Nanopartikel Emas Memodulasi Aktivitas CYP3A4 dan Toksisitas Seluler pada Karsinoma Hepat sel Manusia: Pengaruh Ukuran, Kimia Permukaan, dan Korona Protein
Abstrak
Kami menyelidiki bagaimana nanopartikel emas (AuNP) 40- dan 80-nm yang fungsionalkan polietilenimina bercabang kationik (BPEI), asam lipoat anionik (LA), atau polietilen glikol netral (PEG) berinteraksi dengan baris sel karsinoma hepat sel manusia (HCC) C3A, baik dalam kehadiran maupun tanpa korona protein plasma manusia (PC). AuNP polos, kecuali 80-nm LA-AuNP, sitotoksik pada sel C3A, tetapi PC secara signifikan meredam efek ini. Penyerapan seluler bergantung pada waktu meningkat untuk 40-nm BPEI-AuNP, sedangkan PC mengurangi penyerapan 80-nm PEG-AuNP. BPEI-AuNP memicu respons stres oksidatif/nitrosatif bifasik, sementara PEG-AuNP bertindak sebagai antioksidan yang kuat. Semua AuNP polos menghambat aktivitas CYP3A4 terlepas dari ukuran atau muatan permukaan, tetapi PC memulihkan aktivitas kecuali untuk PEG-AuNP. 40-nm PEG-AuNP menginduksi perubahan ekspresi gen yang terutama mempengaruhi β-oksidasi asam lemak mitokondria dan, dalam ukuran yang lebih kecil, transportir pengangkut/masuk hati. Temuan ini mendalam pemahaman kita tentang interaksi AuNP-sel dan dasar molekularnya dalam HCC, menawarkan wawasan untuk strategi terapeutik yang ditingkatkan.
Latar Belakang
Karsinoma hepat sel (HCC) tetap menjadi salah satu kanker paling prevalen di seluruh dunia dan penyebab kematian kanker yang tumbuh paling cepat di Amerika Serikat [1, 2]. Opsi pengobatan kuratif saat ini—transplantasi hati atau reseksi bedah—terbatas pada penyakit stadium awal, sementara tumor lanjut bergantung pada kemoterapi atau radioterapi, keduanya menderita selektivitas rendah dan toksisitas sistemik yang signifikan [3, 4]. Terapi silencing gen, terutama interferensi RNA (RNAi), menjanjikan spesifisitas yang lebih tinggi, tetapi pengiriman yang efisien memerlukan vektor yang menembus sel target dengan aman. Sementara vektor viral menawarkan efisiensi transduksi yang tinggi, platform non-viral seperti nanopartikel (NP) dipilih karena profil keamanan dan properti fisikokimia yang dapat disesuaikan [5–8]. Nanopartikel emas (AuNP) sangat menarik karena modifikasi permukaan yang mudah dan fitur optiknya, yang memungkinkan pengiriman terpadu beban terapeutik [11, 12]. Namun, setelah memasuki aliran darah, AuNP memperoleh korona protein (PC) yang mengubah kimia permukaannya dan consequently nasib biologisnya, termasuk penyerapan seluler dan toksisitas [13–17]. Memahami bagaimana ukuran NP, muatan permukaan, dan PC memodulasi respons seluler pada sel HCC sangat penting untuk merancang nanomedisin yang aman dan efektif.
Metode
Sintesis Nanopartikel Emas
AuNP 40- dan 80-nm difabriksi secara khusus oleh nanoComposix (San Diego, CA). Fungsionalisasi dengan BPEI, LA, atau PEG dicapai melalui kimia EDC, konjugasi asam lipoat, atau tiol-metoksi PEGylasi, masing-masing. Ukuran, indeks polidispersi (PDI), dan potensial zeta dikonfirmasi oleh pencaran cahaya dinamis (DLS), mikroskop elektron transmisi (TEM), dan spektroskopi UV-Vis. AuNP difilter dengan filtrasi aliran tangential (TFF) dan difilter steril.
Persiapan Korona Protein
Plasma manusia (n=5) dari Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) dicampur dengan AuNP pada 55 % (v/v) dan diinkubasi pada 37 °C, 250 rpm selama 1 jam. Protein yang longgar dihilangkan dengan pencucian PBS berulang (20 000 × g, 20 menit). AuNP yang dilapisi PC yang dihasilkan dicerna kembali dalam PBS dan kemudian dicerna ke dalam medium kultur sel.
Karakterisasi Fisikokimia AuNP
Diameter hidrodinamik (DH), PDI, dan potensial zeta AuNP polos dan yang dilapisi PC diukur dalam air DI, PBS, dan EMEM lengkap (10 % FBS) pada 25 °C dan 37 °C (0 dan 24 jam). Spektrum absorpsi optik direkam pada suhu ruangan.
