Perakitan Titik Karbon ke dalam Kerangka dengan Stabilitas yang Ditingkatkan dan Aktivitas Antibakteri
Abstrak
Titik karbon (CD) telah banyak digunakan sebagai antimikroba karena permukaannya yang aktif, tetapi beberapa CD mengalami ketidakstabilan. Oleh karena itu, aplikasi relatif seperti aktivitas antibakteri mungkin tidak dapat diandalkan untuk penggunaan jangka panjang. Di sini, kami mensintesis CD dengan fluoresensi biru melalui proses hidrotermal. Setelah itu, polietilenimin diterapkan untuk perakitan CD ke dalam kerangka berbasis CD (CDF). CDF menunjukkan fluoresensi yang padam tetapi menunjukkan sifat yang lebih stabil berdasarkan pemindaian mikroskop elektron dan penyelidikan potensi zeta. Baik CD maupun CDF menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli Gram-negatif (E. coli ) dan Gram-positif Staphylococcus aureus (S. aureus ), tetapi CDF menunjukkan kinerja antibakteri yang lebih baik, dan S. aureus dapat sepenuhnya dihambat dengan konsentrasi penghambatan minimum 30 μg/mL. Ini mengungkapkan CDF meningkatkan stabilitas dan aktivitas antibakteri, yang akan lebih menjanjikan untuk aplikasi praktis.
Abstrak grafis
Pengantar
Infeksi bakteri menunjukkan ancaman serius bagi kehidupan manusia, dan pengembangan obat-obatan yang efektif untuk mendisinfeksi bakteri sangat dibutuhkan [1]. Berbagai antibiotik telah digunakan untuk mengobati infeksi bakteri, tetapi penggunaan antibiotik yang berlebihan menyebabkan masalah lain seperti efek samping dan masalah resistensi obat [2]. Nanomaterial termasuk polimer antimikroba [3], nanomaterial logam [4], dan nanomaterial karbon [5, 6] telah digunakan sebagai alternatif antibiotik klasik [7]. Baik masalah yang resistan terhadap obat dan toksik dapat meredakan [8]. Baru-baru ini, CD [9, 10] dan nanocluster (NCs) [11] diterapkan dengan baik untuk memerangi infeksi bakteri karena mereka biokompatibel [12], aktif [13], dan dapat dengan mudah dibersihkan oleh sirkulasi karena ukurannya yang sangat kecil. [14, 15]. Terutama, para peneliti telah menemukan bahwa CD menunjukkan kemampuan menangkap radikal bebas yang sangat baik, yang bisa lebih kuat daripada banyak obat anti infeksi tradisional [16,17,18]. Namun, beberapa antimikroba ultra-kecil mengalami stabilitas yang buruk karena luas permukaan oksidatif yang lebih besar [19]. Sangat diinginkan untuk mengembangkan agen antibakteri yang lebih efektif untuk memerangi infeksi bakteri untuk penggunaan jangka panjang.
Untuk memenuhi permintaan aplikasi praktis, antimikroba harus memiliki karakteristik sebagai berikut:(a) Stabilitas yang sangat baik tetap tidak berubah untuk waktu tertentu di lingkungan sekitar; (b) Biokompatibilitas yang sangat baik dan toksisitas rendah:(c) aktivitas antibakteri yang tinggi. Nanomaterial yang lebih besar cenderung lebih stabil, tetapi mereka mungkin memiliki aktivitas antibakteri yang relatif lebih lemah karena luas permukaan aktif yang lebih kecil. Mempertimbangkan kelemahan nanomaterial kecil dan besar, kami melaporkan perakitan CD kecil menjadi CDF besar hanya dengan menambahkan polietilenimin (PEI) (Gbr. 1). CD tidak menyatu tetapi mempertahankan morfologinya sebagai blok bangunan. Oleh karena itu, seluruh CDF menunjukkan ukuran yang lebih besar tetapi menunjukkan stabilitas yang lebih baik tanpa kehilangan sifat aktif CD. Lebih lanjut, kami menemukan CDF menunjukkan peningkatan aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli Gram-negatif (E. coli ) dan Gram-positif Staphylococcus aureus (S. aureus ) dibandingkan dengan CD, menunjukkan kinerja antibakteri spektrum luas mereka, meskipun banyak CD hanya membasmi bakteri Gram-positif [20]. Selain itu, CDF mempromosikan proliferasi sel PC12 (garis sel yang diperoleh dari pheochromocytoma dari medula adrenal tikus), menunjukkan potensi besar untuk aplikasi pemulihan saraf [21]. Karya ini menyarankan perakitan CD kecil menjadi CDF besar tidak hanya meningkatkan stabilitas tetapi juga memperbesar aktivitas antibakteri.
