Sintesis Ramah Lingkungan Titik Kuantum Karbon Emisi Kuning dengan Mikroplasma untuk Citra Sel Kanker dan Inaktivasi Fotokatalitik
Abstrak
Dalam beberapa tahun terakhir, nanopartikel multifungsi dengan fungsi diagnostik dan terapeutik yang digabungkan menunjukkan janji besar dalam nanomedisin. Dalam studi ini, kami melaporkan sintesis ramah lingkungan dari titik kuantum karbo (carbon quantum dots/CQDs) berfluorensi menggunakan o-fenilendiamin melalui mikroplasma. CQDs yang dihasilkan menunjukkan puncak absorpsi lebar pada 380–500 nm dan memancarkan fluoresensi kuning cerah dengan puncak pada 550 nm. CQDs dengan cepat diserap oleh sel kanker HeLa. Saat diangsangkan di bawah cahaya biru, sinyal fluoresensi kuning cerah dan spesies reaktif oksigen (ROS) yang intens dihasilkan secara efisien, memungkinkan citra sel kanker fluoresensi dan inaktivasi fotodinamis secara bersamaan, dengan penurunan 40% dalam kelangsungan sel relatif. Selain itu, sekitar 98% sel masih aktif setelah inkubasi dengan 400 μg mL−1 CQDs dalam gelap, yang mengungkapkan kompatibilitas biologis yang baik CQDs. Oleh karena itu, CQDs yang baru disiapkan terbukti merupakan bahan yang mungkin efektif dan aman untuk digunakan dalam bioimaging in vivo dan terapi kanker terpandu citra.
Pendahuluan
Kanker tetap menjadi salah satu penyebab kematian utama di seluruh dunia [1]. Nanopartikel multifungsi dengan fungsi diagnostik dan terapeutik memiliki aplikasi yang menjanjikan dalam nanomedisin. Terapi terpadu citra secara bersamaan adalah konsep baru dalam pengobatan kanker dan menunjukkan janji besar terkait optimisasi efisiensi terapeutik. Ini dapat memberikan informasi yang berguna mengenai ukuran dan lokasi tumor, jendela waktu optimal untuk fototerapi, dan efikasi terapeutik [2,3,4]. Terapi fotodinamis (PDT) telah digunakan untuk menangani banyak jenis kanker dan penyakit lain karena keilihangan spasial-temporal dan sifat non-invasifnya [5, 6]. Photosensitiser ideal umumnya memiliki karakteristik berikut: (1) generasi ROS yang sangat efisien, (2) kompatibilitas biologis yang baik, dan (3) kelarutan air [7]. Namun, aplikasi PDT saat ini terbatas oleh kelarutan air yang buruk, ketidakstabilan, dan panjang gelombang eksitasi yang tidak optimal photosensitiser. Oleh karena itu, diperlukan pembuatan pengganti photosensitiser dengan kelarutan air dan kompatibilitas biologis yang baik dengan metode ramah lingkungan dan biaya rendah.
