Penilaian Aktivitas dan Mekanisme Molekuler Penghambatan Sitokrom P450 3A4 Nanopartikel Emas dan Mekanisme Molekuler yang Mendasari Toksisitas Selulernya pada Lini Sel Karsinoma Hepatoseluler Manusia C3A

Metode

Sintesis Nanopartikel Emas

BPEI kationik 40 dan 80 nm, LA anionik, dan PEG Biopure™ AuNP netral disintesis khusus dari nanoComposix (San Diego, CA). Ukuran partikel, indeks polidispersitas (PDI), dan zeta (z)-potensial dan sifat spektral dikarakterisasi dengan hamburan cahaya dinamis (DLS), mikroskop elektron transmisi (TEM), dan spektroskopi UV-Vis. AuNP disintesis melalui reduksi hidrogen tetrakloroaurat (III) hidrat dalam larutan encer kalium karbonat diikuti dengan proses aging dan tangensial flow filtrasi (TFF). Permukaan AuNP difungsikan dengan LA atau PEG dengan menambahkan asam dihydrolipoic (0.2:1, w /dengan ) atau PEG yang diakhiri dengan tiol-metoksi (Laysan Bio Inc., Arab, AL) (0,5:1, w /dengan ), masing-masing, diikuti dengan pencucian TFF dan filtrasi steril. Permukaan AuNP yang difungsikan BPEI disintesis melalui kimia EDC dengan menghubungkan asam karboksilat LA ke amina bebas BPEI diikuti dengan pencucian TFF dan sentrifugasi berikutnya untuk menghilangkan BPEI yang tidak terikat.

Persiapan Protein Corona

Plasma darah manusia yang terkumpul (n = 5) diperoleh dari Biological Specialty Corp. (Colmar, PA). AuNP diinkubasi dalam plasma manusia (55%, v /v ) pada kecepatan konstan 250 rpm pada 37 °C selama 1 jam seperti yang dilaporkan [7, 8]. Protein yang tidak terikat dan terkait lemah dihilangkan dengan pencucian berulang dengan phosphate-buffered saline (PBS) pada 20.000×g selama 20 menit pada 20 °C. AuNP berlapis korona protein plasma manusia (PC) terakhir didispersikan dalam PBS dan kemudian diencerkan dalam media kultur sel untuk karakterisasi atau dosis fisikokimia lebih lanjut. Protokol mendetail diberikan di File tambahan 1.

Karakterisasi Fisikokimia AuNP

Diameter hidrodinamik (D _H ), PDI, dan potensi z dari AuNP telanjang 40 dan 80 nm (tanpa PC) yang difungsikan dengan BPEI, LA, dan PEG dalam air deionisasi (DI) dianalisis pada 25 °C pada 0 jam menggunakan Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrumen, Worcestershire, Inggris Raya); untuk AuNP berlapis PC di PBS pada 25 °C pada 0 jam; dan untuk semua AuNP telanjang dan PC dalam media kultur sel lengkap pada 37 °C pada 0 jam dan 24 jam. Medium kultur sel lengkap mengandung medium esensial minimum Eagle (EMEM) yang dilengkapi dengan 10% FBS (ATCC ^® , Manassas, VA). Sampel diukur 5 kali dengan 11 sub-run masing-masing 10 s. Selain itu, spektrum serapan optik diukur menggunakan pembaca lempeng mikro multi-mode hybrid Synergy H1 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT) pada suhu kamar pada 0 jam.

Mikroskop Transmisi Elektron

Morfologi AuNP dikarakterisasi menggunakan TEM. Semua larutan AuNP kosong dan PC (5 μL) ditempatkan pada kisi-kisi tembaga 200 mesh diikuti dengan pengeringan udara pada suhu kamar. Sampel dilihat pada Tecnai G2 Spirit BioTWIN dengan detektor Oxford (FEI Company, Hillsboro, OR) pada tegangan akselerasi 120 kV. Rangkaian mikroskop GATAN (GATAN Inc., Pleasanton, CA) mengukur diameter AuNP.

Pengukuran Kultur dan Viabilitas Sel

Sel C3A karsinoma hepatoseluler manusia (ATCC ^® CRL-10741™) dibeli dari ATCC ^® (Manassas, VA), dikultur dalam EMEM lengkap (ATCC ^® , Manassas, VA) dilengkapi dengan 10% FBS, dan diperluas menjadi sekitar 80% pertemuan dalam labu T75 dengan perubahan media setiap 4 hari. Setelah 0,25% (w /v ) pencernaan trypsin–0,53 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sel-sel dilapisi dalam pelat 96-sumur pada 8 × 10 ⁴ sel per sumur dan diinkubasi pada suhu 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 95% udara dan 5% CO_2. Setelah inkubasi 48 jam, sel diberi dosis AuNP tanpa kehadiran dan kehadiran PC. Sel C3A antara bagian 9 dan 12 digunakan untuk pemberian dosis.