Skema sintesis CD dan perakitan menjadi CDF dengan menambahkan PEI dengan aktivitas antibakteri yang ditingkatkan
Bahan dan Metode
Materi dan Instrumen
Spektrum fotoelektron permukaan sinar-X (XPS) direkam pada instrumen spektroskopi fotoelektron permukaan sinar-X (XPS) ESCALAB250Xi. Mikroskop elektron transmisi (TEM) dilakukan oleh mikroskop JEM-2100 yang beroperasi pada 200 kV. Fluoresensi bahan diperoleh dengan menggunakan spektrometer fluoresensi F97. Pewarnaan FDA/PI dari sel bakteri direkam dalam mode penyadapan dengan mikroskop Leica DFC450C. Masa pakai fluoresensi diukur pada sistem penghitungan foton tunggal berkorelasi waktu (TCSPC) menggunakan spektrofluorometer Nanolog (Horbia JY, Jepang). Spektroskopi ultraviolet–tampak (UV–vis) diperoleh dari instrumen UV-1600. Pencitraan bakteri diamati dengan mikroskop confocal (Olympus FLUOVIEW FV1000 c). Semua reagen adalah nilai analitis. Air deionisasi digunakan melalui percobaan. Kit penghitung sel-8 diperoleh dari Beyotime Biotechnology.
Persiapan CD dan CDF
L-sistein (1,0 g) dilarutkan dalam 10,0 mL air deionisasi dan dicampur dengan baik. Kemudian pH larutan diatur menjadi 9,0 dengan NaOH 1,0 M. Larutan dipindahkan ke reaktor hidrotermal dan dipanaskan pada suhu 160 °C selama 24 jam. Setelah larutan didinginkan sampai suhu kamar, larutan yang dihasilkan dialisis menggunakan dialisis bag (MW 7000 cut off) selama satu hari. CD yang diperoleh digunakan untuk karakterisasi dan eksperimen berikut. Untuk persiapan CDF, 40 L PEI 1% ditambahkan ke 1 mL CD. Campuran dibiarkan selama 1 jam. Produk dimurnikan dengan dialisis menggunakan metode yang sama seperti pemurnian CD. Untuk karakterisasi HR-TEM, sampel dipekatkan ke dalam volume kecil, dipindahkan ke kolom silika gel, dan dielusi dengan metanol dan diklorometana untuk mendapatkan produk yang lebih murni.
Evaluasi Toksisitas
Sel PC12 diunggulkan di piring 96-sumur selama 12 jam dan kemudian diinkubasi dengan CD dan CDF dengan konsentrasi berbeda. Jumlah sel yang layak diselidiki menggunakan uji Cell Counting Kit-8 (CCK-8). 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (5 mg/mL dalam PBS) ditambahkan pada 1/10 volume kultur, dan sel dikembalikan ke inkubator. Setelah itu supernatan dibuang dan ditambahkan 200 L dimetil sulfoksida (DMSO) ke masing-masing sumur. Kristal dilarutkan dengan mengocok pelat selama 10 menit. Absorbansi pada 490 nm diukur menggunakan Microreader (Varioskan LUX Multimode Reader). Sumur kontrol kosong disertakan untuk semua pengukuran absorbansi.
Eksperimen Antibakteri
E. koli dan S. aureus diinkubasi tanpa adanya CD dan CDF pada suhu 37°C dengan pengocokan 250 rpm. Pertumbuhan sel bakteri dalam kultur Lysogeny broth (LB) diukur dengan Microreader pada panjang gelombang 600 nm (OD600). Media LB digunakan sebagai kontrol blanko. OD600 adalah singkatan dari kepadatan sel, dan viabilitas sel relatif dihitung berdasarkan perbandingan antara sel bakteri yang dikultur dengan adanya bahan dengan kelompok kontrol (OD600 dari sel bakteri tanpa adanya CD atau CDF). Bakteri hidup/mati dievaluasi oleh protokol pewarnaan FDA/PI [22].
