Kerangka Titik Karbon Stabil dengan Efektivitas Antibakteri Superior
Abstrak
Titik karbon (CDs) telah banyak digunakan sebagai antimikroba karena permukaan aktifnya, namun beberapa CDs menderita ketidakstabilan. Oleh karena itulah, aplikasi relatifnya seperti aktivitas antibakteri mungkin tidak dapat diandalkan untuk penggunaan jangka panjang. Di sini, kami menyintesis CDs dengan fluoresensi biru melalui proses hidrotermal. Kemudian, polietilenimina diterapkan untuk merakit CDs menjadi kerangka berbasis CDs (CDFs). CDFs menunjukkan fluoresensi yang dipadamkan tetapi menunjukkan properti yang lebih stabil berdasarkan penyelidikan mikroskop elektron pemindai dan potensial zeta. Keduanya CDs dan CDFs menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli (E. coli) Gram-negatif dan Staphylococcus aureus (S. aureus) Gram-positif, namun CDFs menunjukkan performa antibakteri yang lebih baik, dan S. aureus dapat sepenuhnya terhambat dengan konsentrasi inhibitor minimum sebesar 30 μg/mL. Ini mengungkapkan bahwa CDFs memperbesar baik stabilitas maupun aktivitas antibakteri, yang akan lebih menjanjikan untuk aplikasi praktis.
Abstract Grafik
Pendahuluan
Infeksi bakteri menunjukkan ancaman serius bagi kehidupan manusia, dan pengembangan obat efektif untuk mematikan bakteri sangat dibutuhkan [1]. Berbagai antibiotik telah digunakan untuk mengobati infeksi bakteri, namun penggunaan berlebihan antibiotik menyebabkan masalah lain seperti efek samping dan masalah resistensi obat [2]. Nanomaterial termasuk polimer antimikroba [3], nanomaterial logam [4], dan nanomaterial karbon [5, 6] telah digunakan sebagai alternatif bagi antibiotik klasik [7]. Masalah resistensi obat dan toksisitas sedang berkurang [8]. Akhir-akhir ini, CDs [9, 10] dan nanokluster (NCs) [11] telah banyak digunakan untuk melawan infeksi bakteri karena kompatibel [12], aktif [13], dan dapat dengan mudah dibersihkan melalui sirkulasi karena ukuran ultra-kecil [14, 15]. Khususnya, para peneliti menemukan bahwa CDs menunjukkan kemampuan penyerap radikal bebas yang unggul, yang dapat lebih kuat daripada banyak obat anti-infeksi tradisional [16,17,18]. Namun, beberapa antimikroba ultra-kecil menderita stabilitas yang buruk karena area permukaan oksidatif yang lebih besar [19]. Sangat diinginkan untuk mengembangkan agen antibakteri yang lebih efektif untuk melawan infeksi bakteri untuk penggunaan jangka panjang.
Untuk memenuhi kebutuhan aplikasi praktis, antimikroba harus memiliki karakteristik berikut: (a) Stabilitas yang baik tetap tidak berubah untuk waktu tertentu dalam lingkungan sekitar; (b) Kompatibilitas baik dan toksisitas rendah; (c) aktivitas antibakteri tinggi. Nanomaterial yang lebih besar cenderung lebih stabil, namun mereka mungkin memiliki aktivitas antibakteri yang relatif lebih lemah karena area permukaan aktif yang lebih kecil. Mempertimbangkan kelemahan nanomaterial kecil dan besar, kami melaporkan rakitan CDs kecil menjadi CDFs besar dengan hanya menambahkan polietilenimina (PEI) (Gambar 1). CDs tidak diurai tetapi mempertahankan morfologinya sebagai blok pembangun. Oleh karena itulah, seluruh CDFs menunjukkan ukuran yang lebih besar tetapi menunjukkan stabilitas yang lebih baik tanpa kehilangan properti aktif CDs. Selanjutnya, kami menemukan bahwa CDFs menampilkan aktivitas antibakteri yang ditingkatkan terhadap Escherichia coli (E. coli) Gram-negatif dan Staphylococcus aureus (S. aureus) Gram-positif dibandingkan dengan CDs, yang menunjukkan performa antibakteri spektrum lebar, meskipun banyak CDs hanya mematikan bakteri Gram-positif [20]. Selain itu, CDFs mempromosiasi proliferasi sel PC12 (sel baris yang diperoleh dari feokromositoma medula adrenal tikus), menunjukkan potensi besar untuk aplikasi pemulihan saraf [21]. Karya ini menunjukkan bahwa rakitan CDs kecil menjadi CDFs besar tidak hanya meningkatkan stabilitas tetapi juga memperbesar aktivitas antibakteri.
