Imunofluoresensi Berbasis Nanopartikel Emas Memungkinkan Deteksi Cepat dan Sensitif Biomarker Kanker yang Ditingkatkan Radang

Abstrak

Deteksi kanker dini bergantung pada mengidentifikasi tanda radang yang mendahului keganasan. Kami mengevaluasi nanopartikel emas (AuNP) yang dikonjugasi antibodi primer sebagai agen kontras target untuk radang kronis pada model kolitis ulceratif (UC) dan steatohepatitis, kondisi yang mendisposisikan kanker kolorektal dan hati. AuNP (7,1 nm) disintesis melalui rute yang hemat biaya dan ramah lingkungan dan dikonjugasi dengan anti-COX-2, anti-MIF, dan Alexa Fluor® 488 (ALEXA). Tiga protokol imunofluoresensi (IF)—inkubasi 30 menin dan semalaman, serta protokol amplifikasi—dibandingkan dengan alur kerja IF ALEXA standar. Sistometri aliran (FC) menggunakan AuNP untuk melabeli makrofag M2. Konjugasi dicapai melalui adsorpsi langsung, dikonfirmasi dengan intensitas fluoresensi yang dapat dibandingkan dengan ALEXA. Protokol AuNP 30 menit mengurangi waktu IF total dari 23 jam menjadi 5 jam dan waktu FC dari 4 jam menjadi 1 jam, menawarkan alternatif yang menghemat tenaga kerja dan layak klinis untuk diagnostik kanker yang dipicu radang.

Pendahuluan

Nanopartikel emas (AuNP) telah muncul sebagai sond serbaguna untuk citra optik, menawarkan properti optik yang dapat disesuaikan ukurannya, kompatibilitas biologis yang tinggi, dan kemudahan fungsionalisasi. Konjugat antibodi-AuNP memungkinkan deteksi waktu nyata dari penyerapan emas dalam sel hidup, memfasilitasi pengukuran yang tepat distribusi nanopartikel dalam kondisi penyakit. Secara historis, emas koloidal telah digunakan untuk mikroskopi elektron antigen bakteri, dan kemudian diperluas ke berbagai aplikasi biomedis, termasuk genomika, biosensor, dan terapi fototermal. Dalam onkologi, AuNP meningkatkan sinyal fluoresensi dan reduksi sinar-X, meningkatkan sensitivitas citra tumor.

Membangun pada karya kami sebelumnya yang menunjukkan konjugat antibodi AuNP untuk citrasi kanker kolorektal, studi ini memperkenalkan tiga protokol IF yang menggantikan fluorofora konvensional dengan AuNP, sehingga mempercepat pewarnaan dan mengurangi konsumsi reagen. Kami juga memvalidasi AuNP dalam FC untuk pelabelan makrofag M2, pemain kunci dalam radang yang terkait tumor.

Metode

Tujuan

Untuk menunjukkan bahwa AuNP dapat menggantikan fluorofora konvensional dalam IF dan FC, menyediakan pewarnaan yang lebih cepat dan sama andalnya untuk biomarker kanker yang dipicu radang.

Reagen

AuCl₃, PVP (MW 10.000), NaOH, glycerol, PBS, BSA (5 %), anti-COX-2, anti-MIF, antibodi sekunder Alexa Fluor® 488, dan Fluoroshield dengan DAPI.

Sintesis dan Karakterisasi AuNP

AuNP bola (7,1 nm) disiapkan dengan mengurangi AuCl₃ dalam kehadiran PVP, glycerol, dan NaOH, menghasilkan koloid merah tua. Spektra UV-vis dan pengukuran fluoresensi mengonfirmasi monodispersi dan resonansi plasmon permukaan. Antibodi diiklan langsung pada AuNP, menghasilkan konjugat yang stabil.

Model Hewan

UC yang diinduksi asam asetat pada tikus Wistar betina (n = 5) dan steatohepatitis yang diinduksi alkohol pada tikus Wistar jantan (n = 5) ditetapkan sesuai protokol standar. Jaringan diperbaiki, dienkapsulasi, dan difragmen (4 µm) untuk IF.

Protokol Imunofluoresensi

Tiga protokol berbasis AuNP dievaluasi:

• NP1 (30 menit): Antibodi primer (1:500 COX-2, 1:400 MIF) diinkubasi 30 menit, diikuti oleh penambahan AuNP 30 menit.
• NP2 (semalaman): Antibodi primer diinkubasi 18 jam, kemudian inkubasi AuNP 1 jam.
• NP3 (amplifikasi): ALEXA dicairkan (1:200–1:800) dicampur dengan AuNP; inkubasi 1 jam.

