nanopartikel emas biokonjugasi yang kompatibel secara lingkungan sebagai agen kontras yang efisien untuk pencitraan kanker yang diinduksi peradangan
Abstrak
Untuk banyak kanker, deteksi dini adalah kunci untuk meningkatkan kelangsungan hidup dan mengurangi morbiditas, yang terkait dengan reseksi radikal karena diagnosis yang terlambat. Di sini, kami menggambarkan efisiensi nanopartikel emas terkonjugasi antibodi primer (AuNPs) untuk secara khusus menargetkan proses inflamasi kronis, khususnya makrofag M2, di bagian jaringan kolitis ulserativa (UC) dan steatohepatitis pada tikus yang dapat menyebabkan kanker kolorektal dan karsinoma hati, masing-masing. Dalam penelitian ini, kami mendemonstrasikan bahwa AuNP yang disintesis dengan metode sederhana, murah, dan ramah lingkungan dapat dengan mudah dikonjugasikan dengan antibodi anti-COX-2, anti-MIF, dan Alexa Fluor® 488 (ALEXA) untuk melakukan pewarnaan imunofluoresensi pada inflamasi tisu. Selain itu, kami menunjukkan bahwa nanopartikel emas terkonjugasi antibodi primer (AuNPs) dapat digunakan untuk menargetkan makrofag M2 dengan flow cytometry. Kami merancang tiga protokol pewarnaan imunofluoresensi bagian jaringan dengan AuNPs selama 30 menit dan inkubasi semalam, serta satu protokol aliran sitometri dari pelabelan makrofag M2 dengan AuNPs selama 30 menit. Hasil imunofluoresensi dan flow cytometry menunjukkan bahwa konjugasi dicapai dengan adsorpsi langsung antibodi pada permukaan AuNPs. Jika dibandingkan dengan protokol ALEXA standar dalam imunofluoresensi (IF) dan flow cytometry (FC), protokol inkubasi 30 menit kami menggunakan AuNPs alih-alih ALEXA menurun dari sekitar 23 h menjadi 5 h untuk IF dan dari 4 h menjadi 1h untuk FC, terbukti kurang melelahkan, yang membuat metode ini memenuhi syarat untuk diagnostik kanker yang disebabkan oleh peradangan.
Pengantar
Dalam penelitian medis dan biologi, minat pada nanopartikel emas (AuNPs) untuk studi mikroskop optik dan prosedur diagnostik, terutama mikroskop laser confocal, meningkat. Penggunaan konjugat antibodi/AuNP memungkinkan deteksi real-time pengambilan emas ke dalam sel hidup (misalnya, sel kanker) pada tingkat partikel tunggal, memungkinkan estimasi jumlah NP intraseluler [1,2,3].
Sifat fisikokimia AuNP memungkinkan mereka untuk digunakan dalam banyak penelitian medis, seperti genomik, biosensitivitas, immunoassay, kimia klinis, deteksi, dan fototermolisis mikroorganisme dan sel kanker [1]. Faulk dan Taylor [4] menjelaskan metode pertama konjugasi antibodi dengan emas koloid untuk visualisasi mikroskopis elektron langsung dari antigen permukaan salmonella. Sejak itu, banyak penelitian dikembangkan yang bertujuan untuk aplikasi nanopartikel terkonjugasi dengan biomakromolekul, seperti antibodi, lektin, dan enzim, di berbagai bidang, misalnya, biokimia, mikrobiologi, imunologi, dan morfologi [1, 4]. Dalam studi kanker, agen kontras berbasis AuNP yang sangat spesifik dan sensitif digunakan untuk modalitas sinar-X dan pencitraan optik, karena AuNP mampu meningkatkan intensitas fluoresensi molekul terkonjugasi [5, 6].
Pada tahun 2014, kami menunjukkan bahwa AuNPs dapat diterapkan pada metode pewarnaan imunofluoresensi tidak langsung (IF) dalam kultur sel [6]. Dalam penelitian ini, kami menjelaskan tiga metode baru untuk pewarnaan imunofluoresensi (IF) menggunakan AuNPs. Di sini, kami menggunakan potongan jaringan dan membandingkan intensitas fluoresensi dari masing-masing metode ini dengan protokol pewarnaan standar dengan antibodi Alexa Fluor® 488 (ALEXA) (A1) dengan tujuan mengoptimalkan teknik fluoresen untuk aplikasi klinis [7,8,9 ].
