Kompleksasi dengan C60 Fullerene Meningkatkan Efisiensi Doksorubisin terhadap Sel Leukemia In Vitro
Abstrak
Kemoterapi antikanker konvensional terbatas karena efek samping yang parah serta resistensi multiobat yang berkembang pesat dari sel tumor. Untuk mengatasi masalah ini, kami telah menjelajahi C60 sistem berukuran nano berbasis fullerene sebagai pembawa obat antikanker untuk pengiriman obat yang dioptimalkan ke sel leukemia.
Di sini, kami mempelajari sifat fisikokimia dan aktivitas antikanker C60 kompleks nonkovalen fullerene dengan obat antikanker doxorubicin yang umum digunakan. C60 Kompleks -doksorubisin dengan perbandingan 1:1 dan 2:1 dikarakterisasi dengan spektrometri UV/Vis, hamburan cahaya dinamis, dan spektrometri massa tandem kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC-MS/MS). Data analitik yang diperoleh menunjukkan bahwa kompleks 140-nm stabil dan dapat digunakan untuk aplikasi biologis. Dalam garis sel leukemia (CCRF-CEM, Jurkat, THP1 dan Molt-16), kompleks nano mengungkapkan potensi sitotoksik 3,5 lebih tinggi dibandingkan dengan obat bebas dalam kisaran konsentrasi nanomolar. Juga, tingkat obat intraseluler terbukti C60 fullerene fungsi nanocarrier yang cukup besar.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa C60 nanokompleks pengiriman berbasis fullerene memiliki nilai potensial untuk optimalisasi efisiensi doksorubisin terhadap sel leukemia.
Pengantar
Upaya utama dalam penelitian kanker bertujuan untuk menemukan cara yang lebih kuat dan selektif untuk menghilangkan sel kanker secara langsung. Tugas ini dapat diatasi dengan sarana nanobioteknologi. Kemajuan terbaru dalam bidang ini telah membangkitkan minat pada struktur nano karbon — C60 fullerene [1] yang tidak hanya menunjukkan sifat fisikokimia yang unik [2, 3], aktivitas biologis [4,5,6,7,8,9,10] dan perilaku antioksidan [11,12,13,14], tetapi juga memiliki potensi yang signifikan untuk berfungsi sebagai nanocarrier untuk pengiriman obat ke dalam sel kanker [15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25] (di sini secara konsisten disingkat sebagai "C60 ”).
Obat kemoterapi antikanker anthracycline Doxorubicin (di sini disingkat secara konsisten sebagai "Dox") adalah salah satu kandidat pertama untuk pengiriman nano yang lebih bertarget karena kardiotoksisitas yang mengancam jiwa dan efek samping serius lainnya [25, 26]. Mekanisme utama toksisitas Dox terhadap sel kanker adalah interkalasinya ke dalam DNA nuklir diikuti dengan penghambatan aktivitas topoisomerase, replikasi DNA, dan perbaikan [26,27,28]. Tapi efek samping Dox pada kardiomiosit dianggap ditentukan oleh mekanisme lain, terutama, pembentukan spesies oksigen reaktif yang berhubungan dengan besi [27, 28]. Kombinasi C60 potensi antioksidan [2, 11, 13] dan kemampuannya untuk penghantaran obat [24, 25] membuat struktur nano sangat menarik untuk terapi antikanker.
Kompleksasi Dox dengan struktur nano meningkatkan ukuran obat, baik meningkatkan retensi dalam organisme dan memperpanjang aktivitas terapeutik [29, 30]. Untuk mengembangkan sistem nano yang dapat diterapkan untuk pengiriman obat antikanker yang sukses, penelitian sebelumnya berfokus pada aspek stabilitas, biokompatibilitas, biodistribusi, dan fungsionalitas [29,30,31,32,33].
