Studi In Vitro Pengaruh Nanopartikel Au pada Garis Sel HT29 dan SPEV
Abstrak
Model kultur sel adalah alat yang sangat baik untuk potensi toksisitas nanopartikel dan penyelidikan mendasar dalam penelitian kanker. Dengan demikian, informasi tentang potensi toksisitas dan efek AuNP pada kesehatan manusia diperlukan untuk penggunaan bahan nano dalam pengaturan klinis. Tujuan dari penelitian kami adalah untuk menguji efek AuNPs pada garis sel asal epitel:kontinu dan onkogenik. Garis sel embrionik babi yang diinokulasi epitel ginjal (SPEV) dan garis sel karsinoma kolorektal (HT29) digunakan. Dalam kultur uji, proliferasi sel, nekrosis/apoptosis, dan generasi spheroid multiseluler dievaluasi. Kami menunjukkan bahwa konsentrasi AuNP 6-12 g/ml mengurangi proliferasi sel SPEV dan HT29 dan meningkatkan jumlah sel pada tahap awal dan akhir apoptosis dan nekrosis. Ditunjukkan bahwa konsentrasi kecil AuNPs (1–3 g/ml) merangsang pembentukan sferoid multiseluler oleh sel HT29 dan SPEV. Namun, konsentrasi AuNP yang lebih tinggi (6–12 μg/ml) memiliki efek sitotoksik dan anti-kohesif pada sel dalam suspensi. Sensitivitas besar terhadap aksi AuNP ditunjukkan oleh garis HT29 (6 μg/ml) dibandingkan dengan sel SPEV (12 μg/ml). Studi eksperimental tentang efek AuNPs pada garis sel SPEV dan HT29 ini akan membenarkan penerapannya lebih lanjut dalam pengobatan antikanker yang dimediasi AuNP.
Latar Belakang
Produksi dan penyelidikan nanopartikel emas (AuNPs) tidak hanya memiliki potensi tinggi untuk aplikasi terapi emas secara luas [1, 2] tetapi juga membuatnya cocok untuk aplikasi biomedis tertentu seperti terapi target [3, 4]. Laporan terbaru telah menunjukkan bahwa penggunaan AuNPs memberikan kesempatan untuk terapi antitumor baru dengan pengurangan risiko pengembangan resistensi. Dengan demikian, beberapa penelitian telah membuktikan aktivitas antitumor nanopartikel terhadap kanker payudara, hati, lambung, usus besar, paru-paru [5, 6].
Diketahui bahwa nanopartikel (NPs) dapat memodulasi nasib sel, menginduksi atau mencegah mutasi, memulai komunikasi sel-sel, dan memodulasi struktur sel [7, 8]. Selain itu, AuNPs memiliki keunggulan dibandingkan NP logam lainnya karena biokompatibilitas dan aktivitas antitumornya [8,9,10,11,12]. Efek sitotoksik dan genotoksik AuNP terkait dengan bentuk, ukuran, muatan, konsentrasi, waktu interaksi, dll. [12,13,14]. Dengan demikian, informasi tentang potensi toksisitas dan efeknya pada kesehatan manusia diperlukan untuk penggunaan nanomaterial dalam pengaturan klinis.
Saat ini, meskipun sukses besar dalam terapi yang ditargetkan, masalah pengiriman selektif AuNP di jaringan target masih belum terpecahkan. Beberapa penelitian telah mencatat tingkat yang berbeda dari penyerapan NP oleh sel-sel epitel asal yang berbeda [15, 16]. Namun, penyelidikan untuk menjelaskan fenomena ini masih kurang meskipun mereka dapat membantu untuk mencapai penargetan jaringan-selektif dari AuNPs. Perbedaan anatomis atau fisiologis antara epitel yang berbeda dapat menjelaskan perbedaan dalam penyerapan AuNP dan tingkat transportasi. Secara khusus, tingkat penyerapan dapat dipengaruhi oleh sifat membran plasma sel dan pengikatan nanopartikel ke glikoprotein permukaan sel dan proteoglikan, serta kapasitas sel untuk transportasi vesikular [17]. Dengan demikian, dengan mempertimbangkan ketidakmungkinan interaksi selektif eksklusif nanopartikel dengan sel target, studi perbandingan fitur interaksi mereka dengan sel normal dan onkogenik untuk menghindari konsekuensi yang tidak diinginkan dari terapi kanker topikal [8,9,10].