Pencitraan fluoresensi (FI) untuk penargetan sel kanker menggunakan berbagai teknologi pencitraan optik untuk meningkatkan deteksi neoplasia dini berdasarkan tanda tangan molekuler khusus untuk kanker [10]. Sejak 2013, telah terjadi peningkatan pesat dalam jumlah uji klinis menggunakan FI. Skrining umumnya dipertimbangkan untuk pasien berisiko tinggi, yang didasarkan pada kombinasi faktor gaya hidup, genetika, atau riwayat penyakit pribadi, sedangkan surveilans disediakan untuk pasien dengan diagnosis displasia/inflamasi kronis atau mereka yang dicurigai keganasan. FI dapat membantu dalam mengidentifikasi lesi ganas dengan spesifisitas dan sensitivitas yang lebih baik dibandingkan dengan teknik yang tersedia saat ini. Selanjutnya, skrining berbasis FI dapat memberikan cara yang kurang invasif, lebih hemat biaya untuk mendeteksi lesi kanker atau pra-kanker. Secara khusus, kemampuan FI untuk mendeteksi lesi lebih awal daripada metode skrining konvensional tidak hanya akan menghasilkan hasil pengobatan yang lebih baik tetapi juga mengurangi biaya pengobatan karena akan mencegah kebutuhan akan perawatan multimodalitas, yang diperlukan bagi mereka yang didiagnosis pada diagnosis nanti [11] . Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa konjugat antibodi/AuNP dapat berhasil diterapkan untuk pencitraan peradangan kronis melalui mikroskop fluoresensi.
Metode/Eksperimental
Tujuan Studi
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menunjukkan bagaimana sifat fluoresensi nanopartikel emas dapat digunakan dalam teknik IF dan flow cytometry. Selain itu, kami membandingkan protokol yang diuji dengan AuNPs dengan protokol standar menggunakan ALEXA dan membuktikan bahwa AuNPs dapat digunakan dalam protokol, yang lebih cepat, tetapi dapat diandalkan seperti protokol standar.
Produksi dan Karakterisasi AuNPs dan Spektroskopi Fluoresensi
AuNPs Bulat (7,1-nm) diproduksi dan dikarakterisasi menurut sebuah studi oleh Gasparotto et al. [12]. Singkatnya, semua barang pecah belah disimpan di KMnO4 + Larutan NaOH semalaman, dibilas dengan air deionisasi, disimpan dalam H2 O2 + H2 JADI4 solusi (1:1 v /v ) selama 10 menit, dibilas lagi dengan air deionisasi, dan dikeringkan sebelum digunakan. PVP (0,20 g) dan emas klorida (6,80 mg) dilarutkan dalam 10 ml air. Dalam gelas kimia terpisah, gliserol (0,18 g) dan NaOH (0,080 g) dilarutkan dalam 10 ml air. Kemudian larutan gliserol-NaOH ditambahkan ke AuCl3 -larutan PVT untuk menghasilkan konsentrasi akhir berikut:1,0 mmol/L
−1
Au
3+
, 0,10 M NaOH, 0,10 M gliserol, dan 10 g/L
−1
PVT. Campuran akhir memiliki warna merah tua karena pembentukan AuNPs. Spektrum serapan ultraviolet-tampak koloid dari AuNPs diperoleh dengan spektrofotometer UV-tampak Evolution 60S (Thermo Scientific, MA, USA). Spektroskopi fluoresensi dilakukan dengan spektrofluorofotometer PC RF-5301 (Shimadzu, Kyoto, Jepang).
Desain Eksperimental
Ketiga protokol diuji pada kelompok kontrol dari dua model inflamasi kronis, kolitis ulseratif yang diinduksi asam asetat (UC) [7], dan steatohepatitis yang diinduksi alkohol [8, 9] pada tikus.
UC yang diinduksi asam asetat dilakukan pada tikus Wistar betina (220 ± 20 g BB), diperoleh dari Pusat Bioteknologi/Universidade Federal da Paraiba. Hewan-hewan itu dibagi menjadi dua kelompok (n = 5 per kelompok):kontrol asam asetat dan tikus non-kolitis. Hewan dipuasakan semalaman dan dibius dengan ketamin (70 mg/kg, 10%) dan xylazine (10 mg/kg, 2%). UC diinduksi menurut metode awalnya dijelaskan oleh MacPherson dan Pfeiffer [13] dan dimodifikasi oleh Millar et al. [14]. Kateter dimasukkan dengan hati-hati ke dalam usus besar. Kemudian, 10% asam asetat (0,5 ml) dalam salin 0,9% ditanamkan ke dalam lumen usus besar. Kelompok non-kolitis menerima 0,5 ml saline 0,9% secara intrakolon. Tikus dipertahankan dalam posisi Trendelenburg terlentang selama 30 detik untuk mencegah kebocoran infus intrakolon.
Hewan dipuasakan semalaman dan di-eutanasia dengan overdosis thiopental, 48 jam setelah induksi. Selanjutnya, usus besar diangkat secara aseptik, dibilas dengan PBS, dan diletakkan di atas piring dingin. Usus besar dibersihkan dari lemak dan mesenterium. Kemudian masing-masing benda uji ditimbang dan diukur panjangnya di bawah beban konstan (2 g). Setelah itu, usus besar dibuka membujur dan diberi skor untuk kerusakan yang terlihat secara makroskopis pada skala 0 hingga 10 sesuai dengan kriteria yang dijelaskan oleh Bell et al. [15].
Steatohepatitis alkohol diinduksi pada tikus Wistar jantan (290 ± 10 g BB) yang diperoleh dari Departemen Biofisika dan Farmakologi – Universitas Federal Rio Grande do Norte (UFRN). Hewan-hewan itu dibagi menjadi dua kelompok (n = 5 per kelompok):tikus alkoholik dan non-alkohol. Larutan etanol (7 g/kg berat badan 30% v /v ) digunakan sebagai dosis kronis untuk kelompok alkoholik. Hewan dalam kelompok non-alkohol secara oral menerima volume setara larutan garam (0,9% NaCl) dengan gavage. Prosedur gavage dilakukan sekali sehari pada kedua kelompok selama 28 hari.