Deteksi Ros Reactive Oxygen Species (ROS)
Produksi ROS intraseluler diukur dalam sel bakteri sebelum dan sesudah perawatan dengan CD dan CDF selama 12 jam, dengan probe 2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) mengikuti instruksi. Fluoresensi terdeteksi pada panjang gelombang emisi 525 nm dengan eksitasi pada 488 nm.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi Materi
Investigasi Ukuran
Gambar 2 menunjukkan SEM bubuk untuk CDF dengan perbesaran yang relatif lebih rendah (Gbr. 2a0) dan lebih tinggi (Gbr. 2b0) setelah terpapar udara selama beberapa jam. Dapat dilihat bahwa CDF terdistribusi dengan baik dan menunjukkan ukuran rata-rata ca. 25 nm. CD seharusnya menunjukkan ukuran kecil yang tersebar mono berdasarkan studi TEM dan AFM (File tambahan 1:Gambar S1), tetapi partikel-partikel kecil ini menunjukkan agregasi yang diamati oleh SEM setelah terpapar udara selama waktu tertentu (File tambahan 1:Gambar S2 ). Di sisi lain, CDF mempertahankan morfologinya meskipun terpapar lingkungan sekitar. Ini menunjukkan CDF yang diperoleh lebih menjanjikan untuk aplikasi praktis. CDF selanjutnya dicirikan oleh TEM (Gbr. 2b1). Dapat dilihat bahwa CDF memamerkan struktur perakitan dengan CD kecil sebagai blok bangunan. Analisis mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HR-TEM) (Gbr. 2b2) mengungkapkan bahwa blok penyusun CDF menunjukkan pinggiran kisi dengan jarak d 0,21 nm, sesuai dengan kisi bidang (100) grafit, yang mirip dengan CD klasik [23,24,25]. Oleh karena itu, CDF perakitan tidak kehilangan fitur CD, yang dapat menggabungkan keuntungan dari keseluruhan kerangka besar dan blok bangunan kecil interior.
SEM untuk CDF dengan relatif lebih rendah (a0 ) dan perbesaran yang lebih tinggi (b0 ); TEM (b1 ) HR-TEM (b2 ) dari CDF
Zeta Potensi
Investigasi potensi zeta digunakan untuk mengukur tingkat tolakan elektrostatik CD dan CDF antara partikel bermuatan yang berdekatan dalam sistem terdispersi (Gbr. 3). Dapat dilihat bahwa puncak zeta-potensial CD tidak ditampilkan dengan baik, yang terpapar pada lingkungan sekitar. Selain itu, beberapa puncak potensial zeta diperoleh dengan penyimpangan zeta yang besar (Tabel 1), menunjukkan CD cukup tidak stabil dan tidak dapat diulang. Di sisi lain, puncak potensi zeta untuk CDF terfokus pada kisaran yang relatif stabil. Kami juga memiliki deviasi zeta yang jauh lebih kecil berdasarkan pengukuran tiga kali, menunjukkan CDF lebih stabil dan sistem terdispersi memiliki sampel dengan kemurnian lebih tinggi.
Potensi Zeta dari CD (a ) dan CDF (b )
Properti Fluoresensi
Spektrum emisi fluoresensi digunakan untuk memantau proses perakitan CD ke CDF (Gbr. 4). Saat titrasi PEI, emisi fluoresensi pada 350 nm secara bertahap dipadamkan (Gbr. 4a). Tetapi tidak ada pergeseran spektrum fluoresensi yang signifikan yang diamati, menunjukkan tidak ada agregasi yang terjadi. Struktur perakitan CDF mengubah seluruh ukuran CD, yang memengaruhi fluoresensi. Sementara itu, CD terdekat menandai fluoresensi satu sama lain. Selain itu, kimia permukaan memainkan peran penting dalam sifat fluoresensi. Atom nitrogen dan atom sulfur pada permukaan CD dapat menghasilkan energy traps. Fluoresensi cerah dari CD dikaitkan dengan permukaan cacat dengan banyak gugus karbonil dan amino. Setelah fungsionalisasi PEI, permukaan CDF didominasi oleh gugus amino, yang memadamkan fluoresensi bersama dengan ukuran yang tumbuh. Perbandingan perilaku fluoresensi CD dan CDF diperiksa lebih lanjut oleh TCSPC untuk memahami jalur rekombinasi muatan yang dihasilkan foto dari materi (Gbr. 4b). Emisi dipantau pada 430 nm. Peluruhan fluoresensi membutuhkan kecocokan eksponensial dua komponen. Konstanta waktu dan amplitudo relatif dipasang dan diringkas dalam Tabel S1. Terlihat bahwa umur komponen dominan untuk CD adalah 2,45 ns, sedangkan komponen lainnya adalah 7,47 ns. Di sisi lain, masa pakai komponen dominan untuk CD adalah 1,98 ns, sedangkan komponen lainnya menunjukkan masa pakai 7,30 ns. Tidak ada perubahan masa pakai yang signifikan yang diamati antara CD dan CDF, yang juga menunjukkan bahwa sifat CD tidak berubah secara substansial saat perakitan menjadi CDF [26].