Kopling Dox dan C60 untuk penargetan pasif sel kanker dapat dicapai dengan hubungan kovalen [15,16,17, 23] atau dengan interaksi nonkovalen [18,19,20,21,22]. Kompleks C60 dengan dua molekul Dox terkait amida menunjukkan sitotoksisitas yang sama terhadap sel MCF-7 kanker payudara manusia sebagai obat bebas [16]. Saat Dox terikat ke C60 melalui penghubung karbamat, tidak menunjukkan perubahan dalam kemanjuran antitumor tetapi tidak memiliki toksisitas sistemik dalam model tumor murine [17]. Ketika satu atau dua molekul Dox ditambatkan pada C60 . pegilasi partikel melalui ikatan tipe uretan, kompleks tersebut bahkan menunjukkan efek antiproliferatif yang tertunda pada sel MCF-7 [23].
Untuk kompleksasi nonkovalen dari molekul Dox aromatik dengan permukaan poliaromatik C60 , efek susun -π bertanggung jawab. Dalam upaya perintis, Evstigneev et al. [19] menunjukkan metode sederhana dan cepat dari C60 kompleksasi nonkovalen dengan Dox dalam air [19] dan dalam larutan fisiologis [20]. Sistem nano yang diusulkan terbukti memiliki toksisitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan obat bebas terhadap berbagai lini sel tumor manusia in vitro dan karsinoma paru-paru Lewis tikus in vivo [21, 22]. Dalam pendekatan lain, efek antimikroba dan penerapan untuk pencitraan in vivo ditunjukkan [18].
Tujuan dari penelitian yang disajikan adalah untuk menilai sifat fisikokimia C60 -Kompleks Dox terbentuk setelah interaksi nonkovalen dari komponen, akumulasi intraselulernya dan potensi ytotoxic terhadap garis sel leukemia manusia.
Metode/Eksperimental
Bahan kimia
Media cair RPMI 1640, phosphate-buffered saline (PBS), fetal bovine serum (FBS), penisilin/streptomisin dan L-glutamin diperoleh dari Biochrom (Berlin, Jerman). 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) dan Hoechst 33342 diperoleh dari Sigma-Aldrich Co. (St-Louis, USA). Dimetilsulfoksida (DMSO), natrium klorida, asetonitril, asam format, dan biru tripan dari Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Jerman) digunakan.
C60 dan C60 -Sintesis Kompleks Dox
C60 . yang murni larutan koloid berair dibuat dengan C60 transfer dari toluena ke air menggunakan sonikasi ultrasound terus menerus seperti yang dijelaskan oleh Ritter et al. [34] C60 . yang diperoleh larutan koloid air memiliki konsentrasi akhir 150 μg/ml dengan kemurnian 99%, stabilitas dan homogenitas dan ukuran nanopartikel rata-rata 100 nm [34, 35].
Dox (“Doxorubicin-TEVA”, Pharmachemie B.V., Utrecht, Belanda) dilarutkan dalam larutan fisiologis pada konsentrasi awal 150 μg/ml.
A C60 -Dox kompleks disiapkan sesuai dengan protokol [20]. Secara singkat, C60 dan larutan Dox dicampur dalam rasio berat 1:1 atau 2:1. Campuran diperlakukan dalam penyebar ultrasonik selama 30 menit dan diaduk secara magnetis selama 24 jam pada suhu kamar. Konsentrasi akhir dari kedua C60 dan Dox di C60 -Dox 1:1 kompleks adalah 75 μg/ml. Konsentrasi akhir C60 dan Dox di C60 -Dox 2:1 kompleks adalah 100 μg/ml dan 50 μg/ml, masing-masing. Obat yang tidak terikat dicuci dengan Kit Dialisis Pur-A-LyzerTM Midi 1000 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA). Stabilitas (nilai potensial ) dan distribusi ukuran (diameter hidrodinamik) [20, 36,37,38,39] kompleks diperiksa secara sistematis dan terbukti praktis tidak berubah setelah 6 bulan penyimpanan dalam larutan garam fisiologis. Konsentrasi kerja C60 Kompleks -Dox dalam probe disajikan menurut konsentrasi setara Dox dalam kisaran 0,1–100 μM dengan tujuan untuk membandingkan efek kompleks dengan efek obat bebas dalam konsentrasi yang sama.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi-Spektrometri Massa Tandem
Spektrometri massa C60 -Kompleks Dox setelah pemisahan kromatografi dicapai dengan spektrometer massa quadrupole tandem LCMS-8040, dilengkapi dengan sumber ionisasi elektrospray (ESI) (Shimadzu, Kyoto, Jepang) yang digabungkan ke sistem kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) Nexera. Yang terakhir menggunakan kolom Eclipse XDB-C18 100 mm × 4.6 mm, 3 μM (Agilent, Santa Clara, USA) dengan fase gerak isokratik asetonitril dan larutan air asam format 0,1% (80:20, v /v ) pada laju aliran 0,3 ml/menit. Kondisi fase balik kromatografi dan parameter MS/MS yang dioptimalkan disajikan pada Tabel 1. Untuk identifikasi dan kuantifikasi, ion molekul Dox dipilih. Analisis HPLC-ESI-MS/MS dilakukan dalam mode positif dengan menggunakan rezim pemantauan reaksi ganda (MRM) yang memberikan sensitivitas dan akurasi pengukuran terbaik. Setelah optimasi MS/MS, transisi MRM unik yang mencakup prekursor dan ion produk karakteristik diperoleh dan digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi lebih lanjut. Dox terprotonasi ([M
+
H]
+
, 544.2 m/z) digunakan sebagai ion prekursor dengan ion fragmen paling melimpah 130.2 dan 361.1 m/z.