Viabilitas C3A ditentukan menggunakan alamarBlue ^® uji viabilitas (Thermo Sci., Waltham, MA) seperti yang dijelaskan [7, 27]. Sel di pelat 96-sumur dirawat dengan BPEI-, LA-, dan PEG-AuNP 40 dan 80 nm dengan dan tanpa PC mulai dari 0 hingga 250 μg/cm ² . Setelah 24 jam, 10% dari alamarBlue ^® reagen dalam EMEM lengkap (v /v ) ditambahkan ke dalam kultur sel dan diinkubasi selama 3 jam pada 37°C. EMEM lengkap berfungsi sebagai dispersan. Interaksi AuNP dengan bahan aktif alamarBlue ^® reagen, resazurin atau produk tereduksi, resorufin diukur sebagai kontrol. AuNP dan resazurin (tanpa sel) atau media pemeliharaan (tanpa sel) berfungsi sebagai kontrol latar belakang. Fluoresensi, sebanding dengan viabilitas sel, dinormalisasi ke kontrol dan dinyatakan sebagai persentase relatif terhadap kelompok sel kontrol.

Pengukuran Serapan Seluler dengan Spektrometri Massa Plasma Gabungan Induktif

Sel diunggulkan pada 8 × 10 ⁴ sel per sumur dari pelat 96 sumur dan diberi dosis dengan konsentrasi tidak beracun 1,56 μg/cm ² dari semua AuNP kosong dan PC selama 0,5, 1, 3, 6, 12, dan 24 jam. Langkah etsa dimasukkan untuk menghilangkan AuNP yang terikat membran sel dan ikatan non-spesifiknya ke sumur seperti yang dilaporkan sebelumnya [28]. Panen sel dikeringkan dan dicerna dalam aqua regia dan konsentrasi Au intraseluler diukur menggunakan NexION ^™ 350X spektrometri massa plasma yang digabungkan secara induktif (ICP-MS) (PerkinElmer, Waltham, MA). Serapan seluler AuNP dihitung seperti yang dilaporkan sebelumnya dan dinyatakan sebagai jumlah AuNP per sel [29]. Protokol rinci diberikan dalam file tambahan 1.

Pengukuran stres oksidatif/nitrosatif

Sel diunggulkan pada 8 × 10 ⁴ sel per sumur dari pelat 96-sumur dan diberi dosis 40 nm BPEI- dan PEG-AuNP hingga 125 μg/cm ² selama 1, 3, dan 24 jam. Pengukuran langsung stres oksigen/nitrosatif diuji dengan kit uji total spesies oksigen reaktif (ROS)/superoksida (SO) (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) seperti yang dijelaskan sebelumnya [30]. Fluoresensi, sebanding dengan peningkatan ROS/spesies nitrogen reaktif (RNS) (Ex488/Em520 nm) atau SO (Ex550/Em610 nm) diukur dengan pembaca lempeng mikro. Protokol rinci diberikan dalam file tambahan 1.

Aktivitas Sitokrom P450 3A4

Efek samping dari 40 dan 80 nm telanjang dan PC AuNP pada aktivitas CYP3A4 dicirikan menggunakan uji P450-Glo™ (Promega Corp., Madison, WI) seperti yang dijelaskan sepenuhnya [7]. Sel C3A di pelat 96-sumur diberi dosis pada konsentrasi mematikan median (LC₅₀ ) nilai:127.3 μg/cm ² dari 40 nm BPEI-AuNP, 205,5 μg/cm ² dari 80 nm BPEI-AuNP, 192,5 μg/cm ² dari 40 nm LA-AuNP, dan 129,5 μg/cm ² dari 40 nm PEG-AuNP. Sejak LC₅₀ nilai 80 nm LA- dan PEG-AuNP tidak ditentukan, sel diperlakukan dengan LC₅₀ nilai 40 nm LA- dan PEG-AuNP (192,5 μg/cm ² dan 129,5 μg/cm ² , masing-masing). Setelah inkubasi 24 jam berakhir, sel diinkubasi dengan substrat CYP3A4 (luciferin-IPA) pada suhu 37°C selama 3 jam. Sinyal luminesensi, sebanding dengan aktivitas enzim, diukur dengan pembaca lempeng mikro dan kemudian dinormalisasi ke kontrol. Kontrol ditugaskan untuk menilai interaksi AuNP dengan substrat induk atau metabolit dan substrat bebas sel. Aktivitas CYP dinyatakan sebagai persentase relatif terhadap kelompok sel kontrol.