Titik kuantum karbo (CQDs) telah menerima perhatian yang luar biasa karena properti uniknya yang bermanfaat, seperti sintesis sederhana dan ramah lingkungan, toksisitas rendah, kompatibilitas biologis yang luar biasa, kelarutan air yang baik, dan stabilitas cahaya [8]. CQDs memiliki potensi penggunaan dalam citra sel, biosensing, pengiriman obat target, dan aplikasi biomedis lainnya [9,10,11,12,13]. Ada dua pendekatan utama untuk sintesis titik karbo, pendekatan bottom-up dan top-down. Metode top-down meliputi oksidasi elektrokimia, ablasi laser, oksidasi kimia, dan sintesis ultrasonik. Metode bottom-up terdiri dari perawatan hidrotermal, sintesis microwave, dan dekomposisi termal [14,15,16,17]. Namun, suhu tinggi, tekanan tinggi, dan asam kuat yang diperlukan selalu mengakibatkan konsumsi energi yang besar, proses yang rumit, dan kerusakan lingkungan yang tidak terhindarkan. Oleh karena itu, metode sintesis ramah lingkungan baru muncul sesuai dengan kebutuhan waktu. Seperti yang telah dilaporkan, CQDs dapat diproduksi dalam beberapa saat menggunakan metode mikroplasma-cair tanpa kondisi suhu tinggi, input energi besar, dan prosedur yang menyelimuti [18,19,20]. Mikroplasma menyediakan lingkungan fisikokimia unik untuk studi fundamental dan aplikasi yang melibatkan bahan canggih. Lingkungan kimia dan elektronik yang disediakan oleh mikroplasma sangat tidak setara dan dapat menyimpan energi. Dalam lingkungan ini, sejumlah besar elektron, ion, radikal bebas, dan zat aktif terionisasi-terangsang lainnya dapat diproduksi [21, 22]. Meskipun o-fenilendiamin adalah bahan baku untuk sintesis titik nano karbon, belum digunakan dalam sintesis mikroplasma [23,24,25].
Dalam studi ini, o-fenilendiamin digunakan sebagai bahan baku untuk sintesis CQDs dengan perlakuan mikroplasma. CQDs yang dihasilkan oleh metode ini seragam dalam ukuran (sekitar 3,2 nm diameter) dan menunjukkan puncak emisi pada sekitar 550 nm. Kami menunjukkan bahwa CQDs yang baru disintesis dapat menghasilkan sejumlah besar ROS dalam kondisi cahaya. In vitro, CQDs dapat diserap oleh sel tumor HeLa dan memancarkan cahaya kuning pada eksitasi panjang gelombang biru 420–500 nm dengan toksisitas rendah. Kami juga mengamati inaktivasi sel tumor HeLA pada iradiasi 460 nm. Hasil ini menunjukkan bahwa CQDs yang baru disiapkan mungkin merupakan bahan yang menjanjikan untuk bioimaging in vivo, terapi kanker terpandu citra atau target.
Hasil dan Pembahasan
Karakterisasi CQDs
CQDs beremisi kuning dalam studi ini disiapkan dengan cara sederhana dan ramah lingkungan oleh metode mikroplasma menggunakan o-fenilendiamin sebagai precursor karbon. Meskipun metode pemrosesan mikroplasma telah dilaporkan digunakan untuk sintesis titik nano karbon, ada penelitian terkait yang jarang. Gambar 1A menunjukkan citra mikroskop elektron transmisi (TEM) partikel CQD. Partikel yang dihasilkan oleh mikroplasma berbentuk segitiga tajam atau oval dengan diameter rata-rata 3,2 nm. Seperti yang ditunjukkan pada citra resolusi tinggi Gambar 1A (inset), jarak jaringan dalam CQDs adalah 0,21 nm, termasuk bidang (1,1,0) grafit. Spektra Raman menunjukkan bahwa mode D, bernama mode yang diinduksi oleh kekacauan, terletak sekitar 1342 cm−1 dan mode G berpusat sekitar 1507 cm−1, masing-masing, sebagai hasil dari hibridisasi sp3 dan sp2 karbon (Fig. 1E). Diketahui bahwa intensitas mode D dibandingkan mode G tergantung pada ukuran mikro-kristal grafit dalam sampel. Semakin tinggi kekacauan sampel, semakin tinggi rasio intensitas ID/IG dan semakin kecil mikro-kristal grafit. Selain itu, mode D dan G bubuk CQD juga dapat dilihat sebagai flake grafit kecil dengan rasio intensitas ID/IG yang relatif tinggi (0,77).