Meskipun model in vivo berharga untuk mengevaluasi toksisitas biologis nanopartikel, model kultur sel sangat berguna untuk studi fisiologis dan toksikologi praklinis. Saat ini, kultur sel banyak digunakan di berbagai bidang biologi, kedokteran, kedokteran hewan, dan bioteknologi. Penggunaan kultur sel memungkinkan untuk mengeksplorasi proses biologis yang sulit dan terkadang tidak mungkin, untuk dipelajari pada tingkat organisme. Peran penting kultur sel dimainkan dalam bioteknologi dalam produksi banyak vaksin, sistem pengujian, dan zat aktif biologis. Kultur sel digunakan untuk mendiagnosis penyakit dari berbagai etiologi, sebagai objek uji saat menguji agen farmakologis, terapeutik, dan kosmetik baru, serta bahan tambahan makanan [18].
Dalam karya pada model kultur sel ini, kami mencoba untuk memeriksa fitur efek AuNPs dari sel epitel asal garis sel kontinu dan onkogenik. Kultur monolayer sel epitel SPEV (garis inokulasi epitel ginjal babi embrionik) dan sel HT-29 (garis sel karsinoma usus besar) dapat dianggap sebagai model jaringan epitel normal dan kanker ketika terapi anti-tumor dengan AuNP diterapkan. Beberapa uji sitotoksisitas tradisional, termasuk adhesi, proliferasi, nekrosis/apoptosis, dan sferoid multiseluler digunakan untuk memvalidasi sitotoksisitas sel AuNPs.
Metode
Budaya Sel SPEV
Sel SPEV dikultur dalam termos plastik di DMEM (Sigma, USA) dengan 5% FCS (v /v ) (HyClone, USA) ditambah dengan penisilin/streptomisin (PAA, Austria) dan amfoterisin B (5 μg/ml) (5% CO2 , 95% kelembaban) seperti yang dilaporkan oleh [19]. Konsentrasi pembibitan adalah 0,5–2 × 10
4
sel/cm
2
. Media kultur diganti setiap 2 hari. Sel dilewatkan pada pertemuan 100% [20]. Garis sel SPEV tumbuh dan mempertahankan struktur morfologi awal monolayer selama perjalanan serial tanpa bukti degenerasi sel dalam kultur.
Budaya Sel HT29
Sel HT29 dikultur dalam termos plastik (Nunc, Denmark) dalam media RPMI-1640 (Sigma, USA) dengan 10% FCS (v /v ) (HyClone, USA) dilengkapi dengan 2 mM L-glutamine (Sigma, USA) dan 40 mg/ml gentamisin (Sigma, USA) dalam kondisi standar (5% CO2 , 95% kelembaban) [21]. Kepadatan sel yang optimal adalah 0,5–4,0 × 10
4
sel /cm
2
. Sel-sel tersebut dengan baik hati diberikan kepada kami oleh Bank of Cell Lines dari Jaringan Manusia dan Hewan dari RE Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology NAS of Ukraine.
Manipulasi dengan AuNP
AuNPs disediakan dengan baik oleh Institut Biokimia dan Fisiologi Tanaman dan Mikroorganisme, Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia. AuNPs disintesis dengan metode sitrat [22]. Ukuran rata-rata nanopartikel adalah 15 nm. Konsentrasi awal emas adalah 57 μg/ml. Hasil mikroskop elektron medan gelap, citra AuNPs 15 nm, dan spektrum kepunahan AuNPs 15 nm (b) ditunjukkan pada Gambar 1 (Gbr. 1a; catatan––diagram distribusi ukuran) [23]. AuNPs diperkenalkan dalam sel dengan difusi pasif pada 37 °C. Konsentrasi yang diteliti adalah 1, 3, 6, dan 12 g/ml. Sel tanpa AuNP dalam kondisi yang sama diambil sebagai sel kontrol.