Untuk pemrosesan data, perangkat lunak LabSolutions HPLC-MS/MS (Shimadzu, Kyoto, Jepang) digunakan. Parameter lain disetel secara otomatis.
Standar kalibrasi Dox dari 0,005 hingga 5 μM dibuat dari larutan stok air 1,85 mM. Standar disimpan di tempat gelap pada suhu 4 °C. Kurva kalibrasi diplot dengan 1/X pembobotan, r
2
= 0.99463. Batas deteksi (LOD) dan kuantifikasi (LOQ) didefinisikan menurut LOD = 3.3 × s /Lereng dan LOQ = 10 × s / Lereng, masing-masing, di mana s adalah standar deviasi dari garis regresi.
Analisis Spektroskopi dan Fluorometrik
Spektrum absorbansi dan fluoresensi dari Dox dan C60 . bebas Kompleks -Dox diukur pada parameter berikut:(1) absorbansi — rentang panjang gelombang 400–550 nm, ukuran langkah panjang gelombang 5 nm, jumlah kilatan per sumur 25; (2) fluoresensi — λex = 470 nm, rentang panjang gelombang 500–800 nm, ukuran langkah panjang gelombang 2 nm, jumlah kilatan per sumur 25. Volume 100 μl larutan yang dipelajari diukur dalam pelat 96 sumur Sarstedt (Nümbrecht, Jerman) dengan multimode spektrometer lempeng mikro Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Swiss).
Penghamburan Cahaya Dinamis
C60 Distribusi ukuran kompleks -Dox dievaluasi dengan Zetasizer Nano S (Malvern Instruments, UK) yang dilengkapi dengan laser He-Ne (633 nm). Data direkam pada suhu 37 °C dalam modus hamburan balik pada sudut hamburan 2θ = 173°.
Budaya Sel
Garis sel T kanker manusia asal leukemia CCRF-CEM (ACC 240), Jurkat (ACC 282), dan Molt-16 (ACC 29) dibeli dari Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung). von Mikroorganisme dan Zellkulturen). THP1 dengan baik hati disediakan oleh Dr. Sofia Cortes (Universitas Baru Lisbon, Portugal).
Sel dipertahankan dalam media RPMI 1640 yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi, 1% penisilin/streptomisin, dan 2 mM glutamin, menggunakan 25 cm
2
termos pada 37 °C dengan 5% CO2 dalam Binder inkubator yang dilembabkan (Tuttlingen, Jerman). Jumlah sel yang hidup dihitung pada pewarnaan biru trypan 0,1% dengan Roche Cedex XS Analyzer (Basel, Swiss).