Pembuatan Profil Ekspresi Gen

Karena PEG-AuNP 40 nm beracun digunakan dalam penghambatan aktivitas CYP3A4 dan aktivitas antioksidan dalam sel C3A yang menunjukkan serapan seluler yang tinggi, ia dipilih untuk mengkarakterisasi mekanisme aksi molekuler yang mendasari toksisitas dan respons seluler diferensialnya. Sel diunggulkan pada 2,5 × 10 ⁶ sel per sumur dari pelat 6-sumur dan diberi LC₅₀ nilai PEG-AuNP 40 nm selama 24 jam pada 37 °C. Pada akhir inkubasi, sel dikenakan isolasi RNA dan kemudian dilakukan sintesis cDNA menggunakan RNA total dengan nilai rata-rata RNA Integrity Number (RIN) 7,8 seperti yang dijelaskan sebelumnya [7,8,9]. cDNA yang dihasilkan dicampur dengan RT ² Campuran master hijau SYBR (Qiagen Inc., Valencia, CA) dan kemudian diterapkan pada Pencari Jalur Toksikologi Molekuler Manusia atau Pengangkut Obat Manusia RT ² Susunan PCR Profiler™ di Quantstudio™ 7 Flex (BioSistem Terapan, Foster City, CA). Gen yang diekspresikan secara berbeda dengan perubahan lipatan <− 2 dan> 2 dan a p < 0.05 mewakili regulasi turun dan naik dari gen yang diinginkan. Untuk memvalidasi RT ² Data array PCR, ekspresi sembilan gen yang dipilih dievaluasi dengan sintesis cDNA dan PCR real-time berikutnya. Urutan primer diringkas dalam file tambahan 1:Tabel S1. Semua reaksi PCR dilakukan dalam rangkap tiga. Protokol rinci kondisi dan kuantifikasi PCR real-time diberikan dalam file tambahan 1.

Analisis Statistik

Konsentrasi mematikan rata-rata (LC₅₀ ) nilai AuNP dalam sel C3A diperkirakan dengan memasang persamaan Hill dengan kemiringan variabel ke data yang diamati (input tingkat konsentrasi AuNP dan viabilitas sel yang sesuai) menggunakan GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA) seperti yang dijelaskan [7]. Analisis varians satu arah (ANOVA) dilakukan menggunakan SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC) untuk menilai efek AuNP pada produksi ROS/RNS dan serapan seluler dalam sel C3A. Jika signifikan, perbandingan ganda dilakukan dengan uji beda nyata (HSD) Tukey pada p < 0,05.

Hasil dan Diskusi

Karakterisasi Fisikokimia AuNP PC Telanjang dan Plasma Manusia

Efek ukuran NP, muatan permukaan, dan pembentukan PC plasma manusia di sekitar AuNP pada diameter hidrodinamik (D_H ), indeks polidispersitas (PDI), potensi-z, dan sifat spektral serta morfologi telah dikarakterisasi menggunakan spektroskopi DLS, TEM, dan UV-Vis (Gbr. 1). Dalam gambar TEM, semua AuNP telanjang (tanpa PC) dalam air DI adalah monodispersi dengan distribusi ukuran yang ketat dan rentang spektrum UV-Vis yang unik dari 521-553 nm (Gbr. 1a). Formasi PC di sekitar AuNP diamati dengan perubahan distribusi ukuran dan pergeseran merah dari spektrum penyerapan (Gbr. 1b). D _H dan nilai PDI telanjang 40 dan 80 nm dan PC AuNP dalam EMEM lengkap kompatibel hingga 24 jam pada 37 °C kecuali untuk PC BPEI-AuNP 40 dan 80 nm yang menunjukkan penurunan nilai PDI (masing-masing 0,29 dan 0,32 ) pada 24 jam pada 37°C dibandingkan dengan 0 jam pada 37°C (masing-masing 0,62 dan 1,0) (Tabel 1). Nilai potensial Z dari semua telanjang dan PC AuNP relatif menurun pada 24 jam pada 37 °C dibandingkan dengan pada 0 jam pada 37 °C. Agregasi 40 dan 80 nm PC BPEI-AuNP di PBS dan EMEM lengkap diamati, yang berkorelasi dengan beberapa puncak dalam distribusi ukuran dan perubahan D_H dan pergeseran merah spektrum absorbansi relatif terhadap BPEI-AuNP telanjang (Gbr. 1 dan File tambahan 1:Gambar S1, Tabel 1). Hasil ini didukung oleh penelitian terbaru bahwa PC 40 dan 80 nm dan serum manusia albumin corona-coated BPEI-AuNP dikumpulkan dalam PBS dan berbagai media kultur sel [7,8,9].

