Asam Sulfat Dibantu Persiapan Titik-titik Polimer Berkarbonisasi Pemancar Merah dan Penerapan Bio-Imaging
Abstrak
Titik polimer berkarbonisasi merah (CPD) dibuat dari p -fenilendiamin (p -PD) larutan berair dengan bantuan asam sulfat (H2 JADI4 ), dan sifat optik dan aplikasi bio-imaging dipelajari dalam makalah ini. Dibandingkan dengan sistem bantuan asam kuat lainnya, SA-CPD (dibuat dari H2 JADI4 -sistem berbantuan, diameter rata-rata ~ 5 nm) adalah yang paling terang. Hasil Quantum photoluminescence (QYs) adalah 21,4% (dalam air), dan hasil produk adalah 16,5%. Larutan berair SA-CPD memancarkan pada 600 nm saat tereksitasi oleh cahaya dari 300 hingga 580 nm. Panjang gelombang emisi tidak tergantung pada panjang gelombang eksitasi. Energi pembentukan CPD dalam dua cara dihitung untuk menunjukkan bahwa pertumbuhan memanjang (membentuk polimer) itu sulit, dan pertumbuhan melintang (membentuk CPD) itu mudah. Selain itu, sifat fotoluminesensi dua foton (memancar pada 602 nm saat dieksitasi oleh laser pulsa femtosecond 850 nm) SA-CPD juga digunakan dalam eksperimen untuk pewarnaan sel HeLa dan terbukti memiliki aplikasi potensial dalam bio-imaging.
Latar Belakang
Titik karbon (CD) telah menarik banyak perhatian karena kelebihannya termasuk kelarutan air yang sangat baik, stabilitas optik, sifat fluoresensi yang unik, toksisitas rendah, biaya rendah, dll [1]. Kebanyakan CD dipelajari sebagai kandidat potensial untuk berbagai aplikasi, seperti sensor imun elektrokimia [2], sensor bio-imaging [3,4,5,6] [7,8,9,10,11,12], foto- katalisis [13,14,15], perangkat pemancar cahaya [16], dan optoelektronik [17,18,19]. Sintesis CD memainkan peran penting dalam studi tentang sifat optik dan aplikasi. Pendekatan yang dilaporkan untuk mempersiapkan CD dapat diringkas sebagai "top-down" dari berbagai bahan karbon dan "bottom-up" dari molekul organik, polimer, atau produk alami [20]. Metode "bottom-up" adalah rute yang efisien untuk sintesis CD fluoresen dalam skala besar [21]. Gugus dalam molekul yang diterapkan termasuk –OH, –COOH, –C=O, dan –NH2 dapat didehidrasi dan dikarbonisasi dalam suhu tinggi dengan hidrotermal, microwave, pembakaran, pirolisis, dan sebagainya.
Titik-titik merah telah membangkitkan minat yang cukup besar karena, yaitu, kedalaman penetrasi yang lebih besar di bidang bio-imaging. Terutama, titik-titik warna murni sangat penting untuk keadaan tertentu karena bahan pendaran eksitasi-panjang gelombang-independen dapat memberikan cahaya fotoluminesensi (PL) tunggal dan stabil. Sebagian besar emisi CD bergantung pada panjang gelombang eksitasi, dan CD biasanya memancarkan cahaya biru, hijau, atau kuning, beberapa CD memancarkan cahaya merah terang [22].
Baru-baru ini, isomer phenylenediamine (PD), seperti o -, m -, dan p -PD, telah dipelajari sebagai sumber karbon untuk mempersiapkan CD [8, 9, 23, 24]. CD berwarna biru, hijau, dan merah dapat disiapkan dari m -, o -, dan p -PD larutan etanol, masing-masing [23]. CD pemancar cahaya penuh warna dapat disiapkan dari p -PD dan larutan air urea [24]. Dalam pekerjaan kami sebelumnya [25], kami mengusulkan bahwa titik karbon merah baru (hasil Quantum = 15,8%, dalam air) dapat disintesis dengan mudah dari “p -PD + HNO3 ” sistem air dan diterapkan dalam pendeteksian ion logam dalam air. Baru-baru ini, "o . yang serupa" -PD + H3 PO4 ” [26] dan “o -PD + HNO3 [27] sistem dilaporkan, dan Liu et al. [27] mengganti nama CD mereka (QYs = 10,8%, dalam air) sebagai "titik polimer terkarbonisasi (CPD)." Tidak seperti titik karbon tradisional, panjang gelombang emisi CPD tidak bergantung pada panjang gelombang eksitasi, dan dengan demikian “CD” berbasis PD harus dinamai lebih akurat sebagai CPD.