Viabilitas Sel
10
4
sel / sumur dikultur dalam pelat kultur sel 96-sumur Sarstedt (Nümbrecht, Jerman) selama 24 jam. Media kultur sel digantikan oleh media yang dilengkapi obat. Sel diinkubasi dengan adanya berbagai konsentrasi Dox atau C60 . bebas yang bervariasi -Dox kompleks. Setelah inkubasi 24, 48, dan 72 jam, viabilitas sel ditentukan dengan uji reduksi MTT [40]. Secara singkat, 10 μl larutan MTT (5 mg/ml dalam PBS) ditambahkan ke setiap sumur dan sel diinkubasi selama 2 h pada 37 °C. Media kultur kemudian diganti dengan 100 μl DMSO, dan pembentukan diformazan ditentukan dengan mengukur penyerapan pada = 570 nm dengan pembaca lempeng mikro Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Swiss). Pemasangan kurva dan perhitungan nilai konsentrasi penghambatan setengah maksimal (IC50) dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak khusus GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., USA). Secara singkat, kurva efek konsentrasi individu dihasilkan dengan menyesuaikan logaritma dari konsentrasi senyawa yang diuji versus persentase normalisasi nilai viabilitas sel yang sesuai menggunakan regresi nonlinier.
Mikroskop Fluoresen
Sel CCRF-CEM diunggulkan dalam pelat 6-sumur Sarstedt (Nümbrecht, Jerman) dengan kepadatan sel 2 × 10
5
sel / sumur dalam 2 ml media kultur dan diinkubasi selama 24 h. Kemudian, sel diperlakukan dengan 1 μM Dox gratis atau C60 -Dox kompleks selama 1, 3, dan 6 h dan dicuci dengan PBS. Visualisasi dilakukan dengan Mikroskop Fluoresensi Keyence BZ-9000 BIOREVO (Osaka, Jepang) yang dilengkapi dengan warna merah (λex = 480 nm, em = 600 nm) dan perangkat lunak akuisisi masing-masing Keyence BZ-II Viewer (Osaka, Jepang).
Flow Cytometry
Sel CCRF-CEM (2 × 10
5
/well, 2 ml) diunggulkan di piring 6-sumur, diinkubasi selama 24 h, dan kemudian diperlakukan dengan 1 μM gratis dan C60 terikat Doks. Setelah inkubasi 1, 3, dan 6 jam, sel dipanen, dicuci dengan PBS, dan dianalisis dengan flow cytometer BD FACSJazz™ (Singapura). Minimal 2 × 10
4
sel per sampel diperoleh dan dianalisis dengan perangkat lunak BD FACS™ (Singapura).
Statistik
Semua percobaan dilakukan dengan minimal empat ulangan. Analisis data dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., USA). t . Siswa Berpasangan tes dilakukan. Perbedaan nilai p < 0,05 dianggap signifikan.
Hasil dan Diskusi
Analisis HPLC-MS/MS dari C60 -Kompleks Dox
Untuk pemisahan kromatografi kami menggunakan kondisi fase terbalik dengan harapan bahwa selama proses pemisahan, hidrofobik C60 molekul dipertahankan pada kolom jauh lebih kuat daripada Dox lebih polar [41]. Elusi dengan fase gerak polar seharusnya menyebabkan dekomposisi kompleks dan pelepasan Dox bebas yang memiliki afinitas lebih tinggi terhadap fase gerak dan dapat dideteksi dengan spektrometri massa.
Untuk mengkonfirmasi keberadaan kompleks dalam larutan, konsentrasi 1 μM Dox dipilih sebagai yang optimal untuk analisis analitik. Di bawah kondisi aliran isokratik, waktu retensi untuk Dox dan Dox gratis sebagai komponen kompleks dengan C60 berbeda — 11,66 dan 9,44 min, masing-masing (Gbr. 1). Selain itu, puncak kromatografi Dox yang dilepaskan dari kompleks lebih luas dan dengan "puncak tailing" yang diamati. Pergeseran waktu retensi yang terdeteksi serta bentuk pick yang berbeda menunjukkan bahwa dekomposisi C60 -Dox berkonjugasi pada molekul fullerene kolom yang memiliki afinitas lebih tinggi terhadap kolom C18. Oleh karena itu, struktur nano menempati bagian dari situs pengikatan aktif dan mengganggu pengikatan Dox ke situs tersebut dengan benar, sehingga mempengaruhi proses pemisahan. Hal ini mengakibatkan retensi yang lebih pendek (mengurangi waktu yang dibutuhkan Dox untuk melewati kolom) serta batas puncak dan tailing untuk Dox yang dilepaskan dari kompleks dibandingkan dengan obat bebas. Fenomena yang sangat mirip diamati oleh Lie et al. [42] selama pemisahan kromatografi C60 kompleks nonkovalen dengan pullulan. Perbedaan kromatogram dari Dox bebas dan yang dilepaskan dari kompleks terbukti menunjukkan adanya C60 -Dox kompleks dalam larutan.