Skema sintesis CDs dan rakitan menjadi CDFs dengan menambahkan PEI dengan aktivitas antibakteri yang ditingkatkan
Bahan dan Metode
Bahan dan Instrumen
Spektrum fotoelektron permukaan X-ray (XPS) direkam pada instrumen spektroskopi fotoelektron permukaan X-ray (XPS) ESCALAB250Xi. Mikroskop elektron transmisi (TEM) dilakukan oleh mikroskop JEM-2100 yang beroperasi pada 200 kV. Fluoresensi material diperoleh menggunakan spektrometer fluoresensi F97. Pewarnaan FDA/PI sel bakteri direkam dalam mode sentakan dengan mikroskop Leica DFC450C. Umur fluoresensi diukur pada sistem hitungan foton tunggal terkorelasi waktu (TCSPC) menggunakan spektrofluorometer Nanolog (Horbia JY, Jepang). Spektrum spektroskopi ultraviolet–visibel (UV–vis) diperoleh dari instrumen UV-1600. Pengcitraan bakteri diamati oleh mikroskop konfokal (Olympus FLUOVIEW FV1000 c). Semua reagen adalah grades analitis. Air deionisasi digunakan selama eksperimen. Cell counting kit-8 diperoleh dari Beyotime Biotechnology.
Persiapan CDs dan CDFs
L- cystein (1,0 g) dilarutkan dalam 10,0 mL air deionisasi dan diaduk rata. Kemudian, pH larutan disesuaikan menjadi 9,0 dengan NaOH 1,0 M. Larutan dipindahkan ke reaktor hidrotermal dan dipanaskan pada 160 °C selama 24 jam. Setelah larutan didinginkan ke suhu ruangan, larutan yang dihasilkan dialisis menggunakan kantong dialisis (MW 7000 cut off) selama satu hari. CDs yang dihasilkan digunakan untuk karakterisasi dan eksperimen berikutnya. Untuk persiapan CDFs, 40 µL PEI 1% ditambahkan ke 1 mL CDs. Campuran dibiarkan selama 1 jam. Produk difurnirkan dengan dialisis menggunakan metode yang sama seperti penyulingan CDs. Untuk karakterisasi HR-TEM, sampel dikonsentrasi ke dalam volume kecil, dipindahkan ke kolum silica gel, dan dielusi dengan metanol dan diklorometana untuk mendapatkan produk yang difurnirkan lebih lanjut.
Evaluasi Toksisitas
Sel PC12 ditanam di plates 96-lubang selama 12 jam kemudian diinkubasi dengan CDs dan CDFs dengan konsentrasi yang berbeda. Jumlah sel yang hidup diselidiki menggunakan uji Cell Counting Kit-8 (CCK-8). 3-(4, 5-Dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolium bromida (MTT) (5 mg/mL dalam PBS) ditambahkan pada 1/10 volume kultur, dan sel dikembalikan ke inkubator. Setelah itu, sobrenatan dibuang dan 200 μL dimetil sulfoksida (DMSO) ditambahkan ke setiap lubang. Kristal dilarutkan dengan mengocok plates selama 10 menit. Absorbansi pada 490 nm diukur menggunakan Microreader (Varioskan LUX Multimode Reader). Lubang kontrol kosong disertakan untuk semua pengukuran absorbansi.
Eksperimen Antibakteri
E. coli dan S. aureus diinkubasi dengan dan tanpa CDs dan CDFs pada 37 °C dengan goyangan 250 rpm. Pertumbuhan sel bakteri dalam kultur LB diukur oleh Microreader pada panjang gelombang 600 nm (OD600). Medium LB digunakan sebagai kontrol kosong. OD600 mewakili kepadatan sel, dan keberadaan sel relatif dihitung berdasarkan perbandingan antara sel bakteri yang dikultur dengan kehadiran material terhadap kelompok kontrol (OD600 sel bakteri tanpa kehadiran CDs atau CDFs). Sel hidup/mati dievaluasi dengan protokol pewarnaan FDA/PI [22].