Protokol ALEXA standar (A1 semalaman, A2 30 menit) berfungsi sebagai kontrol. Fragmen diimajering pada Zeiss Observer z.1 dengan analisis fluoresensi piksel-pert-piksel kuantitatif.

Pelabelan Makrofag M2 dan Sistometri Aliran

Sel RAW 264.7 dipolarisir menjadi M2 dengan IL-4 (20 ng mL⁻¹) selama 48 jam. Sel diinkubasi dengan antibodi primer COX-2/MIF dan dilabeli dengan ALEXA atau AuNP (protokol N1). Setelah perbaikan, sampel dianalisis pada BD FACSCanto II; data diproses dengan FlowJo.

Analisis Statistik

ANOVA dengan ujian pasca-noc Bonferroni (IF) dan ujian Dunn (FC) menilai signifikansi; p < 0,05 dianggap signifikansi.

Hasil

Mikroskopi

Citra H&E mengonfirmasi patologi radang yang diharapkan. Intensitas fluoresensi NP1 dan NP2 cocok dengan A1, dan NP3 memperkuat sinyal, memungkinkan pencairan ALEXA dua kali tanpa kehilangan kecerahan. Protokol waktu singkat (30 menit) (A2, NP1) menghasilkan pewarnaan yang dapat dibandingkan dengan standar semalaman, menunjukkan kelayakan untuk diagnostik cepat.

Sistometri Aliran

Sel RAW yang dipolarisir IL-4 menunjukkan CD163 (penanda M2) yang meningkat dan CD86 (M1) yang tidak berubah. AuNP yang dilabeli COX-2/MIF menghasilkan intensitas fluoresensi yang dapat dibandingkan dengan ALEXA, mengonfirmasi ikatan permukaan yang efisien dan penggunaan reagen minimal.

Spektroskopi Fluoresensi

AuNP menunjukkan emisi pada 650–900 nm saat diangkit 320 nm. Adsorpsi antibodi meningkatkan fluoresensi sekitar 12 a.u., menunjukkan konjugasi yang berhasil dan peningkatan sinyal karena penurunan quenching oksigen.

Pembahasan

AuNP memiliki fluoresensi intrinsik dan bertindak sebagai pemerkasa sinyal dengan memblokir akses oksigen ke elektron permukaan, sehingga meningkatkan resonansi plasmon permukaan. Konjugasi melalui adsorpsi langsung memberikan pendekatan yang sederhana dan dapat diskalakan, menghindari kimia kovalen dan mempertahankan aktivitas antibodi. Protokol NP1 mengurangi alur kerja IF total sebesar 18 jam, sementara waktu FC menurun dari 4 jam menjadi 1 jam, menawarkan efisiensi alur kerja yang besar. Pentingnya, AuNP mempertahankan sensitivitas untuk COX-2 dan MIF, biomarker kunci dalam kanker kolorektal yang terkait UC dan kanker sel hepatoseluler yang terkait steatohepatitis yang diinduksi alkohol. Dengan prevalensi radang kronis yang tinggi dalam risiko kanker, metode deteksi yang cepat dan hemat biaya sangat penting.

Kesimpulan

Protokol IF dan FC berbasis AuNP memberikan intensitas fluoresensi yang setara dengan fluorofora konvensional, sambil secara drastis memotong waktu inkubasi dan konsumsi reagen. Temuan ini membuka jalan bagi adopsi klinis AuNP dalam patologi diagnostik dan potensialmente dalam penargetan terapeutik makrofag M2.

Singkatan

A1

Protokol standar ALEXA

A2

Protokol modifikasi ALEXA

ALD

Penyakit hati alkohol

ALEXA

Alexa Fluor® 488®

AuNP

Nanopartikel emas

BSA

Albumin serum sapi

COX-2

Siklooksigenase-2

FC

Sistometri aliran

FI

Citra fluoresensi

IF

Imunofluoresensi

MDA

Malondialdehida

MIF

Faktor inhibi migrasi makrofag

NP1

Protokol nanopartikel 1

NP2

Protokol nanopartikel 2

NP3

Protokol nanopartikel 3

SPR

Resonansi plasmon permukaan

UC

Kolitis ulceratif