Spektrum emisi fluoresensi a CD sebagai titrasi PEI, dan masa pakai b untuk CD dan CDF
Toksisitas
Untuk evaluasi keamanan bahan, toksisitas CD dan CDF terhadap sel PC12 diselidiki. Pengujian MTT dilakukan untuk menyelidiki pengaruh bahan pada viabilitas sel (Gbr. 5). Setelah inkubasi PC12 dengan CD dan CDF, viabilitas sel tidak banyak terpengaruh dalam 24 jam. Menariknya, kedua bahan karbon tersebut mendorong proliferasi PC12, yang memainkan peran penting dalam terapi kerusakan saraf. Hasil ini menunjukkan toksisitas bahan yang rendah, dan bahan tersebut menjanjikan perlindungan saraf dengan sel PC12 yang terlibat [27].
Viabilitas sel PC12 dengan adanya CD (a ) dan CDF (b ). Viabilitas sel (%) = (absorbansi grup eksperimen—absorbansi grup kosong)/(absorbansi grup kontrol—absorbansi grup blanko) × 100%
Investigasi Antibakteri
Aktivitas antibakteri CD dan CDF awalnya dievaluasi dengan mengukur kepadatan bakteri dengan adanya agen ini pada 600 nm [28]. Gbr. 6 menunjukkan efek antibakteri substansial dari CD dan CDF terhadap S. aureus dan E. koli sel. Terutama, kelangsungan hidup S. aureus sel hampir 0 ketika lebih besar dari 30 µg/mL CDF digunakan. Demikian pula, E. koli sel didesinfeksi oleh CD dan CDF. CD menunjukkan beberapa muatan (Gbr. 3a). Di sisi lain, CDF dengan muatan yang tidak signifikan (Gbr. 3b), yang mungkin menekan adhesi bakteri di bawah tolakan yang lemah sehingga berinteraksi dengan permukaan bakteri lebih mudah. Sebagai perbandingan, CDF menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih tinggi berdasarkan fenomena bahwa rasio yang relatif lebih besar dari sel yang terbunuh ketika lebih besar dari 6 g/mL bahan yang digunakan. Peningkatan aktivitas antibakteri CDF mungkin dikaitkan dengan efek sinergi CD sebagai blok bangunan serta muatan permukaan yang lebih stabil. Untuk memahami mekanisme antibakteri secara mendalam, ROS yang dapat mengoksidasi DCFH nonfluoresen menjadi DFC fluoresen diukur (Gbr. 6C). Kedua bahan karbon tidak secara signifikan menginduksi produksi ROS setelah merawat E. koli . Namun, CDF sangat meningkatkan ROS intraseluler saat berinteraksi dengan S. aureus . Karena ROS dapat merusak DNA bakteri, RNA, dan protein, nilai yang ditingkatkan memfasilitasi desinfeksi bakteri. Selanjutnya, ROS dirangsang dengan H2 O2. Perlu dicatat bahwa produksi ROS semuanya dipromosikan secara dramatis dibandingkan dengan H2 O2 pengobatan saja, sementara CDF menunjukkan peningkatan tertinggi. Ini menunjukkan kombinasi H2 O2 dengan dua bahan karbon ini dapat lebih meningkatkan aktivitas antibakteri, terutama untuk CDF.
