Pengaruh Nanopartikel Emas 15‑nm terhadap Proliferasi, Apoptosis, dan Pembentukan Spheroid pada Sel HT29 Kanker Usus Besar dan Sel Ginjal Embrio SPEV

Latar Belakang

Nanopartikel emas (AuNPs) dihargai karena biokompatibilitasnya, properti optik, dan potensi terapeutik yang berkembang di berbagai maligansi, termasuk kanker payudara, hati, lambung, usus besar, dan paru-paru [5–6]. Ciri fisikokimia unik AuNPs—ukuran, bentuk, muatan permukaan, dan konsentrasi—mengatur penyerapan seluler, distribusi, dan efek biologisnya [12–14]. Meskipun banyak studi berfokus pada efektivitas antikanker AuNPs, profil toksisitas komprehensif dalam model yang relevan klinis tetap penting untuk translasi yang aman.

Pengiriman terpadu AuNPs ke jaringan tumor masih merupakan tantangan; laju penyerapan yang berbeda telah dilaporkan di antara sel epitel dari berbagai asal [15–16]. Variasi dalam komposisi membran, ekspresi glikoprotein, dan kapasitas endositosis kemungkinan mendasari perbedaan ini, menekankan kebutuhan akan studi komparatif di garis sel epitel normal dan maligan [17].

Uji kultur sel menyediakan lingkungan terkontrol untuk mengurai respons seluler terhadap AuNPs, memberikan informasi bagi penilaian keamanan dan optimasi terapeutik. Dalam studi ini, kami membandingkan efek AuNPs pada garis sel ginjal embrio seperti normal (SPEV) dan garis kanker kolorektal (HT29) menggunakan output adhesi, proliferasi, apoptosis/nekrosis, dan pembentukan spheroid.

Metode

Kultur Sel SPEV

Sel SPEV dipertahankan dalam DMEM (Sigma, USA) yang disunting dengan 5 % FCS (HyClone, USA), penisilin/streptomisin (PAA, Austria), dan amfoterisin B (5 µg mL⁻¹). Sel ditanam pada 0,5–2 × 10⁴ sel cm⁻² dan dikultur dalam 5 % CO₂ pada kelembaban 95 %. Media difresh setiap 48 jam, dan pasa dilakukan saat mencapai konfluensi, mempertahankan morfologi lapisan tunggal melalui pasa.

Kultur Sel HT29

Sel HT29 ditumbuhi dalam RPMI‑1640 (Sigma, USA) dengan 10 % FCS, 2 mM L‑glutamin, dan 40 mg mL⁻¹ gentamisin (Sigma, USA). Kepadatan kerja adalah 0,5–4 × 10⁴ sel cm⁻². Sel diperoleh dari Bank Garis Sel di Institut Kavetsky RE untuk Patologi Eksperimen, Onkologi, dan Radiobiologi, NAS Ukraina.

Manipulasi dengan AuNPs

AuNPs disintesis dengan metode reduksi sitrat [22] dan disuplai oleh Institut Biokimia dan Fisiologi Tumbuhan dan Mikroorganisme, Akademi Sains Rusia. Partikel rata-rata 15 nm dalam diameter, dengan konsentrasi stok 57 µg mL⁻¹. Mikroskopi elektron lapangan gelap dan spektrum kepunahan mengonfirmasi distribusi ukuran (Gambar 1). Sel diperlakukan dengan 1, 3, 6, atau 12 µg mL⁻¹ AuNPs selama 24–48 jam; kultur tanpa perlakuan berfungsi sebagai kontrol.

Gambar 1. (a) Citra TEM lapangan gelap dari AuNPs 15‑nm (distribusi ukuran); (b) Spektrum kepunahan.

