Sintesis dan Kinerja In Vitro Nanopartikel Besi–Platinum Berlapis Polipirol untuk Terapi Fototermal dan Pencitraan Fotoakustik

Hasil dan Diskusi

Sintesis dan Karakterisasi NP FePt@PPy

Proses sintesis NP FePt diilustrasikan dalam Skema 1. Analisis EDS dari nanopartikel ini mengungkapkan bahwa komposisi atom akhir Fe dan Pt masing-masing adalah 20 dan 80% (File tambahan 1:Gambar S1). NP FePt hidrofobik dimodifikasi dengan 3-MPA; dengan demikian, mereka menjadi NP FePt hidrofilik dengan ukuran rata-rata 8,3 nm. NP FePt hidrofobik terdispersi dalam heksana karena adanya asam oleat dan oleil amina di permukaan. Namun, partikel menjadi larut dalam air setelah pertukaran ligan. Spektrum FTIR dari NP FePt hidrofobik dan NP FePt hidrofilik mengungkapkan pita karakteristik dari ligan absorpsi asam oleat, oleil amina, dan 3-MPA di permukaan (Gbr. 3; Skema 2) [14, 18]. Data FTIR (Gbr. 2) bersama dengan kelarutan yang baik dari NP FePt hidrofilik dalam air (Skema 1, langkah 2) mengkonfirmasi keberhasilan proses pertukaran ligan.

Representasi skematis dari sintesis dan penerapan NP FePt@PPy pada terapi fototermal dan pencitraan fotoakustik

NP FePt dilapisi dengan PPy melalui polimerisasi oksidasi kimia menggunakan (NH₄ )S₂ O₈ sebagai oksidator dan PVA sebagai stabilizer. Lapisan PPy terlihat jelas dengan pencitraan TEM (Gbr. 1c) dengan ketebalan sekitar 10 nm, dan ukuran rata-rata NP FePt@PPy adalah 42 nm (Gbr. 1d). FTIR dari NP FePt@PPy juga diterapkan untuk mengkonfirmasi pelapisan NP PPy dengan memeriksa perubahan frekuensi FTIR (Gbr. 3c). Puncak karakteristik PPy dianalisis dengan baik dalam laporan sebelumnya [19]. Pita getaran FTIR pada 1620 dan 1446 cm ⁻¹ ditugaskan untuk getaran peregangan C–C dan C=C dari cincin PPy. Pita pada 1236 cm ⁻¹ dikaitkan dengan getaran regangan C–N, dan pita pada 1076 cm ⁻¹ menunjukkan adanya mode deformasi dalam bidang C-N. Selanjutnya, pita pada 798 dan 600 cm ⁻¹ masing-masing dikaitkan dengan getaran deformasi dalam bidang C-H dan N-H dan getaran tekuk luar C-H. FTIR bersama dengan TEM memastikan keberhasilan pelapisan NP FePt luar PPy.

a TEM dan b distribusi ukuran yang sesuai dari NP FePt murni. c TEM dan d distribusi ukuran yang sesuai dari NP FePt@PPy

Spektrum FTIR dari (a) NP FePt hidrofobik, (b) NP FePt hidrofilik, dan (c) NP FePt@PPy

Spektrum UV-Vis-NIR dari NP FePt, PPy, dan FePt@PPy murni

Kurva pemanasan fototermal NP FePt murni dan NP FePt@PPy dengan jumlah FePt yang sama. Semua larutan diiradiasi dengan 1-W/cm ² Laser 808 nm selama 6 mnt

a Spektrum UV-Vis-NIR dengan konsentrasi berbeda dari NP FePt@PPy. b Peluruhan fototermal NP FePt@PPy dengan konsentrasi berbeda. c Gambar termografi NIR yang sesuai dari sampel yang diiradiasi. Semua larutan diiradiasi dengan 1-W/cm ² Laser 808 nm selama 5 mnt

a Perilaku fototermal 50 g/mL NP FePt@PPy disimpan di bawah laser 808 nm pada kerapatan daya yang berbeda selama 6 menit. b Catatan suhu real-time dari enam siklus pemanasan/pendinginan 50 μg/mL NP FePt@PPy di ​​bawah eksperimen laser hidup/mati (1 W/cm ² ). c Spektrum UV-Vis-NIR dari NP FePt@PPy sebelum dan sesudah penyinaran