Pada hari ke 29, euthanasia dilakukan dengan injeksi intraperitoneal ketamin 7,5 ml/kg (50 mg/ml) dan 2,5 ml/kg Xylazine (20 mg/ml). Sebelum euthanasia, semua kelompok hewan dipuasakan selama 12 jam. Setelah tidak sadar, hewan menjalani tusukan jantung diikuti dengan pengangkatan hati. Fragmen hati direndam dalam formaldehida buffer 10% untuk analisis histopatologi.
Hewan dari UC yang diinduksi asam asetat dan steatohepatitis yang diinduksi alkohol ditempatkan dalam kondisi standar (siklus terang/gelap 12 jam, 22 ± 0,1 °C, dan kelembaban 50–55%) dengan ad libitum akses ke makanan dan air. Hewan diperlakukan sesuai dengan prinsip-prinsip etika untuk eksperimen hewan.
Histologi
Lima blok parafin dari kontrol positif (kontrol asam asetat dan kontrol alkohol) dari setiap model inflamasi digunakan untuk pewarnaan IF tidak langsung. Antibodi utama anti-COX-2 dan anti-MIF ditemukan sebagai penanda peradangan yang baik pada UC yang diinduksi asam asetat dan steatohepatitis yang diinduksi alkohol, masing-masing, dengan memberikan pewarnaan yang andal dalam hal intensitas fluoresensi yang dapat digunakan untuk membandingkan berbagai protokol.
Jaringan difiksasi dalam 10% buffer formaldehida, didehidrasi dengan etil alkohol (70%, 80%, 90%, 95%, dan P.A.), diklarifikasi dalam Xylol dan diresapi dalam parafin mengikuti protokol standar [8]. Sebelum persiapan bagian untuk pewarnaan IF tidak langsung, slide disimpan dalam oven pada suhu 60°C selama 24 jam.
Desain Imunofluoresensi dan Protokol
Tiga bagian jaringan (4 μm) dari masing-masing hewan dideparafinisasi dalam xilena dan dicuci dalam serangkaian penurunan konsentrasi etanol, dari etanol 99% menjadi etanol 50%. Akhirnya, bagian jaringan dicuci dua kali dalam dH2 O dan satu cuci dengan PBS. Pengambilan antigen dilakukan dengan menempatkan bagian dalam 10 mM natrium sitrat dengan 0,05% Tween 20 pada 95 °C selama 30 menit dan selanjutnya pada suhu kamar (RT) selama 20 menit. Kebisingan/sinyal latar belakang dikurangi dengan menginkubasi bagian dalam 0,1% Sudan hitam dalam alkohol 70% di RT selama 20 min, diikuti oleh tiga kali pencucian dalam 0,02% PBS-Tween 20. Sampel ditembus dalam 0,2% Triton-X-100 di PBS (tiga kali pencucian, masing-masing 5 mnt), dicuci dalam PBS, lalu diblok dengan PBS, 5% BSA, dH2 O, dan Triton-X-100. Slide diinkubasi dengan larutan blok dalam ruang kelembaban selama 2 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 dan Gambar 1, inkubasi antibodi primer anti-COX-2 dan anti-MIF dilakukan mengikuti tiga protokol yang berbeda (NP1, NP2, dan NP3). Protokol-protokol ini dibandingkan dengan dua protokol berbasis ALEXA yang berbeda dalam waktu inkubasi antibodi primer—protokol standar ALEXA (inkubasi semalam) yang diadopsi oleh kelompok penelitian kami sebagai protokol standar untuk sebagian besar prosedur (A1) dan protokol modifikasi ALEXA (A2; inkubasi 30 min). NP1 adalah metode pewarnaan imunofluoresensi yang bergantung pada nanopartikel dengan 30 menit untuk inkubasi primer. Antibodi primer diencerkan dalam 1% BSA pada rasio 1:500 (anti-COX-2) dan 1:400 (anti-MIF), dan setiap sampel diinkubasi dalam ruang kelembaban pada RT (20 °C) selama 30 min . Selanjutnya, 100–150 μl AuNP ditambahkan ke sampel, yang dibiarkan diinkubasi pada RT (20 °C) selama 30 menit lagi. Dalam protokol yang bergantung pada nanopartikel kedua (NP2), antibodi primer diencerkan dalam 1% BSA dan diterapkan langsung ke slide, yang dibiarkan di lemari es semalaman. Oleh karena itu, A2 dan NP1 keduanya merupakan protokol inkubasi 30 menit, tetapi A2 dilakukan dengan antibodi fluoresen sekunder (ALEXA), sedangkan NP1 memiliki AuNPs sebagai fluorofor. Ini juga berlaku untuk protokol inkubasi semalam A1 dan NP2. Setelah waktu inkubasi masing-masing, slide masing-masing protokol dicuci tiga kali dengan PBS untuk menghilangkan kelebihan antibodi primer. Kemudian, 100-150 μl nanopartikel ditambahkan ke setiap slide di NP2, sedangkan ALEXA (1:400) ditambahkan di A1. Setelah 1 jam inkubasi dengan AuNPs (NP2) dan ALEXA (A1), semua slide dicuci tiga kali dengan PBS.