Deteksi Spesies Reaktif Oksigen (ROS)
Produksi ROS seluler diukur dalam sel bakteri sebelum dan setelah perlakuan dengan CDs dan CDFs selama 12 jam, dengan sond 2′, 7′-diklorofuoresin diasetat (DCFH-DA) sesuai petunjuk. Fluoresensi terdeteksi pada panjang gelombang emisi 525 nm dengan penggerusan 488 nm.
Hasil dan Pembahasan
Karakterisasi Material
Penyelidikan Ukuran
Gambar 2 menunjukkan SEM bubuk CDFs dengan pembesaran relatif rendah (Gambar 2a0) dan lebih tinggi (Gambar 2b0) setelah terpapar udara selama beberapa jam. Terlihat bahwa CDFs terdistribusi dengan baik dan menunjukkan ukuran rata-rata sekitar 25 nm. CDs diperkirakan menunjukkan ukuran kecil mono-dispersi berdasarkan studi TEM dan AFM (Berkas Tambahan 1: Gambar S1), namun partikel kecil ini menunjukkan aglomerasi yang diamati oleh SEM setelah terpapar udara untuk waktu tertentu (Berkas Tambahan 1: Gambar S2). Di sisi lain, CDFs mempertahankan morfologinya meskipun mereka terpapar lingkungan sekitar. Ini menunjukkan bahwa CDFs yang dihasilkan lebih menjanjikan untuk aplikasi praktis. CDFs lebih lanjut dikarakterisir oleh TEM (Gambar 2b1). Terlihat bahwa CDFs menunjukkan struktur rakitan dengan CDs kecil sebagai blok pembangun. Analisis mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HR-TEM) (Gambar 2b2) mengungkapkan bahwa blok pembangun CDFs menunjukkan loreng jaring dengan jarak spasi 0,21 nm, yang sesuai dengan jaring bidang (100) grafit, yang serupa dengan CDs klasik [23,24,25]. Oleh karena itulah, rakitan CDFs tidak kehilangan fitur CDs, yang mungkin menggabungkan keuntungan dari kerangka besar keseluruhan dan blok pembangun kecil di dalamnya.
SEM untuk CDFs dengan pembesaran relatif rendah (a0) dan lebih tinggi (b0); TEM (b1) HR-TEM (b2) dari CDFs
Potensial Zeta
Penyelidikan potensial zeta digunakan untuk mengukur tingkat tolakan elektrostatis antara partikel bermuatan yang berdekatan dalam sistem terdisersi (Gambar 3). Terlihat bahwa puncak potensial zeta CDs tidak terlihat jelas, yang terpapar lingkungan sekitar. Selain itu, beberapa puncak potensial zeta diperoleh dengan deviasi zeta yang besar (Tabel 1), menunjukkan bahwa CDs cukup tidak stabil dan tidak dapat diulang. Di sisi lain, puncak potensial zeta untuk CDFs berkonsentrasi pada rentang yang relatif stabil. Kami juga memiliki deviasi zeta yang jauh lebih kecil berdasarkan tiga kali pengukuran, mengungkapkan bahwa CDFs lebih stabil dan sistem terdisersi memiliki sampel dengan kemurnian lebih tinggi.
Potensial zeta CDs (a) dan CDFs (b)
Properti Fluoresensi
Spektrum emisi fluoresensi digunakan untuk memantau proses rakitan CDs menjadi CDFs (Gambar 4). Seiring titrasi PEI, emisi fluoresensi pada 350 nm secara bertahap dipadamkan (Gambar 4a). Namun, tidak ada pergeseran spektrum fluoresensi yang signifikan yang diamati, mengungkapkan bahwa tidak ada aglomerasi yang terjadi. Struktur rakitan CDFs mengubah ukuran keseluruhan CDs, yang mempengaruhi fluoresensi. Sementara itu, CD di dekatnya menandai fluoresensi satu sama lain. Selain itu, kimia permukaan memainkan peran penting dalam properti fluoresensi. Atom nitrogen dan sulfur pada permukaan CDs dapat menghasilkan jebakan energi. Fluoresensi cerah CDs disebabkan oleh permukaan defek dengan banyak grup karbonil dan amino. Setelah fungsionalisasi PEI, permukaan CDFs didominasi oleh grup amino, yang memadamkan fluoresensi bersama dengan pertumbuhan ukuran. Perbandingan perilaku fluoresensi CDs dan CDFs lebih lanjut diperiksa oleh TCSPC untuk memahami jalur rekombinasi muatan yang dihasilkan cahaya dari material (Gambar 4b). Emisi dipantau pada 430 nm. Decay fluoresensi memerlukan fitting eksponensial dua komponen. Konstanta waktu dan amplitudo relatif di fitting dan diringkas dalam Tabel S1. Terlihat bahwa umur komponen dominan untuk CDs adalah 2,45 ns, sementara untuk komponen lainnya adalah 7,47 ns. Di sisi lain, umur komponen dominan untuk CDs adalah 1,98 ns, sementara komponen lainnya menunjukkan umur 7,30 ns. Tidak ada perubahan umur yang signifikan yang diamati antara CDs dan CDFs, yang juga menunjukkan bahwa properti CDs tidak berubah secara substansial saat dirakit menjadi CDFs [26].