Di sini, kami melaporkan metode yang mudah dan efisien tinggi dari rute hidrotermal berbantuan asam kuat untuk menyiapkan CPD yang memancarkan merah dan penerapan bio-imaging dengan sifat fotoluminesensi dua foton. Mekanisme pembentukan CPD diusulkan dengan menggunakan paket program Gaussian 09.
Metode
Sintesis CPD Merah Dari Berbantuan Asam p -Sistem PD
Berdasarkan pekerjaan kami sebelumnya [25], kami memilih asam sulfat (H2 JADI4 ), asam klorida (HCl), dan asam perklorat (HClO4 ) sebagai asisten untuk persiapan CPD merah, CPD yang sesuai diberi label masing-masing sebagai SA-CPD, HC-CPD, dan PA-CPD. Untuk mengoptimalkan kondisi eksperimental H2 JADI4 -sistem yang dibantu, kami memilih beberapa parameter, seperti c (asam) menjadi c (p -PD), rasio c (p -PD), suhu (T ), dan waktu reaksi (t ). Produk CPD dicuci dengan heksana untuk menghilangkan p . yang tidak bereaksi -PD dan dengan etil alkohol untuk menghilangkan asam, disentrifugasi pada 14000 rpm selama 30 menit untuk menghilangkan pengendapan polimer, dan disaring melalui membran filter 0,22 μm. Jika bubuk diinginkan, larutan CPD murni dapat diuapkan lebih lanjut dengan rotavapor hingga mendekati keadaan kering pada 80 °C dan kondisi vakum rendah (sisanya akan berbentuk bubuk).
Karakterisasi dan Pengukuran
Gambar TEM (HR-TEM) resolusi tinggi direkam pada mikroskop transmisi JEM-2100 yang beroperasi pada 200 kV. Spektrum inframerah larutan CPD dikumpulkan menggunakan spektrometer FT-IR Prestige-21 dengan menggunakan irisan jendela KRS-5 (campuran TlBr dan TlI), biasanya fase cair diteteskan pada satu irisan dan dikeringkan. Irisan ditutupi oleh irisan lainnya dan dipasang pada dudukan pengujian. Kemudian spektrum inframerah direkam.
Spektrum fluoresensi CPD diukur pada spektrofotometer fluoresensi F-2500. Spektrum serapan UV-Vis direkam pada Spektrometer UV/VIS/NIR Lambda 950. Spektrum emisi dua foton CPD direkam oleh spektrograf serat (QE65000, Ocean Optics) dalam sistem mikroskop. Larutan berair SA-CPD dan larutan yang dilarutkan kembali dipintal pada slide, dan sifat fotoluminesensi dua foton kemudian diukur.
Hasil kuantum fotoluminesensi (QYs) dari CPD diukur dengan Rhodamin B (QYs = 56% dalam etanol) sebagai pewarna referensi pada kisaran emisi 580–610 nm yang dieksitasi oleh sinar UV 365 nm [25, 28], prosedur Pengukuran QY ditampilkan di File tambahan 1.
Metode Perhitungan
Paket Gaussian 09 digunakan untuk perhitungan teori fungsi densitas (DFT) [29]. Struktur ekuilibrium dioptimalkan dengan metode B3LYP dalam hubungannya dengan tingkat set dasar 6–311++G (d) [30]. Untuk menyelidiki peran efek pelarut, air digunakan dalam model kontinum terpolarisasi (PCM). Analisis frekuensi dilakukan dengan tingkat yang sama untuk memastikan bahwa setiap struktur yang dioptimalkan berhubungan dengan titik stasioner.