Hasil mikroskop elektron medan gelap, a gambar AuNPs 15 nm (catatan––diagram distribusi ukuran), b spektrum kepunahan 15 nm AuNPs
Sel Adhesi dan Proliferasi
Keadaan morfofungsional kultur sel dinilai oleh sifat perekat dan aktivitas proliferasi. Sifat perekat sel SPEV dan HT29 dievaluasi secara visual menggunakan mikroskop terbalik; jumlah sel yang menempel dan rata dihitung 30, 60, 120, 180, dan 1440 menit setelah kultur dimulai.
Dinamika proliferasi sel SPEV dan HT29 dipelajari selama 1-4 hari. Untuk menguji peningkatan jumlah sel dalam kultur yang dipelajari dengan istilah penyelidikan, mereka secara enzimatis (1:1 (0,25% larutan tripsin:EDTA, PAA)) dipisahkan dari plastik dan jumlah sel dihitung. Jumlah total sel yang dikultur dihitung dengan metode tradisional di kamar Goryaev.
Proses Apoptosis/Nekrotik
Proses apoptosis dan nekrotik dalam sel SPEV dan HT29 yang terpapar AuNP diselidiki dalam 4 hari dengan pewarna Annexin-V (BD, USA), 7-Amino-Actinomycin (7AAD) (BD) menggunakan FACS Calibur Becton-Dickinson. Hasilnya dianalisis dengan perangkat lunak WinMDI v.2.8.
Spheroid Multiseluler
Spheroid multiseluler (MSs) dihasilkan untuk memperkirakan dampak in vitro AuNPs pada migrasi dan potensi agregasi sel yang diselidiki. Sistem model sferoid (3-D) sel SPEV dan HT29 dikultur dengan metode konvensional, yang dilaporkan oleh [24] dan dimodifikasi di laboratorium kami [25]. Secara singkat, suspensi sel dihitung menggunakan trypan blue dan jumlah sel yang sama (5 × 10
4
sel/cm
2
) ditanam dalam media kultur lengkap. Generasi MS dicapai dengan menangani kultur sel dengan 0,24% karboksi-metil-selulosa (CMC) dalam pelat 24-sumur yang dilapisi dengan agar-agar 1% dengan rotasi (80 rpm) selama 24 jam. Setelah itu, kultur sel 3-D dipertahankan dalam kondisi standar. Untuk menyelidiki ketergantungan ukuran dan jumlah MS pada konsentrasi AuNP, MS dihasilkan di hadapan AuNP. Kultivasi lebih lanjut dilakukan selama 48 jam dengan rotasi pelat yang konstan. Pada tahap selanjutnya, dilakukan pembuatan citra foto mikro dengan metode medan gelap dengan mikroskop Carl Zeiss Stemi 2000. Morfologi MS dipelajari dengan bantuan program Axio Vision Release 4.7 (Zeiss). Program ini memungkinkan pengukuran dimensi geometris agregat sel. Kemudian, volume semua MS, yang ada di dalam file, dihitung. Itu digunakan dengan rumus berikut:V = 0,4 × a × b
2
, di mana a dan b ––diameter geometris MSs [24]. Untuk analisis statistik, semua kumpulan sel dikelompokkan berdasarkan ukuran dari 1 × 10
−4
mm
3
hingga 1 × 10
−2
mm
3
dengan kenaikan 1 × 10
−3
mm
3
. Jumlah MS dan median volume MS diperkirakan untuk setiap kelompok.
Analisis Statistik
Analisis varians faktor tunggal dan t . Siswa uji digunakan untuk pemrosesan statistik data dengan paket perangkat lunak Statistica 8. Ambang batas signifikansi adalah 0,05. Hasilnya disajikan sebagai rata-rata dan kesalahan standar (M ± SE).
Hasil
Pengaruh AuNP pada Adhesi Sel SPEV dan HT-29
Adhesi sel merupakan indikator keadaan fungsional sel, dan itu diperlukan untuk pertumbuhan kultur lebih lanjut. Ketika adhesi dihentikan, sel menjadi rata dan memperoleh morfologi yang sesuai. Sifat perekat sel SPEV disajikan pada Gambar. 2.