Mikroskop Elektron Transmisi
Morfologi AuNP dievaluasi dengan TEM (Tecnai G2 Spirit BioTWIN, 120 kV). Sampel ditetapkan pada grid tembaga 200-mesh dan dikeringkan udara.
Kultur Sel dan Pengukuran Viabilitas
Sel C3A (ATCC CRL-10741) dikultur dalam EMEM + 10 % FBS, ditanam pada 8 × 10^4 sel/well (plate 96-well), dan diizinkan untuk menempel selama 48 jam sebelum pemberian dosis. Viabilitas diukur menggunakan ujian alamarBlue® setelah 24 jam paparan konsentrasi AuNP yang bervariasi dari 0 hingga 250 µg/cm^2.
Pengukuran Penyerapan Seluler oleh ICP-MS
Sel diobati dengan 1,56 µg/cm^2 AuNP selama 0,5–24 jam. Setelah langkah ets untuk menghapus partikel yang terikat permukaan, sel dicerna dalam aqua regia, dan Au intrakeluler dikuantifikasi oleh ICP-MS. Penyerapan dinyatakan sebagai AuNP per sel.
Pengukuran Stres Oksidatif/Nitrosatif
Produksi ROS/RNS dikuantifikasi menggunakan kit ujian total ROS/SO (Enzo Life Sciences) pada 1, 3, dan 24 jam setelah paparan 40-nm BPEI- dan PEG-AuNP hingga 125 µg/cm^2.
Aktivitas Sitokrom P450 3A4
Aktivitas CYP3A4 dievaluasi dengan ujian P450-Glo™ (Promega) setelah paparan 24 jam konsentrasi LC_50 dari setiap jenis AuNP. Luminescensi dinormalisasi terhadap kontrol kendaraan.
Profiling Ekspresi Gen
Dengan efek yang jelas dari 40-nm PEG-AuNP, sel C3A diekspos pada LC_50-nya (129,5 µg/cm^2) selama 24 jam. RNA total (RIN ≥ 7,8) diisolasi, ditranskripsi balik, dan dianalisis dengan Human Molecular Toxicology Pathway Finder dan Human Drug Transporters RT^2 Profiler™ PCR arrays (Qiagen). Gen yang diekspresikan berbeda (|fold change| > 2, p < 0,05) divalidasi oleh qRT-PCR untuk sembilan gen representatif.
Analisis Statistik
Nilai LC_50 dipasang menggunakan persamaan Hill lereng variabel di GraphPad Prism. One-way ANOVA (SAS 9.4) diikuti oleh ujian Tukey’s HSD menilai signifikansi (p < 0,05).
Hasil dan Pembahasan
Karakterisasi Fisikokimia AuNP Polos dan yang Dilapisi PC
Seperti ditunjukkan pada Gambar 1, TEM mengonfirmasi AuNP monodisperse dengan ukuran yang cocok dengan diameter nominal 40 dan 80 nm. Pembentukan PC menginduksi peningkatan modest pada DH dan pergeseran merah pada puncak plasmon UV-Vis, yang menunjukkan adsorpsi protein. Dalam EMEM lengkap, DH dan PDI tetap stabil selama 24 jam, kecuali untuk PC-BPEI-AuNP, yang menampilkan penurunan sementara pada PDI, yang menunjukkan stabilitas koloid yang ditingkatkan. Potensial zeta bergeser ke nilai netral setelah pelapisan PC, yang mencerminkan masking muatan permukaan oleh protein.
Mikrograf mikroskop elektron transmisi dari (a) AuNP polos dalam air DI dan (b) AuNP-PC dalam PBS pada 0 jam, 25 °C. Spektrum UV-Vis dan distribusi DLS disertakan sebagai inset. Panah menunjukkan pembentukan PC. PC: korona protein plasma manusia; BPEI: polietilenimina bercabang; LA: asam lipoat; PEG: polietilen glikol.
Sitotoksisitas AuNP
Nilai LC_50 untuk AuNP polos bervariasi dari 127,3 hingga 205,5 µg/cm^2 (Gambar 2a). Semua AuNP 40-nm BPEI-, LA-, dan PEG-, serta AuNP 80-nm BPEI, sitotoksik, sedangkan AuNP 80-nm LA tidak menunjukkan toksisitas yang signifikan. PC secara signifikan mengurangi sitotoksisitas di sebagian besar jenis AuNP, dengan pengecualian AuNP 80-nm BPEI, yang mempertahankan 51 % viabilitas pada 250 µg/cm^2 (Gambar 2b). Temuan ini sesuai dengan kerja sebelumnya yang menunjukkan pemerahan toksisitas AuNP yang dimediasi PC dalam hepatosit primer dan baris sel lainnya [7–9].