Mikrograf elektron transmisi a AuNP dalam air deionisasi dan b PC AuNP di PBS pada 0 jam pada 25 °C, panjang gelombang spektrum UV-Vis (inset atas), dan distribusi hamburan cahaya dinamis (inset bawah). Panah menunjukkan pembentukan PC. PC korona protein plasma manusia, BPEI polietilenimin bercabang, LA asam lipoat, PEG polietilen glikol

Sitotoksisitas AuNP

Sitotoksisitas AuNP diukur menggunakan konsentrasi letal median (LC₅₀ ) dalam sel C3A. Muatan permukaan NP-, ukuran partikel-, dan pembentukan PC di sekitar LC yang bergantung pada NP₅₀ analisis dengan AuNP ditunjukkan pada Gambar. 2. Semua 40 nm BPEI-, LA, dan PEG-AuNP dan 80 nm BPEI-AuNP bersifat sitotoksik terhadap sel C3A dengan LC₅₀ yang sesuai. berkisar dari 127,3 hingga 205,5 μg/cm ² (Gbr. 2a). PEG-AuNP telanjang 80 nm menunjukkan 59% viabilitas sel pada konsentrasi tertinggi 250 μg/cm ² , sedangkan 80 nm LA-AuNP tidak sitotoksik. PC mengurangi toksisitas AuNP sebagai fungsi dari modifikasi ukuran dan muatan permukaan kecuali untuk BPEI-AuNP 80 nm yang menunjukkan 51% viabilitas sel pada 250 μg/cm ² pada 24 jam (Gbr. 2b). Studi terbaru menunjukkan bahwa 40 nm BPEI-AuNP telanjang beracun bagi hepatosit manusia primer, HUVEC, dan sel tubulus proksimal ginjal manusia (HPTC) (LC₅₀ berkisar antara 22,4–80,3 μg/cm ² ) [7,8,9]. BPEI-AuNP berlapis PC bersifat sitotoksik terhadap hepatosit manusia, tetapi AuNP berlapis HSA tidak bersifat sitotoksik [7]. Hasil ini menunjukkan bahwa sel C3A lebih tahan terhadap toksisitas AuNP daripada sel manusia primer karena tingkat proliferasi yang tinggi dan aktivitas metabolisme dari garis sel kanker [31].

Viabilitas C3A dan LC₅₀ nilai 40 dan 80 nm a AuNP dan b PC AuNP. Data mewakili mean ± S.D. (n = 3). Korona protein plasma manusia PC, ND tidak ditentukan, polietilenimin bercabang BPEI, asam lipoat LA, polietilena glikol PEG, LC₅₀ konsentrasi mematikan rata-rata

Serapan AuNP Intraseluler

Ukuran NP, muatan permukaan, dan serapan seluler yang bergantung pada PC dari semua AuNP telanjang dan PC ditentukan pada 1,56 μg/cm ² hingga 24 jam. ANOVA menunjukkan perubahan yang signifikan dengan ukuran, PC dan waktu (p < 0,0001), dan interaksi (ukuran PC ×, PC × waktu, ukuran × waktu, dan PC × ukuran × waktu) (p < 0.001) untuk semua penyerapan AuNP selain interaksi yang tidak signifikan (ukuran PC ×) untuk penyerapan LA- dan PEG-AuNP (p = 0.2). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a-f, peningkatan linier dalam serapan seluler dari 40 dan 80 nm telanjang dan PC AuNP diamati selain telanjang 40 nm dan PC BPEI-AuNP yang mencapai serapan seluler tertinggi pada 6 jam dan menurun sesudahnya ( Gambar 3a). Namun, pada 24 jam, BPEI-AuNP kationik 40 nm mengandung serapan tertinggi diikuti oleh PEG-AuNP 40 nm netral dan kemudian LA-AuNP anion 40 nm, yang dikaitkan dengan urutan sitotoksisitas sel C3A dari AuNP (Gbr. 2a ). Hasil ini konsisten dengan penelitian sebelumnya bahwa poli kationik (N-(2-aminoetil) akrilamida)- dan BPEI-AuNP memiliki serapan seluler terbesar dibandingkan dengan poli(asam akrilat) anionik- dan LA-AuNP dan poli( N-(2,3-dihidroksipropil)akrilamida- dan PEG-AuNP dalam sel adenokarsinoma kolorektal manusia Caco-2, HPTC, dan hepatosit manusia [9, 32]. Selain itu, kompleks NP-PC melemahkan semua 40 dan 80 nm BPEI- dan LA-AuNP dan PEG-AuNP 40 nm dalam sel C3A tetapi mempercepat penyerapan PEG-AuNP 80 nm (Gbr. 3f). Hasil ini didukung oleh penelitian terbaru bahwa PC menghambat penyerapan AuNP di HUVEC, HEK, dan HPTC, terlepas dari ukuran dan muatan permukaan [8, 9, 33] Sebaliknya, korona PC dan HSA meningkatkan serapan PEG-AuNP 40 nm di hepatosit manusia tetapi yang terakhir menginduksi serapan PEG-AuNP 80 nm di HEK [7, 33] .