Kromatogram pemantauan reaksi ganda dari Dox gratis (1 μM), C60 -Dox 1:1 dan C60 -Dox 2:1 (konsentrasi setara Dox 1 μM) di bawah aliran isokratik (asetonitril, 0,1% asam format dalam H2 O, 80:20, v :v ), prekursor → transisi ion produk:544.2 → 130.2 dan 361.1 m/z; a.u. unit sewenang-wenang
Analisis Spektroskopi dan Fluorometrik
Sifat optik Dox ditentukan oleh transisi elektron dalam sistem kompleks dari cincin aromatik dan gugus ketonnya [43]. Spektrum serapan khas Dox terletak pada panjang gelombang < 600 nm dengan pita lebar pada 480 nm (Gbr. 2a). Spektrum penyerapan UV/Vis dari C60 . yang murni larutan koloid air memiliki tiga pita serapan khas dengan maksimum pada 220, 265 dan 350 nm dan ekor lebar kecil yang panjang hingga daerah merah dari cahaya tampak [34, 44]. Oleh karena itu, spektrum kontrol masing-masing C60 . bebas dikurangkan dari spektrum kompleks. Spektrum penyerapan yang diamati dari kedua kompleks 50 μM serupa dengan 50 μM Dox bebas, tetapi efek hipokromik 30% diamati (Gbr. 2a) yang menunjukkan fiksasi Dox pada C60 permukaan karena interaksi susun -π.
Karakterisasi optik kompleks. Spektrum densitas optik Dox dan C60 free gratis -Kompleks Dox (a ). Spektrum emisi fluoresensi Dox dan C gratis60 -Kompleks Dox pada konsentrasi setara Dox dari 3 hingga 50 μM (b ); a.u. unit sewenang-wenang
Panjang gelombang maksimum serapan panjang Dox (λ = 480 nm) digunakan sebagai panjang gelombang eksitasi untuk melacak fluoresensinya. Spektrum fluoresensi menunjukkan satu pita lebar yang terdiri dari tiga puncak pada 560, 594 dan 638 nm dengan maksimum sekitar 594 nm (Gbr. 2b) [43], sedangkan C60 tidak memiliki fluoresensi yang terdeteksi pada pita spektral ini. C60 Fluoresensi kompleks -Dox diperkirakan dalam serangkaian pengenceran dengan konsentrasi setara Dox dari 3 hingga 50 μM. Terlepas dari pengenceran, fluoresensi Dox (λex = 480 nm, em = 594 nm) di kompleks dipadamkan oleh C60 bagian (Gbr. 2b). Dengan demikian, fluoresensi Dox di kedua kompleks pada konsentrasi setara Dox 3 μM tampaknya padam sebesar 50%. Pendinginan fluoresensi Dox yang diamati dikaitkan dengan kemampuan penerimaan elektron yang kuat dari C60 [3] dan transfer energi keadaan tereksitasi intramolekul khas untuk kompleks Dox nonkovalen [18, 36, 45], yang menunjukkan kedekatan spasial komponen.
Analisis Distribusi Ukuran berdasarkan Hamburan Cahaya Dinamis
Ukuran dan stabilitas obat antikanker nanopartikel secara substansial tergantung pada komposisi media kultur sel, kekuatan ionik dan konsentrasi protein. Diameter hidrodinamik rata-rata 1 μM C60 -Dox 1:1 dan 2:1 kompleks dalam larutan garam fisiologis (0,9% NaCl) ditemukan masing-masing 135 ± 5 nm dan 134 ± 6 nm, sesuai dengan data penyelidikan sebelumnya [20]. Untuk memperkirakan stabilitas dalam media kultur sel, 1-μM C60 Kompleks -Dox diinkubasi pada suhu 37 °C selama 72 jam dalam RPMI yang dilengkapi dengan 10% FBS. Pola distribusi ukuran partikel dalam media ini (Gbr. 3) dikaitkan dengan kandungan protein yang tinggi serta kemungkinan agregasinya [46, 47].
