Biosensor Amperometrik Ultra-Sensitif untuk Deteksi Matrix Metalloproteinase-7 Menggunakan Nanokomposit Karbon yang Fungsionalkan Pd
Abstrak
Matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) mendorong invasi tumor dengan membersihkan matriks ekstraselular dan ikat peptida antara alanin dan leusin. Di sini kami menyajikan nanokomposit karbon yang fungsionalkan Pd (Pd-CNC) yang bertindak sebagai peningkat impedansi tinggi dalam biosensor amperometrik MMP-7. Nanopartikel paladium memfasilitasi oksidasi 4-kloro-1-naftol (4-CN) oleh H₂O₂, menghasilkan endapan yang tidak larut dan resistensi tinggi pada elektroda. Nanobola karbon yang inherentnya tidak konduktif secara listrik lebih meningkatkan resistensi, memperkuat diferensi arus antara keadaan tanpa analit dan dengan analit. Sensor mencapai rentang deteksi 100 fg mL⁻¹ hingga 100 ng mL⁻¹ dan batas deteksi (LOD) 17,38 fg mL⁻¹.
Latar Belakang
MMP-7, endopeptidase yang bergantung seng, pusat pada progresi dan metastasi tumor karena kemampuannya untuk menguraikan komponen matriks ekstraselular [1]. Tingkat serum MMP-7 yang tinggi berkorelasi dengan metastasi limfa nodus pada kanker kelenjar air liur, adeno karsinoma usus, dan karsinoma sel renal tinggi grade [2–6]. Deteksi yang akurat dan ultra-sensitif terhadap MMP-7 adalah prioritas untuk diagnosis kanker dini [7]. Ujian warna, elektrokluminesens, dan FRET konvensional biasanya hanya mencapai rentang pikogram, sedangkan biosensor elektrokimia dapat mencapai LOD tingkat femtogram [8–11]. Namun, banyak protokol elektrokimia bergantung pada katalis enzimatik yang menderita ketidakstabilan lingkungan dan daya tahan rendah [12–19]. Logam mulia seperti Pd menunjukkan aktivitas katalitik yang superior dan daya tahan kimia, dan ketika dikombinasikan dengan dukungan karbon mereka menyediakan platform luas permukaan tinggi dan stabil untuk aplikasi bioanalitik [20–23].
Dalam karya ini kami merancang nanokomposit karbon yang fungsionalkan Pd yang berfungsi sebagai peningkat impedansi, memanfaatkan dua efek sinergis: (1) konduktivitas listrik yang buruk dari nanobola karbon, dan (2) pembentukan endapan resistif dari oksidasi 4-CN/H₂O₂ yang dikatalisis Pd. Desain ini secara dramatis menurunkan LOD biosensor menjadi 17,38 fg mL⁻¹, menunjukkan potensinya untuk pemantauan MMP-7 klinis.
Metode
Bahan
Semua reagensi adalah grade analitis. HAuCl₄·3H₂O, H₂PtCl₄, 4-CN, glukosa, H₂O₂ (30 %), trombin sapi, oksida grafen (GO), BSA, peptida (NH₂-KKKRPLALWRSCCC-SH), NSE, PSA, MMP-2, MMP-7, dan sampel serum klinis diperoleh dari pemasok komersial. Air ultrapure (18 MΩ cm) dan PBS 0,1 M (pH 7,4) digunakan selama ini.
Alat
Sintesis mikrogelombang menggunakan reaktor CEM Discover® SP. Morfologi dan analisis elemen dilakukan melalui SEM HITACHI S-4800, TEM H7650, dan SEM/EDS SU8010. Pengukuran elektrokimia menggunakan workstation CHI600 dengan sel tiga elektroda (GCE 4 mm, Pt counter, Ag/AgCl referensi). TEM resolusi tinggi dilakukan pada Tecnai G²F30 (300 kV).