FTIR dan XPS adalah alat yang kuat untuk mengkarakterisasi komposisi kimia dan struktur bahan berbasis karbon. Data FTIR untuk CQDs direkam dalam rentang 400–4000 cm−1, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1F. Spektra FTIR mengungkapkan bahwa CQDs terutama mengandung amina (3052 dan 3324 cm−1), OH (3200 cm−1), C=O (1595 cm−1), C–N/C–O (1200 cm−1), C=C (1500 cm−1) dan CH (748 cm−1) grup fungsi atau ikatan kimia [26, 27]. Komponen permukaan CQDs, seperti yang ditentukan oleh XPS, konsisten dengan hasil FTIR. Spektra lengkap yang ditampilkan pada Gambar 2A menunjukkan tiga puncak tipikal: C 1s (285 eV), N 1s (400 eV), dan O 1s (531 eV).
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2B–D, analisis C 1s mengungkapkan keberadaan karbon sp2/sp3 (C–C/C=C, 284,8 eV), karbon nitrous (C–O/C–N, 285,9 eV), dan karbon karbonil (C=O, 287,7 eV). Band N 1s di-dekonvolusi menjadi tiga puncak pada 399,3, 400,3, dan 401,7 eV, yang masing-masing sesuai dengan N pirrolik, N grafitik, dan N amino. Band O 1s mengandung puncak pada 531,6 dan 533,1 eV untuk C–O dan C=O, masing-masing [28, 29]. Pentingnya, keberadaan grup fungsi di atas memberi CQDs kelarutan yang menguntungkan. Selain itu, properti optik CQDs diteliti menggunakan spektroskopi fluoresensi dan UV–Vis absorpsi. Spektra emisi fluoresensi CQDs ditunjukkan pada Gambar 1C. CQDs yang disiapkan menunjukkan perilaku emisi fluoresensi yang bergantung pada eksitasi. Saat diangsangkan pada panjang gelombang dari 400 hingga 500 nm, puncak emisi fluoresensi maksimum merah-shift dari 473 hingga 519 nm dan intensitas fluoresensi menurun secara tajam [30]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1D, spektra UV–vis CQD menampilkan puncak absorpsi kuat dalam rentang panjang gelombang 400–490 nm. CQDs menunjukkan dua puncak absorpsi karakteristik pada 280 dan 420 nm, yang masing-masing merujuk pada transisi π–π* (aromatik C=C) dan n–π* (karboksil dan/atau C–N) [31, 32]. Oleh karena itu, properti optik CQDs ini menyediakan kelayakan untuk citra biologis dan inaktivasi fotodinamis secara bersamaan.
Bioimaging dan Situsel Toksisitas CQDs
Untuk menilai kemampuan CQDs untuk bioimaging dan pelabelan sel, citra sel in vitro menggunakan CQDs diselidiki pada sel HeLa dengan mikroskop laser pemindai konfokal (CLSM). Sel HeLa diinkubasi dengan 200 μg mL−1 CQDs selama 6 jam dan kemudian disiapkan untuk deteksi CLSM. Sebagai hasilnya, sel HeLa menunjukkan fluoresensi kuning cerah yang merata di seluruh sel (Gambar 3A). Yang lebih penting, harus diperhatikan bahwa konsentrasi CQDs rendah 200 μg mL−1 cukup untuk melabeli sel HeLa dengan fluoresensi kuning, yang lebih jauh menentukan kemungkinan CQDs dalam citra sel. Seperti yang telah dilaporkan, partikel nano karbon selalu menunjukkan emisi kuat hanya di wilayah cahaya biru, sementara emisi panjang gelombang biasanya lemah. Di bawah eksitasi UV, jaringan biologis sering menunjukkan autofluoresensi biru dan rentan terhadap kerusakan cahaya, yang secara serius menghambat aplikasi analisis citra biologis partikel nano karbon dengan emisi panjang gelombang pendek [33]. Oleh karena itu, pengembangan partikel nano karbon dengan emisi panjang gelombang sangat dirasakan. Dalam studi ini, CQDs yang disiapkan menunjukkan fluoresensi kuning cerah di bawah eksitasi cahaya 400–450 nm. Fluoresensi kuning yang diangsangkan olehnya mungkin memungkinkan CQDs digunakan untuk deteksi tumor yang tersembunyi dalam tubuh. Namun, masih ada perjalanan panjang sebelum aplikasi praktis dalam citra kanker manusia.