Ukuran hidrodinamik (diameter, nm) 1 μM 60 -Kompleks Dox dalam media kultur sel RPMI yang dilengkapi dengan 10% FBS pada 0 (a ) dan 72-jam (b ) inkubasi. Intensitas (%) persentase dari semua intensitas cahaya yang tersebar
Data hamburan cahaya dinamis pada 1 μM C60 Distribusi diameter hidrodinamik nanokompleks -Dox 1:1 dan 2:1 dalam kultur sel yang dilengkapi FBS menunjukkan bahwa ukurannya adalah 138 ± 6 nm dan 139 ± 5 nm bila diukur segera (Gbr. 3a) dan 146 ± 4 nm dan 144 ± 5 nm setelah 72 jam inkubasi (Gbr. 3b), masing-masing.
Stabilitas maksimum yang terdeteksi (sekitar 140 nm) menunjukkan bahwa tidak ada agregasi tambahan dari C60 -Kompleks Dox selama inkubasi berkepanjangan dalam media kultur sel yang dilengkapi FBS yang mengkonfirmasi kesesuaiannya untuk studi in vitro.
Viabilitas Sel
Kelangsungan hidup sel leukemia manusia dari galur yang berbeda diperkirakan dengan uji MTT pada inkubasi 24, 48, dan 72 jam dengan adanya C60 -Dox kompleks serta Dox bebas secara terpisah pada konsentrasi yang setara. C60 sendiri pada konsentrasi yang setara dengan yang ada di kompleks tidak berpengaruh pada kelangsungan hidup sel leukemia (data tidak ditampilkan).
Gambar 4 menunjukkan penurunan viabilitas sel leukemia yang bergantung pada waktu dan konsentrasi di bawah pengobatan Dox. Obat itu terbukti menunjukkan toksisitas terhadap sel leukemia dalam kisaran nanomolar. Sensitivitas sel leukemia terhadap Dox ditemukan mengikuti urutan Molt-16 ˃ THP1 ˃ Jurkat ˃ CCRF-CEM (kurang sensitif).
Viabilitas sel leukemia CCRF-CEM, Jurkat, THP1 dan Molt16, diobati dengan dosis yang sama dari Dox atau C60 gratis -Dox kompleks untuk 24, 48, dan 72 h (*p 0,05 dibandingkan dengan Dox gratis, **p 0,05 dibandingkan dengan C60 -Dox 1:1 kompleks, n = 5)
Di bawah aksi 100 nM Dox, kelangsungan hidup sel CCRF-CEM menurun menjadi 84 ±7, 50 ± 4 dan 34 ± 7% dibandingkan dengan kontrol pada 24, 48 dan 72 h, masing-masing. Pola yang sebanding dari efek toksik Dox 100 nM ditemukan dalam sel Jurkat. Kelangsungan hidup sel THP1 setelah pengobatan dengan sel Dox 100 nM ditemukan 50 ± 4, 47 ± 5, dan 13 ± 4% pada 24, 48 dan 72 h, masing-masing. Konsentrasi Dox penghambatan setengah-maksimal (IC50) untuk CCRF-CEM, THP1 dan sel Jurkat pada 72 h inkubasi diperkirakan masing-masing 80 ± 9, 43 ± 5 dan 38 ± 6 nM. Data ini sesuai dengan data literatur [48, 49]. Sel Molt-16 tampaknya paling sensitif terhadap obat karena efek toksiknya terdeteksi dalam kisaran 1 hingga 25 nM dalam semua periode inkubasi sel. Viabilitas sel Molt-16 yang diobati dengan 5 nM Dox menurun menjadi 75 ±4, 28 ± 4 dan 18 ± 4% dari kontrol pada 24, 48 dan 72 h, masing-masing, dan nilai IC50 pada 72 h adalah sama dengan hanya 2.0 nM. Sensitivitas tinggi yang serupa dari sel Molt-16 dengan induksi apoptosis 10 kali lebih intensif dibandingkan dengan sel Jurkat di bawah pengobatan alkaloid herbal sebelumnya dilaporkan oleh Cai et al. [50].