Serapan seluler 40 nm a . yang bergantung pada waktu BPEI-AuNP, b LA-AuNP, dan c PEG-AuNP, dan 80 nm d BPEI-AuNP, e LA-AuNP, dan f PEG-AuNP tanpa kehadiran dan kehadiran PC dalam sel C3A hingga 24 jam. Data mewakili mean ± S.D. (n = 3). Huruf berbeda nyata menurut uji HSD Tukey. BPEI polietilenimin bercabang, LA asam lipoat, PEG polietilen glikol, PC korona protein plasma manusia, MSD perbedaan signifikan minimal. *p < 0,05; ** p < 0,005; ***p < 0,0001

Pengukuran Stres Oksidatif dan Nitrosatif

Karena 40 nm BPEI- dan PEG-AuNP telanjang menunjukkan sitotoksisitas dan serapan seluler yang lebih tinggi dalam sel C3A dibandingkan dengan AuNP lainnya, mereka dipilih untuk menyelidiki stres oksidatif/nitrosatif yang diinduksi AuNP. Kedua AuNP memodulasi generasi ROS/RNS dalam sel C3A dengan cara yang bergantung pada waktu dan konsentrasi (p < 0,0001) dan berdasarkan interaksi (waktu × konsentrasi, p < 0,0001). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, pembentukan ROS/RNS menurun pada konsentrasi yang lebih tinggi dari BPEI-AuNP 40 nm (62,5 μg/cm ² dan 125 μg/cm ² ) pada 1 jam pada 37 °C tetapi meningkat hingga 24 jam. Sebaliknya, PEG-AuNP 40 nm secara substansial menekan generasi ROS/RNS pada 39,1 μg/cm ² seterusnya dengan perubahan lipatan < 0,5 hingga 24 jam (Gbr. 4b). Aktivasi kematian sel sering berkontribusi terhadap toksisitas NP dan dalam banyak kasus, peningkatan produksi ROS/RNS, yang menyebabkan stres oksidatif, bertanggung jawab atas toksisitas NP [34]. Produksi ROS/RNS yang bergantung pada muatan permukaan diamati dengan BPEI kationik 40 nm dan PEG-AuNP netral. BPEI-AuNP 40 nm menunjukkan pola bifasik generasi ROS/RNS (antioksidan pada 1 jam dan prooksidan pada 3 jam dan seterusnya) pada konsentrasi tinggi, yang dikaitkan dengan sitotoksisitasnya dalam sel C3A (Gbr. 2a). Hasil ini konsisten dengan penelitian sebelumnya bahwa generasi ROS yang diinduksi BPEI-AuNP 40 dan 80 nm dan 20 nm sitrat-AuNP dikaitkan dengan sitotoksisitasnya masing-masing pada hepatosit manusia dan sel HepG2, dalam hal waktu dan konsentrasi. [7, 35]. AuNP menunjukkan sitotoksisitas yang diinduksi stres oksidatif dalam sel leukemia promyelocytic manusia, HL-60 dengan pengurangan glutathione total, terlepas dari ukuran [19]. Sebaliknya, PEG-AuNP 40 nm berfungsi sebagai antioksidan yang menunjukkan bahwa stres oksidatif/nitrosatif mungkin bukan mekanisme langsung dari sitotoksisitas yang diinduksi PEG-AuNP 40 nm dalam sel C3A (Gbr. 2b).

Produksi ROS/RNS yang bergantung pada waktu dan konsentrasi dalam sel C3A yang terpapar a 40 nm BPEI-AuNP dan b PEG-AuNP 40 nm hingga 24 jam. Data mewakili mean ± S.D. (n = 3). Huruf berbeda nyata menurut uji HSD Tukey. BPEI polietilenimin bercabang, LA asam lipoat, PEG polietilen glikol, CTRL kontrol, MSD perbedaan signifikan minimum, PCN piosianin (penginduksi ROS). ** p < 0,005; ***p < 0,0001