Spektrum emisi fluoresensi a dari CDs sebagai titrasi PEI, dan umur b untuk CDs dan CDFs
Toksisitas
Untuk evaluasi keamanan material, toksisitas CDs dan CDFs terhadap sel PC12 diselidiki. Uji MTT dilakukan untuk menyelidiki pengaruh material terhadap kelangsungan sel (Gambar 5). Setelah inkubasi PC12 dengan CDs dan CDFs, kelangsungan sel tidak banyak terpengaruh dalam 24 jam. Menariknya, kedua material karbon mempromosiasi proliferasi PC12, yang memainkan peran penting dalam terapi kerusakan saraf. Hasil ini menunjukkan toksisitas rendah dari material, dan material menjanjikan untuk perlindungan saraf dengan sel PC12 terlibat [27].
Kelangsungan sel PC12 kehadiran CDs (a) dan CDFs (b). Kelangsungan sel (%) = (absorbansi kelompok eksperimen—absorbansi kelompok kosong)/(absorbansi kelompok kontrol—absorbansi kelompok kosong) × 100%
Penyelidikan Antibakteri
Aktivitas antibakteri CDs dan CDFs awalnya dievaluasi dengan mengukur kepadatan bakteri kehadiran agen ini pada 600 nm [28]. Gambar 6 menunjukkan efek antibakteri yang signifikan dari baik CDs dan CDFs terhadap sel S. aureus dan E. coli. Khususnya, kelangsungan sel S. aureus hampir 0 ketika lebih dari 30 µg/mL CDFs digunakan. Demikian pula, sel E. coli dimatikan oleh baik CDs dan CDFs. CDs menunjukkan banyak muatan (Gambar 3a). Di sisi lain, CDFs dengan muatan yang tidak signifikan (Gambar 3b), yang mungkin menekan adhesi bakteri di bawah tolakan lemah sehingga berinteraksi dengan permukaan bakteri dengan lebih mudah. Secara perbandingan, CDFs menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih tinggi berdasarkan fenomena bahwa rasio sel yang lebih banyak dibunuh ketika lebih dari 6 µg/mL material digunakan. Aktivitas antibakteri yang ditingkatkan CDFs kemungkinan disebabkan oleh efek sinergi dari CDs sebagai blok pembangun serta muatan permukaan yang lebih stabil. Untuk memahami secara mendalam mekanisme antibakteri, ROS yang dapat mengoksidasi DCFH tidak fluoresen menjadi DFC fluoresen diukur (Gambar 6C). Kedua material karbon tidak secara signifikan menginduksi produksi ROS setelah mengobati E. coli. Namun, CDFs secara luar biasa meningkatkan ROS seluler saat berinteraksi dengan S. aureus. Karena ROS dapat merusak DNA, RNA, dan protein bakteri, nilai yang ditingkatkan memfasilitasi pemadaman bakteri. Selanjutnya, ROS diprakarsai dengan H2O2. Perlu diperhatikan bahwa produksi ROS semua secara dramatis dipromosikan dibandingkan perlakuan H2O2 sendirian, sementara CDFs menunjukkan peningkatan tertinggi. Ini menunjukkan bahwa kombinasi H2O2 dengan kedua material karbon ini mungkin lebih meningkatkan aktivitas antibakteri, terutama untuk CDFs.