Sintesis Nanokomposit Karbon yang Fungsionalkan Pd
Glukosa (4 g) dilarutkan dalam 40 mL air ultrapure, kemudian dirawat hidrotermal pada 170 °C selama 5 jam untuk menghasilkan nanobola karbon. Suspensi disentrifugasi, dicuci, dan dicerna kembali dalam 8 mL air. Untuk fungsionalisasi dengan Pd, 1 mL suspensi nanobola dicampur dengan 25 µL H₂PdCl₄ 1 mM dan di-mikrogelombang pada 100 °C, 250 W selama 15 menit. Nanobola karbon-Pd yang dihasilkan difilter dengan sentrifugasi dan dicerna kembali dalam 1 mL air. BSA (1 wt %) diinkubasi dengan nanobola Pd selama 1 jam untuk mencegah ikatan non-spesifik, diikuti oleh pencucian dan penyimpanan pada 4 °C.
Elektrodeposisi Au-rGO pada GCE
GCE dipoles dengan alumina 0,05 µm, di sonikasi, dan dicuci. GO (8 mg) didisperse dalam 20 mL air dengan sonikasi selama 2 jam, kemudian 200 µL HAuCl₄ 4 wt % ditambahkan. Au-rGO dielektrodeposisi dengan voltammetri siklik dari +1,5 hingga –1,5 V (50 mV s⁻¹). Elektroda yang dimodifikasi dicuci dan dikeringkan.
Fabrikasi Biosensor
Elektroda Au-rGO/GCE diinkubasi dengan 40 µL (50 µM) peptida selama 40 menit pada 37 °C, kemudian di-cross-link dengan 50 µL (0,10 wt %) gluteraldehida selama 30 menit. Akhirnya, 20 µL suspensi Pd-CNC ditetapkan pada elektroda yang dimodifikasi peptida dan diizinkan untuk diam selama 1 jam. Setiap langkah diikuti oleh pencucian yang menyeluruh dengan air ultrapure.
Pengukuran Elektrokimia
Setelah diinkubasi dengan 1 ng mL⁻¹ MMP-7 selama 1 jam pada 37 °C, elektroda dicuci dan 50 µL 1 mM 4-CN yang mengandung 10 mM H₂O₂ ditambahkan untuk memulai reaksi endapan selama 50 menit. Voltammetri gelombang persegi (SWV) dilakukan dari –0,2 hingga 0,6 V (5 mM [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻, 0,1 M PBS, pH 7,4) dengan amplitudo pulsa 25 mV dan langkah 4 mV s⁻¹.
Hasil dan Pembahasan
Prinsip Biosensor Pemotongan Peptida
Seperti diilustrasi pada Skema 1, elektroda Au-rGO/GCE menyediakan platform konduktif tinggi yang mendukung imobilisasi peptida melalui ikat Au-S. Pd-CNC bertindak sebagai peningkat impedansi katalitik; setelah penambahan 4-CN/H₂O₂, Pd memfasilitasi oksidasi 4-CN, menghasilkan endapan yang tidak larut yang secara signifikan meningkatkan resistensi elektroda. Ketika MMP-7 memotong peptida (antara Ala dan Leu), Pd-CNC sebagian dihilangkan, mengurangi lapisan resistif dan menghasilkan peningkatan arus yang dapat diukur. Dual amplifikasi ini—pemotongan peptida dan endapan katalitik—mendorong ultra-sensitivitas sensor.
Ilustrasi skematis nanobola karbon yang fungsionalkan Pd sebagai peningkat impedansi untuk ujian amperometrik MMP-7
Citra SEM Pd-CNC/peptida/Au-rGO/GCE setelah langkah endapan (Fig. 1a) menunjukkan lapisan endapan seragam yang tidak larut, mengonfirmasi pembentukan endapan resistensi tinggi yang berhasil. Oleh karena itu, sensor mencapai rasio sinyal-ke-bising yang sangat ditingkatkan.
Citra SEM Pd-CNC/peptida/Au-rGO/GCE (a) setelah reaksi endapan katalitik (b)
Karakterisasi Pd-CNC
TEM mengonfirmasi depo partikel nanopartikel Pd yang seragam pada nanobola karbon 150 nm (Fig. 2a–c). Spektra EDS (Fig. 2d–f) memvalidasi kehadiran C, O, Pd, dan S/N yang berasal dari BSA, menunjukkan fungsionalisasi yang berhasil. TEM resolusi tinggi (Fig. 3a–d) mengungkapkan kristal Pd kubus face-centered dengan bidang lattice (1,1,1) yang teramati.