Selain karakteristik luminesensi, kompatibilitas biologis yang tinggi dan toksisitas rendah selalu diperlukan jika CQDs dimaksudkan untuk dikembangkan sebagai reagen pelabelan bio potensial. Untuk aplikasi biomedis, bahan harus sangat kompatibel biologis pada dosis yang direkomendasikan. Untuk menguji toksisitas sel, sel HeLa ditreated dengan CQDs pada konsentrasi akhir yang bervariasi dari 0 hingga 400 μg mL−1 selama 24 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3B, lebih dari 95% sel bertahan sesuai dengan uji MTT (3-(4,5-dimetiltiazolil-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida), yang mengungkapkan bahwa CQDs secara praktis tidak beracun.
Data ini menunjukkan bahwa CQDs yang baru dihasilkan dengan fluoresensi kuning yang diangsangkan memiliki toksisitas sel rendah dan kompatibilitas biologis tinggi, yang memfasilitasi prospek menjanjikan untuk citra biologis.
Efikasi Terapi Fotodinamis
Inaktivasi Sel Kanker
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3C, kelangsungan tidak berbeda antara sel HeLa yang treated dengan CQDs atau cahaya biru saja. Treatment bersamaan dengan CQDs dan cahaya biru secara menjanjikan mengurangi kelangsungan sel HeLa, tergantung pada durasi foto-paparan. Setelah iradiasi pada 460 nm selama 15 menit, CQDs menunjukkan aktivitas antitumor yang luar biasa; kelangsungan sel HeLa menurun sekitar 40% pada konsentrasi 200 μg mL−1. Untuk mendeteksi lebih lanjut efek CQDs yang diangsangkan, uji MTT dilakukan untuk mengevaluasi konsentrasi inhibitor setengah maksimal (IC50) CQDs yang diangsangkan pada sel HeLa. Sebagai hasilnya, IC50 CQDs setelah diangsangkan pada sel HeLa sekitar 427,5 μg mL−1 (95% CI 366,7–498,7 μg mL−1) setelah iradiasi 10 menit dan sekitar 255,1 μg mL−1 (95% CI 220,9–249,8 μg mL−1) setelah paparan cahaya biru selama 15 menit.
Hasil ini menunjukkan bahwa CQDs yang diangsangkan dapat secara efektif membunuh sel tumor seperti beberapa obat kanker klinis, seperti Photofrin [34], yang mendorong nilai menjanjikan CQDs dalam terapi antitumor terpandu citra.
Generasi ROS CQDs
Selama PDT, sel kanker dapat dibunuh oleh ROS sitotoksik yang dihasilkan oleh photosensitiser yang diendosit di bawah kondisi iradiasi yang tepat [35, 36]. ROS dapat menonaktifkan sasaran sel melalui apoptosis atau necrosis dengan sedikit efek samping melalui PDT dalam beberapa penyakit [37,38,39,40]. Pemeriksaan Gambar 4A menunjukkan bahwa reagen ROS memancarkan fluoresensi merah, yang menunjukkan generasi ROS. Selain itu, sinyal merah ROS tumpang tindih dengan baik dengan fluoresensi CQDs, yang berarti generasi ROS berkaitan erat dengan pengambilan CQDs oleh sel tumor. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4B, dibandingkan grup kontrol dan tanpa iradiasi laser, grup eksperimental di bawah iradiasi laser 460 nm selama 15 menit menunjukkan generasi ROS yang jelas. Hasil kami menunjukkan bahwa CQDs dapat secara signifikan mempromosikan produksi ROS seluler pada iradiasi laser 460 nm dan memiliki potensi besar untuk aplikasi dalam PDT. Secara prinsip, CQDs dapat diangsangkan dari keadaan dasar (S0 pada Gambar 4C) ke keadaan terangsang (Sn pada Gambar 4C), dan efisiensi proses ini ditentukan oleh intensitas sumber cahaya dan koefisien eliminasi. Setelah relaksasi melalui pelarut, CQDs tetap pada tingkat getaran terendah dari keadaan terangsang singlet pertama. Karena relaksasi getaran yang cepat setelah eksitasi, energi foton yang dipancarkan dari keadaan terangsang singlet pertama (S1 pada Gambar 4C) lebih rendah dari energi foton eksitasi, yang mengakibatkan peningkatan panjang gelombang. Citra fluoresensi menggunakan transisi CQDs dari S0 ke Sn ke S1 [41]. CQDs diindori oleh sel tumor HeLa dan memancarkan fluoresensi saat diiluminasi oleh sumber panjang gelombang yang sesuai, sehingga memungkinkan sel untuk dilabeli. S1 dapat kembali ke keadaan S0 melalui fluoresensi atau melalui lintasan sistem ke keadaan terangsang triplet non-fluoresensi (T1 pada Gambar 4C) [7, 42]. Grup fluoresen T1 sangat aktif dalam reaksi transfer elektron, menghasilkan radikal bebas superoxide dan kemudian mengakibatkan degradasi grup fluoresen. Energi dari T1 yang ditransfer ke oksigen molekuler akan menghasilkan agen oksidasi oksigen singlet terangsang yang lebih kuat dari oksigen molekuler keadaan dasar. Radikal superoxide dan oksigen singlet, serta ROS lainnya, termasuk OH dan H2O2, bereaksi dengan molekul biologis di sekitar untuk menghasilkan fototoksisitas, yang mengakibatkan kematian sel. Setelah CQDs diindori oleh sel HeLa, illuminasi menghasilkan transfer keadaan singlet ke keadaan triplet melalui lintasan sistem, dan proses transfer energi menghasilkan ROS dan pada akhirnya mengakibatkan kematian sel. Di bawah sumber panjang gelombang yang sesuai, CQDs mengalami dua jenis transfer energi. Fluoresensi dipancarkan untuk melabeli sel tumor HeLa, dan sel HeLa dibunuh oleh ROS. Data eksperimental kami mengungkapkan kompatibilitas biologis yang baik CQDs yang baru diproduksi dalam gelap dan efisiensi pembunuh tumor dalam kondisi cahaya. Oleh karena itu, CQDs dapat digunakan sebagai photosensitiser untuk sel dan jaringan tumor.
Selain itu, masih merupakan masalah yang belum terpecahkan bagaimana CQDs dapat menargetkan tumor secara akurat dan membunuh sel tumor lebih efektif. Kelimpahan grup fungsi hidrofilik permukaan yang melimpah (karboksil, karbonil, epoksi, hidroksil, dll.) memungkinkan titik karbo untuk dikonjugasi dengan spesifik antibody yang dapat menargetkan tumor secara akurat, dan ini membutuhkan tumor memiliki biomarker spesifik. Secara bersamaan, titik karbo juga dapat berfungsi sebagai alat untuk pengiriman obat dan gen karena rasio luas permukaan terhadap volume yang tinggi [43]. Mempertimbangkan kompatibilitas biologis yang unggul, ukuran kecil untuk internalisasi oleh sel tumor, kaya akan grup fungsi permukaan, dan potensi citra bio, titik karbo (termasuk CQDs) dipercaya akan menjadi calon theranostik yang menjanjikan untuk terapi tumor. Namun, masih ada tantangan dan banyak masalah yang belum terpecahkan untuk aplikasi titik karbo dalam nanomedisin dan citra bio. Lebih banyak upaya harus dilakukan untuk mempromosikan terjemahan nanomedisin terkait titik karbo dari bangku ke ranjang pasien di masa depan.