Uji Adhesi dan Proliferasi

Adhesi diukur dengan menghitung sel yang merata pada 30, 60, 120, 180, dan 1440 menit setelah penanaman, menggunakan mikroskop terbalik. Proliferasi selama 1–4 hari dinilai dengan pelepasan trypsin‑EDTA dan perhitungan dalam ruang Goryaev. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SE.

Penilaian Apoptosis/Nekrosis

Setelah 4 hari paparan AuNPs, sel diwarnai dengan Annexin‑V dan 7‑AAD dan dianalisis dengan sitometrika aliran (FACS Calibur, BD). Hasil diproses dengan WinMDI v2.8.

Pembentukan Multiselular Spheroid

Untuk menghasilkan spheroid, 5 × 10⁴ sel cm⁻² ditanam dalam plate 24‑lubang yang dilapisi agar 1 % dan dikultur dalam karboximetil‑selulosa (CMC) 0,24 % dengan rotasi 80 rpm. Spheroid dibiarkan terbentuk selama 24 jam, kemudian dipertahankan selama 48 jam tambahan dengan kehadiran AuNPs. Ukuran dan jumlah spheroid diukur dengan mikroskopi lapangan gelap dan dianalisis dengan Axio Vision 4.7, menghitung volume melalui V = 0,4 × a × b² (a, b = diameter). Agregat dikelompokkan berdasarkan volume (1 × 10⁻⁴–1 × 10⁻² mm³) untuk menentukan volume median dan jumlah.

Analisis Statistik

Data dianalisis menggunakan ANOVA satu jalur dan uji t Student (Statistica 8). Signifikansi ditetapkan pada p ≤ 0,05, disajikan sebagai rata-rata ± SE.

Hasil

Adhesi Sel SPEV dan HT29

Gambar 2 menggambarkan dampak AuNPs terhadap adhesi SPEV. Setelah 1 jam, AuNPs 1, 3, dan 6 µg mL⁻¹ mengurangi jumlah sel yang menempel relatif terhadap kontrol, dengan 12 µg mL⁻¹ menyebabkan penurunan 1,8 kali yang berlangsung selama 24 jam. Sel HT29 menunjukkan tren yang serupa: konsentrasi rendah memiliki efek yang tidak signifikan, sedangkan 6 dan 12 µg mL⁻¹ mengurangi adhesi masing‑masing 1,16‑ dan 1,28 kali (Gambar 3).

Gambar 2. Dinamika adhesi sel SPEV setelah paparan AuNPs (*p ≤ 0,05 vs. kontrol).

Gambar 3. Dinamika adhesi sel HT29 setelah paparan AuNPs (*p ≤ 0,05 vs. kontrol).

Proliferasi Sel SPEV dan HT29

Gambar 4 menunjukkan bahwa AuNPs 1–6 µg mL⁻¹ tidak mengubah proliferasi SPEV selama hari 2–4, sedangkan 12 µg mL⁻¹ mengurangi jumlah sel hingga 1,5 kali (Gambar 4). Proliferasi HT29 tetap tidak berubah hingga 3 hari; pada hari 4, 6 dan 12 µg mL⁻¹ menurunkan jumlah sel masing‑masing 1,33‑ dan 1,44 kali (Gambar 5).

Gambar 4. Proliferasi sel SPEV setelah paparan AuNPs (*p ≤ 0,05 vs. kontrol).

Gambar 5. Proliferasi sel HT29 setelah paparan AuNPs (*p ≤ 0,05 vs. kontrol).

Induksi Apoptosis/Nekrosis

Dosis AuNPs rendah (1–3 µg mL⁻¹) tidak mengubah profil Annexin‑V/7‑AAD secara signifikan pada kedua garis (Tabel 1–2). Pada 6–12 µg mL⁻¹, baik SPEV maupun HT29 menunjukkan peningkatan populasi apoptosis/nekrosis awal dan akhir. Untuk SPEV, 12 µg mL⁻¹ meningkatkan sel Annexin‑V⁺/7‑AAD⁺ sebesar 7,8 % (p ≤ 0,05); untuk HT29, 6 µg mL⁻¹ dan 12 µg mL⁻¹ meningkatkan fraksi ini masing‑masing 3,2 % dan 4,8 %.