Viabilitas sel C3A dan nilai LC_50 untuk (a) AuNP polos dan (b) AuNP yang dilapisi PC. Data mewakili mean ± S.D. (n = 3). PC: korona protein plasma manusia; ND: tidak ditentukan; BPEI: polietilenimina bercabang; LA: asam lipoat; PEG: polietilen glikol; LC_50: konsentrasi letal median.
Penyerapan Intrakelular AuNP
Analisis penyerapan bergantung pada waktu (Gambar 3) mengungkapkan bahwa 40-nm BPEI-AuNP menumpuk dengan cepat, mencapai puncak pada 6 jam sebelum menurun. Sebaliknya, PC mengurangi penyerapan 40- dan 80-nm BPEI- dan LA-AuNP tetapi meningkatkan internalisasi 80-nm PEG-AuNP. Tren ini konsisten dengan literatur yang menunjukkan bahwa PC dapat menghambat atau mempromosikan masuknya NP tergantung pada ukuran NP, kimia permukaan, dan jenis sel [8, 9, 33].
Penyerapan seluler bergantung pada waktu dari 40-nm (a) BPEI-, (b) LA-, dan (c) PEG-AuNP, dan 80-nm (d) BPEI-, (e) LA-, dan (f) PEG-AuNP dalam kehadiran dan tanpa PC. Data mewakili mean ± S.D. (n = 3). Huruf menunjukkan perbedaan yang signifikan (Tukey’s HSD, p < 0,05). PC: korona protein plasma manusia.
Pengukuran Stres Oksidatif dan Nitrosatif
Kedua jenis AuNP menginduksi ROS/RNS secara bergantung pada waktu dan konsentrasi (p < 0,0001). Konsentrasi tinggi 40-nm BPEI-AuNP menghasilkan respons bifasik: efek antioksidan awal pada 1 jam, diikuti oleh lonjakan pro-oksidan yang jelas pada 3 jam dan seterusnya. Sebaliknya, 40-nm PEG-AuNP secara konsisten menekan produksi ROS/RNS (fold change < 0,5) di semua titik waktu, menunjukkan peran antioksidan pelindung (Gambar 4).
Produksi ROS/RNS bergantung pada waktu dan konsentrasi dalam sel C3A yang diekspos kepada (a) 40-nm BPEI-AuNP dan (b) 40-nm PEG-AuNP hingga 24 jam. Data mewakili mean ± S.D. (n = 3). Perbedaan yang signifikan ditandai dengan bintang (Tukey’s HSD, p < 0,05).
Pengukuran Aktivitas CYP3A4
Semua AuNP polos (40- dan 80-nm BPEI, LA, dan PEG) menghambat aktivitas CYP3A4 menjadi 20–31 % dari tingkat kontrol pada konsentrasi LC_50 (Gambar 5). Konsentrasi non-toksik 80-nm LA- dan PEG-AuNP juga menekan aktivitas (~30 %). PC sebagian besar memulihkan aktivitas CYP3A4 untuk semua AuNP kecuali untuk PEG-AuNP, yang mempertahankan 63 % dan 46 % aktivitas untuk partikel 40- dan 80-nm, masing-masing. Hasil ini mengkonfirmasi laporan sebelumnya tentang inhibisi CYP3A4 yang dimediasi AuNP melalui interaksi enzim langsung atau pemblokiran kantong substrat [7, 25].
Efek inhibisi AuNP terhadap aktivitas CYP3A4 dalam sel C3A setelah paparan 24 jam 40- dan 80-nm BPEI-, LA-, dan PEG-AuNP, dengan dan tanpa PC. Nilai mewakili mean ± S.D. (n = 3). PC: korona protein plasma manusia.
Profiling Ekspresi Gen Fokus Jalur Toksisitas 40-nm PEG-AuNP
Analisis array gen mengidentifikasi 212 gen yang diekspresikan berbeda (186 down-regulasi, 26 up-regulasi) pada LC_50 dari 40-nm PEG-AuNP (Gambar 6). Khususnya, 12,3 % dari gen ini terlibat dalam β-oksidasi asam lemak mitokondria, dengan enzim kunci (ACAD11, ACAD9, ACADM, ACADS, ACAA1, ACAA2, DECR1, ECHS1, EHHADH, HADHA) yang sangat dipencet (fold change 2–18). Down-regulasi enzim β-oksidasi menunjukkan produksi NADH/FADH2 yang terganggu, merusak siklus TCA dan sintesis ATP, ciri khas disfungsi mitokondria yang diamati dalam hepatosit yang diobati AuNP [7–9].