Gambar pewarnaan hematoxylin dan eosin dari UC yang diinduksi asam asetat dan kelompok kontrol steatohepatitis yang diinduksi alkohol. a Kontrol negatif Model UC (× 100; bilah skala = 100 μm). b UC yang diinduksi asam asetat. Panah merah menunjukkan infiltrasi leukosit pada area mukosa (× 100; skala bar = 100 μm). c Kontrol negatif steatohepatitis (× 200; skala bar = 50 μm). d Steatohepatitis akibat alkohol. Panah hitam menunjukkan infiltrasi leukosit (× 200; skala bar = 50 μm)
Protokol ketiga (NP3) dirancang untuk mengeksplorasi sifat penguatan AuNPs dalam sistem fluoresen. Dalam NP3, AuNPs diterapkan selama pengenceran ALEXA dalam 1% BSA. Tiga pengenceran antibodi sekunder (1:200, 1:400, dan 1:800) dalam BSA dengan AuNPs diuji untuk membandingkan intensitas fluoresensi setiap pengenceran dengan A1. Pengenceran disiapkan sedemikian rupa sehingga volume AuNP sebanding dengan volume BSA, misalnya, untuk pengenceran 1:200, 2 μl ALEXA diencerkan dalam 199 μl AuNPs + 199 μl BSA. Waktu inkubasi untuk antibodi primer pada A1 dan NP3 adalah sekitar 18 h (semalam), sedangkan waktu inkubasi untuk suspensi ALEXA + AuNPs adalah 1 h.
Terakhir, sampel dipasang menggunakan Media Pemasangan Fluoroshield dengan DAPI. Slide disimpan dalam kotak terlindung cahaya dan disimpan pada suhu 4 °C sampai analisis mikroskopis. Gambar fluoresen diperoleh dengan mikroskop tegak Zeiss Observer z.1 untuk fluoresensi dan pencitraan bidang terang (tujuan × 20 dan × 10, Carl Zeiss, Jena, Jerman) dengan AxioCam MRc. Parameter rata-rata aritmatika dari perangkat lunak edisi biru Zeiss ZEN lite (Carl Zeiss) digunakan untuk mengevaluasi secara kuantitatif intensitas piksel fluoresensi demi piksel untuk setiap gambar saluran ALEXA. Setidaknya tiga sampel dari setiap hewan (lima hewan per kelompok) dianalisis dan lima gambar diambil dari setiap fragmen dengan tujuan × 10.
Induksi TAM terpolarisasi M2 In Vitro
Untuk evaluasi nanopartikel emas terkonjugasi antibodi primer (AuNPs) dalam makrofag M2, sel RAW 264,7 (5 × 10
5
sel/sumur dalam piring 12-sumur) dikultur dalam media lengkap dengan 10% serum janin sapi ditambah dengan 20 ng/ml IL-4 selama 24 jam. Setelah pengobatan dengan IL-4, sel dicuci tiga kali dengan DMEM bebas serum, diikuti dengan kultur dalam media yang sama selama 48 jam. Sel dianalisis menggunakan mikroskop cahaya Telaval 31 (ZEISS, Oberkochen, Jerman).
Flow Cytometry
Setelah inkubasi dengan IL-4 selama 48 h, sel RAW 264,7 dan makrofag M2 (1,5 × 10
4
sel/sumur dalam pelat 12-sumur) dikumpulkan dengan pengikis dan diblokir dengan 0,5 g BSA dalam 100 ml PBS (PBA) selama 45 menit, diikuti dengan inkubasi dengan CD163 anti-tikus terkonjugasi PerCP (1:1000) dan FITC -CD86 anti-tikus terkonjugasi (1:1000) pada 4 °C selama 60 min. Selain itu, makrofag M2 diberi label dengan antibodi primer COX-2 dan MIF sehingga terkonjugasi dengan AuNPs. TAM terpolarisasi M2 dikumpulkan dan difiksasi dengan paraformaldehida 2% dalam PBS selama 10 menit, diikuti dengan inkubasi dengan anti-COX-2 dan anti-MIF primer (1:100) selama 60 menit pada 4 °C dan; setelah itu, sel diberi label dengan antibodi sekunder terkonjugasi Alexa® Fluor 488 anti-kelinci kambing (Thermo Fisher Scientific) dalam larutan inkubasi (1:100) pada suhu kamar selama 60 menit seperti yang dijelaskan dalam protokol standar Alexa [16]. Mengikuti protokol (N1) di mana AuNP menggantikan antibodi sekunder terkonjugasi Alexa® Fluor 488 anti-kelinci kambing, makrofag M2 dipanen, dicuci dengan PBS, dan diinkubasi dengan primer anti-COX-2 dan anti-MIF (1:100 ) dalam larutan inkubasi pada suhu kamar selama 30 min. Kemudian, sel-sel diinkubasi dengan AuNPs (1:5) pada suhu 4 ° C selama 30 menit (eksitasi AuNP pada 520 nm). Setelah langkah pencucian terakhir, sel berlabel dianalisis dalam perangkat lunak BD FACSCanto II (BD Biosciences, Belanda) dan FlowJo (versi 10.1; Tree Star Inc., UK). Semua analisis flow cytometry dilakukan dengan sampel dalam rangkap tiga dan diulang tiga kali. Perbandingan antara protokol ALEXA dan AuNPs standar ditunjukkan pada Tabel 2.