Sel yang diobati dengan Dox gratis digunakan sebagai kontrol untuk menilai kelangsungan hidup di bawah aksi C60 -Dox kompleks pada dosis obat yang setara. Nilai IC50 untuk Dox dan C gratis60 -Kompleks Dox dihitung untuk setiap titik waktu dan garis sel dan tercantum pada Gambar. 4.
Ditunjukkan bahwa kedua C60 -Kompleks Dox memiliki potensi toksik yang lebih tinggi dibandingkan dengan Dox bebas terhadap garis sel leukemia manusia (Gbr. 4).
Singkatnya, banyak percobaan kami menunjukkan untuk empat garis sel berbagai toksisitas yang ditingkatkan hingga 3,5 kali lipat. C60 -Dox 1:1 kompleks telah menunjukkan toksisitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan 2:1 kompleks. Efek yang kurang jelas (IC50 menurun pada 2,5 kali dibandingkan dengan Dox gratis) dari kompleks 2:1 dapat dikaitkan dengan konsentrasi C60 yang lebih tinggi sebagai komponennya. Karena aktivitas antioksidannya [11, 13], kelebihan C60 dapat melindungi sel dari stres oksidatif terkait Dox [27].
Akumulasi Intraseluler Dox Gratis dan C60 -Kompleks Dox
Untuk menyelidiki korelasi potensial dari peningkatan efek toksik C60 -Dox kompleks dengan akumulasi obat intraseluler yang lebih efektif, ambilan seluler dari Dox dan C60 gratis -Dox dipelajari. Karena Dox memiliki penyerapan dan fluoresensi yang kuat di wilayah spektral yang terlihat [43, 45] (Gbr. 2), pelacakan kompleks Dox dimungkinkan dengan teknik berbasis fluoresen langsung non-invasif. Sel CCRF-CEM diinkubasi dengan adanya 1 μM Dox atau C60 -Kompleks Dox dalam konsentrasi yang setara dengan obat, diperiksa dengan mikroskop fluoresen dan dikenai flow cytometry untuk mengukur tingkat akumulasi obat intraseluler setelah pengobatan 1, 3 dan 6 jam (Gbr. 5). Intensitas fluoresensi rata-rata dari setiap sampel dihitung dari histogram FACS logaritmik dengan nilai masing-masing sinyal fluoresen merah Dox (λex = 488 nm, em = 585/29 nm) dan disajikan pada Tabel 2. Autofluoresensi sel yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol negatif (Gbr. 5a).
Akumulasi intraseluler dari 1 μM gratis dan C60 kompleks Dox. Aliran sitometri (a ) dan gambar mikroskop fluoresen (b ) sel CCRF-CEM yang diinkubasi dengan Dox dan C60 -Dox pada rasio 1:1 dan 2:1 untuk 1, 3 dan 6 h. Bilah skala 20 μM
Akumulasi 1 μM Dox yang bergantung waktu diperkirakan dengan peningkatan intensitas fluoresensi (Gbr. 5, Tabel 2). Gambar mikroskop fluoresensi menggambarkan bahwa C60 -Kompleks Dox diinternalisasi lebih cepat daripada obat bebas sebagaimana dibuktikan oleh fluoresensi intraseluler yang jauh lebih cerah (Gbr. 5b). Intensitas fluoresen rata-rata sel CCRF-CEM, diperlakukan dengan 1:1 C60 Kompleks -Dox pada konsentrasi setara Dox 1 μM, meningkat 1,5, 1,7 dan 2,2 kali dibandingkan dengan Dox bebas masing-masing pada 1, 3 dan 6 h. 2:1 C60 -Kompleks Dox menunjukkan akumulasi obat intraseluler tertunda yang mencapai tingkat yang sama dengan kompleks 1:1 pada 6 jam (Gbr. 5, Tabel 2).