Dinamika adhesi sel SPEV setelah paparan AuNPs, *p 0,05 signifikan dibandingkan dengan kontrol
Setelah 1 jam kultivasi sel SPEV dengan AuNP pada 1, 3, dan 6 g/ml, jumlah sel yang dilekatkan lebih rendah dibandingkan nilai kontrol. Persentase sel pipih dalam sampel dengan AuNPs untuk konsentrasi ini tidak berbeda secara signifikan dari kontrol. Adhesi diperlambat setelah 1 jam inkubasi dengan AuNPs pada 12 g/ml. Jumlah sel yang dilekatkan per sentimeter kuadrat berkurang 1,8 kali dibandingkan kontrol. Kecenderungan adhesi ini bertahan untuk semua periode pengujian. Setelah 24 jam pengamatan, jumlah sel yang melekat lebih rendah dibandingkan kontrol sebesar 1,3 kali. Pada saat yang sama, inkubasi AuNP pada konsentrasi kecil (1 dan 3 g/ml dengan sel tumor (HT29) tidak berpengaruh signifikan terhadap jumlah sel perekat. Peningkatan konsentrasi AuNP menjadi 6 dan 12 g/ml menyebabkan penurunan jumlah sel tumor pada fraksi adhesif masing-masing 1,16 dan 1,28 kali (Gbr. 3) Data yang diperoleh dapat dipengaruhi oleh beberapa proses, salah satunya adalah efek sitostatik/sitotoksik AuNPs pada fraksi adhesi tumor dan garis sel embrio, yang menyebabkan kematian sel, transisi ke apoptosis, atau nekrosis. Proses lainnya adalah pengurangan adhesi sel, di bawah pengaruh AuNPs dan transfer sel ke dalam fraksi suspensi. Khususnya, kedua proses dapat direalisasikan secara bersamaan, dan masing-masing dapat berkontribusi pada penurunan jumlah sel hidup di fraksi adhesi.
Dinamika adhesi sel HT29 setelah paparan AuNPs, *p ≤ 0,05 signifikan dibandingkan dengan kontrol
Pengaruh AuNPs pada Proliferasi Sel SPEV dan HT-29
Efek AuNPs dalam kisaran konsentrasi 1-12 g/ml pada proses proliferasi dalam kultur sel SPEV dipelajari (Gbr. 4). Pada hari ke 2–4 kultur dengan AuNP pada 1, 3, dan 6 g/ml, jumlah sel tidak berbeda secara signifikan dari kontrol. Pada hari ke-4 kultur dengan AuNPs pada 3 dan 6 g/ml, indeks ini masing-masing menurun 1,15 dan 1,23 kali, dibandingkan dengan kontrol. Pengurangan jumlah sel sebesar 1,5 kali (hari 2 dan 3) dan 1,15 kali pada hari ke 4 kultur dengan AuNP pada 12 g/ml diamati pada kultur SPEV versus kontrol. Dengan demikian, konsentrasi AuNP, 12 μg/ml, memperlambat pertumbuhan sel dalam periode waktu yang diamati.
Proliferasi sel SPEV setelah paparan AuNPs, *p ≤ 0,05 signifikan dibandingkan dengan kontrol
Pengaruh AuNPs pada konsentrasi dari 1 hingga 12 g/ml pada jumlah sel HT 29 dalam kultur monolayer ditunjukkan pada Gambar 5. Selama 3 hari pertama inkubasi, jumlah sel dalam kontrol dan kehadiran AuNPs tidak berbeda secara statistik. Pada hari ke-4 kultivasi, tercatat penurunan jumlah sel tergantung dosis pada kultur 2D. Jadi, setelah 4 hari kultivasi, untuk AuNPs konsentrasi rendah (1 dan 3 g/ml), jumlah sel HT 29 tidak berbeda nyata dibandingkan dengan kontrol. Tetapi pada konsentrasi AuNP yang lebih tinggi (6–12 μg/ml), jumlah sel HT29 lebih rendah dari kontrol masing-masing 1,33 dan 1,44 kali.