Viabilitas sel (dengan uji MTT) sel MDA-MB-231 yang diinkubasi dengan NP FePt dan FePt@PPy dengan konsentrasi berbeda selama 48 jam

Persentase sel yang hidup dari sel yang dirawat dengan NP FePt @ PPy di ​​bawah kepadatan daya laser yang berbeda dan waktu penyinaran yang berbeda. a Iradiasi dilakukan selama 4 menit. b Iradiasi dilakukan selama 6 mnt

Bidang terang dan gambar fluoresensi sel MDA-MB-231 dalam kondisi berbeda. a Kontrol. b Laser saja. c 50-μg/mL FePt@PPy NP + laser. d 70-μg/mL FePt@PPy NP + laser. e 100-μg/mL FePt@PPy NP + laser. Semua larutan diiradiasi dengan 1 W/cm ² Laser 808 nm selama 6 mnt

a Gambar optik dan gambar termografi NIR yang sesuai dari mouse telanjang sebelum injeksi NP FePt @ PPy. b Sisi kiri:gambar optik mouse telanjang dengan injeksi subkutan. Lingkaran merah putus-putus menunjukkan lokasi injeksi. Sisi kanan:gambar termografi NIR dari mouse telanjang setelah 6 menit di bawah penyinaran pada laser 808 nm (1 W/cm ² ). Perhatikan bahwa pemanasan maksimum sesuai dengan tempat injeksi. c Perubahan suhu permukaan kulit di tempat suntikan dan pada tikus dengan penyinaran pada laser 808 nm (1 W/cm ² ) selama 6 mnt

Setup eksperimental sistem PAI

Evaluasi tanggapan PA dari NP FePt@PPy pada berbagai konsentrasi:a hantu dan b gambar PA yang sesuai

Spektrum serapan UV-Vis-NIR dari NP FePt, PPy, dan FePt@PPy murni disajikan pada Gambar 3. Penyerapan kuat pada daerah NIR diamati untuk nanopartikel komposit. Spektrum penyerapan FePt dan PPy bersama-sama dapat berkontribusi pada NP FePt@PPy. Sifat optik dispersi air FePt@PPy NP dengan konsentrasi yang berbeda (dari 20 hingga 120 g/mL) juga direkam dengan spektroskopi UV-Vis-NIR. Seperti yang diplot pada Gambar. 4a, dengan peningkatan konsentrasi NP FePt@PPy, intensitas fotoabsorpsi seluruh wilayah UV-Vis-NIR meningkat.

Kinerja Fototermal NP FePt@PPy

Perilaku fototermal NP FePt dan FePt@PPy murni dibandingkan pada Gambar. 4. NP FePt dan FePt@PPy murni dengan jumlah FePt tetap diiradiasi oleh laser 808-nm pada kerapatan daya 1 W/cm ² . NP FePt @ PPy menunjukkan perilaku fototermal yang sangat baik dibandingkan dengan NP FePt murni. Data ini menunjukkan bahwa lapisan PPy meningkatkan kemanjuran fototermal dari keseluruhan sistem.

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, di bawah kondisi laser NIR yang sama (5 mnt, 1 W/cm ² ), suhu larutan yang mengandung 20 g/ml NP FePt@PPy meningkat dari 25 menjadi 39,3 °C sedangkan yang mengandung 120 g/ml NP FePt@PPy dengan cepat mencapai 71 °C. Selain itu, gambar termografi (Gbr. 5c) menunjukkan konversi efektif fototermal dari sampel yang mengandung NP FePt@PPy yang diiradiasi dengan laser 808 nm. NP FePt@PPy (50 μg/mL) terpapar pada penyinaran laser NIR pada kepadatan daya laser yang berbeda 0,5, 1,0, dan 1,5 W/cm ² selama 6 menit, dan suhu yang dihasilkan masing-masing adalah 41,1, 51,3, dan 59,4°C. Hasil eksperimen ini mengungkapkan bahwa waktu pemaparan, konsentrasi nanopartikel, dan intensitas daya laser merupakan parameter penting yang secara signifikan mempengaruhi kinerja fototermal NP FePt@PPy.