Pengukuran Aktivitas CYP3A4

Efek penghambatan 40 dan 80 nm telanjang dan PC AuNP pada aktivitas CYP3A4 dicirikan. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5, BPEI-, LA-, dan PEG-AuNP 40 nm dan BPEI-AuNP 80 nm pada LC₅₀ nilai menghambat aktivitas katalitik CYP3A4 dalam sel C3A dengan aktivitas yang sesuai dari 20,1 hingga 31,4% relatif terhadap kontrol, terlepas dari ukuran dan muatan permukaan. Konsentrasi nontoksik dari 80 nm LA- dan PEG-AuNP juga menekan aktivitasnya (masing-masing 31,4 dan 26,6%). Namun, PC secara ekstensif memperbaiki penghambatan CYP3A4 yang diinduksi AuNP 40 dan 80 nm selain PEG-AuNP 40 dan 80 nm yang menunjukkan aktivitas 63 dan 46% dibandingkan dengan kontrol. Hal ini konsisten dengan penelitian in vitro dengan jaringan hati manusia dan hepatosit bahwa asam tanat anionik-AuNP dan kationik 40 dan 80 nm BPEI-AuNP secara substansial menghambat aktivitas katalitik CYP3A4 [7, 25]. Sebaliknya, kationik PEI-AuNP dan polivinilpirolidon netral-AuNP-menginduksi ekspresi mRNA dari CYP1A2, CYP2C9, dan CYP3A4 dalam sel HepG2 dan CYP2B dan CYP3A dalam irisan hati tikus, masing-masing [36, 37]. Studi terbaru melaporkan bahwa 40 dan 80 nm bare dan PC BPEI-AuNP secara substansial menekan aktivitas CYP3A4 dalam hepatosit manusia melalui perubahan konformasi protein atau memblokir kantong substrat sebagai penghambatan reversibel [7].

Efek penghambatan AuNP pada aktivitas CYP3A4 dalam sel C3A yang terpapar BPEI-, LA-, dan PEG-AuNP 40 dan 80 nm tanpa kehadiran dan kehadiran PC selama 24 jam. Nilai mewakili mean ± S.D. (n = 3). BPEI polietilenimin bercabang, LA asam lipoat, PEG polietilen glikol, PC korona protein plasma manusia

Profil Ekspresi Gen Berfokus Jalur Toksisitas dari 40 nm PEG-AuNP

Dari perwakilan gen yang mencakup 13 jalur stres dan toksisitas yang berbeda, total 212 gen (gen ↓186 dan 26) diekspresikan secara berbeda pada LC₅₀ nilai PEG-AuNP 40 nm (Gbr. 6, File tambahan 1:Tabel S2–S7). 12,3% (26 gen, 26, 0 gen) dari total gen (212 gen) sebagian besar terlibat dalam -oksidasi asam lemak mitokondria; untuk apoptosis 11,3% (24 gen, 18, 6 gen); untuk jalur kerusakan dan perbaikan DNA 11,3% (24 gen, 18, 6 gen); dan untuk respon kejutan panas 11,3% (24 gen, 22, 2).

Gen representatif yang terlibat dalam a -oksidasi asam lemak mitokondria, b apoptosis, c stres oksidatif dan respons antioksidan, dan d ambilan hati dan pengangkut penghabisan pada LC₅₀ nilai 40 nm PEG-AuNP. Semua data memiliki perubahan lipat <− 2 dan> 2 di p < 0,05. Analisis ontologi gen tercantum dalam File tambahan 1:Tabel S2–S7

Dalam jalur -oksidasi asam lemak mitokondria, gen yang mengkode tiga enzim berbeda yang terlibat dalam produksi asil-KoA dan ekuivalen pereduksi NADH dan FADH₂ terutama ditekan; Gen ACAD11, ACAD9, ACADM, dan ACADS dalam dehidrogenase Asil-CoA (2,0 hingga 13,6 kali lipat); ACAA1 dan ACAA2 dalam tiolases ketoasil-KoA (7,3 hingga 14,9 kali lipat); DECR1, ECHS1, EHHADH, dan HADHA (10,7 hingga 18,9 kali lipat) dalam enoyl-CoA hydratase (Gbr. 6a, File tambahan 1:Tabel S2). Asam lemak mitokondria -oksidasi memainkan peran penting dalam produksi asil-KoA dan mereduksi ekuivalen NADH dan FADH₂ , yang berasosiasi dengan empat enzim utama (asil-KoA dehidrogenase, enoil-KoA hidratase, hidroksiasil-KoA dehidrogenase, dan ketoasil-KoA tiolase [38, 39]. Selanjutnya, pembawa elektron, NADH dan FADH₂ , terlibat dalam siklus asam trikarboksilat (TCA) dan rantai pernapasan mitokondria, menghasilkan produksi ATP. Dalam studi saat ini, PEG 40 nm menginduksi disfungsi mitokondria, hilangnya pemeliharaan ATP melalui penurunan tingkat ATP dan FADH intraseluler₂ , akibatnya menentukan sitotoksisitasnya dalam sel C3 (Gbr. 2a). Fenomena serupa dilaporkan pada hepatosit manusia, HUVEC dan HPTC, yang terpapar pada 40 nm BPEI-AuNP yang menunjukkan bahwa disfungsi mitokondria mungkin merupakan mekanisme umum toksisitas AuNP, terlepas dari muatan permukaan dan jenis sel [7,8,9]. Sebuah studi baru-baru ini melaporkan bahwa sitotoksisitas yang relevan dengan disfungsi mitokondria diamati pada sel epitel kanker prostat yang diabadikan dan sel epitel kanker paru-paru sebagai respons terhadap penghambat fosforilasi STAT3, OPB-51602 [40].