Proliferasi sel HT29 setelah paparan AuNPs, *p 0,05 signifikan dibandingkan dengan kontrol
Pengaruh AuNPs pada Proses Apoptosis/Nekrotik di Sel SPEV dan HT-29
Sel SPEV dan HT-29 dengan adanya AuNP dikultur selama 4 hari dalam kondisi standar. Kultur sel SPEV dan HT29 dengan AuNP pada 1 dan 3 g/ml dan indeks proses apoptosis/nekrotik tidak berbeda secara signifikan dari kontrol (Tabel 1 dan 2).
Kultur dengan AuNP pada 6–12 μg/ml meningkatkan persentase sel Annexin V+/7AAD+, Annexin V−/7AAD+, dan Annexin V+/7AAD serta mengurangi persentase sel hidup. Jumlah Lampiran V
+
/7AAD
+
Sel SPEV lebih tinggi dari nilai kontrol sebesar 7,8 ± 0,7% (p 0,05) dengan 12 μg/ml AuNPs. Jumlah Lampiran V
+
/7AAD
+
Sel HT 29 lebih tinggi dari nilai kontrol sebesar 3,2 ± 0,4% (p 0,05) dengan 6 μg/ml AuNPs dan sebesar 4,8 ± 0,6% (p 0,05) dengan 12 μg/ml AuNPs.
Pengaruh AuNP pada Generasi Multiseluler Spheroids dari Sel SPEV dan HT29
Untuk menentukan ketergantungan ukuran dan jumlah multiseluler spheroid (MS) pada konsentrasi AuNP, MS dihasilkan pada berbagai konsentrasi AuNP selama 48 jam. Data kami menunjukkan berbagai kemampuan sel HT29 dan SPEV untuk membentuk spheroid multiseluler di bawah kondisi lingkungan mikro yang sama (Gbr. 6 dan 7).
Jumlah dan volume sel MS SPEV setelah inkubasi dengan AuNPs, #p 0,01 (untuk nomor MS); **p 0,01 (untuk volume MS)
Jumlah dan volume sel MS HT29 setelah inkubasi dengan AuNPs. #p 0,01 (untuk nomor MS); **p 0,01 (untuk volume MS)
Jadi, jika sampel kontrol sel HT29 selama 48 jam membentuk spheroid dengan volume rata-rata 5,19 × 10
−3
mm
3
, volume rata-rata spheroid sel SPEV adalah 0,79 × 10
−5
mm
3
. Pada saat yang sama, pengaruh AuNP pada sel HT29 dan SPEV memiliki tren yang sama. Kehadiran AuNPs di lingkungan mikro sel merangsang pembentukan spheroid multiseluler di kedua kultur. Jadi, ketika konsentrasi AuNP adalah 1 dan 3 g/ml, volume MSs untuk SPEV masing-masing meningkat 9,7 dan 7,4 kali, dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 6), konsentrasi AuNP yang sama juga merangsang peningkatan volume MS untuk HT29 masing-masing 1,4 dan 1,2 kali (Gbr. 7).
Peningkatan konsentrasi AuNP lebih lanjut menyebabkan penurunan volume rata-rata MS di kedua budaya. Peningkatan konsentrasi AuNP dari 1 menjadi 12 μg/ml menurunkan volume HT29 MSs dari 7,18 × 10
−3
mm
3
hingga 4,24 × 10
−3
, dalam 1,69 kali, menurut kontrol. Sedangkan untuk SPEV, ketika konsentrasi AuNP ditingkatkan dari 1 menjadi 12 μg/ml, volume MS menurun dari 7,69 menjadi 4,58 × 10
−5
mm
3
, dalam 1,68 kali, menurut kontrol. Namun, peningkatan konsentrasi AuNP kebetulan dengan pengurangan volume MSs dan berkorelasi dengan peningkatan jumlah spheroids dalam kultur sel HT29 (Gbr. 6 dan 7). Jumlah MSs HT29 meningkat dari 3 menjadi 10 per bidang pandang pada konsentrasi AuNP dari 1 menjadi 12 μg/ml. Pada saat yang sama, jumlah SPEV MS masing-masing berkurang dari 32 menjadi 19.