Data yang diperoleh menunjukkan bahwa kompleksasi Dox dengan C60 mempromosikan masuknya ke dalam sel tetapi tidak mempengaruhi lokalisasi. Pewarnaan kontrol sel yang dipelajari dengan pewarna pengikat DNA Hoechst 33342 mengungkapkan kolokalisasinya dengan sinyal Dox (data tidak ditampilkan). Terbukti, molekul Dox dari C60 kompleks dan obat bebas memasuki inti yang mencerminkan dampak antiproliferatif melalui kerusakan DNA [26,27,28]. Penyerapan obat intraseluler meningkat pada kompleksasi dengan C60 menunjuk ke arah yang terakhir berfungsi sebagai promotor transportasi obat. C60 struktur nano ditunjukkan untuk memindahkan membran plasma seluler karena difusi pasif [51] dan/atau endositosis/pinositosis [52, 53], sedangkan molekul kecil seperti Dox hanya dapat menembus melalui difusi pasif. C60 struktur menyerupai struktur clathrine [54, 55], komponen mantel utama pembentukan vesikel selama endositosis. Oleh karena itu, C60 dapat berfungsi sebagai pengangkut molekul aromatik kecil [56]. Sebaliknya, ikatan kovalen antara pembawa dan kargo memperkenalkan perubahan struktural ke dalam molekul obat. Akibatnya, pola akumulasi dan interaksi dengan target intraseluler diubah yang mengakibatkan hilangnya sebagian atau seluruh fungsi obat. Liu dkk. [15] menunjukkan bahwa C60 dengan dua molekul Dox yang terikat melalui ikatan amida didistribusikan secara dominan di sitoplasma.
Kesimpulan
Sifat fisikokimia C60 -Kompleks Dox dengan rasio komponen 1:1 dan 2:1 telah ditentukan, dan toksisitasnya terhadap sel leukemia manusia CCRF-CEM, Jurkat, Molt-16 dan THP1 diperkirakan.
Analisis HPLC-MS/MS mengungkapkan perbedaan nyata dalam kromatogram Dox bebas dan yang dilepaskan dari C60 -Dox kompleks. Kompleksasi C60 dengan Dox dikonfirmasi oleh efek hipokromik penyerapan dan pendinginan fluoresensi di C60 -Dox kompleks. Kami menentukan bahwa ukuran C60 Kompleks -Dox sekitar 140 nm dipertahankan dengan adanya protein dan inkubasi yang berkepanjangan dalam medium. Studi pada garis sel leukemia manusia mengungkapkan bahwa C60 Kompleks -Dox memiliki sitotoksisitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan obat bebas dalam konsentrasi yang setara. Pada 72 jam inkubasi sel, nilai IC50 untuk kompleks 1:1 dan 2:1 masing-masing menurun pada 3,5 dan 2,5 kali, dibandingkan dengan IC50 untuk obat bebas. Kompleksasi dengan C60 mempromosikan masuknya Dox ke dalam sel leukemia. Perawatan sel CCRF-CEM selama 6 jam dengan C60 -Kompleks Dox dalam 1 μM Konsentrasi setara Dox diikuti oleh peningkatan 2,2 kali lipat tingkat intraseluler obat dibandingkan dengan pengobatan dengan Dox gratis.
Hasil kami mengkonfirmasi fungsi C60 sebagai nanocarrier dan perspektif penerapannya untuk optimalisasi efisiensi Dox terhadap sel leukemia. Karena Dox hanya merupakan bahan perwakilan atau model untuk banyak obat antitumor, kami berharap bahwa temuan kami dapat ditransfer ke obat lain. Meningkatkan penyerapan obat ke dalam sel tumor dan/atau kualitas antitumornya dapat mengarah pada strategi pengobatan baru. Kompleksasi obat dengan nanocarrier dapat mengurangi tingkat dosis yang efektif dan dengan demikian mengurangi efek samping yang tidak diinginkan.
Riwayat perubahan
Singkatan
C60 :
C60 fullerene
DMSO:
Dimetilsulfoksida
Dox:
Doksorubisin
ESI:
Ionisasi semprotan listrik
FBS:
Fetal bovine serum
HPLC-MS/MS:
High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