Mikrograf TEM nanobola karbon (a), nanobola karbon-Pd (b) dan Pd-CNCs (c) EDS nanobola karbon (d), nanobola karbon-Pd (e) dan Pd-CNCs (f)
Citra TEM resolusi tinggi nanobola karbon-Pd (a), citra diperbesar nanopartikel Pd (b, c) dan citra FFT nanopartikel Pd (d)
Pemantauan Pembangunan dengan SWV dan EIS
Gambar 4a menampilkan evolusi SWV selama modifikasi elektroda. Arus puncak naik ke ~420 µA setelah depo Au-rGO, kemudian turun setelah pemasangan peptida dan Pd-CNC karena penambahan impedansi. Pemotongan oleh MMP-7 memulihkan arus (~48,7 µA ΔI₁). Setelah langkah endapan, arus turun menjadi 136,1 µA (ΔI₂ = 81,2 µA). EIS (Fig. 4b) mengakui perubahan ini: diameter lingkaran semi meningkat dengan setiap modifikasi, dan resistensi turun setelah pemotongan peptida, yang mencerminkan penghapusan Pd-CNC.
Respons SWV (a) dan EIS (b) proses modifikasi elektroda dalam fosfat bufer 5 mM [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻ (0,1 M, pH 7,4)
Optimasi Kondisi Deteksi
Konsentrasi peptida optimal ditemukan pada 50 µM; waktu inkubasi 40 menit memaksimalkan stabilitas sinyal. Waktu pemotongan peptida dan reaksi endapan 50 menit masing-masing menghasilkan respons plat, memastikan reaksi yang lengkap. Kondisi ini diadopsi untuk analisis selanjutnya.
Efek konsentrasi peptida (a), waktu inkubasi peptida 50 µM (b), waktu pemotongan peptida (c) dan waktu reaksi endapan (d) terhadap respons arus biosensor
Performa Analitik
Biosensor menunjukkan respons linier (R² = 0,9967) antara puncak arus dan log[MMP-7] pada 0,1 pg mL⁻¹–100 ng mL⁻¹ (Eq. 1). LOD, dihitung pada S/N = 3, adalah 17,38 fg mL⁻¹. Dibandingkan dengan sensor pemotongan peptida terbaru, perangkat ini mengungguli yang lain dalam sensivitas dan rentang dinamis (Tabel 1).
a Respons SWV deteksi elektrokimia untuk MMP-7 dalam fosfat bufer 5 mM [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻ (0,1 M, pH 7,4) pada konsentrasi 100 fg mL⁻¹ hingga 100 ng mL⁻¹. b Kurva kalibrasi linier arus dan logaritma konsentrasi MMP-7. Bar kesalahan adalah deviasi standar untuk n = 3.
Spesifikitas, Stabilitas, dan Aplikasi Praktis
Ujian reproduktibilitas (n = 3) menghasilkan deviasi standar relatif 1,3–4,0 % di seluruh rentang 0,01–100 ng mL⁻¹. Studi interferensi dengan MMP-2, NSE, PSA, trombin, dan BSA (100 ng mL⁻¹ masing-masing) menunjukkan perubahan sinyal yang dapat diabaikan, mengonfirmasi spesifikitas tinggi. Penyimpanan pada 4 °C selama 28 hari menghasilkan RSD < 10 %, menunjukkan stabilitas yang kuat. Ujian pemulihan dalam serum yang ditambahkan (10–100 ng mL⁻¹) mengembalikan 86,3–117,2 %, menunjukkan kelayakan klinis.
Kesimpulan
Kami telah merancang nanokomposit karbon yang fungsionalkan Pd yang berfungsi sebagai peningkat impedansi, memanfaatkan keahlian katalitik Pd untuk oksidasi 4-CN dan konduktivitas listrik buruk dari nanobola karbon untuk menciptakan amplifikasi sinyal berbasis endapan yang sangat resistif. Biosensor amperometrik yang dihasilkan memberikan LOD 17,38 fg mL⁻¹ dan rentang linier yang luas (0,1 pg–100 ng mL⁻¹) untuk MMP-7, dikaitkan dengan spesifikitas, reproduktibilitas, dan stabilitas yang baik. Platform ini mengilustrasikan kekuatan peningkat impedansi dalam ujian elektrokimia dan membuka jalan bagi biosensor generasi mendatang dalam diagnosik onkologi.