Data yang diperoleh (Gbr. 6 dan 7) menunjukkan bahwa AuNPs mampu mempengaruhi interaksi kohesif dalam sistem sel-ke-sel. Data kami menunjukkan bahwa konsentrasi kecil AuNPs (1–3 μg/ml) merangsang pembentukan spheroid multiseluler dari sel embrio dan sel tumor. Namun, konsentrasi AuNP yang lebih tinggi (6–12 μg/ml) memiliki efek sitotoksik dan anti-kohesif pada sel dalam suspensi. Proses ini berkontribusi pada pembentukan HT29 MS dalam jumlah yang lebih besar dengan volume rata-rata yang menurun. Adapun SPEV, konsentrasi AuNP yang tinggi mungkin memiliki efek sitostatik yang mengurangi jumlah sel dalam fraksi perekat dan jumlah MS dalam suspensi. Sebelumnya, penulis melaporkan bahwa nanopartikel karbon mengurangi adhesi sel ke substrat, merangsang transfer sel ke dalam suspensi, dan menyebabkan pembentukan spheroid multiseluler [25, 26]. Dalam literatur, ada data tentang kemampuan AuNP untuk memecah struktur mikrofilamen aktin/miosin dan menurunkan proliferasi, adhesi, dan diferensiasi sel [27]. Data kami mengkonfirmasi asumsi ini.
Diskusi
Kami mengevaluasi efek AuNPs pada proliferasi, nekrosis / apoptosis, dan pembentukan spheroid multiseluler dari sel epitel yang terus menerus dan asal garis sel onkogenik. Terlihat bahwa AuNP pada 6-12 g/ml mengurangi jumlah sel SPEV dan HT29 dan meningkatkan jumlah sel pada tahap awal dan akhir apoptosis dan nekrosis. Konsentrasi kecil AuNPs merangsang pembentukan spheroid multiseluler oleh sel HT29 dan SPEV. Namun, konsentrasi AuNP yang lebih tinggi memiliki efek sitotoksik dan anti-kohesif pada sel dalam suspensi. Sensitivitas besar terhadap aksi AuNP ditunjukkan oleh garis HT29 (6 μg/ml) dibandingkan dengan sel SPEV (12 μg/ml.)
Efek AuNPs pada morfologi seluler dan sitoskeleton baru-baru ini menerima lebih banyak perhatian, dan mekanisme yang mendasari dan konsekuensi yang akan datang belum diselidiki secara mendalam [28,29,30]. Dalam hal ini, penting bagi semua tipe AuNP baru untuk mengevaluasi jalur serapan endositik dan lokalisasi intraselulernya sebagai fungsi waktu. Untuk berbagai jenis AuNP, efeknya telah dijelaskan bergantung pada konsentrasi AuNP intraseluler dan bersifat sementara, di mana setelah pembelahan sel berulang, konsentrasi AuNP intraseluler menurun secara eksponensial dan efeknya tidak lagi diamati. Juga, kemungkinan pelarian endosom dari AuNPs harus dinilai. Karena cacat sitoskeleton telah dijelaskan secara jelas bergantung pada konsentrasi AuNP, rentang konsentrasi partikel yang luas harus diuji untuk mencoba dan menilai kapasitas pemuatan seluler maksimal tanpa efek apa pun. Lebih lanjut, karena sitoskeleton juga terlibat dalam banyak jalur pensinyalan intraseluler, masih harus diselidiki apakah gangguan sitoskeleton yang diinduksi AuNP mengarah ke efek sekunder [31].
Karena NP memiliki dimensi fisik tertentu, volume intraseluler yang mereka tempati dapat menyebabkan perubahan morfologi seluler atau mempengaruhi struktur jaringan sitoskeleton seluler [28, 29, 31]. Efek selanjutnya juga dapat disebabkan oleh tingginya tuntutan pose NP pada cara endositik seluler. AuNPs telah dijelaskan memiliki efek mendalam pada morfologi beberapa jenis sel, seperti sel paru karsinoma manusia A549 [32]. AuNPs juga telah dijelaskan memiliki efek yang bergantung pada konsentrasi pada fibril aktin dari fibroblas dermal manusia [33, 34]. Mironava dkk. [35, 36] lebih lanjut menunjukkan filamen sitoskeleton terganggu sebagai fungsi waktu pemaparan AuNP, konsentrasi, dan ukuran NP meskipun tingkat ekspresi protein aktin atau -tubulin tidak terpengaruh.