Uji Stabilitas Fototermal NP FePt@PPy

Selain transduksi fototermal yang kuat, fotostabilitas nanopartikel penting dalam PTT. Larutan FePt@PPy NP 50 μg/mL diiradiasi dengan laser NIR 808-nm pada 1,0 W/cm ² sampai larutan mencapai suhu tertinggi, kemudian pendinginan secara alami ke suhu kamar dengan mematikan laser. Setelah enam siklus pemanasan dan pendinginan, kurva termal NP FePt@PPy tetap hampir sama untuk setiap siklus (Gbr. 4d). Spektrum UV-Vis-NIR sebelum dan sesudah paparan laser ditunjukkan pada Gambar. 6c. Tidak ada perubahan signifikan yang diamati untuk seluruh spektrum. Hasil di atas menunjukkan stabilitas fototermal yang baik dari NP FePt@PPy untuk periode penyinaran laser NIR yang lama.

Uji Penyimpanan Jangka Panjang

Ukuran partikel dan spektrum serapan UV-Vis-NIR dari nanopartikel yang disiapkan dipantau selama 30 hari penyimpanan. Pertama, tidak ada agregasi yang diamati di semua larutan yang mengandung NP FePt@PPy (File tambahan 1:Gambar S3a). Kedua, NP FePt@PPy dalam media kultur sel pada konsentrasi 120 μg/mL tidak menunjukkan perubahan signifikan pada spektrum UV-Vis-NIR (File tambahan 1:Gambar S3b) setelah 30 hari penyimpanan. Selain itu, ukuran partikel rata-rata NP FePt@PPy hampir tidak berubah selama penyimpanan jangka panjang (File tambahan 1:Gambar S3c). Semua hasil di atas membuktikan stabilitas nanopartikel yang disiapkan.

Uji Sitotoksisitas Sel In Vitro

Untuk pengobatan kanker, nanopartikel harus memiliki biokompatibilitas yang sangat baik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, sel kanker payudara MDA-MB-231 diperlakukan dengan NP FePt dan FePt@PPy murni dengan konsentrasi berbeda dan diinkubasi selama 48 jam. Tidak ada sitotoksisitas signifikan dari NP FePt@PPy yang diamati bahkan pada konsentrasi uji tertinggi (120 μg/mL), dan viabilitas sel sel kanker payudara MDA-MB-231 masih lebih tinggi dari 95%. Untuk NP FePt murni, 120 μg/mL nanopartikel yang diiradiasi membunuh 20% sel kanker. Hasil ini menunjukkan bahwa pelapisan lapisan PPy meningkatkan biokompatibilitas NP FePt, dan NP FePt@PPy dapat dianggap sebagai bahan nontoksisitas.

Serapan Seluler

Pewarnaan biru Prusia, yang didasarkan pada reaksi besi dan kalium ferrosianida dalam larutan asam, dilakukan untuk mendeteksi serapan seluler NP FePt@PPy. Seperti yang ditunjukkan dalam File tambahan 1:Gambar S2, sebagian besar sel diwarnai dengan noda biru di dalam sel, yang menunjukkan serapan seluler dari NP FePt@PPy.

Terapi Fototermal In Vitro

Uji MTT standar dilakukan untuk mengevaluasi kemanjuran NP FePt@PPy yang diiradiasi pada kemampuan membunuh sel kanker payudara MDA-MB-231. Pertama, sel kanker diinkubasi dengan konsentrasi NP FePt@PPy yang berbeda selama 24 jam dan kemudian diekspos ke laser 808 nm pada 1 W/cm ² selama 4 mnt. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8, persentase viabilitas sel secara bertahap menurun ketika konsentrasi nanopartikel yang dirawat ditingkatkan. Sekitar 50% sel mati pada konsentrasi 100 g/mL NP FePt@PPy yang diiradiasi. Untuk membunuh lebih banyak sel kanker, waktu penyinaran ditingkatkan hingga 6 menit. Dengan konsentrasi 100 g/mL, sekitar 70% sel mati diamati. A comparison of the photothermal therapy performance between the proposed system and some reported nanoparticles was conducted in Additional file 1:Table S1. It is found that the proposed system shows comparable capability in killing cancer cells (i.e., 70% cell death) with quite low nanoparticle concentration (i.e., 100 μg/mL) under relatively weak power density condition (i.e., 1 W/cm ² ) and short irradiation time (i.e., 6 min).