Analisis Statistik
Analisis varians (ANOVA) dan post hoc Bon Bonferroni tes dilakukan untuk analisis imunofluoresensi. Untuk analisis flow cytometry, perbedaan yang signifikan antara kelompok dihitung menggunakan ANOVA dan uji Dunn, seperti yang ditunjukkan. p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik untuk semua analisis yang dilakukan.
Hasil
Analisis Mikroskopi
Bagian pada Gambar 1a menunjukkan bagian jaringan yang diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (kontrol negatif). Proses inflamasi kronis yang diinduksi oleh asam asetat digambarkan pada Gambar 1b, yang menunjukkan hilangnya arsitektur jaringan dengan konsekuensi penghancuran epitel, pengurangan sel goblet, adanya perdarahan dan leukosit di dekat lokasi cedera. Dalam gambar akumulasi tetesan lemak dan infiltrat inflamasi (neutrofil dan limfosit) terlihat di hati dari tikus yang terkena paparan alkohol kronis.
Dalam hal intensitas fluoresensi, AuNPs tampak mirip dengan ALEXA, yang merupakan fluorofor konvensional untuk pewarnaan IF. Dalam sampel hati dan usus besar, perbedaan intensitas fluoresensi NP1 dan NP2 minimal atau tidak ada jika dibandingkan dengan A1. Pada Gambar. 2, beberapa perbandingan antara protokol IF yang diuji menggunakan antibodi primer anti-COX-2 dan anti-MIF ditampilkan. Gambar 2a dan d menunjukkan bahwa intensitas fluoresensi A2, NP1, dan NP2 tidak berbeda nyata dibandingkan dengan protokol A1 (
#p> 0,05), menunjukkan bahwa protokol inkubasi 30 menit (baik menggunakan ALEXA atau AuNPs) dapat diterapkan dalam konteks diagnostik.
Perbandingan intensitas fluoresensi antar kelompok. a Intensitas fluoresensi AuNPs di A2, NP1, dan NP2 dibandingkan dengan UC (antibodi anti-COX-2) yang diinduksi asam asetat A1 saja. b Semua pengenceran NP3 (1:200, 1:400, dan 1:800) dibandingkan dengan intensitas fluoresensi A1 (1:400)-hanya asam asetat yang diinduksi UC (antibodi anti-COX-2). c Perbandingan intensitas fluoresensi antara hewan yang diinduksi asam asetat dan kontrol negatif setelah waktu singkat (A2 dan NP1) dan inkubasi semalam (A1 dan NP2). d Intensitas fluoresensi AuNPs di A2, NP1, dan NP2 dibandingkan dengan steatohepatitis yang diinduksi alkohol hanya-A1 (antibodi anti-MIF). e Semua pengenceran NP3 (1:200, 1:400, dan 1:800) dibandingkan dengan intensitas fluoresensi steatohepatitis yang diinduksi alkohol (antibodi anti-MIF) hanya-alkohol A1 (1:400). f Perbandingan intensitas fluoresensi antara hewan steatohepatitis yang diinduksi alkohol dan kontrol negatif setelah inkubasi 30 menit (A2 dan NP1) dan inkubasi semalam (A1 dan NP2). Statistik:uji post hoc ANOVA dan Bonferroni,
#p 0,05, **p < 0.01,***p < 0.001, dan ****p < 0,0001
Selain itu, protokol NP3 (Gbr. 2b, e) menunjukkan bahwa dimungkinkan untuk menggabungkan AuNPs ke ALEXA sehingga intensitas fluoresensi yang terdeteksi meningkat (***p < 0.001), memungkinkan pengenceran ALEXA dua kali lipat tanpa penurunan fluoresensi relatif terhadap pengenceran 1:400 yang awalnya diuji pada A1 (
#p> 0,05).
Akhirnya, kami membandingkan kelompok yang sakit dengan kelompok yang sehat (Gbr. 2f) untuk menunjukkan bahwa semua protokol yang diuji, baik dengan ALEXA atau dengan AuNPs, efektif dalam mendeteksi permulaan proses inflamasi yang dicirikan oleh antigen COX-2 dan MIF. Gambar 3 dan 4 mendukung data yang ditampilkan secara grafis pada Gambar 2. Baik ALEXA dan AuNP direpresentasikan dalam pewarnaan hijau, yang distribusinya sesuai dengan lokasi peningkatan infiltrasi leukosit dan cedera jaringan.