Pembentukan Spheroid

Gambar 6 dan 7 menggambarkan bagaimana AuNPs memodulasi jumlah dan volume spheroid. Spheroid kontrol HT29 rata‑rata 5,19 × 10⁻³ mm³, sedangkan spheroid SPEV rata‑rata 0,79 × 10⁻⁵ mm³. AuNPs 1–3 µg mL⁻¹ memperbesar volume spheroid SPEV sebesar 9,7‑ dan 7,4 kali, dan volume HT29 sebesar 1,4‑ dan 1,2 kali. Peningkatan konsentrasi AuNPs menjadi 12 µg mL⁻¹ mengurangi volume spheroid pada kedua garis (HT29: 7,18 → 4,24 × 10⁻³ mm³; SPEV: 7,69 → 4,58 × 10⁻⁵ mm³) sambil meningkatkan jumlah spheroid HT29 dari 3 menjadi 10 per bidang dan mengurangi spheroid SPEV dari 32 menjadi 19.

Gambar 6. Jumlah dan volume spheroid SPEV setelah paparan AuNPs (#p ≤ 0,01 untuk jumlah; **p ≤ 0,01 untuk volume).

Gambar 7. Jumlah dan volume spheroid HT29 setelah paparan AuNPs (#p ≤ 0,01 untuk jumlah; **p ≤ 0,01 untuk volume).

Diskusi

Data kami mengonfirmasi profil sitotoksik bergantung pada dosis dari AuNPs 15‑nm pada sel SPEV dan HT29. Konsentrasi 6–12 µg mL⁻¹ menghambat proliferasi, meningkatkan apoptosis/nekrosis, dan mengganggu kohesi sel dalam suspensi, sebagaimana ditunjukkan oleh perubahan ukuran dan jumlah spheroid. Sensitivitas yang lebih tinggi HT29 (6 µg mL⁻¹) relatif terhadap SPEV (12 µg mL⁻¹) selaras dengan laporan sebelumnya mengenai penyerapan yang berbeda dan gangguan sitoskeletal oleh AuNPs [27–30].

Mekanisme, AuNPs mungkin mengganggu kompleks adhesi fokus, memodulasi dinamika aktin, dan memicu stres oksidatif mitokondria—jalur yang culminasi dalam siklus sel dan sel terprogram [31–34]. Efek anti-kohesif yang diamati pada dosis tinggi kemungkinan mencerminkan gangguan juncinya sel–sel, yang mengakibatkan fragmentasi spheroid yang meningkat.

Meskipun temuan in vitro menjanjikan, validasi in vivo sangat penting untuk mengonfirmasi efektivitas dan keamanan terapeutik. Meskipun demikian, studi kami memberikan patokan yang ketat untuk desain strategi antikanker berbasis AuNPs yang mengeksploitasi kapasitas ganda mereka untuk menghambat pertumbuhan tumor dan memodulasi mikroenvironment seluler.

Kesimpulan

AuNPs 15‑nm menunjukkan efek yang jelas dan bergantung pada konsentrasi pada sel SPEV seperti normal dan HT29 maligan: proliferasi yang dikurangi, apoptosis/nekrosis yang meningkat, dan dinamika spheroid yang berubah. Dosis rendah (1–3 µg mL⁻¹) mempromosikan pembentukan spheroid, sedangkan dosis yang lebih tinggi (6–12 µg mL⁻¹) menunjukkan tindakan sitotoksik dan anti-kohesif. Temuan ini mendukung penyelidikan lebih lanjut tentang AuNPs sebagai modalitas antikanker yang ditargetkan, dengan perhatian pada optimasi dosis untuk manfaat terapeutik maksimal dan toksisitas off‑target minimal.