Penilaian Biosafety dan Efektivitas Antibakteri Grafen dan Oksida Grafen untuk Aplikasi Implan Orthopedic
Abstrak
Grafen (G) dan oksida grafen (GO) nanopartikel muncul sebagai modifikasi yang menjanjikan untuk permukaan implan orthopedic, namun profil keamanan dan antimikroba mereka belum sepenuhnya ditetapkan. Kami mengevaluasi sitotoksisitas in vitro pada sel akar mesenchymal tulang (BMSC) dan biocompatibilitas in vivo dengan implantasi intramuskular pada tikus. Hasil mengidentifikasi 10 µg/mL sebagai ambang di bawahnya G dan GO menunjukkan sitotoksisitas minimal. Konsentrasi di atas nilai ini menginduksi kematian sel yang bergantung pada dosis, dengan GO lebih toksik daripada G. Uji antimikroba terhadap Staphylococcus aureus mengungkapkan bahwa G hanya menghambat pertumbuhan bakteri pada ≥100 µg/mL, sedangkan GO menunjukkan aktivitas antibakteri yang signifikan pada ≥50 µg/mL. Rentang 50–100 µg/mL tampak optimal, menyeimbangkan sitotoksisitas rendah dengan efektivitas antibakteri yang kuat, mendukung translasi klinis dalam jendela dosis ini.
Latar Belakang
Implan orthopedic harus menggabungkan biosafety yang baik dengan kontrol infeksi yang efektif, terutama terhadap S. aureus, patogen paling sering dalam infeksi terkait implan. Terapi konvensional sering kali gagal, yang mengarah pada penyembuhan yang lama atau amputasi. Nanoteknologi menawarkan jalan baru; grafen dan turunannya, dengan jaringan karbon dua dimensi, memiliki properti mekanik, listrik, dan kimia unik yang dapat dimanfaatkan untuk regenerasi tulang dan aksi antibakteri.
Tepi yang tajam grafen dapat secara fisik mengganggu membran bakteri, sementara mekanisme transfer muatan lebih menekan proliferasi bakteri. GO, yang fungsional dengan grup oksigen, meningkatkan dispersi dan dapat berfungsi sebagai pengantar obat, agen imaging, atau permukaan antimikroba. Namun, struktur nanosama yang memberikan manfaat terapeutis dapat juga menimbulkan toksisitas seluler, terutama pada dosis yang lebih tinggi atau karena pembentukan protein corona.
Studi sebelumnya telah melaporkan ambang sitotoksisitas yang bertentangan untuk G dan GO. Sementara beberapa data menunjukkan G relatif tidak berbahaya, GO sering menunjukkan toksisitas yang lebih tinggi terhadap sel mamalia, potensial karena kimia permukaannya. Memperjelas hubungan dosis-respons ini adalah penting untuk penerapan klinis yang aman.
Hasil
Sitotoksisitas In Vitro G dan GO
Mikroskopi elektron transmisi mengungkapkan flakes G dan GO yang tidak beraturan dengan rata-rata 30 ± 5,6 nm, dengan aglomenasi sesekali (Gambar 1a–b). Setelah 7 hari budaya bersama, BMSC mempertahankan morfologi fusiform; diferenciasi osteogenik dan adipogenik mengonfirmasi multipotensi (Gambar 1c–e).
Sitotoksisitas G dan GO: gambar TEM G (a) dan GO (b) menunjukkan jaringan nano; morfologi BMSC (c); penumpukan kalsium (d); akumulasi lipid (e); keberadaan sel setelah paparan pada berbagai konsentrasi (f). Signifikansi statistik: * p < 0,01 vs. kontrol; # p < 0,01 vs. 10 µg/mL G; ○ p < 0,05 vs. 50 µg/mL G; ☆, □, △ p < 0,01 vs. konsentrasi yang sama G. Koefisien korelasi: r² (G) = 0,843; r² (GO) = 0,939.
Keberadaan sel menurun secara bergantung pada dosis ketika konsentrasi melebihi 10 µg/mL. GO menunjukkan sitotoksisitas yang lebih besar daripada G pada dosis yang sama, dengan kesenjangan yang semakin lebar pada konsentrasi yang lebih tinggi (Gambar 1f). Mikroskopi elektron pencitraan mengonfirmasi temuan ini: pada 10 µg/mL, BMSC menempel dan menyebar secara normal; pada 50 µg/mL G, sel menyusut dan menunjukkan sekresi permukaan yang meningkat; pada 50 µg/mL GO, sel sangat berubah bentuk dan sebagian besar tidak viable (Gambar 2).
Gambar SEM BMSC dengan G dan GO. (a) G 10 µg/mL – sel sehat; (b) G 50 µg/mL – ukuran terkurang, mikrovilus yang panjang; (c) GO 50 µg/mL – sel menyusut dan berubah bentuk.
Mikroskopi elektron transmisi mengonfirmasi internalisasi baik G maupun GO. Pada konsentrasi di atas 50 µg/mL, GO menginduksi gangguan intrakelular yang jelas, termasuk organel yang tidak teratur dan kehilangan mikrovilus (Gambar 3).
Gambar TEM BMSC dengan G dan GO. (a) G – gangguan struktural sedang; (b) GO – perubahan sitotoksik yang luas.
Secara keseluruhan, 10 µg/mL diidentifikasi sebagai ambang keamanan kritis; GO menunjukkan toksisitas seluler yang lebih tinggi di atas tingkat ini.