Gambar anti-COX-2 JIKA sampel usus besar dari salin (kontrol negatif) dan kelompok UC yang diinduksi asam asetat diwarnai dengan senyawa fluoresen hijau (ALEXA, AuNPs, atau keduanya) dan DAPI (biru) untuk inti. a Kontrol negatif diwarnai dengan protokol standar ALEXA (A1) dengan anti-COX-2 dan ALEXA (hijau). b Kontrol negatif diwarnai dengan protokol ALEXA yang dimodifikasi (A2) dengan anti-COX-2 dan ALEXA. c Kontrol negatif diwarnai dengan protokol nanopartikel 1 (NP1) dengan anti-COX-2 dan AuNPs (hijau) sebagai ganti ALEXA. d Kontrol negatif diwarnai dengan protokol nanopartikel 2 (NP2) dengan anti-COX-2 dan AuNPs, bukan ALEXA. e Kontrol positif diwarnai dengan A1. f Kontrol positif diwarnai dengan A2. g Kontrol positif diwarnai dengan NP1. h Kontrol positif diwarnai dengan NP2. saya Kontrol positif diwarnai dengan protokol nanopartikel (NP3) dengan anti-COX-2 + AuNPs dengan ALEXA 1:200. j Kontrol positif diwarnai dengan NP3 (dengan pengenceran ALEXA 1:400). k Kontrol positif UC diwarnai dengan NP3 (dengan pengenceran ALEXA 1:800). Pembesaran, × 200. Bilah skala = 50 μm
Gambar anti-MIF IF sampel hati dari salin (kontrol negatif) dan kelompok steatohepatitis yang diinduksi alkohol diwarnai dengan senyawa fluoresen hijau (ALEXA, AuNPs, atau keduanya) dan DAPI (biru) untuk inti. a Kontrol negatif diwarnai dengan protokol standar ALEXA (A1) dengan anti-MIF dan ALEXA (hijau). b Kontrol negatif diwarnai dengan protokol modifikasi ALEXA (A2) dengan anti-MIF dan ALEXA. c Kontrol negatif diwarnai dengan protokol nanopartikel 1 (NP1) dengan anti-MIF dan AuNPs (hijau) sebagai pengganti ALEXA. d Kontrol negatif diwarnai dengan protokol nanopartikel 2 (NP2) dengan anti-MIF dan AuNPs sebagai pengganti ALEXA. e Kontrol positif diwarnai dengan A1. f Kontrol positif diwarnai dengan A2. g Kontrol positif diwarnai dengan NP1. h Kontrol positif diwarnai dengan NP2. saya Kontrol positif diwarnai dengan protokol nanopartikel 3 (NP3) dengan anti-MIF + AuNPs dengan ALEXA 1:200. j Kontrol positif diwarnai dengan NP3 dengan pengenceran ALEXA 1:400. k Kontrol positif diwarnai dengan NP3 dengan pengenceran ALEXA 1:800. Pembesaran, × 200. Bilah skala = 50 μm
Dalam hal aplikasi klinis, protokol NP1 terbukti paling menjanjikan, karena jika dibandingkan dengan protokol A1 standar, memungkinkan penghematan 18 h.
Flow Cytometry:Nanopartikel Emas Terkonjugasi Antibodi Primer (AuNP)-Makrofag M2 Berlabel
Untuk mengkarakterisasi lebih lanjut makrofag M2, ekspresi pembuat terkait M1 (CD86)- dan M2 (CD163) dalam sel RAW 264.7 yang distimulasi IL-4 dianalisis dalam flow cytometry. Hasil Flow cytometry menunjukkan bahwa penanda terkait M2 seperti reseptor CD163 secara signifikan lebih tinggi daripada sel asli (Gbr. 5a, c, p < 0.001) sedangkan ekspresi reseptor CD86 tidak menunjukkan perbedaan antara makrofag M2 dan sel naif (Gbr. 5b, c, p> 0,05). Hasilnya menunjukkan bahwa IL-4 (20 ng/ml) berhasil menginduksi perubahan makrofag klasik menjadi makrofag M2. Setelah langkah ini, makrofag M2 diinkubasi dengan antibodi primer COX-2 dan MIF dan kemudian diberi label dengan AuNPs untuk membandingkan efisiensi nanopartikel emas terkonjugasi antibodi primer (AuNPs) dengan protokol standar (ALEXA). Hasilnya menunjukkan bahwa nanopartikel emas terkonjugasi antibodi COX-2 dan MIF (Gbr. 5d, f, p < 0.001) atau ALEXA (Gbr. 5e, f, p < 0.001) menunjukkan intensitas fluoresensi yang lebih tinggi pada makrofag M2 jika dibandingkan dengan sampel yang tidak diwarnai.