In addition, by using the fluorescence imaging technique of five groups, we conducted experiments on the cancer cells to consider the killing capability of the prepared nanoparticles:the control groups (only cells), the laser-only group (cells were exposed to the 808-nm laser), the 50-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), the 70-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), and the 100-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser).

Double staining of Hoechst 33342 and PI was used to explore the damaged and dead cells. Hoechst 33342 is a DNA dye, which can be permeable in both dead and viable cells [20]. The changes in the size and shape of nuclei of the Hoechst 33342 stained cells can be observed under fluorescence microscopy. With the apoptosis cells, Hoechst 33342 will make the condensed chromatin brighter than that in a normal cell. PI dye also binds to DNA, but it only permeates through the membrane of damaged and dead cells [21]. Thus, double staining can differentiate between dead cells and live cells by each treatment method.

As shown in Fig. 9, the cancer cells exposed to the NIR laser in the presence of the FePt@PPy NPs emit strong fluorescence, whereas the slight fluorescence is emitted by cancer cells in the absence of the nanoparticles. Only a few dead cells with the red nuclei were observed in the control and laser-only group (Fig. 9a, b). In contrast, many cells in the FePt@PPy NPs + 808-nm laser groups died and displayed red nuclei, as observed in Fig. 9c–e. After incubation for 24 h, some dead cells lost the binding ability and were washed out of the cell disk. Therefore, the intensity of cancer cells in the 100-μg/mL of FePt@PPy NPs + 808-nm laser group was less than the others. Conclusively, almost cancer cells which were treated with 100-μg/mL of FePt@PPy NPs was destructed after being exposed to the 808-nm NIR laser at a power density of 1.0 W/cm ² .

In Vivo Laser Heating Experiment

The potential ability of FePt@PPy NPs for laser-induced heating was finally tested in an animal model. The nude mouse was subcutaneously injected with 100 μL of an aqueous FePt@PPy (100 μg/mL) NPs in PBS. Figure 10a presents the optical and NIR thermographic images of the nude mouse before injection, pointing out the temperature of mouse surface’s skin is about 36 °C. Fig. 10b (left side) shows an optical image of the mouse in which the injection site is indicated by a dashed red circle. The injected area was irradiated with the 808-nm laser at 1 W/cm ² for 6 min, and the NIR thermographic image of this mouse is shown in Fig. 10b (right side). The temperature of the skin’s surface was continuously monitored with an NIR thermographic camera. The time evolution of the surface temperature during the 6 min irradiation is shown in Fig. 10c, figuring out a temperature increment of the skin about 19 °C. From that, we can see clearly that the injected FePt@PPy NP area with laser irradiation produced a high temperature, as required for tumor ablation. Moreover, the heating area was found to be well localized at the injection site as shown in the NIR thermographic image (Fig. 10b, right side). Conclusively, with the excellent laser-induced heating properties, FePt@PPy could be a novel promising agent for photothermal therapy.

In Vitro Photoacoustic Imaging

The top-view image of the phantom filled with pretreated cancer cells is shown in Fig. 12a. The corresponding PAI acquired at the 808-nm laser from the sample in Fig. 12a is illustrated in Fig. 12b.

PAI is an emerging imaging modality and can be used to assist phototherapy [22]. All the samples containing pretreated cells were clearly visible, whereas the controlled samples with 4% gelatin did not produce any PA signal. The magnitude of the PA signal was increased when the concentration of nanoparticles increased. The ability to image FePt@PPy NPs inside phantom with the PAI system is very promising for image-guided photo-induced cancer therapy. The laser system for PAI, which was used in conjunction with FePt@PPy NPs, also showed the potential for future implementations.