Kultur dan Perawatan Sel
1,35 mL sel HeLa di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco) dengan kepadatan awal 4 × 10
4
sel per mililiter diunggulkan di setiap cawan dan dibiakkan pada suhu 37 °C selama 24 jam di bawah atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5% CO2 . Serbuk SA-CPD dilarutkan kembali dalam air untuk menyiapkan larutan cadangan (400 μg mL
− 1
). 1350 μL sel dikultur dengan 150 μL larutan cadangan SA-CPD (konsentrasi akhir adalah 40 μg mL
− 1
) selama 12 jam dan kemudian dicuci tiga kali dengan PBS untuk menghilangkan SA-CPD bebas. Terakhir, hasil pencitraan seluler dikumpulkan dengan mikroskop confocal di bawah eksitasi laser femtosecond 850 nm (30 mW).
Hasil dan Diskusi
Mengoptimalkan Persiapan untuk CPD Merah
Dalam eksperimen dasar, sistem bantuan asam yang berbeda dengan berbagai rasio konsentrasi, suhu reaksi, dan waktu diselidiki (lihat File tambahan 1:Gambar S1). Kami menemukan bahwa CPD merah dapat dibentuk di atas 180 °C (bereaksi selama 2 jam) untuk sistem asam yang berbeda, dan reaksi tidak dipengaruhi oleh anion dalam larutan. Waktu lama (4–12 j, 240 °C untuk H3 PO4 dan sistem HF, lihat File tambahan 1:Gambar S1f) reaksi akan meningkatkan ukuran partikel, dan fluoresensi merah pada akhirnya akan memudar, sedangkan perubahan fluoresensi tidak terlihat jelas untuk sistem HCl (2–6 jam, 200 °C, lihat Tambahan file 1:Gambar S2). Dengan mempertimbangkan penghematan energi dan batas suhu atas pelapis Teflon, suhu dan waktu reaksi optimum dipilih masing-masing sebagai 200 °C dan 2 jam. Berdasarkan strategi pengoptimalan p -PD + HCl sistem (lihat File tambahan 1:Gambar S2), kami mengoptimalkan p -PD + H2 JADI4 dan p -PD + HClO4 sistem dan memperoleh hasil pengoptimalan yang ditunjukkan sebagai Tabel 1.
SA-CPD, HC-CPD, dan PA-CPD disiapkan dari p -PD solusi dengan bantuan H2 JADI4 , HCl, dan HClO4 , masing-masing. c . yang dioptimalkan (asam) menjadi c (p -PD) rasio H2 JADI4 -, HCl-, dan HClO4 -sistem yang dibantu adalah 1, 3, dan 3, masing-masing (lihat File tambahan 1:Gambar S3a). c . yang cocok (p -PD) untuk preparasi CPD merah luas (dari 0,02 hingga 0,20 mol L
− 1
). Suhu yang dioptimalkan (T ) dan waktu reaksi (t ) adalah 200 °C dan 2 jam. SA-CPD adalah CPD merah paling terang dengan QY tinggi sebesar 21,4% (File tambahan 1:Gambar S3b). Ada dua alasan mengapa H2 JADI4 -bantuan titik karbon memiliki kualitas yang lebih baik dibandingkan dengan HCl-, HClO4 -, dan HNO3 -yang dibantu (diterbitkan dalam pekerjaan kami sebelumnya [25]). Pertama, H2 JADI4 adalah asam kuat yang tidak mudah menguap yang mempertahankan keasamannya dalam larutan reaksi suhu tinggi dan tekanan tinggi. Kedua, H2 JADI4 -sistem berbantuan adalah satu-satunya yang dapat membentuk pengendapan garam amonium dalam prekursor, dan endapan melepaskan reaktan bebas secara perlahan, menghindari pembentukan endapan polimer partikel besar dan selanjutnya mempromosikan pembentukan titik karbon berkualitas tinggi. HA-CPD dan PA-CPD adalah larutan kental berwarna merah tua-coklat dan memancarkan PL merah tua di bawah penyinaran sinar UV 365 nm, sedangkan SA-CPD yang disiapkan adalah larutan tipis transparan berwarna merah terang dan memancarkan cahaya merah terang (File tambahan 1:Gambar S3c). Setelah dimurnikan dengan pencucian, pemekatan, penyaringan, dan penguapan, diperoleh serbuk SA-CPD berwarna merah-coklat tua (file tambahan 1:Gambar S3d) dengan hasil produk 16,5%. Bubuk dapat dilarutkan kembali dalam air dan larutan memancarkan fluoresensi cerah dan merah (File tambahan 1:Gambar S3e).