Aktivitas antibakteri CD dan CDF terhadap S. aureus (a ) dan E.coli (b ), c intensitas fluoresensi DCF pada 525 nm, yang menunjukkan hubungan linier dengan tingkat ROS, dengan perlakuan CD dan CDF tanpa kehadiran dan keberadaan H2 O2 (100 μM)
Beberapa CD sebelumnya dilaporkan untuk desinfektan S. aureus , yang tercantum dalam Tabel 2 untuk perbandingan. CDF saat ini menunjukkan MIC yang kompetitif. Selain itu, daripada hanya menurunkan viabilitas sel yang diselidiki, CDF mempromosikan proliferasi sel PC12, yang menunjukkan keserbagunaannya saat mengobati infeksi bakteri.
Integritas membran bakteri setelah perlakuan CD dan CDF diselidiki dengan eksperimen pewarnaan hidup/mati (Gbr. 7). Pewarnaan FDA fluoresen hijau hanya dapat menunjukkan sel hidup, sedangkan PI fluoresen merah secara khusus menodai bakteri mati dengan membran rusak, tetapi bakteri hidup dengan membran bakteri utuh tidak diwarnai [30, 31]. Seperti yang ditunjukkan pada gambar fluoresensi, fluoresensi merah yang jelas terlihat pada sampel yang diolah dengan CD dan kepadatan sel mati yang jauh lebih tinggi terlihat pada sampel yang dirawat dengan CDF.
Pewarnaan FDA/PI S. aureus dan E. koli dengan tidak adanya dan adanya CD dan CDF pada 30 µg/mL. Bilah skala, 200 µm
Berdasarkan perbandingan di atas, kami menyimpulkan bahwa CDF menjanjikan untuk membunuh sel bakteri Gram-positif dan Gram-negatif. Oleh karena itu, E. koli dan S. aureus sebelum dan sesudah pengobatan dengan 30 g/mL CDF dicirikan oleh SEM (Gbr. 8). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8a, c, bakteri sebelum pengobatan dengan CDF menunjukkan permukaan yang teratur. Namun, setelah inkubasi dengan CDF, morfologi sel bakteri termasuk S. aureus (Gbr. 8b) danE. coli (Gbr. 8d) berubah drastis. Selain itu, membran banyak sel bakteri pecah. Beberapa bahan kecil diamati pada permukaan bakteri, yang berasal dari CDF yang terpasang. Ini menunjukkan CDF dapat mendisinfeksi sel bakteri dengan merusak membran [32].
SEM untuk S. aureus (a , b ) dan E.coli sebelumnya (a , c ) dan setelah (b , d ) pengobatan dengan 30 µg/mL CDF. Bilah skala:2 µm
Karena CD dan CDF keduanya berpendar, 6 g/mL agen diselidiki untuk pencitraan bakteri selama proses desinfeksi. Pencitraan S. aureus diselidiki dan ditunjukkan pada Gambar. 9. Menariknya, ditemukan bahwa CD dan CDF dapat digunakan untuk pencitraan S. aureus . Namun, CDF menunjukkan efisiensi penyerapan yang lebih tinggi karena sel bakteri yang mengamati dari bidang terang dan gelap hampir tumpang tindih. Di sisi lain, hanya sebagian dari S. aureus sel diwarnai oleh CD. Selain itu, kepadatan sel bakteri lebih kecil dengan perlakuan CDF, menunjukkan CDF yang didesinfeksi S. aureus lebih efisien dibandingkan dengan CD pada dosis yang sama. Hasil ini juga mengungkapkan bahwa CDF dapat digunakan sebagai pewarna alternatif untuk pencitraan berbagai sel bakteri.
Pencitraan S. aureus dengan penggunaan CD dan CDF setelah 12 jam
Kesimpulan
Perakitan CD menjadi CDF menghasilkan aktivitas antibakteri yang lebih kuat. Disimpulkan bahwa struktur perakitan memungkinkan sifat yang lebih stabil tetapi memperbesar aktivitas antibakteri CD. Pekerjaan ini juga menyediakan jalan baru untuk merakit nanomaterial kecil ke dalam kerangka kerja untuk aplikasi yang lebih praktis.
Ketersediaan Data dan Materi
Semua data yang mendukung kesimpulan artikel ini disertakan dalam artikel.