Dalam jalur apoptosis, enam gen pro-apoptosis CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A, TNFRSF10B, dan TNFSF10 diregulasi, sedangkan enam gen anti-apoptosis AKT1, ALB, BCL2, BCL2L1, MCL1, dan XIAP diturunkan regulasi (Gbr. 6b, File tambahan 1:Tabel S3), yang berkorelasi dengan sitotoksisitas tergantung dosis dalam sel C3A (Gbr. 2a). In DNA damage and repair check point, genes of the checkpoint kinases (CHEK1/2), the DNA excision repair genes (ERCC1/2/3), and the DNA ligase IV (LIG4) were upregulated but other excision repair genes (ERCC5/6, XRCC1/5), the checkpoint kinase (CDKN1A), and protein kinases (PRKDC) genes were downregulated (2- to 19-fold). These results suggested that the 40 nm PEG-AuNP-induced interference with cell cycle and DNA repair system may correlate with an induction of cell death in C3A cells (Fig. 2a, Additional file 1:Table S3). Genes encoding two different heat shock proteins (HSP) (A1A and A1B) were upregulated (10.2- to 14.2-fold) but HSP40 subfamily A, B, and C; HSP90 member 1; and HSP60 were downregulated (2- to 16-fold) (Additional file 1:Table S4).

In oxidative stress and antioxidant response, the 40 nm PEG-AuNP at LC₅₀ value induced antioxidants genes and suppressed pro-oxidants, which was associated with a decrease in ROS/RNS generation being antioxidant itself (Fig. 4b). In antioxidant genes, glutathione peroxidase (GPX) 1, GPX2, GPX4, PRDX1, PRDX2, PRDX6, superoxide dismutase (SOD) 1, and CAT were induced (3.8- to 18.1-fold). In pro-oxidant genes, TXNIP and PPP1R15B were suppressed (4.8- and 17-fold, respectively) (Fig. 6c, Additional file 1:Table S5). This is consistent with a previous study that AuNP displayed oxidative stress-induced cytotoxicity in HepG2 and human hepatocytes, irrespective of size [7, 19].

In phase I metabolism, CYP3A4 and ESD genes were extensively suppressed (7-fold and 12-fold, respectively). Especially, inhibitory effect of 40 nm PEG-AuNP on CYP3A4 expression was correlated with a decrease in CYP3A4 activity (Fig. 5). Recent studies reported that the 40 nm BPEI-AuNP inhibited gene expression of CYP1A2, CYP2C9, and CYP3A4 in human hepatocytes; ESD in HUVEC; and CYP1A1 in HPTC [7,8,9]. Epidemiology study demonstrated that CYP enzymes in liver tissue of HCC patient were substantially inhibited by the tumorigenic process at the molecular and the functional level [41].

Drug Uptake and Efflux Transporter Gene Expression Profiling

The development of multidrug resistance (MDR) by tumor cells is one of the main causes of cancer treatment failures [42, 43]. Integral membrane transporters-mediated decrease in drug uptake and increase in drug efflux including P-glycoprotein (P-gp) and breast cancer resistance protein (BCRP) is one of the major mechanisms of MDR.

Differential gene expression of drug efflux and uptake transporters in C3A cells exposed to 40 nm PEG-AuNP showed that a total of 14 genes of ABC transporters (↓12 and ↑2 genes) and a total of 21 genes of SLC transporters (↓21 and ↑0 genes) were substantially modulated at LC₅₀ value (Figs. 6d and 7, Additional file 1:Table S7). In drug efflux transporters of ABC family, genes of multidrug resistance-associated protein (MRP3/ABCC3), MRP4 (ABCC4), and cholesterol efflux regulated protein (CERP/ABCA1) in basolateral membrane were downregulated (7.2- to 10.4-fold). The genes encoding P-gp (ABCB1), MRP2 (ABCC2), BCRP (ABCG2), and sterolin 2 (ABCG8) in canalicular efflux transporters were also suppressed (8.6- to 13.8-fold). In contrast, multidrug resistance (MDR4/ABCB4) in canalicular membrane and mitochondria ABC transporter (MTABC3/ABCB6) in the outer mitochondrial membrane were highly upregulated (9.8-fold and 5.8-fold, respectively). In drug uptake transporters, genes of copper transporter protein (CTR1/SLC31A1) and to a lesser degree organic anion transporting (OAT7/SLC22A9) were also inhibited (18- fold and 15-fold, respectively). These results support a recent study that the 40 nm BPEI-AuNP downregulate MDR3 in human hepatocytes but upregulates MRP3 in HUVEC indicating surface charge- and cell type-dependent interaction between AuNP and efflux transporters [7, 8]. Epidemiology study exhibited that a high expression of BCRP and a low expression of OCT3 occurred in HCC tumor, which was closely associated with the tumor progression and its size [44]. A previous study exhibited that P-gp inhibitor, verapamil enhanced cytotoxicity of glutathione-AuNP conjugated with doxorubicin in feline fibrosarcoma cell lines by increasing intracellular drug concentration [45]. The current study emphasizes that the mechanisms-derived information on the 40 nm PEG-AuNP identified a separate but still complementary action on mitochondrial fatty acid β-oxidation, TCA cycle and respiratory chain, drug efflux and uptake transporters, as well as CYP3A4 activity in C3A cells (Fig. 7). To the end, this will highlight AuNP interaction with key biological processes and its underlying molecular mechanism in HCC, which may be further implicated in the development of more effective therapeutic target in HCC treatment.

