan larutan glutaraldehid 2,5% selama 24 jam dan irisan diamati dengan mikroskop elektron transmisi (FEI Tecnai G2 TEM, USA).
Toksisitas dan Identifikasi Jaringan Otot
Untuk menganalisis sitotoksisitas G dan GO in vivo, kami memilih jaringan kerangka untuk mewakili dan mensimulasikan keadaan transplantasi lokal dalam ortopedi. G atau GO masing-masing disuntikkan ke dalam jaringan otot femoralis medial tikus Balb/C. Tikus dibunuh setelah 7 hari, dan jaringan otot yang disuntik dengan G atau GO difiksasi dengan larutan formaldehida netral 10% selama 24 jam. Setelah dehidrasi alkohol, jaringan dibungkus dengan parafin dan diiris untuk dilakukan pewarnaan hematoxylin dan eosin (HE). Irisan diamati di bawah mikroskop terbalik (mikroskop terbalik Leica DMI6000B, RBT).
Kemampuan Antibakteri
Kultur Bakteri
Kami memilih Xen-29 untuk dikultur untuk reaksi luminescentnya. Xen-29 adalah bakteri bioluminescent Staphylococcus aureus (Caliper, LS, USA) berasal dari ATCC-12600. Bakteri dikultur dalam media Luria Bertani (LB, Sigma, St. Louis, MO, USA) yang mengandung 200 g/ml kanamisin (Sigma, St. Louis, MO, USA) pada suhu 37 °C. Koloni tunggal diambil dalam kaldu LB pada suhu 37 ° C dengan pengocokan selama 2-3 jam dengan kecepatan 200 rpm. Ketika absorbansi pada 600 nm mencapai 0,5 (kira-kira setara dengan 1,44 × 108 cfu/ml) dibandingkan dengan absorbansi dalam blanko kaldu LB, bakteri digunakan untuk percobaan berikutnya.
Pencitraan Bioluminescent
Untuk menyajikan pencitraan bioluminescent, kami menggunakan sistem pencitraan makroskopik optik CCD berpendingin IVIS Lumina II (Caliper, LS, USA). Sinyal bioluminescent bakteri diubah menjadi intensitas foton (PI). Perangkat lunak Living Image® 4.2 (Caliper, LS, USA) digunakan untuk kuantifikasi PI di region of interest (ROI). Untuk mencegah pergerakan tikus dalam proses pencitraan, tikus dibius untuk menghindari ketidakstabilan sinyal yang diterima.
Kemampuan Antibakteri In Vitro
Xen-29 ditambahkan ke dalam plat 24 lubang dan konsentrasi di setiap lubang adalah 10
7
cfu. Kemudian ditambahkan suspensi G atau GO untuk mengatur konsentrasi menjadi 0 (kontrol), 10, 50, 100, 500, dan 1000 g/ml. Volume konstan di setiap lubang adalah 500 l. Untuk menganalisis kemampuan antibakteri G dan GO, PI bakteri dalam ROI diukur secara berurutan pada 0, 8, dan 24 jam setelah intervensi.
Kemampuan Antibakteri Pada Vivo
Berdasarkan hasil percobaan di atas, dipilih kelompok 100 g/ml untuk mengidentifikasi kemampuan antibakteri. Suspensi Xen-29 (200 l) disuntikkan ke dalam jaringan otot femoralis medial mencit Balb/C. PI ROI terdeteksi pada 0 dan 24 jam setelah operasi.
Analisis Data
Semua data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). t Student siswa Uji ini digunakan untuk perbandingan antara G dan GO dengan konsentrasi yang sama. Analisis varians satu arah (ANOVA) digunakan untuk membandingkan perbedaan antara G dan GO dengan konsentrasi yang berbeda masing-masing. P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Kesimpulan
Kesimpulannya, G dan GO memiliki beberapa efek sitotoksik biologis dengan cara yang bergantung pada dosis. G dan GO memiliki sifat antibakteri dan berfungsi sebagai cara yang tergantung dosis juga; sifat antibakteri GO secara signifikan lebih baik daripada G in vivo. Konsentrasi 50~100 g/ml mungkin lebih baik untuk menjaga keseimbangan toksisitas biologis minor dan kemampuan antibakteri mayor. Selain itu, modifikasi GO untuk mengurangi toksisitas perlu diklarifikasi untuk berkontribusi pada aplikasi G dan GO dalam pengobatan nano.