Sitotoksisitas In Vivo
Jaringan otot yang ditanam dengan G mempertahankan arsitektur normal, dengan miofibril paralel dan inti yang utuh (Gambar 4a–b). Sebaliknya, jaringan yang dirawat GO menunjukkan garis melintang yang retak dan tanda atrofi serta nekrosis, yang menunjukkan toksisitas in vivo yang lebih tinggi (Gambar 4c).
Biris otot yang diwarnai H&E: (a) kontrol – serat utuh; (b) G – struktur terawat; (c) GO – serat terganggu dan nekrosis.
Properti Antibakteri
In Vitro
Pencitraan bioluminesensi Staphylococcus aureus (Xen-29) menunjukkan inhibisi yang bergantung pada dosis oleh baik G maupun GO. G membutuhkan ≥100 µg/mL untuk penurunan yang signifikan; GO mencapai inhibisi pada ≥50 µg/mL. Kurva intensitas foton (PI) mengonfirmasi aksi antibakteri yang lebih kuat GO (Gambar 5).
Intensitas foton Xen-29 in vitro: (a) derajat waktu; (b–d) korelasi statistik. Markers signifikansi: * p < 0,01 vs. kontrol; # p < 0,01 vs. kontrol; ☆, □, △, ○ p < 0,01 vs. konsentrasi yang sama G.
In Vivo
Dalam otot tikus, GO pada 100 µg/mL menghasilkan PI yang jauh lebih rendah pada 0 dan 24 jam, sedangkan G tidak berbeda secara signifikan dari kontrol (Gambar 6). Jadi, GO mempertahankan efektivitas antibakteri yang kuat in vivo, sementara efek G tidak signifikan pada dosis ini.
Intensitas foton in vivo: (a) derajat waktu; (b–c) PI pada 0 dan 24 jam. Signifikansi: # p < 0,01 vs. kontrol.
Diskusi
Studi ini mengonfirmasi bahwa baik G maupun GO menunjukkan sitotoksisitas yang bergantung pada dosis terhadap BMSC dan otot kerangka, dengan GO konsisten lebih toksik. Aktivitas antibakteri juga mengikuti respons dosis, dengan GO mengalahkan G baik in vitro maupun in vivo. Rentang 50–100 µg/mL tampak menyeimbangkan sitotoksisitas minimal dengan aksi antibakteri yang signifikan, menjadikannya rentang sasaran yang menjanjikan untuk modifikasi permukaan implan.
Wawasan mekanisme menyiratkan bahwa tepi tajam dan properti transfer muatan G mengganggu membran bakteri, sementara grup oksigen permukaan GO memfasilitasi interaksi yang lebih kuat dengan sel mikroba dan mungkin menginduksi produksi spesies reaktif oksigen. Toksisitas mamalia yang lebih tinggi GO mungkin berasal dari pembentukan protein corona dan stres oksidatif, menekankan kebutuhan akan modifikasi permukaan yang mengurangi efek samping tanpa mengurangi fungsi antimikroba.
Pekerjaan masa depan harus mengeksplorasi fungsionalisasi GO untuk mengurangi sitotoksisitas, mengevaluasi biodegradasi jangka panjang, dan mengevaluasi efek pada jaringan lainnya. Memahami hubungan antara atribut fisikokimia dan respons biologis akan sangat penting untuk memajukan nanomedisin berbasis G dan GO.
Metode
Hewan
Tikus Sprague-Dawley jantan (4 minggu) menyediakan BMSC; tikus Balb/C jantan digunakan untuk studi implantasi. Semua prosedur mematuhi pedoman perawatan hewan institusi.
Persiapan Grafen dan Oksida Grafen
G dan GO komersial (1–2 lapis) dicampur dalam etanol, PBS, atau salin, lalu disonikasi selama 2 jam untuk mencapai larutan stok 1 mg/mL.
Budidaya Sel dan Uji Sitotoksisitas
BMSC diperluas ke jalan 3–5, kemudian diekspos ke 0, 10, 50, 100, 500, atau 1000 µg/mL G atau GO selama 24 jam. Uji AlamarBlue® mengukur aktivitas metabolik; SEM dan TEM memberikan wawasan morfologis.
Implantasi In Vivo
G atau GO (10 µg/mL) diinjeksi ke otot femur medial tikus; jaringan dipanen setelah 7 hari untuk pewarnaan H&E.
Pengujian Antibakteri
S. aureus bioluminescens (Xen-29) dibudidayakan pada 10⁷ cfu/mL dan dirawat bersama dengan G atau GO pada rentang konsentrasi yang sama. Intensitas foton dicatat pada 0, 8, dan 24 jam (in vitro) dan pada 0 dan 24 jam (in vivo) menggunakan sistem IVIS Lumina II.
Analisis Data
Hasil disajikan sebagai rata-rata ± standar deviasi. Uji t Student dan ANOVA satu arah mengevaluasi signifikansi statistik; p < 0,05 dianggap signifikan.
Kesimpulan
Grafen dan oksida grafen keduanya menunjukkan efek sitotoksisitas dan antibakteri yang bergantung pada dosis. Potensi antibakteri GO yang lebih baik pada 50–100 µg/mL, bersama dengan toksisitas yang dapat diatasi, memosisikannya sebagai kandidat kuat untuk lapisan implan orthopedic, asalkan modifikasi permukaan dapat lebih mengurangi respons advers seluler.