Gen representatif yang terlibat dalam (a) β-oksidasi asam lemak mitokondria, (b) apoptosis, (c) respons stres oksidatif/antioksidan, dan (d) transportir pengangkut/masuk hati pada LC_50 dari 40-nm PEG-AuNP. Fold change < −2 atau > 2, p < 0,05.
Gen apoptosis (CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A/B, TNFSF10) di-up-regulasi, sedangkan gen anti-apoptosis (AKT1, BCL2, MCL1, XIAP) di-down-regulasi, konsisten dengan sitotoksisitas bergantung pada dosis yang diamati. Cekpoin kerusakan dan perbaikan DNA (CHEK1/2, ERCC1/2/3, LIG4) menunjukkan regulasi yang bercampur, yang menunjukkan integritas genom yang terganggu. Protein panas (HSPA1A/B) di-up-regulasi, sementara subfamili HSP40/90/60 di-down-regulasi, mencerminkan respons stres yang kompleks. Gen antioksidan (GPX1/2/4, PRDX1/2/6, SOD1, CAT) diinduksi, sedangkan gen pro-oksidan (TXNIP, PPP1R15B) di-down-regulasi, sesuai dengan fenotipe antioksidan PEG-AuNP.
Profiling Ekspresi Gen Transportir Pengangkut dan Keluar Obat
Modulasi transportir obat yang diinduksi PC lebih menekankan implikasi farmakokinetik potensial. Dari 35 gen transportir yang diperiksa, 12 transportir ABC di-down-regulasi (misalnya, ABCB1, ABCC2/3/4, ABCG2/8, ABCA1) dan 21 transportir SLC di-down-regulasi (misalnya, SLC31A1, SLC22A9). Sebaliknya, MDR4 (ABCB4) dan transportir ABC mitokondria (ABCB6) di-up-regulasi, yang menunjukkan respons kompensatif terhadap paparan nanopartikel. Perubahan ini dapat mempengaruhi konsentrasi intrakelular kemoterapi dan memerlukan pertimbangan yang cermat dalam terapi kombinasi.
Representasi skematik mekanisme kunci di mana 40-nm PEG-AuNP memodulasi aktivitas CYP3A4, β-oksidasi mitokondria, dan ekspresi gen transportir obat dalam sel HCC. Bar hijau (inhibisi) dan segitiga merah muda (induksi) menunjukkan arah perubahan.
Validasi qRT-PCR dari sembilan gen yang dipilih mengonfirmasi hasil array, memperkuat keandalan data transkripsional.
Kesimpulan
Studi ini menunjukkan bahwa kimia permukaan AuNP dan kehadiran korona protein plasma manusia secara kritis menentukan sitotoksisitas, penyerapan seluler, profil stres oksidatif, inhibisi CYP3A4, dan perubahan ekspresi gen dalam sel HCC C3A. AuNP polos BPEI- dan LA- sangat sitotoksik, sedangkan PEG-AuNP menunjukkan properti antioksidan tetapi masih menekan aktivitas CYP3A4. PC sebagian besar meredam toksisitas dan inhibisi CYP3A4, kecuali untuk PEG-AuNP, yang mempertahankan efek yang signifikan. Analisis ekspresi gen 40-nm PEG-AuNP mengungkapkan down-regulasi yang dominan dari enzim β-oksidasi asam lemak mitokondria, up-regulasi gen pro-apoptosis, dan modulasi yang luas dari transportir obat, memberikan wawasan tentang mekanisme potensial hepatotoksisitas dan interaksi obat-nanopartikel. Temuan ini menggarisbawahi pentingnya mempertimbangkan pembentukan korona protein dan fungsionalisasi permukaan saat merancang terapeutik berbasis AuNP untuk HCC.
Singkatan
ANOVA:
Analisis variansi satu arah
AuNP:
Nanopartikel emas polos: tanpa PC
BPEI:
Polietilenimina bercabang
CYP:
Sitokrom P450
DH:
Diameter hidrodinamik
DLS:
Pencaran cahaya dinamis
EDTA:
Asam etilendiaminotetraasetat
EMEM:
Medium minimum esensial Eagle
HCC:
Karsinoma hepat sel manusia
HPTC:
Sel tubular proximale renal manusia
HSD:
Ujian perbedaan signifikansi jujur Tukey
HUVEC:
Sel umbilical vena manusia
ICP-MS:
Spektrometri massa plasma terkombinasi secara induktif