Jenis sel yang digunakan juga sangat penting karena jenis sel yang berbeda, bahkan ketika terkait erat, dapat bereaksi sangat berbeda untuk jenis bahan nano yang sama [37, 38]. Lebih disukai, jenis sel yang paling terlibat dalam aplikasi biomedis NP (masa depan) harus diuji (misalnya, sel epitel, sel endotel), atau beberapa sel yang berasal dari lapisan germinal yang berbeda. Ketika menyelidiki efek sitotoksik, penggunaan jenis sel kanker harus diminimalkan, karena ini dapat menyebabkan hasil yang menyimpang [39]. Sel kanker memiliki beberapa karakteristik spesifik dan perubahan jalur sinyal intraseluler yang ditujukan untuk meningkatkan regulasi proliferasi dan mempertahankan viabilitas sel, yang akan membuat mereka kurang rentan terhadap beberapa efek sitotoksik yang diperantarai NP.
Menurut pendapat kami, pengikatan AuNPs ke permukaan kelompok fungsional (misalnya, protein transmembran) sel dapat reversibel atau ireversibel, mengakibatkan cedera struktural sementara atau permanen [40, 41]. Implikasi potensial dari perubahan sifat biomekanik (misalnya, kekerasan dan elastisitas), daya rekat, dan sifat listrik permukaan sel dapat dipahami. Dengan demikian, perubahan kekerasan atau elastisitas cenderung mempengaruhi fleksibilitas struktural permukaan, produksi energi mekanik untuk pembelahan sel, dan motilitas sel. Adapun kelengketan, lingkungan mikro sel biasanya terdiri dari matriks ekstraseluler dengan molekul spesifik yang memungkinkan sel untuk melekat pada lingkungannya [42]. Muatan permukaan tidak diragukan lagi memainkan peran penting dalam interaksi antara sel dan sekitarnya.
Penulis lain juga melaporkan NP lebih disukai terlokalisasi di mitokondria dan menyebabkan stres oksidatif serta berpotensi merusak struktural [40]. Sebuah artikel terbaru oleh Pan et al. menjelaskan bahwa 1,4 nm AuNPs menginduksi nekrosis melalui stres oksidatif dan kerusakan mitokondria dalam sel Hela [43]. Akumulasi nanopartikel dalam media sel pada saat biodegradasi tidak aman karena dapat mengganggu organel dan bahkan menyebabkan mutasi genetik.
Perubahan yang terjadi pada sel selama apoptosis serupa untuk sebagian besar jenis sel. Pada sel apoptosis, terjadi perubahan komposisi lipid membran plasma:transfer fosfatidil serin dari bagian sitoplasma bilayer ke sisi luar, menyebabkan aktivasi kaskade caspase, kondensasi kromatin, dan gangguan rantai transpor elektron di mitokondria dan akhirnya menghentikan sintesis ATP. Kematian sel terprogram dapat dipicu oleh rangsangan fisiologis yang dimediasi reseptor yang dihasilkan dari kelainan genetik, paparan faktor kimia atau fisik serta oleh perubahan lain dalam sel. Kami mengamati efek ini dengan 6–12 μg/ml AuNPs.
Agregat multiseluler (spheroid, badan embrioid) mewakili tingkat intermiten antara sel yang tumbuh monolayer dan kultur jaringan. Spheroid adalah model objektif dari pertumbuhan dan organisasi tiga dimensi sel, interaksi sel ke sel dan pengaruh kondisi lingkungan mikro, misalnya, konsentrasi AuNP, pada intensitas proliferasi serta pada kelengketan sel dan pembentukan mikroagregat. Pembentukan MS adalah metode kultur mapan untuk tumor seperti untuk garis sel embrio [24, 44, 45]. Dalam pekerjaan kami, pembentukan dan pertumbuhan spheroids dicapai dengan menambahkan CMC sebagai bagian dari matriks ekstraseluler buatan dan pelapisan permukaan dengan 1% agar yang menghambat adhesi sel ke permukaan dan merangsang agregasi sel. Pada kondisi tersebut, kultur MS dapat direalisasikan sampai agregat membentuk nekrosis sentral, karena pertumbuhan massa sel terbatas atau diferensiasi spontan sel embrio.