Aktivitas antibakteri CDs dan CDFs terhadap S. aureus (a) dan E.coli (b), c intensitas fluoresensi DCF pada 525 nm, yang menunjukkan hubungan linier dengan tingkat ROS, dengan perlakuan CDs dan CDFs dalam keadaan tidak ada dan ada H2O2 (100 μM)
Beberapa CDs sebelumnya telah dilaporkan untuk mematikan S. aureus, yang tercantum dalam Tabel 2 untuk perbandingan. CDFs saat ini menunjukkan MIC yang kompetitif. Selain itu, daripada hanya mengurangi kelangsungan sel yang diteliti, CDFs mempromosiasi proliferasi sel PC12, yang menunjukkan keberagaman mereka saat mengobati infeksi bakteri.
Integritas membran bakteri setelah perlakuan CDs dan CDFs diselidiki oleh eksperimen pewarnaan hidup/mati (Gambar 7). Pewarnaan FDA hijau fluoresen hanya dapat menunjukkan sel hidup, sementara PI merah fluoresen secara spesifik mewarnai bakteri mati dengan membran yang rusak, tetapi yang hidup dengan membran bakteri utuh tidak diwarnai [30, 31]. Seperti yang ditunjukkan dalam gambar fluoresensi, fluoresensi merah yang jelas terlihat dalam sampel yang diobati CDs dan kepadatan sel mati yang jauh lebih tinggi terlihat oleh sampel yang diobati CDFs.
Pewarnaan FDA/PI S. aureus dan E. coli kehadiran dan tidak ada CDs dan CDFs pada 30 µg/mL. Skala batas, 200 µm
Berdasarkan perbandingan di atas, kami menyimpulkan bahwa CDFs menjanjikan untuk membunuh sel bakteri Gram-positif dan Gram-negatif. Oleh karena itulah, E. coli dan S. aureus sebelum dan setelah diobati dengan 30 µg/mL CDFs dikarakterisir oleh SEM (Gambar 8). Seperti ditunjukkan dalam Gambar 8a, c, bakteri sebelum perlakuan dengan CDFs menunjukkan permukaan teratur. Namun, setelah inkubasi dengan CDFs, morfologi sel bakteri termasuk S. aureus (Gambar 8b) dan E. coli (Gambar 8d) berubah secara dramatis. Selain itu, membran banyak sel bakteri pecah. Beberapa material kecil diamati pada permukaan bakteri, yang berasal dari CDFs yang menempel. Ini menunjukkan bahwa CDFs dapat mematikan sel bakteri dengan merusak membran [32].
SEM untuk S. aureus (a, b) dan E.coli sebelum (a, c) dan setelah (b, d) perlakuan dengan 30 µg/mL CDFs. Skala batas: 2 µm
Karena baik CDs dan CDFs fluoresen, 6 µg/mL agen ini diselidiki untuk pengcitraan bakteri selama proses pemadaman. Pengcitraan S. aureus diselidiki dan ditampilkan dalam Gambar 9. Menariknya, ditemukan bahwa baik CDs dan CDFs dapat digunakan untuk pengcitraan S. aureus. Namun, CDFs menunjukkan efisiensi penyerapan yang lebih tinggi karena sel bakteri yang diamati dari lapangan terang dan gelap hampir tumpang tindih. Di sisi lain, hanya sebagian sel S. aureus yang diwarnai oleh CDs. Selain itu, kepadatan sel bakteri lebih kecil oleh perlakuan CDFs, mewakili CDFs mematikan S. aureus lebih efisien dibandingkan CDs pada dosis yang sama. Hasil ini juga mengungkapkan bahwa CDFs dapat digunakan sebagai pewarna alternatif untuk pengcitraan berbagai sel bakteri.
Pengcitraan S. aureus oleh penyerapan CDs dan CDFs setelah 12 jam
Kesimpulan
Rakit CD menjadi CDFs menghasilkan aktivitas antibakteri yang lebih kuat. Disimpulkan bahwa struktur rakitan memungkinkan properti yang lebih stabil tetapi memperbesar aktivitas antibakteri CDs. Karya ini juga menyediakan jalan baru untuk merakit nanomaterial kecil menjadi kerangka untuk aplikasi praktis yang lebih luas.
Ketersediaan Data dan Bahan
Semua data yang mendukung kesimpulan artikel ini termasuk dalam artikel.