Kesimpulan
Secara ringkasnya, kami menyintesis CQDs fotoluminesens menggunakan o-fenilendiamin dengan metode plasma. Diangsangkan oleh laser biru, CQDs dengan diameter sekitar 3,2 nm memancarkan fluoresensi kuning. Hasil Raman, UV–vis, FTIR, dan XPS menunjukkan bahwa lebih banyak atom karbon terlibat dalam hibridisasi sp2, membentuk grup organik baru. CQDs yang disintesis dengan metode plasma terbukti menjadi sonda yang efektif dalam eksperimen citra sel, dan fluoresensi kuning yang dipancarkan oleh CQDs dapat dengan jelas melabeli sel HeLa. Selain itu, CQDs yang disintesis menunjukkan kelarutan yang menguntungkan, tidak beracun, dan kompatibilitas biologis tinggi, yang dapat mempercepat kemampuan citra bio mereka. Selain itu, CQDs yang diangsangkan dapat secara efektif membunuh sel HeLa dengan generasi ROS, yang secara jelas menunjukkan sitotoksisitas fotodinamis yang memuaskan CQDs in vitro dan mendukung aplikasi mereka dalam PDT.
Metode Eksperimental
Sintesis Titik Kuantum Karbon
Sistem pemrosesan mikroplasma diringkas dalam File Tambahan 1: Gambar S1. Pipa stainless hollow dengan diameter dalam 180 μm dihubungkan ke sumber daya DC tegangan tinggi (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, China) dan dijaga pada 2 mm di atas permukaan larutan. Elektroda Pt (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) dihubungkan ke katoda sumber daya dan diendapkan dalam larutan. Kemudian, 400 mg o-fenilendiamin (Shanghai, China) dilarutkan dalam 40 mL air deion, dan 20 mL larutan o-fenilendiamin ditambahkan ke dalam Petri dish dan diaduk menggunakan pengaduk magnetik. Selama perlakuan mikroplasma, gas argon (Ar) mengalir melalui pipa pada laju aliran 60 sccm, dan arus DC dijaga pada 17 mA. Setelah 10 min perlakuan plasma, produk coklat kehitaman didialisis menggunakan membran dialisis (batas bobot molekuler, 500 Da) terhadap 2 L air deion selama 12 jam dan kemudian difilter melalui membran ultrafiltirasi 0,22 μm. Akhirnya, CQDs murni diperoleh dengan freezing drying.
Karakterisasi Struktur, Komposisi, dan Properti Optik CQDs
Ukuran dan morfologi CQDs dikarakterisasi dengan TEM menggunakan sistem JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Jepang). Spektroskopi fluoresensi dilakukan menggunakan Perkin Elmer LS 55 Luminescence Spectrometer (Waltham, MA, AS). Spektra absorpsi UV/Vis diukur menggunakan Varian Cary 50 UV–VIS spectrophotometer (Palo Alto, CA, AS). Spektra FTIR diperoleh menggunakan Nicolet 6700 spectroscope (Thermo Scientific, Waltham, MA, AS), dan spektroskopi Raman dilakukan menggunakan 800 UV micro-Raman spectrometer (Invia-reflex, Inggris). Eksperimen XPS dilakukan menggunakan Axis Ultra DLD system (Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Jepang).
Budidaya Sel dan Uji Situsel Toksisitas
Sel HeLa (ATCC, Manassas, VA, AS) dibudidayakan dalam Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) yang mengandung 10% FBS dan 1% penicillin–streptomycin pada 37 °C dalam atmosfer CO2 5% yang lembab. Untuk studi toksisitas CQDs, sel dihitung dan ditanam dalam plate 96-lubang yang berisi 200 μL medium lengkap dengan kepadatan 6000 sel per lubang. Setelah 24 jam budidaya, sel diinkubasi dengan CQDs pada konsentrasi 0, 25, 50, 100, 200, dan 400 μg mL−1 selama 24 jam lagi, dan kemudian kelangsungan sel dideteksi menggunakan uji MTT untuk menilai toksisitas CQDs. Singkatnya, larutan ini diganti dengan larutan uji MTT 100 μL (0,5 mg mL−1) dan diinkubasi selama 4 jam dalam incubator dalam gelap. Supernatan dihilangkan dan kristal dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO). Akhirnya, absorbansi setiap lubang diukur pada 490 nm. Kepadatan optik dikaitkan dengan kelangsungan sel dengan mengasumsikan 100% kelangsungan untuk sampel kontrol tanpa CQDs.