Nanopartikel emas terkonjugasi antibodi COX-2 dan MIF (AuNPs) memiliki afinitas tinggi pada permukaan makrofag M2. a –c Sel RAW 264,7 distimulasi dengan IL-4 (20 ng/ml) selama 24 jam, diikuti dengan analisis flow cytometry untuk mengukur jumlah CD163, penanda makrofag M2, dan CD86, penanda M1. d , f Baik nanopartikel emas terkonjugasi antibodi COX-2 dan MIF atau e , f ALEXA 488 menunjukkan intensitas fluoresensi yang lebih tinggi dalam makrofag M2 jika dibandingkan dengan sampel yang tidak diwarnai. Data dinyatakan sebagai mean ± SD,
#p> 0,05, ***p < 0.001, p < 0,0001. Data aliran representatif yang ditampilkan berasal dari eksperimen yang dilakukan secara independen setidaknya tiga kali
Spektroskopi Fluoresensi
Untuk mengukur spektrum emisi fluoresensi untuk AuNP murni tanpa dan adanya anti-COX-2 (Gbr. 6a), anti-MIF (Gbr. 6b), dan ALEXA (Gbr. 6c), panjang gelombang eksitasi ditetapkan pada 320 nm dan emisi tercatat dalam kisaran 650 hingga 900 nm. Peningkatan panjang gelombang eksitasi tidak mengubah rentang emisi partikel, sehingga mengecualikan kemungkinan proses hamburan. Emisi fluoresensi sedikit meningkat dengan penyerapan anti-COX-2 (meningkatkan 11,93 unit absorbansi (au) untuk konsentrasi antibodi tertinggi), anti-MIF (meningkat 12,15 au untuk konsentrasi antibodi tertinggi), dan ALEXA (meningkat 3,18 au untuk konsentrasi antibodi tertinggi). konsentrasi antibodi tertinggi) dalam kombinasi dengan AuNPs.
Spektrum emisi fluoresensi AuNPs tereksitasi pada 320 nm dengan adanya anti-COX-2 (a ), anti-MIF (b ), dan ALEXA (c ). Gambar TEM dari nanopartikel sferis yang digunakan dalam penelitian ini, menunjukkan ukuran dan distribusinya (d ). Celah eksitasi dan emisi adalah 10 nm. Konsentrasi AuNP dipertahankan konstan pada 29,6 ng/ml
−1
. Konsentrasi antibodi adalah 100 ng/ml
−1
(kurva biru), 150 ng/ml
−1
(kurva merah), dan 200 ng/ml
−1
(kurva hijau)
Diskusi
Telah ditunjukkan bahwa AuNPs memiliki sifat fluoresensi, karena struktur dan ukuran kimianya, dan dapat bertindak sebagai molekul penguat sinyal fluoresen. Lebih spesifik, fluoresensi AuNP sendiri berasal dari interaksi aurofilik pada permukaan atom emas [17, 18]. Data dari Gambar. 6 serupa dengan temuan studi tentang nanopartikel perak, yang berutang emisi fluoresensi meningkat untuk kompetisi antara spesies adsorben dan oksigen molekul terlarut dalam larutan. Oleh karena itu, peningkatan emisi fluoresensi nanopartikel emas dapat dikaitkan dengan fakta bahwa BSA teradsorpsi pada permukaannya [19].
Sinyal fluoresensi adalah fungsi dari fenomena resonansi plasmon permukaan (SPR). Oleh karena itu, peningkatan jumlah elektron bebas menghasilkan sinyal SPR yang lebih kuat, karena SPR adalah osilasi kolektif elektron bebas. BSA yang teradsorpsi mencegah elektron bebas permukaan mengikat molekul oksigen, menyebabkan peningkatan sinyal fluoresensi [20, 21]. Anti-COX-2, anti-MIF, dan ALEXA mungkin telah teradsorpsi pada AuNPs, sehingga mencegah O2 mencapai permukaan nanopartikel. Hal ini didukung oleh Gambar 6, di mana peningkatan sinyal fluoresensi terjadi pada konsentrasi yang sangat rendah dari antibodi yang berbeda. Perlu diperhatikan, bagaimanapun, bahwa ALEXA membutuhkan konsentrasi yang lebih tinggi untuk menyebabkan O2 isolasi permukaan AuNPs.
Proses inflamasi kronis ditandai dengan infiltrasi sel imun, terutama makrofag, di lokasi cedera yang disebabkan oleh asam asetat atau etanol pada model masing-masing. Inflammation is also characterized by the leukocyte-dependent release of several cytokines and mediators in response to a pathogen or a stressful condition. Among these cytokines, COX-2 and MIF are known to be markers for several inflammation processes, since they are pro-inflammatory cytokines. The green staining observed in Fig. 3 and Fig. 4 is due to the release of COX-2 and MIF cytokines, respectively.
In chronic UC and liver steatohepatitis, macrophages are the main cells found which can be classified into two major types:M1 macrophages and M2 macrophages. The classically activated macrophages (M1 macrophages) are proinflammatory and play a pivotal role in host defense against infection which is associated with iNOS and IL-23 production and their cell surface-expressed CD86 or HLA-DR that attract killer cells like neutrophils and/or direct Th1 (cytotoxic) responses and stimulate further M1-type responses [22]. Meanwhile, the alternatively activated macrophages (M2 macrophages) are associated with the responses to anti-inflammatory reactions as well as tissue remodeling [23]. In the tumor context, it has been documented that M2-polarized macrophages promote pro-tumor functions by production of a large array of growth factors such as COX-2 and MIF for tumor cells, which are essential for tumor proliferation [24].