A schematic representation of the basic mechanisms of action of 40 nm PEG-AuNP in HCC treatment. Green bars (an inhibition) and pink triangles (an induction) indicate the 40 nm PEG-AuNP-modified biological markers and pathways. Gene ontology analysis is listed in Additional file 1:Tables S2–S7

To validate gene expression analysis from RT ² array, the nine genes were selected for real-time PCR. In Additional file 1:Table S1, all nine genes were modulated at LC₅₀ of the 40 nm PEG-AuNP. These transcriptional changes were consistent with those in gene expression analysis with PCR arrays (Fig. 6, Additional file 1:Tables S2–S7).

Conclusions

We have presented that cationic BPEI-, anionic LA-, or neutral PEG-AuNP interaction with human plasma protein corona (PC) caused the changes in D _H , PDI, and z-potential of AuNP and further influenced cellular responses in C3A cells. All bare (no PC) 40 and 80 nm AuNP were cytotoxic to C3A cells besides the 80 nm LA-AuNP but PC completely ameliorated their cytotoxicities besides the 80 nm BPEI-AuNP. The 40 nm bare BPEI-AuNP showed the highest cellular uptake followed by the 40 nm PEG-AuNP and then the 40 nm LA-AuNP, whereas PC suppressed AuNP uptake besides the 80 nm PEG-AuNP. The 40 nm BPEI-AuNP caused biphasic responses of oxidative stress (pro- and antioxidant) in C3A cells, whereas the 40 nm PEG-AuNP was antioxidant. CYP3A4 activity was extensively suppressed by all bare AuNP, irrespective of size and surface charges, whereas PC substantially ameliorated its inhibitory effect on enzyme activity besides the 40 and 80 nm PEG-AuNP. Differentially expressed genes at LC₅₀ value of 40 nm PEG-AuNP were mainly involved in mitochondrial fatty acid β-oxidation and to a lesser degree hepatic efflux/uptake transporters. The 40 nm PEG-AuNP inhibited three main enzymes in β-oxidation (acyl-CoA dehydrogenase, enoyl-CoA hydratase, and ketoacyl-CoA thiolase), other enzymes in TCA cycle, and the mitochondrial respiratory chain for ATP production. The 40 nm PEG-AuNP increased the expression of pro-apoptotic genes and decreased anti-apoptotic genes at LC₅₀ nilai. A high level of antioxidants and a low level of pro-oxidants genes were observed in C3A cells exposed to 40 nm PEG-AuNP. In addition, genes of drug efflux and uptake transporters located in both basolateral and canalicular membrane were substantially modulated.

Singkatan

ANOVA:

One-way analysis of variance

AuNP:

Gold nanoparticles bare:no PC

BPEI:

Branched polyethylenimine

CYP:

Cytochrome P450

D _H :

Hydrodynamic diameters

DLS:

Hamburan cahaya dinamis

EDTA:

Ethylenediaminetetraacetic acid

EMEM:

Eagle’s minimum essential medium

HCC:

Human hepatocellular carcinoma

HPTC:

Human renal proximal tubular cells

HSD:

Tukey’s honest significant difference test

HUVEC:

Human umbilical vein cells

ICP-MS:

Inductively coupled plasma mass spectrometry

LA:

Anionic lipoic acid

LC₅₀ :

Median lethal concentration

MDR:

Resistensi multiobat

NP:

Nanopartikel

PBS:

Phosphate-buffered saline

PC:

Human plasma protein corona

PDI:

Indeks polidispersitas

PEG:

Neutral polyethylene glycol

RNAi:

RNA interference

RNS:

Reactive nitrogen species

ROS:

Spesies oksigen reaktif

SO:

Superoxide

TEM:

Mikroskop elektron transmisi

TFF:

Tangential flow filtration

Sintesis dan Studi In Vitro dari Integrin Penargetan Probe Mode Ganda αvβ3 Electric- Field-Modified In Situ Deposisi Tepat Serat Lem Medis Electrospun pada Hati untuk Hemostasis Cepat