Uji MTT juga digunakan untuk mengevaluasi IC50 CQDs yang diangsangkan pada sel HeLa. Singkatnya, sel HeLa dalam plate 96-lubang diinkubasi dengan CQDs pada konsentrasi 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200, dan 6400 μg mL−1 selama 24 jam dalam incubator, treated dengan cahaya pada 460 nm selama 10 menit atau 15 menit secara terpisah, dan kemudian dibudidayakan selama 24 jam lagi. Kelangsungan sel setiap lubang dideteksi menggunakan uji MTT dan data digunakan untuk evaluasi IC50.
Citra Sel
Sel dengan konsentrasi 2 × 104 mL−1 ditanam dalam dish konfokal (diameter = 15 mm), dibudidayakan selama 24 jam, dan dicuci dengan PBS dua kali untuk memastikan tidak ada sel mati. Larutan CQD (200 μg mL−1; pH 7) ditambahkan dan sel diinkubasi selama 6 jam. Sel kemudian dicuci dengan PBS tiga kali untuk menghilangkan CQDs yang tidak terikat dan diperapih dengan 4% paraformaldehid. Kemudian, sampel diamati menggunakan CLSM (LSM510, Zeiss, Jerman) dengan eksitasi pada panjang gelombang yang bervariasi dari 400 hingga 450 nm.
Terapi Fotodinamis dan Pengukuran ROS
Untuk menyelidiki efek antitumor, sel HeLa diinkubasi dengan 200 μg mL−1 CQDs selama 24 jam pada 37 °C dalam gelap dan treated dengan cahaya pada 460 nm (30 mW cm−2) selama 5, 10, dan 15 menit. Setelah 24 jam inkubasi, uji MTT standar dilakukan untuk menentukan kelangsungan sel relatif. Generasi ROS seluler terdeteksi secara kimiawi menggunakan metode spektrofotometri dengan Fluorometric Intracellular Ros Assay Kit (sigma, AS). Sel dibudidayakan dalam dish konfokal (diameter = 15 mm) selama semalaman untuk pelepasan sel. Kemudian, sel diinkubasi dengan 200 μg mL−1 CQDs selama 4 jam. Selanjutnya, 100 μL/lubang Master Reaction Mix ditambahkan. Setelah inkubasi selama 1 jam, sel diperapih dengan 4% paraformaldehid selama 10 menit, dan citra fluoresensi sel diamati oleh CLSM. Untuk deteksi produksi ROS, sel dibudidayakan dalam plate 96-lubang dengan 200 μL medium budidaya. Setelah 24 jam inkubasi, medium diganti dengan 100 μL larutan CQD pada konsentrasi 0, 100, 200 μg mL−1, dan sel diinkubasi selama 4 jam lagi. Selanjutnya, sampel dicuci tiga kali dengan PBS, diiradiasi selama 15 menit atau tidak, dan diinkubasi dengan 100 μL/lubang Master Reaction Mix selama 1 jam. Akhirnya, intensitas fluoresensi diukur menggunakan pembaca fluoresensi (eksitasi 520 nm, emisi 605 nm).
Analisis Statistik
Eksperimen yang terlibat dalam studi ini diulang tiga kali, dan analisis statistik dilakukan menggunakan SPSS19.0. Perbedaan antara dua grup dibandingkan menggunakan uji Mann–Whitney U. IC50 CQDs yang diangsangkan pada sel HeLa dievaluasi dengan menggunakan regresi non-linear. P < 0,05 dianggap secara statistik signifikan.