It is well established that UC is an important risk factor for colonic epithelial dysplasia and adenocarcinoma [25, 26]. According to Agoff et al. [25], increased malondialdehyde (MDA) levels and upregulation of Bcl-2 during UC are potential mechanisms to explain the relationship between COX-2 overexpression and neoplastic progression. In UC, the inflammation boosts COX-2 activity, leading to genetic damage through increased production of MDA. MDA is a by-product of COX-mediated prostaglandin synthesis and lipid peroxidation, and it is also constitutively produced by COX-1. Since COX-2 upregulates Bcl-2 expression, it leads to resistance to apoptosis in UC-associated neoplasia [27].
MIF is a multipotent cytokine in the innate immune responses that contributes to hepatic injury driven by alcohol-induced steatohepatitis [28]. When steatohepatitis has developed, the liver morphology rarely goes back to normal, even after cessation. In addition, there is a higher risk of the development of cirrhosis, which is the last stage of alcoholic liver disease (ALD) before hepatocellular carcinoma (HCC) [29].
Studies show MIF presence in the sera after hepatic resection or expression in the course of liver cancer progression [30]. MIF is involved in COX-2 and PGE2 upregulation and directly promotes tumorigenesis by inhibition of p53 accumulation, which is a classic tumor suppressor gene that can promote cell cycle arrest and apoptosis in response to DNA damage [31].
In a previous study [6], we have demonstrated that AuNPs can be easily conjugated with the antibodies anti-β-catenin and anti-E-cadherin to specifically target colorectal carcinoma cells, whose clinical value can be found in an early diagnosis of cancer through non-invasive methods in body fluids such as saliva and urine. In addition, we developed a new protocol to decrease the 27 h that are usually needed for the standard protocol to about 1 h needed for our improved protocol, which makes this method eligible for a clinical colorectal cancer diagnostic.
In this study, we took advantage of the properties of AuNPs conjugated with primary antibodies and applied them for the indirect IF staining method of tissue sections. At this point, we cannot affirm whether the interaction of the antibody with the nanoparticle is purely physical or if there is a chemical bond, since the amount of antibodies used in this method are far too small to produce discernible signals in Fourier-transform infrared spectroscopy. Thus, we rely only on fluorescence data that suggest that conjugation was achieved by direct adsorption of antibodies on the AuNPs surface. Such enhancement has been rationalized in terms of competition between adsorbing species and molecular oxygen dissolved in solution, as explained before by Lima et al. [6]. We found that the replacement of ALEXA by the AuNPs in NP1 saves about 18 h (similar to A2), when compared to standard protocol and NP2 that require about 24 h, each, from the antigenic retrieval to the assembling of the slides for microscopic analysis (Fig. 7 and Table 1). The time for incubation with the primary antibody was 30 min for A2 and NP1, but overnight (18 h) for A1, NP2, and NP3 (Fig. 7a and Table 1).
Comparative schemes illustrating the immunofluorescence (a ) and flow cytometry protocols used in this study (b ). In immunofluorescence, AuNPs may be applied in 30-min incubation protocols as fluorescence-enhancing agents, providing faster results with comparable fluorescence levels to the traditional ALEXA protocol, which makes NP1 a suitable protocol for cancer diagnose. Time was counted from the antigen retrieval to the end of the second incubation. In flow cytometry, although the ALEXA marking was higher than that of the AuNPs, the N1 protocol with AuNPs allowed a greater saving of reagents as well as reduced the time required for the technique from 4 to 1 h
Moreover, we demonstrated MIF and COX-2 primary antibody-conjugated gold nanoparticles can be arranged on the surface of M2 macrophage as a fast alternative to analyze the immune profile of inflammation-induced cancer tissues by flow cytometry. Although the standard protocol is laborious, the intensity of marking to both the primary antibodies was higher than primary antibody-conjugated gold nanoparticles. However, the primary antibody-conjugated gold nanoparticles needed less reagents and the time saving was higher as seen in the standard protocol (4 h) and in primary antibody-conjugated gold nanoparticles N1 protocol (1 h) (Fig. 7b). These results suggest that M2 macrophages can be targeted with primary antibody-conjugated gold nanoparticles either to diagnosis or therapy.
The time saving, the specificity, and the low cost provided by NP1 are especially important in cancer diagnosis, when fast and accurate results are highly required. It is important to highlight that, although the models adopted for this work were based on inflammation diseases, the inflammation markers used in this study are highly cancer-correlated and AuNPs provide multiple possibilities for application in clinical research and diagnosis.
Conclusions
All nanoparticle protocols tested showed similar fluorescent intensities to those observed in standard IF, extending the application of AuNPs, not only in research, but also in clinical diagnostics. When diluted with ALEXA, AuNPs allow greater dilutions with acceptable fluorescence intensity. More importantly, AuNPs can be used in faster protocols (e.g., 30-min incubation protocols), completely substituting ALEXA and providing a way to develop further technologies that will improve cancer diagnose and other diseases. We believe that these findings will contribute to advance research and diagnostic procedures that utilize IF methods as well as widen the applications of AuNPs in biotechnology.