Karakterisasi TEM dan analisis FT-IR
Gambar TEM dari sampel OpPD (tanpa H2 JADI4 ) dan SA-CPD (dengan H2 JADI4 ) ditunjukkan pada Gambar. 1. Sampel OpPD terdiri dari fragmen (oligomer, Gambar 1a) dan polimer (Gambar 1a sisipan). SA-CPD adalah CPD monodispersi dengan ukuran rata-rata ~ 5 nm (Gbr. 1c). Ini menunjukkan jari kisi yang diselesaikan dengan baik dengan jarak ~ 0,21 nm (Gambar 1b sisipan), sesuai dengan (100) jarak kisi dalam bidang dari graphene [31, 32].
Gambar TEM dari sampel OpPD (tanpa H2 JADI4 ) (a ) dan SA-CPD (b ). c Distribusi ukuran SA-CPD. d Spektrum FT-IR sampel OpPD dan CPD merah. Sampel OpPD dan SA-CPD disiapkan dari p -PD larutan air tanpa dan dengan H2 JADI4 -dibantu
Keadaan permukaan CPD dapat mempengaruhi sifat optik. Kelompok kimia permukaan sampel OpPD dan SA-CPD dicirikan oleh spektrum FT-IR (Gbr. 1d). Dua sampel memiliki beberapa grup serupa, seperti Ar-H (2700–3200 cm
− 1
[33], termasuk getaran ulur C-H aromatik), C-C (~ 1433 cm
− 1
, yang termasuk dalam vibrasi regangan tulang C aromatik, mengungkapkan adanya vibrasi regangan aromatik yang merupakan karakteristik unit benzenoid) [34], dan C=O (1628 cm
− 1
, termasuk dalam gugus –COOH). Dibandingkan dengan sampel OpPD, grup baru, seperti O-H (3300–3700 cm
− 1
dan 1175 cm
− 1
termasuk dalam kelompok –COOH), C-O-C (1055 cm
− 1
, ada dalam ester), dan C-H (2400–3000 cm
− 1
milik radikal alkil yang terbentuk dalam reaksi pembukaan cincin), ditemukan di CPD, sedangkan –NH2 atau –NH– grup terkait seperti N-H (3100–3300 cm
− 1
dan 1512 cm
− 1
dan C-N (1126, 1261, dan 1305 cm
− 1
milik –NH2 free gratis atau –NH– grup dari p Prekursor -PD, melemah atau menghilang. Adanya gugus –OH atau –COOH menunjukkan bahwa derajat oksidasi permukaan SA-CPD (dengan H2 JADI4 menambahkan) lebih tinggi dari sampel OpPD (tanpa penambahan asam).
Mekanisme yang Diusulkan untuk Pembentukan CD
Energi formasi dihitung menggunakan paket program Gaussian 09. Setelah diprotonasi dengan bantuan asam, bipolimer dapat dipolimerisasi dalam dua cara yang disebut pertumbuhan memanjang dan melintang. Energi formasi yang dihitung dari pertumbuhan melintang (− 1406.07 kJ mol
− 1
) secara signifikan lebih tinggi daripada pertumbuhan memanjang (− 616,25 kJ mol
− 1
). Ini menunjukkan bahwa bipolimer terprotonasi penuh (pH 3, setelah kelebihan H
+
ditambahkan) cenderung dipolimerisasi secara melintang untuk membentuk struktur planar (Gbr. 2). Struktur planar ini kemudian dirakit sendiri untuk membentuk CPD berbentuk bola.