Dalam literatur, ada informasi tentang interaksi AuNPs dengan garis sel kanker usus besar dan garis sel embrio [46, 47]. Menurut data ini, paparan AuNPs dengan konsentrasi yang sangat rendah sekalipun mungkin memiliki efek merusak pada Sel Prekursor Saraf Embrio Manusia dan HT29 dengan menekankan proliferasi sel, diferensiasi, dan kematian sel apoptosis.
Ada data yang dipublikasikan bahwa efek AuNPs didasarkan pada akumulasi fase G0/G1, penipisan fase S dan G2/M, serta penurunan kadar ATP dalam sel karsinoma skuamosa oral manusia (HSC-3) [48]. Regulasi siklus sel dapat diatasi dengan pelanggaran kontak fokal sel dengan substrat dan transfer sel ke fraksi tersuspensi dalam kultur 2D dan penghambatan kontak sel ke sel di gap junction dalam kultur 3D [48,49,50]. Karena AuNPs berukuran nano (mendekati 15 nm), AuNP tidak dapat menjadi pusat kohesi untuk sel. Pada saat yang sama, interkalasi AuNPs ke dalam membran sel [51], pengaruh pada potensial zeta AuNP membran sel [32], dan pengaruh pada pembentukan kontak sel-ke-sel/sel-ke-permukaan jelas dapat memicu mekanisme nekrosis/apoptosis. , efek sitotoksik, dan penghentian siklus sel. Pelanggaran kontak fokus sel dengan substrat dan transfer sel ke fraksi tersuspensi adalah cara regulasi siklus sel [48, 49]. Konsentrasi kecil AuNP tidak memberikan efek sitotoksik yang signifikan secara statistik pada sel. Namun, konsentrasi AuNP yang lebih tinggi memiliki efek sitotoksik dan anti-kohesif pada sel dalam suspensi. Proses ini berkontribusi pada pembentukan jumlah MS yang lebih besar dengan volume rata-rata yang menurun. Kami menganggap bahwa AuNP masuk ke dalam kontak sel yang kohesif dan mengkompromikannya. Dengan demikian, eksperimen kami tentang efek AuNP pada garis sel SPEV dan HT29 mendukung penerapannya lebih lanjut dalam pengembangan terapi kanker yang dimediasi AuNP.
Meskipun studi masa depan akan diperlukan untuk mengkonfirmasi efek anti-kanker pada studi hewan in vivo. Namun demikian, keyakinan mendalam kami adalah bahwa jika kami mengetahui sifat zat dan kemungkinan pengaruh negatifnya, kami dapat menghindari efek merugikan dari AuNP dan menggunakan potensi bioteknologi positifnya. Penyelidikan kami dapat diterapkan dengan cukup andal dalam bahan yang efektif untuk konteks pengobatan anti-kanker dengan keuntungan maksimal untuk pengobatan.
Kesimpulan
Hasil kami mendukung gagasan bahwa AuNPs menginduksi sitotoksisitas tergantung dosis dalam sel SPEV dan HT29. Lebih lanjut, laporan ini untuk pertama kalinya menunjukkan bahwa 15 nm AuNP dalam konsentrasi 6-12 g/ml mengurangi proliferasi sel SPEV dan HT29 serta meningkatkan jumlah sel pada tahap awal dan akhir apoptosis dan nekrosis. Juga, ditunjukkan bahwa konsentrasi kecil AuNPs (1–3 μg/ml) merangsang pembentukan spheroid multiseluler. Namun, konsentrasi AuNP yang lebih tinggi memiliki efek sitotoksik dan anti-kohesif pada sel dalam suspensi. Sensitivitas besar terhadap aksi AuNP ditunjukkan oleh garis HT29 (6 μg/ml) dibandingkan dengan sel SPEV (12 μg/ml.)