Energi pembentukan pertumbuhan memanjang dan melintang
Properti optik
Meskipun dibuat dengan bantuan asam yang berbeda, semua CPD memiliki sifat optik yang sama [25]. Untuk spektrum UV-Vis larutan berair SA-CPD (Gbr. 3a), puncak absorbansi yang terletak pada ~ 290 nm dikaitkan dengan transisi dalam cincin benzena, dan puncak yang terletak pada 430 nm dan 510 nm dapat ditetapkan ke -π* transisi fenazin tersubstitusi terkonjugasi ke pasangan elektron bebas pada gugus amina yang berdekatan dan transisi elektron dari cincin benzenoid ke cincin quinoid [32]. Kurva eksitasi menggambarkan tren naik yang lebar dan bertahap di wilayah yang terlihat, dan puncak eksitasi maksimum (~ 580 nm) dekat dengan puncak emisi (~ 600 nm). CPD memancarkan pada zona lampu merah (600–700 nm) saat tereksitasi dari 220 nm hingga 310 nm, sementara memancarkan pada cahaya oranye (~ 600 nm) saat tereksitasi dari 310 nm hingga 580 nm (Gbr. 3b). Perlu dicatat bahwa fluoresensi jenis CPD yang memancarkan merah ini tidak bergantung pada panjang gelombang eksitasi [22, 35].
a Penyerapan UV-Vis, eksitasi (puncak pada 600 nm), dan b spektrum emisi (eksitasi 220–580 nm) SA-CPD
Pencitraan Seluler
Sifat fotoluminesensi dua foton SA-CPD sebelum dan sesudah proses pembuatan serbuk ditunjukkan pada Gambar 4a. Ada pergeseran biru dari 602 nm (sebelum proses pembubutan) menjadi 529 nm (setelah proses pembubutan) pada panjang gelombang eksitasi yang sama 850 nm oleh laser pulsa femtosecond (30 mW). Intensitas PL meningkat setelah proses pembubutan.
Spektrum fotoluminesensi dua foton SA-CPD (a ) dan gambar mikroskop fluoresensi confocal dari sel HeLa yang dirawat dengan SA-CPD yang dieksitasi oleh laser pulsa femtosecond 850 nm, 30 mW (b –e )
Serbuk SA-CPD dilarutkan kembali dalam PBS (1X) dan diaplikasikan dalam pencitraan sel HeLa menggunakan mikroskop fluoresensi confocal dan laser pulsa femtosecond 850 nm (30 mW) (lihat Gambar 4b-e). Setelah dikultur dengan sel HeLa selama 12 jam, SA-CPD ditelan oleh sel HeLa, dan CPD memasuki sitoplasma. Intensitas FL saluran merah (645–675 nm) lemah sedangkan saluran hijau (526–574 nm) cerah, konsisten dengan pergeseran biru dalam proses pembubutan.
Kesimpulan
Metode mudah rute hidrotermal yang dibantu asam untuk menyiapkan titik karbon dan penerapan bio-imaging telah dilaporkan. Dalam H2 JADI4 -, HCl- dan HClO4 -sistem berbantuan, SA-CPD disiapkan dari H2 JADI4 -sistem berbantuan adalah CPD paling terang dengan ukuran rata-rata ~ 5 nm, QY 21,4%, dan hasil produk 16,5%. Larutan berair SA-CPD memancarkan pada 600 nm saat tereksitasi oleh cahaya dari 300 hingga 580 nm. Panjang gelombang emisi adalah eksitasi-panjang gelombang-independen. Selain itu, SA-CPD memiliki sifat fotoluminesensi dua foton yang memancarkan pada 602 nm saat dieksitasi oleh laser pulsa femtosecond 850 nm (30 mW). Metode ini juga telah digunakan dalam pencitraan untuk sel HeLa dan memiliki potensi, misalnya, aplikasi bio-pencitraan.
Singkatan
CD:
Titik karbon
BPD:
Titik polimer berkarbonisasi
HC-CPD:
Titik Karbon disiapkan dari p -PD dengan sistem yang dibantu HCl
PA-CPD:
Titik Karbon disiapkan dari p -PD dengan HClO4 -sistem yang dibantu
p -PD:
P -fenilendiamina
QY:
Hasil Kuantum
SA-CPD:
Titik Karbon disiapkan dari p -PD dengan H2 JADI4 -sistem yang dibantu
